新的卵巢癌生物标志物和靶的制作方法

专利名称：新的卵巢癌生物标志物和靶的制作方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及改善的对一些癌症类型进行治疗、诊断、预后和预测对治疗的响应的方法，及用于筛选和开发新颖靶、生物标志物和治疗剂以供治疗一些类型的癌症的方法。本发明的实施方案尤其应用于对卵巢的透明细胞癌，子宫内膜样癌，和子宫癌进行治疗、诊断、预后和预测对治疗的响应的方法中，并涉及筛选和开发用于治疗卵巢的透明细胞癌，子宫内膜样癌和子宫癌的新颖治疗剂的方法。
背景技术：
在北美，卵巢癌是由于妇科恶性肿瘤导致的死亡的主要原因，并且是加拿大妇女中第五大癌症死亡原因。卵巢癌可基于其肿瘤细胞类型分为不同亚型。卵巢的透明细胞癌(clear cell carcinomas, CCC)是一种卵巢癌亚型,并占所有癌性卵巢肿瘤的大约12%。尽管其固有地耐受传统的钼和紫杉烷类治疗，这些肿瘤仍接受类似于其它卵巢癌的治疗。因此,患有CCC的患者接受无效、有毒且昂贵的治疗,而且目前并无对于该疾病有效的任何其它抗癌剂。因此，由于传统化学疗法的效果有限，急需对卵巢癌的CCC亚型具特异性的更有效的治疗。上皮卵巢癌上皮卵巢癌是在加拿大癌症死亡的第五大主要原因和第二常见的妇科恶性肿瘤。上皮卵巢癌具有数种亚型。晚期重症癌(high grade serous cancer)最为常见,并占所有病例的大约70%。CCC是第二常见的亚型(12%的病例)2和卵巢癌相关死亡的第二大主要原因。尽管晚期重症癌是Cancer GenomeAtlas Project的主题,但CCC相对而言研究较少。透明细胞癌的临床特征、病理学特征和分子特征尽管显然不同卵巢癌亚型基本上为不同疾病3，4，目前的实践是将其均用钼/紫杉烷化学疗法进行治疗。然而，CCC对于该治疗5_7响应极其不良，其响应率为15%，而对于晚期重症癌为80%4。CCC具有低有丝分裂速率4’8，在遗传上稳定，是二倍体或四倍体，并发育自良好确立的前体病变。它们不显示与晚期重症癌相关的复杂的核型或染色体不稳定性8’9，这可能导致其化学抗性。CCC常常在早期诊断出，其中80%的病理呈现I或II期癌1(U1，然而对于Ι/II期CCC的存活率显著低于患有其它卵巢癌亚型、呈现Ι/II期病变的患者7’12。目前对于CCC并无有效的抗癌剂。CCC基于组织病理学上发现其为主要包含透明细胞和鞋钉样细胞(hobnail cell)的肿瘤而定义13。尽管CCC表达干细胞核因子I β，它们很少表达通常与晚期重症癌或其它卵巢癌相关的生物标志物4，且明显的CCC免疫表型可在诊断上有困难的病理中用作辅助14O CCC中最通常突变的基因是PIK3CA(存在于14%至50%的病例)15_19。与之相对，BRCAl，BRCA2，和TP53通常见于晚期重症癌但通常不存在于CCC19’2°。尽管在CCC和具有子宫内膜异位的低级子宫内膜样癌之间由某种联系21，该转化的机理对于CCC尚属未知。此外，CCC可来源于腺纤维瘤22'23。CCC是攻击性的癌，用目前的化学疗法无法治疗，对其知之甚少，并仍然研究不足。此外，它们在基因组上是稳定的8’9。新一序(Next generation sequencing)新一代测序技术基于大量地平行进行单分子测序以合算地产生数以百万计的短序列读取结果。该技术可以以单碱基分辨率彻底探查基因组或转录组寻求单核苷酸差异、剪接变体、基因组重排、拷贝数变化、倒位、以及插入和缺失24。在配对末端测序(paired-end sequencing)的情况下,新一代测序技术生成数以百万计的随机片段化的短序列读取，其位于更长的未经测序的区的侧翼。数据使用四色DNA “通过合成进行的测序(sequencing-by-synthesis) ”技术然后进行突光检测来生成。在完成第一遍读取之后，原位重新生成模板以使得能够从片段的另一端进行第二遍读取，产生末端序列配对。可以使用该技术进行全基因组分析，然而这比RNA-Seq(全转录组分析)成本要高得多，后者仅对从总mRNA生成的cDNA进行测序。将所得的配对末端的读取与参照序列(例如NCBI build36.1，hgl8)比对，这对于每次读取产生相关数据，如转录组内的位置，读取的品质，错配的数量，和配对末端的标志(flag)。单核苷酸变体(SNV)基于参照基因组和比对匹配的读取之间的偏差进行预测。融合转录物和其它重排可通过鉴定所有不与人基因组成对严格配对的所有配对对来识别。SffI/SNF 复合物染色体DNA缠绕着称作组蛋白的蛋白质以形成复杂的结构，称为染色质。染色质的基础单元是核小体，其包含围绕包裹八个组蛋白的DNA。核小体通过接头DNA相连接，类似线上的珠。染色质的进一步卷曲或凝聚构成了更高级结构，其称作异染色质。组织成为异染色质的DNA对于转录机器而言无法接近。需要进行染色质重构，无论是通过组蛋白的共价修饰还是通过核小体的动态化(mobilization),才能使得DNA可进行转录起始。SWI/SNF蛋白复合物使用ATP水解以使得调节对转录机器的可接近性的核小体动态化。SWI/SNF蛋白复合物通常与转录激活或阻抑以及启动子处的功能相关。该复合物存在于所有真核生物，并对于许多细胞过程包括发育、分化、增殖、DNA修复和肿瘤抑制是必需的26。该复合物包含两种ATP酶，BRM (Brahma)或BRGl (Brahma-相关基因I)之一 27’28，以及保守的核心亚基和称为BAF(BRM或BRGl相关因子)的可变的辅助蛋白(图1)。认为在不同复合物内蛋白质的特定组合赋予对基因调节的特异性。含BRGl的SWI/SNF复合物含有BAF250或BAF180之一，而BRM复合物仅含有BAF250。存在两种BAF250蛋白，其分别由平行进化同源基因编码。BAF250a(亦称作p270)由ARIDlA基因编码，而BAF250b由ARIDlB基因编码。这些蛋白在含BRGl或BRM的SWI/SNF复合物内是彼此互斥的29。共免疫沉淀研究表明BAF250a和BAF250b通过其C端域与BRGl和BRM相互作用3°，且显示BAF250a和BRGl之间的相互作用对于MMTV (小鼠乳腺肿瘤病毒)启动子的反式激活(transactivation)是必需的31。该类固醇激素应答启动子通常用作研究来自SWI/SNF介导的染色质重构的转录激活的模型系统的一部分。具体而言，已显示BAF250a刺激糖皮质激素受体介导的反式激活，这需要BAF250a C端的存在，其可与糖皮质激素受体在体外直接相互作用32。在肿瘤学领域对于新的治疗模态仍存在未实现的需求，所述模态特异性靶向驱动CCC、子宫内膜样癌(EC)和子宫癌的疾病发生的分子缺陷。对于CCC、EC和子宫癌的新颖预后、诊断和预测(对治疗的响应)的标志物仍有需求。对于供治疗CCC、EC和子宫癌的新颖治疗靶，用于鉴定此类新颖治疗靶的方法，和用于治疗这些癌症的治疗剂仍有需求。

发明内容
下述实施方案及其各方面的描述和说明涉及意图为例示性和说明性，而非范围限制性的系统、工具和方法。在多个实施方案中，减少或消除了一种或多种上述问题，而其它实施方案涉及其它改善。本发明的实施方案提供了用于治疗一些类型的癌症，包括CCC、EC和子宫癌的新颖生物标志物和治疗靶。在编码参与构成SWI/SNF染色质重构蛋白复合物的蛋白质的基因(包括ARID1A)中的突变，或此类蛋白如BAF250a的表达的缺失，可用于衡量子宫内膜异位演进或转化为癌症的可能性，对于患有癌症的患者提供预后，评估是否常规治疗针对癌症是很可能有效，和/或在合成性致死筛选(synthetic lethal screen)中用于鉴定新颖的靶和治疗物以供治疗癌症。ARIDlA或其它编码SWI/SNF复合物中组分的基因中的突变可通过测定从受试者的子宫内膜异位或癌病灶获得的组织样品中此类突变的存在来评估。可用于确认ARIDlA中突变的存在的技术包括对组织样品的Sanger测序或对组织样品的新一代测序，基于PCR的方法(包括基于 AmplificationRefractory Mutation System (ARMS)的 PCR),或TaqMan 测定，或基于杂交的方法(包括荧光原位杂交(FISH))，或任何其它合适的检测技术。作为SWI/SNF复合物组分的蛋白(包括BAF250a)的表达的缺失，可通过从受试者的子宫内膜异位或癌的病灶获得组织的样品，用例如免疫组化测定该蛋白的表达来进行评估。在一些实施方案中，在ARIDlA或其它编码SWI/SNF复合物组分的基因中具有突变的细胞可用于合成性致死筛选以鉴定供治疗CCC、EC和子宫癌的新颖靶。在一些实施方案中，通过此类筛选鉴定出的靶可用于筛选可用于治疗CCC、EC和子宫癌的新颖治疗物。除了上述的例示性方面和实施方案之外，通过参考附图和通过研究下述详细描述，进一步的方面和实施方案会是显而易见的。


例示性实施方案参考附图进行说明。意欲将本文中公开的实施方案和附图视为说明而非限制。图1显示SWI/SNF复合物的蛋白组分的概略性综述，并列出了编码SWI/SNF复合物的组分的十五个基因。图2显示ARIDlA cDNA (从ATG起始至TGA终止)和BAF250a蛋白质的概略性综述。由发明人通过转录组(RNA)测序鉴定出的突变总结于概略图上方。由发明人通过对基因组DNA进行的祀向外显子重测序(targeted exonresequencing)和Sanger测序而鉴定出的突变显示于概略图下方。概略图下方的数字I至6858表示核苷酸(nt)位置，起始于ARIDlA在位置I的ATG起始密码子中的A(基于在Entrez Gene中登录号NM 006015. 4给出的序列)。UTR表示非翻译区。图3总结了通过对CCC的19个标本进行的RNA测序和外显子重测序鉴定出的突变。图4总结了序列分析，肿瘤和种系验证，以及对于呈现ARIDlA中的突变的样品测量的BAF250a表达的结果。列出了每个突变基因序列的序列编号SEQ ID NO。图5总结了通过对CCC的19个标本进行RNA测序鉴定出的在除了 ARIDlA之外的基因中的突变。图6显示CCC23中的BAF250a表达，ARIDlA突变，和杂合特性的丧失，以及相应的
