专利名称：利用人类白血球抗原(hla)筛检预测药物不良反应的方法
利用人类白血球抗原(HLA)筛检预测药物不良反应的方法相关申请的交叉引用本申请主张于2010年4月12日递交的美国临时申请No. 61/323，067的优先权。在此通过整体引用该在先申请将其内容结合到本申请中。
背景技术：
不良药物反应(ADR)仍为临床上及制药工业的主要问题。在许多ADR类型中，以史蒂生-琼森症候群(Stevens-Johnson syndrome, SJS)、中毒性表皮坏死溶解(TEN)及过敏症候群(HSS)最严重且危及生命，其中，SJS及TEN有10-50%的死亡率。参看Roujeau等人，New Engl. J. Med. 333:1600-1607(1995)。尽管 SJS/TEN/HSS 的发病率低，但这些病状可能会造成个死亡或导致严重残疾。对于制药工业而言，发生严重药物过敏是非常不利的；目前有部分的新药因为会造成严重药物不良反应，而招致药品退市的命运。参看画· fda.gov/safety/recalls/default, htm。已发现某些I型人类白血球抗原(HLA)对偶基因(例如HLA-A及HLA-B对偶基因)及某些II型HLA对偶基因(例如HLA-DR对偶基因)与ADR有关。参看Hung等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102:4134-4139(2005) ;Daly 等人，Nat. Genet. 41:816-819 (2009)；Hautekeete, Gastroenterology 117 (5) : 1181-6 (1999) ^Dettling M, PharmacogenomicsJ. 7 (5) : 325-32 (2007)。所有这些ADR-HLA对偶基因的关联性，是在测定罹患核准上市药物诱发ADR的患者后被发现。目前，尚没有可用于预测开发中的候选药物是否会在人类中产生这些危及生命的病状(诸如SJS/TEN/HSS)的方法。因为新药物开发可能平均耗费10亿元及10年时间，所以开发适用于在药物开发早期阶段预测候选药物的安全性概况的筛选方法将具有重大价值。
发明内容
本发明涉及自HLA库中鉴别出会与化合物结合的HLA复合物(若存在)的方法。此方法可依用于预测化合物是否将诱发不良药物反应，且若诱发不良药物反应，在哪一人类群体中诱发。本发明方法包括至少4个步骤⑴提供HLA库(例如I型或II型HLA库)，其包括位于支撑构件上的多个地址处的多种HLA复合物(例如可溶性HLA复合物)，各HLA复合物指定于一独特地址，( )使化合物与HLA复合物接触，(iii)判定该化合物是否会与库中的HLA复合物结合，且，若结合，(iv)则基于HLA复合物的地址鉴别与化合物结合的HLA复合物。本文所用的术语“独特地址〃是指支撑构件上一种且仅一种类型的HLA复合物所位于的点。在一个实例中，HLA库为以微芯片为基础的库，其包括连接于支撑构件的多种HLA复合物。在此情形中，判定步骤可通过表面等离子共振(SPR)来执行。在另一实例中，HLA库为以细胞为基础的库，其包括各自表达特定HLA复合物的多个细胞株。各细胞株可通过表达HLA复合物的亲本细胞来制备，该亲本细胞优选地缺乏至少一种类型的HLA (例如I型HLA)。在此情形下，判定步骤可通过收集自各地址的HLA复合物，且通过质谱法判定HLA复
4合物是否与化合物结合来执行。或者，化合物可经同位素标记且通过检验各地址处的放射性来执行判定步骤。以下说明书中阐述本发明一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点将自以下附图及实施方式、以及随附权利要求书中显而易知。
