专利名称：一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别氨苄青霉素的高效特异结合物与研制可以快速检测氨苄青霉素残留的免疫速测试剂盒的用途。
背景技术：
氨节青霉素(Ampicillin, Amp),别名:氨节西林、氨节青、安比西林等，分子式为C16H19N304S，分子量为349.41。氨苄青霉素游离酸含3分子结晶水，为白色结晶性粉末，味微苦，在水中微溶，不溶于氯仿、乙醇、乙醚或脂肪油，溶解于稀酸或稀碱溶液，PKa为2.5和7.3。由于在治疗家禽疾病过程中超量应用Amp，并通过食物链传递给人，使经常食用的人对Amp的耐药性增加。由于Amp的抗菌作用，使肠道细菌菌群混乱，引起出血性结肠炎。Amp的使用还会引起过敏性哮喘、过敏性休克等。在马、猪中出现流汗、不安、呼吸困难、站立不稳、心跳加速等症状。大剂量或超大剂量使用青霉素类兽药，可干扰凝血机制而造成出血或引起中枢神经系统中毒，引起动物抽搐、大小便失禁、瘫痪等症状。Lipocalin是从细菌到人都含有的一组胞外亲脂蛋白的总称，作为受体较强的结合小分子具有重要的生物学功能。这类蛋白能够结合和转运血浆中的疏水性生物活性因子，也可用于运输和储藏次级代谢产物如脂质、信息激素、前列腺素等。尽管Iipocalin在一级结构上存在多样性，但其二级结构与四级结构却惊人的相似:由N末端环、α螺旋、C末端环、β片层形成的刚性结构核心组成，其形状象一个洞穴。而8条反相平行的β折叠片与一个α螺旋扭曲形成一个折叠桶， 称作桶，形成了“Lipocalin支架”结构。桶的一个末端有溶解能力并含有一个配体结合位点，开口端由连接β条带的多个Loop组成,是整个分子比较柔韧的部分，且氨基酸成员为极性氨基酸，LoopU Loop2、Loop3、Loop4是其随机突变的区域，β桶的反相末端由短的环封闭。侧链充满了桶的下层部分，形成蛋白质的疏水核心。最近，设计Lipocalin支架作为非天然配体用于蛋白质特异性的研究。通过设计Iipocalin的支架可模拟抗体与小分子结合,这些设计的Iipocalin突变体称为Anticalin，具有配体特异性。据此我们可采用随机突变抗体库技术制备具有抗体功能的特异识别结合分子，类似于抗体与抗原之间的关系。核糖体展示技术(ribosome display, RD)是一种体外展示技术,基因型(DNA序列)和表型(蛋白质)可以联系起来，即将可扩增的基因组信息DNA或RNA与可选择的突变体蛋白质联系在一起。RD技术中mRNA缺乏终止密码子并经过适当修饰，在体外翻译过程中核糖体会停留在mRNA的3'末端，形成十分稳定的“mRNA-核糖体-蛋白质”三元复合物，这种三元复合体形式将蛋白质和mRNA信息连接到一起，应用RD可进行特殊功能的肽和蛋白质筛选。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种潜在的检测用氨苄青霉素特异结合物。
本发明的第二个目的提供一种氨苄青霉素特异结合物的制备方法。本发明的技术方案概述如下:本发明提供的抗氨节青霉素特异结合物是从核糖体展示anticalin模拟抗体库中筛选获得的并进行了可溶性功能表达。本发明提供的抗氨苄青霉素特异结合物的制备方法为:1.核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein, bbp)作为突变库的模板,根据bbp序列及结构，设计随机突变位点，，随机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T ;K为G和Τ)，Anticalin抗体库构建由PCR完成，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Anticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库,该库转录后的RNA分子包括一个5’_loop和3’_loop莖环结构,一个核糖体结合位点，突变的bbp库，C末端间隔序列等,全长约950bp。其中突变库的模板可以是其他Iipocalin分子,优选bbp2.氨苄青霉素特异结合物的筛选将构建的核糖体展示特异结合物文库进行体外转录翻译后，用Amp-BSA和Amp-PLL(多聚赖氨酸，polylysine, PLL)作为抗原固相交替筛选氨苄青霉素的特异结合物，通过改变Mg2+浓度将筛选得到的特异结合物-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库。然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，经过七轮核糖体展示筛选后，文库中抗原阳性的抗体得以富集。可以采用氨苄青霉素-BSA进行筛选，还可以采用氨苄青霉素-PLL进行筛选，优选交叉筛选。3.氨苄青霉素特异结合物的可溶性功能表达将七轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子中有5株序列相同，将该基因与pTIG-TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中。4.氨苄青霉素特异结合物的纯化与鉴定利用金属螯合亲和层析柱对表达的特异结合物进行了纯化，使目的条带得到了明显的浓缩和分离，竞争ELISA分析检测特异结合物的竞争结合活性，并计算其检测限与检测范围。本发明还可以提供一种测定环境和食品中氨苄青霉素残留的检测试剂盒中的最关键检测试剂——特异结合物，尽管amp残留严重威胁着人体健康，但它在畜牧业上的应用能带来较高的经济价值，这使得在社会上仍有非法滥用现象。本发明制备的氨苄青霉素特异结合物可以部分取代测定食品和环境样品中氨苄青霉素残留测定所需的特异抗体。本发明所制备的抗氨苄青霉素特异结合物的优势在于:(I)利用amp-BSA和氨苄青霉素-PLL作为抗原固相交替筛选，可以克服BSA 造成的干扰，从而获得amp高特异性结合物；(2)所获得的特异结合物序列清楚，便于基因工程操作，易于在大肠杆菌中大量功能表达。
图1核糖体展示anticalin模拟抗体库框架示意图.