子宫内膜异位前体病变。图7显示在CCC14情况下对BAF250a的Sanger测序、RNA测序和免疫组化染色的结果。图8的免疫荧光显示，通过在HCT116细胞中稳定表达ARIDlA shRNA而敲低了BAF250a表达。图像以63X放大率摄取。图9显示对于CCC和EC的119个样品，在手术时点ARIDlA突变状态和子宫内膜异位的存在的相关性。图10列出了用于通过靶向的外显子重测序来验证ARIDlA序列的引物序列。图11显示对RNA测序鉴定出的ARID1A-ZDHHC18融合物的序列预测。图12显示根据癌类型的发现群和突变验证群中BAF250a的突变状态和相应表达。图13显示三种卵巢癌亚型透明细胞癌(CCC)、子宫内膜样癌(EC)和晚期重症(HGS)癌的肿瘤中的BAF250a表达(其中数值和总数列于括号内)。图14显示CCC23和邻近的非典型子宫内膜异位的试验结果。图15显示对来自标本CCC13和邻近的非典型子宫内膜异位的透明细胞癌分析的结果。图16显示来自CCC13的Sanger测序结果。图17的表显示所研究的组织微阵列中BAF250a表达的免疫组化结果。图18显示多种不同恶性肿瘤中BAF250a表达的免疫染色，包括=(A)DLBCL (弥散性大B-细胞淋巴瘤)，⑶MCL(套细胞淋巴瘤)，(C)滤泡性淋巴瘤，(D) 口腔癌，(E)胃癌，(F)间变性甲状腺癌，(G)肾癌，(H)胰腺癌，(I)GISK胃肠道间质瘤)，(J)乳腺癌，(K)宫颈癌，和(L)性索间质细胞瘤(sexcord-stromal tumour)。BAF250a的丧失在胃癌中证实(E)，如缺乏肿瘤细胞染色和阳性间质染色所示；所有其它小图显示阳性BAF250a染色。图像以20X放大来捕捉。图19显示子宫内膜的晚期恶性肿瘤有BAF250a表达的缺失。(A)晚期子宫内膜样癌，(B)透明细胞癌，(C)晚期重症癌，和(D)癌肉瘤的组织核心。对于所有小图，注意肿瘤细胞中BAF250a免疫染色的丧失，而邻近的非瘤性间质细胞显示阳性BAF250a核染色。所有小图的原始放大倍数为20X。图20显示来自有子宫内膜异位的直肠子宫凹陷(cul-de-sac)的活检，具有子宫内膜类型的腺体和间质。(A)对于H&E染色，存在腺上皮的局部细胞异型(focalcytological atypia)(箭头)，而其它腺上皮细胞并不显示异型(箭)。(B) BAF250a免疫染色显示在非典型子宫内膜异位的腺上皮细胞中表达的缺失(箭头)，而在非异型腺上皮细胞中和在子宫内膜间质细胞中存在表达(箭)。小图(A)和⑶在20X捕捉。小图(C)和(D)分别显示对于非异型腺上皮细胞的H&E和BAF250a IHC的40X放大。小图(E)和(F)分别显示对于非典型子宫内膜异位的H&E和BAF250a IHC的40X放大。图21显示在具有ARIDlA突变的细胞中发现与野生型具有最大差异表达的50个基因。图22显示评估ARIDlA对于细胞生长的作用的实验的流程图。发明详沭在整个下述详述中，列出了具体细节以对本领域技术人员提供更详尽的理解。然而，可能会不显示或不详述公知的要素以避免不必要地使本公开变得含糊。相应地，说明书和附图应以说明性而非限制性的意义来理解。为了进一步明确，对于ARIDlA基因、RNA和蛋白质的数据库标识符如下所述Entrez Gene :8289 ；UniProtKB/Swiss-Prot ARI1A_HUMAN, 014497 ；RefSeq DNA 序列NC_000001. 10 NT_004610. 19 ；对于 ARIDlA 基因的 REFSEQ mRNA(2 个可变的转录物)NM_006015. 4 NM_139135. 2。对于 ARID1A(NM_006015. 4)的野生型序列列于 SEQ ID N0:lo发明人已发现在编码WI/SNF复合物的组分的蛋白质的基因中的突变可用作生物标志物或靶以对一些类型的癌症包括卵巢的透明细胞癌(CCC)、子宫内膜样癌(EC)和子宫癌协助诊断、预后和治疗，以及开发其治疗剂。本发明人已阐明此类突变在子宫内膜癌中相对常见，但在其它类型的癌症中相对不常见。涉及这些突变的癌症的演进的机理似与其它已知的癌症发展机理不同。亦参见Wiegand等，N. Engl. J. Med. 2010，363:1532-1543，及其补充附录，两者均通过提述并入本文。认为卵巢CCC和EC来自子宫内膜异位。在编码对于子宫内膜异位中SWI/SNF的适当功能是重要的蛋白的基因中无义突变、显著的错义突变或基因重排可表明子宫内膜异位的恶性肿瘤演进或转化为这些癌症或其它类型的卵巢癌，对于患有具有此类突变的癌症形式的患者的不良预后，或标准的化疗剂如钼或紫杉烷治疗物不太可能对于治疗具有此类突变的癌症形式有效的可能性。在对于子宫内膜异位中SWI/SNF的适当功能是重要的蛋白的表达的缺失可表明子宫内膜异位的恶性肿瘤演进或转化为这些癌症或其他类型的卵巢癌。在对于子宫内膜异位中SWI/SNF的适当功能是重要的蛋白的表达的缺失可表明对于患有该癌的患者的不良预后，或标准的化疗剂如钼或紫杉烧治疗物不太可能对于治疗该癌有效的可能性。本文中，术语“显著的突变”当提及基因时，指基因的DNA序列中的突变，其产生不能够完全实现该蛋白的通常功能的突变蛋白。术语“显著的突变”当提及蛋白质时意指编码该蛋白的DNA序列中的突变，其产生不能够完全实现该蛋白的通常功能的突变的蛋白，且包括由于遗传密码的简并性而与之等价的所有突变。显著的突变可包括截短突变，无义突变，显著的错义突变，和/或基因重排。本文中，术语“预后不良”意指癌症患者有因癌症所致负面结果(例如发病或死亡)的明显预期。本发明的实施方案提供了与卵巢的CCC，EC，和子宫癌的发展和疾病发生相关的新颖的靶和分子缺陷。这些靶和缺陷与那些表征其他类型的卵巢癌的靶和缺陷不同，并会使得能够开发对于治疗卵巢的CCC，EC，和子宫癌有效的新颖疗法。本发明的实施方案提供了可用于对卵巢的CCC，EC，和子宫癌进行预后的新颖生物标志物。本发明的实施方案提供了使得能够预测子宫内膜异位性病变(子宫内膜异位)的恶性肿瘤演进(或转化)为这些癌症或其他类型的卵巢癌的风险的新颖生物标志物。本发明的实施方案提供了可用于预测患有卵巢的CCC，EC，和子宫癌的患者对治疗(化学疗法、放射、靶向药物疗法等)的响应的新颖生物标志物。在本发明的一个方面，在一个或多个包含于SWI/SNF染色质重构复合物中的基因/蛋白质中的突变为可用作治疗靶，或使得能够开发对于治疗卵巢的CCC，EC，和子宫癌的治疗靶的标志物。在本发明的另一个方面，在一个或多个包含于SWI/SNF染色质重构复合物中的基因/蛋白质中的突变为可用于卵巢的CCC，EC，和子宫癌的预后和用于预测子宫内膜异位性病变(子宫内膜异位)的恶性肿瘤演进(或转化)的风险的新颖的生物标志物。在本发明的另一个方面，在一个或多个包含于SWI/SNF染色质重构复合物中的基因/蛋白质中的突变为可用于预测患有卵巢的CCC，EC，和子宫癌的患者对治疗(化学疗法、放射、靶向药物疗法等)的响应的新颖生物标志物。在本发明的另一个方面，在基因ARIDlA(编码蛋白BAF250a(亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的一个或多个突变，为可用作治疗靶或使得能够开发用于治疗卵巢的CCC，EC，和子宫癌的治疗靶的标志物。在本发明的另一个方面，在基因ARIDlA(编码蛋白BAF250a(亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的一个或多个突变，为可用于卵巢的CCC，EC，和子宫癌的预后和用于预测子宫内膜异位性病变(子宫内膜异位)的恶性肿瘤演进(或转化)的风险的新颖的生物标志物。在本发明的另一个方面，在基因ARIDlA(编码蛋白BAF250a(亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的一个或多个突变，为可用于预测患有卵巢的CCC，EC，和子宫癌的患者对治疗(化学疗法、放射、靶向药物疗法等)的响应的新颖生物标志物。在本发明的一个方面，在基因ARIDlA (编码蛋白BAF250a (亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的SEQ ID N0:2至SEQ IDN0:122 (示于本发明的图4)中的一个或多个突变，为可用作治疗靶或使得能够开发用于治疗卵巢的CCC，EC，和子宫癌的治疗靶的标志物。在本发明的另一个方面，在基因ARIDlA(编码蛋白BAF250a(亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的SEQ ID N0:2至SEQ IDN0:122 (示于本发明的图4)中的一个或多个突变，为可用于卵巢的CCC，EC，和子宫癌的预后和用于预测子宫内膜异位性病变(子宫内膜异位)的恶性肿瘤演进(或转化)的风险的新颖的生物标志物。在本发明的另一个方面，在基因ARIDlA(编码蛋白BAF250a(亦称作p270))，SWI/SNF染色质重构复合物的一个组分中的SEQ ID N0:2至SEQ IDN0:122 (示于本发明的图4)中的一个或多个突变，为可用于预测患有卵巢的CCC，EC，和子宫癌的患者对治疗(化学疗法、放射、靶向药物疗法等)的响应的新颖生物标志物。在本发明的一个方面，在基因SMARCA4(编码蛋白BRG1)，PBRMl (编码蛋白BAF180)，或SMARCC2 (编码蛋白BAF170)，SffI/SNF染色质重构复合物的所有组分中的一个或多个突变(示于本说明书的图5)，为可用作治疗靶或使得能够开发用于治疗卵巢的CCC，EC，和子宫癌的治疗靶的标志物。在本发明的另一个方面，在基因SMARCA4(编码蛋白BRG1)，PBRMl (编码蛋白BAF180)，或SMARCC2 (编码蛋白BAF170)，SffI/SNF染色质重构复合物的所有组分中的一个或多个突变(示于本说明书的图5)，为可用于卵巢的CCC，EC，和子宫癌的预后和用于预测子宫内膜异位性病变(子宫内膜异位)的恶性肿瘤演进(或转化)的风险的新颖的生物标志物。在本发明的另一个方面，在基因SMARCA4(编码蛋白BRG1)，PBRMl (编码蛋白BAF180)，或SMARCC2 (编码蛋白BAF170)，SffI/SNF染色质重构复合物的所有组分中的一个或多个突变(示于本说明书的图5)，为可用于预测患有卵巢的CCC，EC，和子宫癌的患者对治疗(化学疗法、放射、靶向药物疗法等)的响应的新颖生物标志物。在一些实施方案中，在从受试者的前癌性病变获得的组织的样品中的一个或多个编码SWI/SNF复合物的组分的基因中的突变的存在，其破坏相应的蛋白产物的功能或表达，表明该病变恶性肿瘤演进或转化为癌症的风险。在此类基因中突变的存在可通过任何合适的方法确定，如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，荧光原位杂交(FISH)，或其它合适的检测技术。在一些实施方案中，所述一个或多个基因为 ARID1B，ARID2，SMARCA2, SMARCCI, SMARCDI, SMARCD2, SMARCD3,SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B,或 SCMARCB1。