图I为说明获得能够与HLA-Β-β 2微球蛋白复合物结合的肽的方法的流程图，其中该复合物是由稳定表达可溶性HLA-B分子的ClR细胞中产生。图2为说明表面等离子共振检定的流程图。图3为显示在37°C过夜下未脉冲自体性B-LCL细胞(敞开条)或以25 μ g/ml CBZ,0XC、GAB或媒剂对照脉冲的自体性B-LCL细胞(封闭框)的特异性溶解图表。分析三名患者的资料以获得平均值土SD。* p<0. 05 (未脉冲B-LCL细胞相对于经脉冲B-LCL细胞)。** p<0. 001 (药物处理组相对于媒剂处理组)。图4显示在固定(封闭条)及未固定(敞开条)B-LCL存在下自体性T细胞增殖的图表。通过习知[3H]胸苷掺入检定测定T细胞增殖。* :p〈0.05(药物处理组相对于媒剂处理组)。图5为显示各种浓度下的CBZ及其类似物(62. 5至1000 μ Μ)与涂布于CM5芯片上的可溶性HLA-B*1502结合的图表。通过标准DMSO溶剂校正曲线使用TlOO评估软件自4至7个独立实验计算相对反应(R. U.)。图6为显示CBZ及其类似物与各种HLA-B分子结合的图表。图表中显示的数据表示4至11个独立实验的平均值土平均值的标准误差(SEM)。
具体实施例方式本文描述使用HLA库筛选会与化合物(例如小分子药物或药物候选物)特异性相互作用的HLA复合物(若存在)的方法。此方法可用于评估化合物诱发不良药物反应的机率，并可用于鉴别会对测试化合物产生药物过敏的高风险人类群体(亦即，带有此方法中鉴别出的HLA复合物的人类群体)。因此，此在新药物开发中尤其重要，因为其帮助预测药物候选物是否可能引起不良药物反应，且若引起不良药物反应，会在哪一患者群体中引起。本发明方法中使用的HLA库可为I型库，其包括一个或多个HLA复合物子群(例如HLA B库)。HLA-B对偶基因为最具多形性的基因之一，其具有超过800个变异体。参看Marsh, Marsh, Hum. Immunol. 71(4) :432_6;2010。必要时，HLA-B 库可包括所有已知的 800种以上不同HLA-B复合物。HLA库亦可为II型库，其包括一个或多个II型HLA复合物子群(例如HLA-DR库)。或者，HLA库可含有I型及II型HLA复合物两者。必要时，任何上述库均可扩展以包括新HLA复合物。I型及II型HLA对偶基因是本领域公知的。举例而言，这些对偶基因可自GenBank 或由 HUGO 基因命名委员会(HUGO Gene Nomenclature Committee)、EMBL 茵格斯顿分部(EMBL Outstation-Hinxton)、欧洲生物信息研究所(European BioinformaticsInstitute)、英国茵格斯顿剑桥 Wellcome Trust 基因体科学园 CBlO ISD (Wellcome TrustGenome Campus Hinxton Cambridge CBlO 1SD, UK)(参看http://www. genenames. org/)提供的数据库撷取。本发明方法可使用以细胞为基础或以微芯片为基础的HLA库执行。以细胞为基础的HLA库以细胞为基础的HLA库含有多个细胞株，其各自产生独特的HLA复合物。各细胞株可经由已知的重组技术，将亲本细胞(优选为哺乳动物细胞)进行遗传修饰以表达(a)I型HLAa链及视情况选用的β 2-微球蛋白(若亲本细胞不表达内源性β 2-微球蛋白)，或(b)II型HLAa链及II型HLAii链来制备。用于构建库的亲本细胞优选缺乏至少一种类型的HLA对偶基因，例如I型HLA、II型HLA或其子群。此种细胞株包括(但不限于)ATCCCRL-1933 (ClR)、ATCC CRL-2309 (KerTr)、ATCC CRL-1992 (T2)、ATCC CRL-2134 (LS513)、ATCC CRL-2158(LS1034)、ATCC CRL-2159 (LS411N)、ATCC CRL-2547 (Pane 10. 05)、ATCCCRL-255l(Panc 08. 13)、ATCC CRL-2553(Pane 02. 03)、ATCC CRL-2549(Pane 03. 27)、ATCCCRL-2554(Pane 02.13)、ATCC CRL-2555(Panc04. 03)及 ATCC CRL-2557(Pane 05.04)。在此清单中，前两个细胞株缺乏I型HLA而其余细胞株缺乏II型HLA。可经由例行程序来选择可稳定表达所欲HLA分子的经转染细胞。可选择产生高含量I型HLA复合物(由I型HLA α链及β 2_微球蛋白构成)或II型复合物(由II型HLAa链及II型HLAii链构成)的稳定细胞株作为以细胞为基础的HLA库的成员。