图2重叠引物延伸PCR构建核糖体展示anticalin模拟抗体库的过程示意3核糖体展示anticalin库琼脂糖凝胶电泳图,M为DNA marker, I为核糖体展不 anticalin 库 DNA图4antical in-amp 诱导表达产物的 SDS-PAGE 图O为空质粒对照，1、2、3为诱导后的全菌产物，4为诱导后破碎的上清，M为蛋白Marker，自上而下分子量依次为(单位 kD):170，130，95，72，56，43，34，26，17.
图5直接ELISA分析anticalin-amp的结合活性.
图6间接竞争ELISA分析anticalin-amp的竞争结合活性，线性回归方程I =37.2771ogC+120.39，R2 = 0.9847，线性范围为 0.004 0.9 μ g/mL, IC50 = 0.056 μ g/mL,IC20 = 0.007 μ g/mL。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂与材料，如无特殊说明，均可从常规试剂公司购买得到。实施例1核糖体展示anticalin模拟抗体的构建一.引物合成根据bbp序列及构建Anticalin抗体库需要改变的突变位点来设计合成引物，随机核酸编码区设计成NNK (N为G、C、A、T ;K为G和T)，同时设计与核糖体展示元件相连的引物，主要引物如下表所示。表I寡核苷酸引物
权利要求
1.一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法，主要由以下步骤组成: (1)核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建 选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein, bbp)作为突变库的模板,根据bbp序列及结构，设计随机突变位点，，随机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T ;K为G和Τ)，Acticalin抗体库构建由PCR完成，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Acticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、莖环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库转录后的RNA分子包括一个5’ -loop和3’ -loop莖环结构,一个核糖体结合位点，突变的bbp库，C末端间隔序列等,全长约950bp ； (2)氨苄青霉素特异结合物的筛选 将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用Amp-BSA和Amp-PLL (多聚赖氨酸，polylysine, PLL)作为抗原固相交替筛选氨苄青霉素的特异结合物，通过改变Mg2+浓度将筛选得到的特异结合物-核糖体-mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库；然后重复体外转录-体外翻译-亲和筛选-RT-PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟抗体DNA文库；经过七轮核糖体展示筛选后，抗体文库中抗原阳性的抗体得以富集； (3)antical in-amp的可溶性功能表达 将七轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子中有5株序列相同，将该基因与pTIG-TRX连 接成表达载体，在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达，经SDS-PAGE和WesternBlot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中； (4)ant ical in-amp的纯化与鉴定 利用Ant1-His tag亲和层析柱对表达的anticalin_amp进行了纯化,使目的条带得到了明显的浓缩和分离，直接ELISA分析其结合活性，间接竞争ELISA分析其竞争结合活性。
2.权利要求1所述随机突变库的模板可以是其他Iipocalin分子,优选bbp。
3.权利要求1所述筛选方法中的包被原可以选用氨苄青霉素-BSA，还可以选用氨苄青霉素-PLL进行筛选，优选交叉筛选。
全文摘要
本发明涉及氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其应用，属于生物技术领域，该特异结合物是由核糖体展示anticalin库中筛选出来的并进行了可溶性表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选氨苄青霉素特异结合物的方法。本发明筛选出的氨苄青霉素特异结合物可以应用于青霉素非法添加及滥用检测与研制快速检测青霉素残留的免疫速测试剂盒的用途，为以后该物质的检测与研究奠定了基础。
文档编号C40B50/06GK103172694SQ20111044061
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者宁保安, 白家磊, 彭媛, 刘建青, 孙亚楠, 柳明, 孙思明, 高志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所