在一些实施方案中，在从受试者的前癌性病变获得的组织的样品中的、是SWI/SNF复合物的组分的一种或多种蛋白质的表达的缺乏，表明该病变恶性肿瘤演进或转化为癌症的风险。在组织样品中蛋白质的表达水平可以以任何合适的方法，包括例如免疫组化，来确定。在一些实施方案中，所述蛋白质为BAF250b，BAF200, BRM, BAF155, BAF60a, BAF60b,BAF60c, BAF57, BAF53a, BAF53b 或 BAF47。在一些实施方案中，在从受试者的子宫内膜异位性病变获得的组织的样品中ARID1A，编码蛋白质BAF250a的基因中的突变的存在，其破坏了 BAF250a的功能或表达，表明该子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险。在组织样品中ARIDlA中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，FISH，或其它合适的检测技术来确定。在一些实施方案中，ARIDlA中的突变，其表明子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险，包括列于SEQ IDN0:2至SEQ ID NO: 122的突变(示于图4)。在一些实施方案中，在从受试者的子宫内膜异位性病变获得的组织的样品中BAF250a的表达的缺乏，表明该子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险。在组织样品中BAF250a的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，BAF250a中的突变，其表明子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险，包括列于图4的突变。在一些实施方案中，在从受试者的子宫内膜异位性病变获得的组织的样品中SMARCA4, PBRMl，或SMARCC2中的突变的存在，其分别破坏BRGl，BAF180,或BAF170的功能或表达，表明该子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险。在组织样品中这些基因中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，FISH，或其它合适的检测技术来确定。在一些实施方案中，在从受试者的子宫内膜异位性病变获得的组织的样品中BRGl, BAF180，或BAF170的表达的缺乏，表明该子宫内膜异位性病变的恶性肿瘤演进或转化为癌如CCC，EC或子宫癌的风险。在组织样品中BRG1，BAF180，或BAF170的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，在从受试者的癌性病变获得的组织的样品中的一个或多个编码SWI/SNF复合物的组分的基因中的突变的存在，其破坏相应的蛋白产物的功能或表达，表明该受试者的不良预后。在此类基因中突变的存在可通过任何合适的方法确定，如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，或TaqMan 测定，或基于杂交的方法包括FISH，或其它合适的检测技术。在一些实施方案中，所述一个或多个基因为 ARID1B，ARID2, SMARCA2, SMARCCI, SMARCDI, SMARCD2, SMARCD3,SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B,或 SCMARCB1。在一些实施方案中，在从受试者的癌性病变获得的组织的样品中的、是SWI/SNF复合物的组分的一种或多种蛋白质的表达的缺乏，表明该受试者的不良预后。在组织样品中蛋白质的表达水平可以以任何合适的方法，包括例如免疫组化，来确定。在一些实施方案中，所述蛋白质为 BAF250b，BAF200, BRM, BAF155, BAF60a, BAF60b, BAF60c, BAF57, BAF53a,BAF53b 或 BAF47。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中ARID1A，编码蛋白质BAF250a的基因中的突变的存在，其破坏了 BAF250a的功能或表达，表明该受试者的不良预后。在组织样品中ARIDlA中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，或TaqMan 测定，或基于杂交的方法包括FISH，或其它合适的检测技术来确定。本领域技术人员会知道，可使用多种用于鉴定产物如ARMS-PCR产物的方法或技术以检测在ARIDlA或其它编码SWI/SNF复合物组分的蛋白质的基因中的突变的存在。举例而言，实施方案包括但不限于技术如引物延伸，经典的微阵列，或线性探针。PCR产物终点检测的方法，其包括但不限于荧光，化学发光，色度法技术，或氧化还原电势的测量，亦可用于本文中所述的实施方案以供检测基因突变。在一些实施方案中，ARIDlA中的突变，其表明不良预后，包括SEQ IDN0:2至SEQID NO: 122中的突变，其列于表4。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中BAF250a的表达的缺乏表明不良预后。组织样品中BAF250a的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，BAF250a中的突变，其表明不良预后，包括图4中列出的突变。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中，SMARCA4, PBRMl，或SMARCC2的突变的存在，其分别破坏BRGl，BAF180,或BAF170的功能或表达，表明不良预后。在组织样品中这些基因中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，FISH,或其它合适的检测技术来确定。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中BRG1，BAF180，或BAF170的表达的缺乏表明不良预后。组织样品中BRG1，BAF180，或BAF170的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，在从受试者的癌性病变获得的组织的样品中的一个或多个编码SWI/SNF复合物的组分的基因中的突变的存在，其破坏相应的蛋白产物的功能或表达，表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。在此类基因中突变的存在可通过任何合适的方法，如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序来确定。在一些实施方案中，所述一个或多个基因为ARID1B，ARID2，SMARCA2, SMARCCI,SMARCDI, SMARCD2, SMARCD3, SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B，或 SCMARCB1。在一些实施方案中，在从受试者的癌性病变获得的组织的样品中的、是SWI/SNF复合物的组分的一种或多种蛋白质的表达的缺乏，表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。在组织样品中蛋白质的表达水平可以以任何合适的方法，包括例如免疫组化，来确定。在一些实施方案中，所述蛋白质为BAF250b，BAF200，BRM，BAFl55，BAF60a, BAF60b, BAF60c, BAF57, BAF53a, BAF53b 或 BAF47。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中ARID1A，编码蛋白质BAF250a的基因中的突变的存在，其破坏了 BAF250a的功能或表达，表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。在组织样品中ARIDlA中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，或TaqMan 测定，或基于杂交的方法包括FISH，或其它合适的检测技术来确定。在一些实施方案中，ARIDlA中的突变，其表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低，包括SEQ ID N0:2至SEQ IDN0:122中的突变，其列于表4。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中BAF250a的表达的缺乏表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。组织样品中BAF250a的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，BAF250a中的突变，其表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低，包括图4中列出的突变。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中，SMARCA4, PBRM1，或SMARCC2的突变的存在，其分别破坏BRG1，BAF180，或BAF170的功能或表达，表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。在组织样品中这些基因中的突变的存在可通过任何合适的方法如例如组织样品的Sanger测序或组织样品的新一代测序，基于PCR的方法包括基于ARMS的PCR，或TaqMan 测定，或基于杂交的方法包括FISH，或其它合适的检测技术来确定。在一些实施方案中，在从受试者的CCC，EC或子宫癌获得的组织的样品中BRG1，BAF180，或BAF170的表达的缺乏表明用标准化疗剂如钼和紫杉烷治疗受试者可能成功的可能性较低。组织样品中BRG1，BAF180，或BAF170的表达水平可以以任何合适的方式确定，包括例如免疫组化。在一些实施方案中，BAF250a的表达或功能的丧失是针对来源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤的生物标志物。在一些实施方案中，ARIDIA突变或BAF250a丧失是癌症的可靶向的特征。在一些实施方案中，所述癌症是CCC，EC，或子宫癌。