在一个实例中，所选细胞株表达全长HLA分子。在另一实例中，其表达HLA分子的片段，包括其胞外域。该种细胞株产生可溶性HLA复合物。根据上文所述的程序，可构建表达多种HLA复合物的细胞株，亦即每种细胞株可产生一种类型HLA复合物。多种HLA复合物可包括I型HLA(例如HLA-A、HLA-B, HLA-C,HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K, HLA-L 或其组合)、II 型 HLA(例如 HLA-DP、HLA-DQ, HLA-DR、HLA-DM、HLA-DO或其组合)。这些稳定细胞株形成以细胞为基础的HLA库。各稳定细胞株可安置于支撑构件的孔(亦即独特地址)中。为了执行本文所述的筛选法，将各细胞株与测试化合物一起培养一适合时段。接着洗涤细胞以移除该化合物的游离分子，接着检验并判定细胞所表达的HLA复合物是否与化合物结合。参看图I。在一个实例中，化合物经放射性同位素标记，且基于各孔相对于空白对照的放射性程度判定化合物与HLA复合物间的结合。若孔中的放射性程度大于空白对照，则表示彼孔中细胞产生的HLA复合物能够与化合物结合。当使用产生可溶性HLA复合物的细胞株时，可以下示方式判定其与测试化合物的结合。在细胞以测试化合物处理之后，收集各孔中的上清液且使用含有HLA特异性试剂(例如能够结合于所有类型的I型或II型HLA的抗体)的亲和力管柱纯化可溶性HLA复合物。含有经纯化HLA复合物的样品在适合温度(例如70°C )下加热10分钟，以解离化合物(可连接于肽)与HLA复合物之间的结合。例如使用离心过滤器(3-1^^截断,4111；[(3011Ultra-4, Millipore)收集含有低分子量组分(例如<3_kDa)的部分,且进行液相层析联合质谱分析法以判定其是否含有测试化合物。已知抗原呈递细胞(APC)对某些药物(例如阿巴卡韦(abacavir)及青霉素(penicillin))的呈递为加工依赖性(processing-dependent)的。亦即，在进入细胞之后，这些化合物共价结合于载体蛋白质，所述蛋白质接着经加工且由APC细胞呈递。参看Schnyder 等人，J. Clin. Invest. 100:136—141 (1997)及 Naisbitt 等人，J. Allergy Clin.
6Immunol. 111:1393-1403(2003)。以细胞为基础的I型HLA库尤其适用于筛选对HLA复合物具特异性的经由加工依赖性路径而由APC呈递的化合物。以芯片为某础的HLA库以芯片为基础的HLA库可经由常规的方法将各种HLA复合物(较佳含有HLA分子的胞外域)各自固定于微芯片的独特点上来制备。参看例如Nature Reviews DrugDiscovery. 1:515-528(2002)。各种HLA复合物可自上文所述的稳定细胞株获得。为了筛选能够与测试化合物结合的HLA复合物，可在允许化合物与其同源(cognate)HLA复合物结合的条件下，将连接于微芯片的各种HLA复合物与化合物一起培育适合时段。接着洗涤芯片以移除未结合的化合物分子，接着进行SPR量测以鉴别与化合物结合的HLA复合物。在发现HLA复合物与测试化合物结合之后，可基于其在芯片上的地址确定其身分。SPR为高产量、无标记相互作用分析系统，且用于诸如药物研发、抗体表征、蛋白质组研究、免疫原性、生物治疗剂开发及制造、及许多生命科学研究应用的领域。表面等离子共振(SPR)检测紧邻传感器芯片的表面层的折射率的变化。共振角的此变化可以共振信号(与质量变化成比例)相对于时间的曲线图形式非侵入性实时监测。参见图2。使用以芯片为基础的HLA库可鉴别对经由加工独立性路径由APC呈递(亦即直接结合于HLA复合物)的化合物具特异性的HLA复合物(参看Wu等人，J. Allergy Clin.Tmmunol.118:233-241;2006 及 Marsh, Hum. Tmmunol. 71(4):432-6;2010)。若经本发明方法鉴别，无HLA复合物与测试化合物结合的现象，则表明此化合物诱发ADR的机率较低。