在一些实施方案中，一个或多个编码是SWI/SNF复合物组分的蛋白质的基因中的突变，其破坏SWI/SNF复合物中相 应的蛋白质的功能，可用于筛选以鉴定用于治疗CCC，EC，和/或子宫癌的治疗靶。在一些实施方案中，一个或多个SWI/SNF复合物组分的蛋白质的突变，其破坏SWI/SNF复合物中该蛋白质的功能，可用于筛选以鉴定用于治疗CCC，ECJP /或子宫癌的治疗靶。所述用于鉴定治疗靶的筛选可为合成性致死筛选。可使用任何合适的细胞系，其不表达一种或多种SWI/SNF组分蛋白，以低至无法维持SWI/SNF复合物的适当功能的水平表达一种或多种SWI/SNF组分蛋白，或不允许保持SWI/SNF复合物的适当功能的一种或多种SWI/SNF组分蛋白的突变形式。在一些实施方案中，所述筛选可使用867CL，867CL-ARID1A_AL2007，和867CL-ARID1A-WT进行。在一些实施方案中，所述筛选可使用HCTl 16细胞中ARIDlA的同基因敲除来进行。在一些实施方案中，所述合成性致死筛选可使用Hannon/Elledgelent1-shRNA人文库。在一些实施方案中，所述合成性致死筛选可使用Dharmacon siGenome汇集。在一些实施方案中，至少一种用于合成性致死筛选中的突变是在ARIDlA基因中。在一些实施方案中，所述至少一种ARIDlA基因中的突变是SEQ ID N0:2至SEQID NO: 122中的突变之一。在一些实施方案中，所述至少一种ARIDlA基因中的突变是ARIDlA- A L2007。在一些实施方案中，所述至少一种ARIDlA基因中的突变编码突变形式的BAF250a蛋白。在一些实施方案中，所述突变形式的BAF250a蛋白是图4中列出的突变之
o在一些实施方案中，至少一种用于合成性致死筛选中的突变是在SMARCA4，PBRMl，或SMARCC2基因之一中。在一些实施方案中，所述至少一种在SMARCA4，PBRM1，或SMARCC2基因中的突变是图5中列出的突变之一。在一些实施方案中，所述至少一种突变是在BRGl，BAF180,或BAF170蛋白之一中。在一些实施方案中，所述至少一种BRG1，BAF180，或BAF170蛋白中的突变是图5中列出的突变之一。在一些实施方案中，至少一种用于合成性致死筛选中的突变是在ARID1B，ARID2，SMARCA2, SMARCCI, SMARCDI, SMARCD2, SMARCD3, SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B，或 SCMARCB1 基因之一中。在一些实施方案中，至少一种突变是在BAF250b，BAF200, BRM, BAF155, BAF60a,BAF60b, BAF60c, BAF57, BAF53a, BAF53b，或 BAF47 蛋白之一中。在一些实施方案中，开发治疗剂以抑制一种或多种通过合成性致死筛选鉴定出的靶的活性。在一些实施方案中，此类治疗剂用于治疗癌症如CCC、EC或子宫癌。在一些实施方案中，治疗涉及将治疗有效量的治疗剂施于有需要的受试者。可针对所述一种或多种靶筛选的潜在的治疗剂包括已知的药物，小分子天然化合物，化学文库，和siRNA。在一些实施方案中，用于测定编码构成SWI/SNF复合物一部分的蛋白质的基因，包括ARIDlA中的突变的存在的试剂，或测定构成SWI/SNF复合物一部分的蛋白质，包括BAF250a的表达的试剂，可以以试剂盒的形式提供。本发明的实施方案进一步参照下述实施例说明，其旨在说明而非限制。
实施例实施例1. 0-在卵巢癌中鉴定ARIDlA突变因为CCC是基因组稳定的8’9，预期其会具有限制的突变概貌以及反复出现的突变，其通过少量病例的分析会是明显的24。发明人使用RNA-seq解读了 17个卵巢透明细胞癌的转录组(transcriptomes)。基因融合和小的中间缺失或插入通过最近发表的文献中描述的方法检测25’33’34，而SNV使用SNVmix,—种近来发表的基于Bayesian混合物的算法来检测35。预测绝大多数SNV是罕见的种系变体，而非体细胞突变。因此，发明人使用导致在粒层细胞瘤中鉴定出F0XL2突变的相同方法1以鉴定在CCC中但不在无关癌症类型中反复出现突变的基因。发明人在十七个CCC中的六个中鉴定出ARIDlA基因的突变三例具有无义突变，第四例具有6018-6020delGCT(2007 AL)3碱基对缺失突变，第五例同时具有体细胞错义突变(T5953C(S1985P))和外显子20中的单核苷酸插入(5541insG)，而第六例具有跨越内含子一的基因组缺失，其导致ARIDlA中外显子I的3’区的丧失以及其与邻近基因(ZDHHC18)的融合；这通过荧光原位杂交(FISH)得到验证(图2和3)。所有ARIDlA点突变通过Sanger测序验证，且在所有情况下，当可获得种系DNA时，突变确定为体细胞的。杂合特性的丧失(LOH)在具有6018-6020delGCT突变的CCCOl中检测出。在另一例来源于子宫内膜异位性囊肿的CCC(CCC23)中使用Sanger测序分析ARIDlA基因，因为该例并未包括在RNA-seq实验中。这导致鉴定截短突变(G6139T(E2047*))。该例亦通过一个拷贝的染色体I的丧失呈现L0H。因此，在十八个研究的透明细胞癌的七个中发现了 ARIDlA基因中的体细胞突变。通过比较，未在50个三重阴性的乳腺癌，6个子宫内膜样癌，或6个晚期重症癌的转录组中发现ARIDlA突变(p=0. 00003)。在研究的卵巢的两个粘液癌的一个中发现了截短的ARIDlA突变。对于图2，显示了由发明人鉴定出的突变的位置。BAF250a具有大约100个氨基酸的DNA结合或ARID域(富AT相互作用域)，和多个LXXLL (其中L是亮氨酸而X是任何氨基酸)基序，其潜在地与核激素受体相互作用。在BAF250a蛋白的概略图之上显示了 ARIDlA的20个外显子(编号框)。在BAF250a中，显示了 ARID DNA结合域(“ARID”)，和HICl结合域(“癌I中的超甲基化”)(“HIC1”)。标示了四个LXXLL基序，且三个C端LXXLL基序协助与糖皮质激素受体的相互作用。在概略图之上列出的核苷酸突变(其中相应的氨基酸突变位于括号中)是通过对卵巢CCC和T0V21G细胞系的18个样品的转录组测序(RNA测序)鉴定出的那些。在概略图之下列出的突变是对来自210个卵巢癌样品的基因组DNA使用靶向外显子重测序和Sanger测序鉴定出的那些(如下所述，结果示于图4)。显示了所有在卵巢透明细胞癌、子宫内膜样癌和晚期重症癌的样品中检测出的独特体细胞突变。前述结果提供了强有力的遗传证据证明ARIDlA这种根据功能性研究被视为肿瘤抑制物的基因，常常在CCC中被破坏。实施例2.0-在卵巢癌中突变的其它SWI/SNF基因的鉴定在ARIDlA-突变阴性的CCC中，本发明人在其它SWI/SNF中鉴定出SNV，包括在SMARCA4 (编码BRG1)中的错义突变和在PBRMl (编码BAF180)中的错义突变(图5)。因为ARIDlA或其它SWI/SNF编码基因中的突变见于18个CCC中的9个(50%)，这些事件对于该癌的发展是重要的。与之相对，TP53，BRAF，PIK3CA和PTEN中的突变分别仅见于一个、两个、两个和三个CCC。基于来自之前的公开文献的数据，预测该比例的病例携带这些突变15。对于图1，突出显示了其中检测出突变的SWI/SNF复合物组分。所有15个编码SWI/SNF复合物的蛋白组分的基因示于表左。箭指示BAF250a或BAF250b之一可存在于复合物中。PBAF SffI/SNF复合物(未显示)具有BRGl，并含有BAF200和BAF180但非BAF250a/b。基于发明人的突变数据，由ARIDlA编码的BAF250a涉及CCC，并以橙色显示。发明人发现有突变的其它SWI/SNF基因(SMARCA4，PBRM1，SMARCC2)以下划线在左框中表示，而相应的蛋白质在右侧的图像中以下划线表示(除了 BAF180的情况，其不存在于图示的复合物中)。该复合物的恒定核心组分以蓝色表示。ATP酶以绿色显示。除了ARIDlA 中的变体之外，还在 CCC02 和 CCC03 中检测出 CTNNBl (C110G(S37C)，NM_001904. 3, SEQ ID NO. : 125)体细胞突变，并在来自这些病例的种系DNA和肿瘤DNA中均通过PCR扩增和Sanger测序得到验证。此外，基于RNA测序数据，在T0V2IG细胞系中预测了两个变体，即 PIK3CA(C3139T(H1047Y)，NM_006218. 2，SEQ ID NO. : 123)和KRAS (G37T (G13C), NM_004985. 3, SEQ ID NO. 124)，其通过 PCR 扩增和 Sanger 测序验证。虽然在RNA测序数据中观察到BRAF中的变体，但无一通过在肿瘤DNA中进行的Sanger测序被验证。实施例3. 0在ARIDlA中的突变与BAF250a表达的缺失相关为了阐明ARIDlA突变与表达的缺失相关，本发明人使用了靶向BAF250a蛋白的中心区的小鼠单克隆抗体(Abgent，Inc.)。该抗体对所有正常细胞核强烈染色。在实施例1. 0中通过RNA-seq分析的18个透明细胞癌样品中，八个显示BAF250a表达的缺失。在这八个病例中，五个具有ARIDlA突变(图3)。有趣的是，在其它三个对于免疫组化BAF250a染色为阴性的病例中，通过RNA-seq未检测出ARIDlA突变，表明对于BAF250a表达的缺失可有其它的遗传或外遗传Gpigenetic)机理。两个具有ARIDlA突变的病例表达BAF250a ;其中之一含有外显子20中单个氨基酸的框内缺失(CCC01中的6018-6020delGCT ( A L2007))，而另一个含有在外显子18中构成过早终止密码子的SNV(CCC06中的C4201T(Q1401*))。CCC06中表达的BAF250a可能是截短的蛋白。为了说明BAF250a的丧失在卵巢癌中是亚型特异性现象，发明人对来自其卵巢肿瘤库的300个肿瘤进行了染色。所有非肿瘤细胞核对于BAF250a为强烈阳性，而27个CCC病例中的11个(40%)显示所有肿瘤细胞中BAF250a的完全丧失。与之相比，180个晚期重症癌中的17个(10%)显示BAF250a丧失(p〈0. 0001)。实施例4. O-ARIDlA突变为子宫内膜异位转化或演进的风险提供证据。为了说明ARIDlA突变和BAF250a表达的缺失是否是卵巢致癌作用中的早期事件，发明人研究了来自病例CCC23的肿瘤和邻近的子宫内膜异位，CCC23在外显子20中具有截短突变，并具有L0H，伴以BAF250a表达的完全丧失(图6)。子宫内膜异位的上皮而不是间质，显示BAF250a表达的缺失。FISH分析显示子宫内膜异位在小部分细胞中在ARIDlA基因座处具有L0H。克隆化PCR产物的Sanger测序亦揭示子宫内膜异位性上皮细胞中的突变。这是第一个在子宫内膜异位中描述的癌症特异性突变，并表明ARIDlA可能在子宫内膜异位转化为癌中起作用。图6显示CCC23中的BAF250a表达，ARIDlA突变，和杂合特性的丧失，以及对应的子宫内膜异位性前体病变。小图(A)显示子宫内膜异位性囊肿的子宫内膜衬中细胞核阴性BAF250a免疫染色(左)和来源于子宫内膜的透明细胞癌(右)的高倍放大视图。邻近子宫内膜异位的正常组织对于BAF250a表达是阳性的(箭)。BAF250a免疫染色用1:25稀释的Abgent小鼠单克隆抗体(cat#AT1188a,克隆3H2)进行并在Ventana Discovery XT上运行，用抗小鼠HRP 二抗检测。小图(B)显示子宫内膜异位性病变的壁的切片，其中激光捕获显微解剖的目标区域被突出显示(红色方块)。癌性组织用箭头指示(上部)。经激光捕获显微解剖取出后子宫内膜细胞的分离的条(底部)。小图(C)显示对CCC23肿瘤(上部)的荧光原位杂交(FISH)分析，其表明仅存在单个拷贝的ARIDlA基因(箭)，因此在未突变的等位基因处存在杂合性丧失的情形。红色5’探针(RP11-35M8)长度为158，905bp，在ARIDlA上游大约200kb处杂交。绿色3’探针(RP11-285H13)长度为183，012bp,并在ARIDlA下游大约130kb处杂交。对应于CC23的子宫内膜异位的FISH分析(下部)显示正常细胞(左上部的细胞)和具有ARIDlA基因座处杂合性丧失的细胞(中部和最右部细胞)的混合。标记使用上述多个侧翼于ARIDlA (白色箭)的探针以及一个CEPl (橙色)Vysis着丝粒探针(通过黄色箭表示)。有杂合性丧失的细胞保持两个着丝粒，但仅具有一个拷贝的ARIDlA基因座。小图(D)显示对CCC23进行Sanger测序的结果。突变(G6139T)及其在正常组织中的相应位置分别在肿瘤、正常和子宫内膜异位来源的样品中用箭表示。子宫内膜异位测序用激光显微解剖来进行，然后将PCR扩增的ARIDlA克隆入大肠杆菌。对48个菌落进行了测序，在2个菌落中检测出突变。作为发明人的肿瘤存库(tumor banking)方法的一部分,他们开发了异种移植的肾下胶囊技术以在N0D/SCID小鼠中生成卵巢癌模型，目前为止具有超过90%的移植成功率36。已从五个透明细胞癌构建了可移植的异种移植物，所述透明细胞癌其包括病例V0A867 (CCC14)，其具有截短突变(C1680A/G，Y560X)伴以BAF250a蛋白的完全缺乏(图7)。图7显示了来自病例V0A867(CCC14)的数据。小图(A)显示来自从肿瘤和匹配的正常DNA进行的ARIDlA的Sanger测序的结果。突变(C1680A)的位置用箭表示。肿瘤DNA追踪表明杂合性。小图⑶显示来自V0A867 (CCC14)的RNA-seq的序列标记，表明野生型和突变体等位基因以大约相等的频率表达。突变(C1680A)用箭表示。小图(C)显示V0A867 (CCC14)中BAF250a的免疫组化染色。这些结果显示表达的缺失(左部)。在右部显示具有阳性BAF250a表达的非何杰金淋巴瘤以供比较。BAF250a免疫染色使用1:25稀释的Abgent小鼠单克隆抗体(cat #AT1188a,克隆3H2)进行，并在Ventana Discovery XT上运行，通过抗小鼠HRP 二抗检测。实施例5. O-HCTl 16细胞中BAF250a表达的敲低本发明人还通过在HCTl 16细胞中表达ARIDlA-shRNAmir-GFP有效地敲低了BAF250a的表达(图8)。图8显示的免疫荧光数据阐明了在HCT116细胞中通过稳定表达ARIDlA shRNA敲低BAF250a表达。将靶向人ARIDlA序列的shRNAmir_GFP慢病毒载体(绿色)(Open Biosystems-shRNA, V2LHS-72862)根据生产商的指示包装并转导入人HCTl 16结肠癌细胞系。具有有效GFP表达的良好转导的细胞显示ARIDlA的显著敲低(无BAF250a (红色)表达)，而缺乏GFP表达的、未转导的细胞BAF250a染色为阳性(红色)。
实施例6. O-ARIDlA在CCC中的作用的进一步确认基于对实施例1. 0中18个CCC和上述一个CCC细胞系的全转录组进行测序获得的结果，发明人在其它210个卵巢癌和第二个卵巢CCC细胞系中对ARIDlA进行了测序。在2个CCC中，本发明人对来自显微解剖的邻近非典型子宫内膜异位上皮的DNA进行测序以确定ARIDlA突变是否存在。本发明人通过免疫组化分析在其它455个卵巢癌中测量了BAF250a 表达。实施例6.1-材料和方法实施例6.1.1-患者和样品选择了来自OvCaRe (Ovarian Cancer Research)冷冻肿瘤库的十八个卵巢CCC和一个CCC细胞系(T0V21G)进行全转录组配对末端RNA测序。患者在进行手术之前提供了使用这些肿瘤样品的研究的书面同意书，包括承认通过使用样品进行研究可导致保密的丧失。另外还获得了来自医院机构审查部门、允许使用这些样品以供RNA测序实验的批准。为了衡量ARIDlA突变在CCC和其它卵巢癌亚型中的频率，发明人使用基于Illumina的靶向外显子重测序以探查101个CCC的突变验证群的DNA序列(除了如上所述19个用于RNA seq的病例(“发现群”)之外，还包括33个EC，76个HGS癌和CCC衍生细胞系 ES2。10 个 CCC 来自 Johns HopkinsUniversity (JHU), 29 个来自 Universit6deMontr6al (UdeM),而 42 个来自 Australian Ovarian Cancer Study (AOCS);所有其它癌从OvCaRe冷冻肿瘤库获得)。所有患者同意其肿瘤和种系DNA用于研究，包括基因组研究。从119个CCC (发现群和突变验证群)和33个EC (突变验证群)的群，检查了 86个CCC和所有33个EC以确定在手术时点是否存在子宫内膜异位。这些结果示于图9。DNA和RNA使用标准方法提取。在其中无法获得足够的DNA进行ARIDlA重新测序的情况下，使用全基因组扩增(WGA)以延伸DNA模板，然而使用非WGA处理的DNA确认了所有的突变。实施例6.1. 2-病理学审查所有肿瘤样品在突变分析之前由一位妇科病理学家独立审查。在其中该审查诊断与来源诊断不同的情况下，该样品由作为仲裁人的另一位妇科病理学家进一步审查。两位审查病理学家对基因组研究结果并不知情。实施例6.1.3-配对末端RNA测序和分析(全转录组测序)全转录组测序如前所述进行i’35。双链cDNA从多腺苷酸化的RNA合成，并剪切所得的cDNA。分离了 190-210bp的DNA级分，并对其进行PCR扩增以生成测序文库，遵循Illumina Genome Analyzer 配对末端文库实验方案(Illumina Inc.，Hayward, CA)。在Illumina GAii上对所得的文库进行测序。将从Illumina GAii获得的短读取序列在配对末端模式中使用MAQ 3来作图于参照人类基因组(NBCI build 36.1, hgl8)加上已知的外显子连接2的数据库。使用Bayesian混合物模型SNVmix预测了单核苷酸变体1，35。仅具有>Q20碱基质量(base quality)的碱基视作使错误最小化。将SNV针对dbSNP版本129和公开的基因组进行交叉参照以消除任何之前描述的种系变体、基因融合使用deFuse预测。deFuse通过在配对末端RNA测序数据中搜索携带融合边界的读取结果来预测基因融合。连续读取结果(Spanning read)在读取结果中间位置的未测序区中携带融合边界，而分别读取结果(split read)在一个末端的序列中携带融合边界。deFuse检索的是连续的读取结果，其读取的末端与不同基因对齐(align)。然后将由连续读取结果暗示的大致的融合边界解析为核苷酸水平，是基 于候选的分别读取结果的比对而进行动态编程来实现。实施例6.1. 4-Affymetrix SNP 6. 0阵列的拷贝数分析将Affymetrix SNP 6. 0阵列使用CRMAv237归一化，所用的缺省设置是为了进行等位基因串扰(allelic-crosstalk)校正，探针序列效应归一化(probesequence effectsnormalization),探针水平总结(probe-level summarization)和 PCR 片段长度归一化(PCR fragment length normalization)。log比例然后通过针对参照进行归一化来计算，所述参照使用从AfTymetrix获得的270个HapMap样品的正常数据库生成。区段化(segmentation)使用11-态的隐藏马尔科夫模型(hidden Markov model)进行。该方法同时检测和区分癌基因组中的体细胞DNA和种系DNA的拷贝数变化。所述隐藏马尔科夫模型对log比例强度数据进行区段化，并对于每个所得的区段从五个体细胞状态(纯合缺失，半合缺失，获得，扩增，和高水平扩增)，五个类似种系状态，和中性拷贝数的组来预测分立的拷贝数状态。这些区段的边界作为拷贝数改变事件的结果提供了基因组中候选的断裂点。在所有用Affymetrix SNP 6. 0数据的情况下，仅CCC04在ARIDlA中含有断裂点。该区段(chrl :26898389-27000523)为纯合缺失，其使得基因在5’端附近断裂并截短。研究了来自450个HapMap个体的公开的CNV图谱38以观察是否报道了重叠ARIDlA的任何区，结果一无所获。基于此，预测这是体细胞变化。实施例6.1. 5-ARID1A的基于Illumina的革巴向外显子重测序对在上述《患者和样品》章节中描述的病例的基因组DNA进行基于Illumina的靶向外显子重测序。简言之，将所有ARIDlA外显子PCR扩增，并对单个扩增子进行索引、汇集和测序。单个索引使得能够将来源于单个样品、从相同文库一同测序的读取结果解卷积(deconvolution)。对于所有潜在的截短或错义突变通过Sanger测序进行验证,它们的氨基酸变化Grantham指数大于X，出现在10%突变体等位基因频率截断值以上。从外显子I未获得足够的可用数据；其在所有情况下用四个重叠的扩增子进行Sanger测序。自动引物设计使用Primer339和定制脚本(custom scripting)进行。将引物设计为跨越指定的ARIDlA的外显子(UCSC build hgl8)，其中平均PCR产物大小为2067bp。