另一方面，若此方法中鉴别出测试化合物与HLA复合物的结合，则表明测试化合物诱发ADR的机率较高，且在表达该HLA复合物的人类中尤其如此。此项技术中已知某些HLA对偶基因在特定人类种族中出现的频率比其它种族高。参看WWW. allelefrequencies. net。基于此知识,本发明方法获得的结果可用于预测哪一种族将对特定药物或药物候选物敏感。这将关于临床试验中患者的选择及销售决策方面引导药物开发。下表I列出高加索人(Caucasians)、亚洲人(Asians)及非裔美国人(AfricanAmericans)中的主要HLA-B对偶基因。表I.高加索人、亚洲人及非裔美国人中的主要HLA-B对偶基因
权利要求
1.一种鉴别会与化合物结合的HLA复合物的方法，其包括提供HLA库，其包括位于支撑构件上的多个地址处的多种HLA复合物，所述HLA复合物各自指定于一独特地址；使化合物与所述HLA复合物接触；判定该化合物是否与所述HLA复合物中的之一结合；及当该化合物与一个HLA复合物结合时，基于该一个HLA复合物的地址鉴别与该化合物结合的该一个HLA复合物。
2.根据权利要求I的方法，其中所述HLA复合物为I型HLA复合物。
3.根据权利要求2的方法，其中所述I型HLA复合物为HLA-B复合物。
4.根据权利要求I的方法，其中所述HLA复合物为II型HLA复合物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述II型HLA复合物为HLA-DR复合物。
6.根据权利要求I的方法，其中该HLA-B库为以微芯片为基础的库，其中该多种HLA复合物连接于该支撑构件。
7.根据权利要求6的方法，其中所述HLA复合物为其天然存在的对应物的胞外域。
8.根据权利要求7的方法，其中该判定步骤系通过表面等离子共振来执行。
9.根据权利要求I的方法，其中该HLA库为以细胞为基础的库，该库包括多个表达该多种HLA复合物的细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中所述HLA复合物为其天然存在的对应物的胞外域。
11.根据权利要求9的方法，其中该多个细胞各自通过在缺乏I型HLA的亲本细胞中表达I型HLA复合物来制备。
12.根据权利要求9的方法，其中该多个细胞各自通过在缺乏II型HLA的亲本细胞中表达II型HLA复合物来制备。
13.根据权利要求9的方法，其中该判定步骤通过自各地址收集该HLA复合物且通过质谱法判定该HLA复合物是否结合于该化合物来执行。
14.根据权利要求9的方法，其中该化合物具放射性且该判定步骤通过检验各地址处的放射性来执行。
15.—种评估化合物于施用该化合物的个体中诱发不良药物反应的风险的方法，其包括提供HLA库，其包括位于支撑构件上的多个地址处的多种HLA复合物，所述HLA复合物各自指定于一独特地址；使化合物与所述HLA复合物接触；及判定该化合物是否与所述HLA复合物之一结合；其中当该化合物与所述HLA复合物之一结合时，表示该化合物会于施用该化合物的个体中诱发不良药物反应的风险。
16.根据权利要求15的方法，当该化合物与该一个HLA复合物结合时，其进一步包括基于该一个HLA复合物的地址鉴别与该化合物结合的该一个HLA复合物。
17.根据权利要求15的方法，其中所述HLA复合物为I型HLA复合物。
18.根据权利要求17的方法，其中所述I型HLA复合物为HLA-B复合物。
19.根据权利要求15的方法，其中所述HLA复合物为II型HLA复合物。
20.根据权利要求19的方法，其中所述II型HLA复合物为HLA-DR复合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于自HLA库鉴别出会与化合物特异性结合的HLA复合物的方法。此方法可用于评估化合物是否可能诱发不良药物反应，且若诱发不良药物反应，在哪一人类群体中诱发。
文档编号C40B40/10GK102918396SQ201180018181
公开日2013年2月6日 申请日期2011年4月11日 优先权日2010年4月12日
发明者陈垣崇, 洪舜郁, 魏淳郁 申请人:中央研究院