引物由 Integrated DNA Technologies 以 25nmol 规模用标准脱盐发(IDT Coralville, IA)进行合成，并在PCR中使用对照人基因组DNA进行测试。将无法生成预期大小的产物的引物对重新设计。引物序列在图10中提供。聚合酶循环反应在96孔板中设置，包含0. 5 ii M正向引物；0. 5 ii M反向引物，Ing的gDNA模板或Ing的使用REPL1-』「\[ini/Midi(QIAGEN, Valencia, CA)全基因组扩增的 gDNA，5X Phusion HF Buffer, 0. 2 u M 各dNTPs, 3%DMS0,和 0. 4 单位的 Phusion DNA 聚合酶(NEB, Ipswich, MA, USA)。将反应平板在MJR Peltier Thermocycler (PTC-225型)上循环，循环条件为在98 °C进行30秒的变性步骤，接着进行35个循环，每循环为[98°C进行10秒，69 °C进行15秒，72 °C进行15秒]，和在72°C进行10分钟的最终延伸步骤。PCR反应物通过SybrGreen(LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA)在以 170V 运行 90 分钟的1. 2% 琼脂糖(SeaKem LE,Cambrex, NJ, USA)凝胶中显影以评估PCR是否成功。将反应物就模板汇集(4 iU每孔)并使用Covaris E210超声波96孔声处理平台(75秒，20个工作循环，强度5，循环/破裂200 ；Covaris Inc. Woburn, MA)剪切至 200bp 的平均大小，并对其在 BioMek FX LaboratoryAutomation Workstation (Beckman Coulter, Brea, CA)上使用修饰的配对末端实验方案(Illumina, Hayward, CA)进行基于平板的文库构建。这涉及剪切的扩增子的末端修复和A-加尾，接着连接于Illumina PE接头并进行PCR扩增。在该过程中的每一步，将反应物使用固相可逆固定化顺磁珠(Agencourt AMPure, Beckman Coulter, Brea, CA)在96孔板中在BioMek FX平台上使用定制的内部程序进行纯化。将纯化的接头-连接的扩增子使用Phusion DNA 聚合酶(NEB, Ipswich, MA)在 10 个循环中使用 PE 引物1. 0 (Illumina)和定制的多通路 PCR 弓丨物[5，CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’ ]进行PCR扩增，其中用96个独特的容错六聚物条形码(faulttoleranthexamer barcode)替代“NNNNNN”。将单个扩增子索引并通过平板汇集，并在8%Novex TBEPAGE凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)上将200_400bp大小范围排除接头连接矫作物(adapter ligationartifact)进行纯化。单独索引使得能够将来源于从相同文库一同测序的单个样品的读取解卷积。评估了 DNA品质并使用Agilent DNA 1000系列II测定(Agilent, Santa Clara CA)和 Nanodrop7500 分光光度计(Nanodrop, Wilmington, DE)进行定量，随后稀释至10nM。最终浓度使用Quant-1T dsDNAHS测定试剂盒和Qubit荧光计(Invitrogen, Carlsbad, CA)确认。对于测序，在 Illumina 族工作站(Illumina clusterstation)上使用v4簇试剂和使用v4测序试剂在Illumina GAiix平台上生成的末端配对的75bp读取遵循生产商的指示生成簇。在配对的75bp读取之间，使用下述定制测序引物[5’ -GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCG]进行了第三I碱基对读取以对六聚物条形码进行测序。图像分析、碱基辨别(base-calling)和错误校正使用vl. 60的Illumina’ sGenome分析流水线进行。实施例6.1. 6-对于ARIDlA的基于Illumina的祀向外显子重测序的数据加工将来自ARIDlA靶向外显子重测序实验的序列读取结果用MAQ版本0. 7.1与所述PCR引物靶向的基因组区比对。通过针对靶定的间隔列举所有独特的比对读取结果，来进行评估每个外显子的覆盖。于整个靶向的间隔内计算每个基因组位置的等位基因读数来确定SNV。考虑对所有显示至少10%变体的等位基因比例的位置进行通过Sanger测序的验证。使用Maq indelpe程序使用用于选择实验性随访的10%等位基因比例标准来预测插入和缺失。此外，为了对于每个SNV预测确定置信度的量度，我们对每个如Shah等1所述覆盖的位置使用比对的读取结果应用单尾二项式精确检验以计算预期的分布。将用于多重比较的Benjamin1-Hochberg40校正应用于所得的二项式检验p值以对于每个位置产生q值。实施例6.1. 7-ARIDlA外显子I的Sanger测序对ARIDlA的基于Illumina的祀向外显子重测序并未提供对外显子I的覆盖。为了获得外显子I的序列信息，设计了四个重叠的PCR引物组，向其5’端添加供M13正向和M13反向的引发位点以允许扩增子的直接Sanger测序。对于PCR，在94°C变性I分钟之后，将 DNA 使用 MJ Research Tetrad (Ramsey, MN)扩增 35 个循环(94 °C 进行 30 秒，58-60 °C进行30秒，72°C进行30秒)。最终延伸在72°C进行5分钟。PCR产物使用ExoSAP-汀 (IJSB PrOduets Affymetrix, Inc. , Cleveland, OH)纯化，并使用 ABI BigDye 终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)和 ABI Prism 3130xlGeneticAnalyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行测序。对所有毛细血管不踪进行肉眼检查以确认其存在于肿瘤中，并不存在于种系示踪，或对其使用Mutation Surveyor进行分析。实施例6.1. 8-对预测的突变进行Sanger序列验证基于外显子重测序数据，任何在等位基因处以超过10%的频率出现的截短突变或根本的错义突变(导致氨基酸电荷或极性的变化41)在肿瘤DNA中，并在大部分情况下在种系DNA中，使用Sanger测序进一步验证。将ARIDlA含有推定的突变的区从基因组DNA使用引物进行PCR扩增，所述引物在其5’端添加供M13正向和M13反向的引发位点以允许扩增子的直接Sanger测序。在当患者的匹配的种系DNA来自FFPE材料的情况下,设计短 250nt)的扩增子以验证SNV。除非另行声明，扩增子从基因组DNA从肿瘤和来自同一患者的匹配的种系DNA产生。对于PCR，在94°C变性I分钟之后，DNA使用MJ ResearchTetrad (Ramsey, MN)扩增35个循环(94°C进行30秒，60-65 °C进行30秒，72 °C进行30秒)。最终延伸在72°C进行5分钟。PCR产物使用MinElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN, Valencia CA)纯化，并使用ABI BigDye 终止子 v3.1 循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)和 ABIPrism 3130xlGenetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行测序。对所有毛细血管示踪进行肉眼检查以确认其存在于肿瘤中，并不存在于种系示踪，或对其使用Mutation Surveyor进行分析。对于该分析以及免疫组化的结果总结于图4。 实施例6.1. 9-BAF250a蛋白的免疫组化分析除了来自AOCS的42个CCC和来自JHU的4个样品，对于所有病例进行了 BAF250a免疫组化(IHC)染色。对于肝细胞细胞核因子(HNF)-1P和雌激素受体的额外IHC染色在两个如前所述14与非典型子宫内膜异位相关的病例的整个切片上进行。ER通常在子宫内膜异位中是阳性而在CCC中是阴性，而HNF-1 P通常在子宫内膜异位中是阴性而在CCC中是阳性140对4 U m 厚石腊切片在半自动化 Ventana Discovery XT 装置(VentanaMedicalSystems, Tucson, AZ)上进行免疫组化分析。将ARIDlA和HNF-1 P使用VentanaChromoMap DAB试剂盒进行染色。抗原回收以标准的CCl进行，进行两小时一级温育。将 ARIDlA 小鼠克隆 3H2 (Abgent, San Diego, CA)以 1:25 施用，接着用预稀释的 UltraMap Mouse HRP(Ventana)进行16分钟的二级温育。将HNF-1 0山羊多克隆(Santa CruzBiotechnology, SantaCruz, CA)以1:200稀释施用，接着用未偶联的兔抗山羊二抗以1:500 (JacksonImmunoResearch Labs Inc.，West Grove, PA)进行 32 分钟温育。在此之后，将三抗与预稀释的Ventana UltraMap Rabbit HRP温育16分钟。ER免疫染色是使用Ventana DABMap 试剂盒以标准 CCl 进行。将兔克隆 SPl (ThermoScientif ic, Fremont, CA)以1:25温育60分钟,接着用预稀释的VentanaUniversal Secondary进行32分钟的二级温育。组织学图像使用 ScanScope XT 数字扫描系统(Aperio Technologies Inc. , Vista, CA)获得。突施例6.1. 10-BAF250A的免疫组化分析-其它实验将总共455个来自之前描述的组织微阵列4的其它卵巢癌样品-包括132个卵巢透明细胞癌，125个子宫内膜样癌，和198个晚期重症癌，用于免疫组化验证群，并就BAF250a表达进行分析。所有正常妇科组织对于BAF250a显示温和/或强烈的细胞核免疫反应性。若肿瘤细胞显示明确的细胞核染色，则将肿瘤记为对于BAF250a阳性，若肿瘤细胞核不具有任何免疫反应性，但来自相同样品的内皮和其它非肿瘤细胞显示免疫反应性，则记为对于BAF250a阴性。其中间质中的正常细胞和肿瘤细胞均无免疫反应性的情况视作技术失败的结果。对于肝细胞细胞核因子IP (HNF-1 ^ )和雌激素受体的其它免疫组化染色在两个如前所述14与邻近的非典型子宫内膜异位相关的肿瘤的整个切片上进行。实施例6.1.11-激光捕获显微解剖(LCM)，DNA分离和克隆在两个具有鉴定出的ARIDlA突变的情况下，由妇科病理学家鉴定出非典型(邻接)和远侧子宫内膜异位切片。使用激光捕获显微解剖以分离子宫内膜异位性上皮。将从这些细胞提取的DNA通过就在每种情况下发现的突变进行测序来分析。对于显微解剖，将福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)切片(5 ii M)在Ti ssue- Tek_ Cryo3 低温恒温器(Sakura Finetek，Dublin, 0H)上切为干净的、不带电荷的载玻片。将FFPE切片去石腊并重新水合，用 Arcturus Histofiene Staining Solution (Molecular Devices, Inc. , Sunnyvale, CA)染色,然后在乙醇和二甲苯中脱水。所有试剂用不含核酸酶的水制备，且所有步骤使用不含核酸酶的技术进行。将非典型或远侧子宫内膜异位性细胞从制备的FFPE切片使用VeritaSTMLaSerCapture Microdissection System(Arcturus Bioscience,Inc. ,MountainView, CA)根据生产商的标准实验方案进行显微解剖。将含有捕捉的细胞的LCM帽直接置于15 ii L的裂解缓冲液以及10 ii L的蛋白酶K，并使用QI Aa丨Tip DNA Microkit (QIAGEN, Hi I den, Germany)分离 DNA。DNA 接着在 NanoDrop 分光光度计(NanoDropTechnologies, Wilmington, DE)上定量。进行 PCR,接着使用 QIAquick Gel ExtractionKit (QIAGEN)进行PCR产物的凝胶提取，遵循生产商的指示使用Topo TA Cloning Kit克隆PCR产物。对来自单个克隆的插入物进行PCR扩增和Sanger测序以确定突变频率。实施例6.1. 12-荧光原位杂交(FISH)将来自CCC13和CCC23的组织样品就ARIDlA的缺失使用荧光原位杂交(FISH)进行测定。将六微米厚的切片如前所述42进行预处理。使用对于ARIDlA侧翼的区具特异性的 BAC(RPl1-35M8(chrl:26，609，021-26，767，926)和 RPl1-285H13(chrl:27, 033, 759-27,216,771))和对于 ARIDlA 基因座具特异性的 F 粘粒(fosmid) (G248P86703G10 (chrl: 26,976，949-27，017，636)，G248P89619A2 (chrl:26，954，143-26，991，761)，和 G248P88415D8 (chrl: 26，914，023-26，954，284))进行三色 FISH 测定。BAC 和 F 粘粒从 BritishColumbiaGenome Sciences Centre 获得，并用 Spectrum Red, Spectrum Blue,或 Spectrum Green 使用 Nick Translation Kit (Abbott Molecular Laboratories, Abbott Park, II)直接标记。分析在Zeiss Axioplan落射突光显微镜(epifluorescent microscope)上进行。图像使用 Metasystems Isis FISH 成像软件(MetaSystems Group, Inc. Belmont MA)捕捉。杂合性的丧失在CCC23中得到确认，而对于CCC13结果不确定。实施例6.1. 13-基因表达分析对于基因表达分析，首先将RNA测序读取结果用MAQ(0. 7.1)作图于基因组(NCBI36/hg 18)。发明人使用 Sequence Alignment/Map (SAMtools 0.1. 7)进行下游加工。允许高至五个错配。原始表达值(读取计数)通过将基于Ensembl数据库(Release 51)作图于人类基因的读取结果数总和而获得。起始基因表达值使用分位数归一化方法使用R(2. 11.1)中的 aroma, light (1. 16. 0.)包进行归一化。实施例6. 2-结果实施例6. 2.1-ARIDlA 突变在19个RNAseq样品中，3个具有体细胞截短突变(C4201T (Q1401*)，C5164T(R1722*)，和C1680A(Y560*)，其中星号表示终止密码子)，2个具有体细胞插入缺失(indel)(插入-缺失6018-6020delGCT和5541insG)，一个具有体细胞错义突变(T5953C (S1989P)，见于与5541 insG突变的同一样品中)，而I个具有涉及ARIDlA和邻近基因ZDHHC18 (编码含锌指DHHC域的蛋白质18)的基因重排(图2和3)。该重排的融合末端作图于涉及ARIDlA基因主要部分的同源缺失，其示于图11。所有预测的变体通过Sanger测序在来自来源肿瘤的DNA中得到验证。作为一个例外，所述缺失一重排使用微阵列数据(Affymetrix SNP 6.0)验证。这些突变均为体细胞性的。因为在PIK3CA (磷酸肌醇-3-激酶，催化性，a -多肽基因)，CTNNBl (连环蛋白3 -1基因)，KRAS (v-K1-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源基因)和TP53 (肿瘤蛋白P53基因)中的突变在卵巢透明细胞癌中屡次出现15，本发明人亦分析了 RNA测序数据并对这些基因中变体的存在进行了聚合酶链式反应分析(图3)。对于19个发现群样品的全转录组序列数据已存储于European Genome-Phenome Archive (登录号EGAS00000000075)。在CCC和其它卵巢癌亚型中的ARIDlA突变频率使用对较大群的样品进行的基于Illumina的靶向外显子重测序来确立。具有显著的ARIDlA突变的CCC的总频率为55/119，或46%。仅两个具有体细胞错义突变；剩余为均匀分布于编码序列中的截短突变(图2)。ARIDlA突变亦常见于EC中，其中30%(10/33)具有确认的截短突变，但在76个具有体细胞ARIDlA错义突变(突变总结于图4)的HGS癌中未发现一例ARIDlA突变。十七个病例，包括12个CCC和5个EC，每个具有两个验证的ARIDlA突变。本发明人在发现和突变验证群中分析了来自55个样品(47个卵巢透明细胞癌和8个子宫内膜样癌)的种系DNA中65个截短突变(53个见于卵巢透明细胞癌，而12个见于子宫内膜样癌)的存在。在所有55个中，突变都是体细胞性的。基于此，本发明人假定12个后续的截短突变(卵巢透明细胞癌中的10个和子宫内膜样癌中的2个)会是体细胞性的(即预测为体细胞性而未进行种系DNA测试)(图4)。ARIDlA突变的存在显示与子宫内膜异位相关的卵巢癌亚型(CCC或EC)具有强关联(Fisher 精确，p〈0. 0001)(图 12)。实施例6.2. 2-BAF250a蛋白表达 ARIDlA进一步通过在73个CCC，33个EC和76个HGS癌中对于BAF250a进行IHC染色来衡量，对于这些癌，在发现群和突变验证群中可获得经福尔马林固定、石蜡包埋的切片。这些结果总结于图13。BAF250a表达的缺失强烈关联于子宫内膜异位性相关的卵巢癌。在一个群中，35/74 (47%)的CCC和7/33 (21%)的EC，但仅1/76 (1%)的晚期重症癌显示BAF250a表达的缺失(Fisher精确，p=l. 70E-10)。在ARIDlA中截短突变的存在与子宫内膜异位相关癌中BAF250a的丧失显著相关(Fisher精确，p=3. 38E-07)。在CCC内，27/55 (49%)具有截短突变的病例显示丧失，相对于8/35(23)%的突变阴性病例(亦参见图4)。
在另一个分析中，ARIDlA突变和BAF250a表达之间的关联通过在182个肿瘤(73个卵巢透明细胞癌，33个子宫内膜样癌，和76个晚期重症癌)中对于BAF250a进行免疫组化染色来衡量，对于这些肿瘤在如上所述的发现群和突变验证群中可获得经福尔马林固定、石蜡包埋的切片。突变的存在与子宫内膜异位相关癌中BAF250a丧失显著相关(P〈0. 001，根据Fisher精确检验)。具有ARIDlA突变的卵巢透明细胞癌和子宫内膜样癌中分别37个样品中的总共27个(73%)和10个样品中的总共5个(50%)，显示BAF250a表达的缺失，与之相比，在不具有ARIDlA突变的癌中分别为36个样品中的4个(11%)和23个样品中的2个(9%)(图12和图13A)。BAF250a表达的缺失与子宫内膜异位相关的卵巢癌强烈相关-其中卵巢透明细胞癌中73个样品中的31个(42%)和子宫内膜样癌中33个样品中的7个(21%)显示表达的缺失-与之相比，对于晚期重症癌，76个样品中的I个(1%)具有表达的缺失(P〈0. 001，根据Fisher精确校验)(图13A)。在86个卵巢透明细胞癌和33个子宫内膜样癌中ARIDlA突变并不与子宫内膜异位的存在显著相关(图9)。免疫组化验证群亦评估了 BAF250a表达(图13B)。该分析揭示了卵巢透明细胞癌中132个样品的55个(42%)，子宫内膜样癌中125个样品的39个(31%)，和晚期重症癌中198个样品的12个出%)缺失BAF250a表达。这些结果与在发现和突变验证群中观察到的比例一致。未基于显现年龄、疾病分期(低或高)、或疾病特异性存活在任何癌亚型中见到与BAF250a表达的缺失的显著相关，如分别根据Welch的差异分析，Fisher精确检验，和对数秩统计分析来评估(对于所有分析，P>0. 05)。对于图13，来自发现和突变验证群、显示BAF250a表达的缺失的来自三种卵巢癌亚型一透明细胞癌(CCC)，子宫内膜样癌(EC)，和晚期重症(HGS)癌一的肿瘤的百分比(数量和总数置于括号中)对于具有和不具有ARIDlA突变的样品示于小图A，而对于在发现和突变验证群中的样品和免疫组化验证群中的样品示于小图B。BAF250a丧失的比率在具有ARIDlA突变的CCC标本中高于不具有ARIDlA突变的那些(P〈0. 001);对于EC标本亦如此(P=O. 02)。当在发现和突变验证群中评估并再次在免疫组化验证群中评估时，表达的缺失亦同样在CCC和EC (即两种子宫内膜异位相关癌)中比在HGS癌中更常见(小图B)，对于所有比较，P〈0. 001。所有P值使用Fisher精确检验来计算。实施例6. 2. 3-在相关的子宫内膜异位中分析ARIDlA两个患有携带ARIDlA突变的卵巢透明细胞癌(样品CCC13和CCC23)的患者具有邻近非典型子宫内膜异位。病例CCC23在外显子20具有ARIDlA截短突变(G6139T (E2047*))并在癌和邻近非典型子宫内膜异位上皮中具有BAF250a丧失(图14) ;HNF-1 P仅在CCC中表达，而ER在非典型子宫内膜异位上皮中表达。对于远离CCC的远侧子宫内膜异位的IHC分析显示BAF250a和ER表达的阳性，和HNF-1P的阴性。E2047*突变在肿瘤中是杂合性，并存在于17/42个来自邻近非典型子宫内膜异位的克隆和0/52个来自远侧子宫内膜异位病变的克隆(Fisherp〈0. 0001)。因此，邻近非典型子宫内膜异位显示ER表达和缺乏HNF-1 P表达，类似于远侧良性子宫内膜异位病变，但具有与CCC相同的ARIDlA突变。因此，非典型子宫内膜仅可基于BAF250a表达的缺失(与ARIDlA突变的存在关联)而与远侧子宫内膜区分。对于图14，小图A显示在子宫内膜异位性囊肿(白色箭)中出现了透明细胞癌(黑色箭)的切片(苏木精和伊红[H&E])。同一切片，在更高放大率下观察，显示透明细胞癌和邻近非典型子宫内膜异位的区。亦显示了来自同一患者的远侧子宫内膜异位的区。小图B显示小图A中组织标本的上皮部分对于BAF250a、肝细胞核因子I P (HNF-1 ^ )和雌激素受体(ER)的表达的免疫组化染色的结果。BAF250a免疫反应性在透明细胞癌和邻近非典型子宫内膜异位中丧失，但保持在远侧子宫内膜异位中。子宫内膜异位的两个区均与所述癌区别在于，它们缺乏HNF-1 P表达(在邻近非典型子宫内膜异位为弱表达)和保持雌激素受体表达。小图C显示对于透明细胞癌的测序色层谱和来自邻近非典型子宫内膜异位和远侧子宫内膜异位(从其提取DNA)的显微解剖材料的聚合酶链式反应(PCR)克隆。癌和邻近非典型子宫内膜异位显示对应于G6139T的核苷酸变化(如虚线框所示)；所述肿瘤在该位置显示杂合性峰，而非典型子宫内膜异位对于该取代是纯合的(在42个克隆中的17个)。与之相对，远侧子宫内膜异位显示野生型序列(在分析的所有52个克隆中)。任何来自远侧子宫内膜异位的PCR克隆均未显示与野生型序列的差异。第二个病例CCC13(数据示于图15)，具有两个ARIDlA突变体细胞错义突变 T5953C(S1985P)，和截短的插入缺失突变5541 ins G。两种突变在该肿瘤中均是杂合的，而所有来自远侧子宫内膜异位的克隆化PCR产物对于这些突变是阴性(T5953C为0/58 ；5541InsG为0/59)。与之相对，错义突变存在于来自邻接的非典型子宫内膜异位的20/51个克隆中，而插入缺失突变仅见于3/54个克隆，表明该插入可为子宫内膜异位克隆演化为CCC中涉及的第二个命中。这些突变，以及CTNNBl错义突变，均存在于该肿瘤和邻近的非典型子宫内膜异位中，但不存在于远侧的子宫内膜异位病变中(图15，小图B)。对于图15，显示了标本CCC13的透明细胞癌和邻近非典型子宫内膜异位的结果。小图A显示子宫内膜异位性囊肿(f)中出现的透明细胞癌(*)的H&E染色切片，以低分辨率显示邻近的组织学(a)，以较高分辨率显示透明细胞癌的区(b)和邻近的非典型子宫内膜异位的区(C)。来自同一个体的子宫内膜异位的远侧区以低分辨率显示(d)。小图B显示BAF250a免疫反应性在透明细胞癌和邻近的非典型子宫内膜异位的上皮区丧失，然而保持在远侧子宫内膜异位中。HNF-1 P可见于该肿瘤和邻近的非典型子宫内膜异位，然而在远侧子宫内膜异位中基本上是阴性的仅有零星的阳性细胞。ER仅在远侧子宫内膜异位中高度表达，并在肿瘤样品和邻近的非典型子宫内膜异位中丧失。小图C显示来自透明细胞癌的测序色层谱和来自邻近非典型子宫内膜异位的PCR克隆，明显地显示对应于T5953C(S1985P)的核苷酸变化。该突变存在于20/51个邻近非典型子宫内膜异位的克隆中。与之相对，来自远侧子宫内膜异位的所有克隆化PCR产物(来自58个克隆)，其保持BAF250a表达，仅显示野生型序列。杂合峰见于来自肿瘤的DNA。将来自两种子宫内膜异位样品的显微解剖的材料用于提取DNA，通过PCR扩增，克隆并测序。所有来自远侧子宫内膜异位的PCR克隆均不显示与野生型序列的差异。小图D :如在小图“C”中，来自透明细胞癌的测序色层谱和来自邻近非典型子宫内膜异位的PCR克隆显示额外插入一个G(5541InsG)。该突变存在于来自邻近非典型子宫内膜异位的3/54个克隆中。与之相对，所有来自远侧子宫内膜异位的克隆化PCR产物(来自59个克隆)，其保持BAF250a表达，仅显示野生型序列。来自肿瘤样品的测序读取结果显示对应于插入点之后框内和框外等位基因的特征性重叠读取解雇。如在“C”中，对邻近的非典型子宫内膜异位和远侧子宫内膜异位均显示了来自PCR克隆的序列。对CCC13进行了 Sanger测序。从单个PCR片段测序了两个体细胞突变(5541insG和T5953C(S1985P))。将PCR产物克隆然后重新测序。总共分析了来自45个克隆的序列。本发明人发现15/45个(33%)野生型序列，9/45个(20%)具有T5953C (S1985P)突变的序列，9/45个(20%)具有5541insG突变的序列，和12/45个(27%)在单个Sanger序列示踪中具有两个突变的序列。这揭示了在反式(在独立的等位基因上)和亦在顺式(在相同的等位基因)中发生的突变之间的复杂关系(参见图16)。该发现，以及野生型等位基因的存在，表明该肿瘤是非整倍体的，且在ARIDlA基因座发生了基因转换或其它重排，且其存在于一部分细胞。突变，包括截短突变和体细胞错义突变，以及一个ARIDlA重排，见于56/119(47%)的CCC和10/33 (30%)的EC (总共66/153或43%)，但仅见于1/76 (1%)的晚期重症卵巢癌。所有可获得种系DNA的截短突变均为体细胞性的，且十五个病例具有两个体细胞突变。BAF250a蛋白的丧失与截短突变强烈相关联。在两个CCC中，ARIDlA突变和BAF250a表达 的缺失明显见于肿瘤和邻近非典型子宫内膜异位，但不见于远侧子宫内膜异位病变或正常组织。实施例6. 2. 4-ARID1A突变体中的差异化基因表达对于具有ARIDlA突变的细胞，具有最大差异化表达的50个基因的结果示于图21。图21显示在含突变体ARIDlA的细胞相对于野生型细胞中差异化表达的基因，和这些基因相对于野生型在表达方面的倍数变化。这些基因代表潜在的靶基因以用于合成性致死筛选，并亦代表潜在的药物靶以供开发新的CCC、E0C、子宫癌治疗。实施例-6. 3实验结果的讨论总体而言，46%的CCC和30%的EC在ARIDlA中具有体细胞截短突变或错义突变，与之相反，在76个分析的HGS癌的标本中则无。ARIDlA表达的缺失亦具有亚型特异性，其中细胞核BAF250a的丧失见于39%的CCC和EC但仅1%的HGS癌。有许多证据链支持体细胞ARIDlA突变的重要生物作用。首先，鉴定出的突变几乎完全是截短突变，期待编码非功能性蛋白。它们以高频率存在于子宫内膜异位相关的卵巢癌，但非HGS癌，两种不同的肿瘤类型，这强烈地表明它们与前者高度相关，且并非随机事件。通过将透明细胞癌与其邻近的非典型子宫内膜异位病变相比较，本发明人证实相同的突变存在于推定为肿瘤的前体病变中。与之相对，远侧子宫内膜异位病变对于突变是阴性的。在图14中所示的情况中，突变在非典型子宫内膜异位发展出与癌相关的免疫表型(ER阴性，HNF-1 ^阳性)之前即已存在，表明该突变是赘生物转化中非常早期的事件。突变的存在与BAF250a蛋白的丧失强烈相关，表明正常等位基因通常丧失，并进一步支持ARIDlA在致癌中的重要作用。近来，在15个病例中的该基因座处两个突变事件的发现，以及在编码区内平均散布的截短突变以及蛋白表达的频繁丧失的发现，表明ARIDlA是典型的肿瘤抑制基因。不像BRCA或p53突变(可见于种系)，所有的ARIDlA突变是体细胞性的；这可由下述观察解释在小鼠中ARIDlA的杂合突变是胚胎致死突变。当通过扩增子外显子重测序分析RNAseq病例时，鉴定出了四个其它突变；这些突变可能由于其转录物迅速被祀向无义介导的衰变(nonsensemediated decay, NMD)43而未见于RNAseq数据，表明RNAseq，尽管是有用的发现工具，但对于检测无义或其它截短突变具有不完善的敏感度。
在CCC和EC中，表达的缺失见于67%的突变阳性病例和仅16%的突变阴性病例。具有BAF250a表达丧失的突变体阴性CCC和EC可能能通过其它机理如染色体重排、外遗传沉默、转录阻抑物的表达或翻译后机理而丧失了 ARIDlA表达。BAF250a免疫反应性在小部分具有蛋白截短突变的病例中的存在可表明单倍体不足(haploinsufficiency)(在小鼠中是胚胎致死的)是致病性的。或者其可归因于不影响蛋白表达水平的第二次命中事件(一些突变的显性阴性功能)，或在IHC测定中对截短但功能障碍的蛋白的检测。后者在一些病例中是可能的，因为使用的抗体靶向蛋白中部(在外显子14-16之间)。尽管长期以来有证据表明子宫内膜异位是CCC和EC的主要风险因素，但该转化的分子机理尚属未知44’45。在PTEN基因中的突变描述于20%的子宫内膜异位性囊肿中。在小鼠模型中，发现Cre介导的肿瘤基因K-ras的表达诱导子宫内膜异位，而在肿瘤抑制物Pten中的第二次命中导致演进为子宫内膜样癌，然而K-ras突变并未见于人子宫内膜异位或子宫内膜异位相关的卵巢癌。了解CCC和EC亚型的起始事件可导致新治疗方法的开发，并使得能创建有赘生物转化风险的子宫内膜异位性病变的鉴定工具。ARIDlA中的突变和BAF250a表达的缺失偏好地见于CCC和EC，这些癌不表征为HGS癌的基因组混乱，近乎遍在的TP53突变，和频繁的BRCA异常。若HGS癌是以染色体中大量的结构异常所表征，那么可能CCC和EC的特征是改变染色质用途的那些基因中的缺陷，以及之前描述的WNT和PI3激酶途径突变。若此种模型正确，则其它影响ARIDIA基因座的异常或其它染色质重构基因的失调会见于ARIDlA突变阴性的CCC和EC。这得到了对于ARIDlA阳性和阴性的卵巢透明细胞癌之间在临床上的类似性的支持。ARIDlA中体细胞突变使得良性子宫内膜异位病状演进为癌的机理仍需阐明。然而，前述发现强烈地暗示ARIDlA突变在CCC和EC的生成中的基本作用。在子宫内膜异位上皮中ARIDlA的丧失看来在该组织类型中的恶性肿瘤转化中具有重要性。这些数据暗示ARIDlA为在CCC和EC中被频繁破坏的肿瘤抑制基因。因为ARIDlA突变和BAF250a的丧失可见于前赘生物病变中，这是早期事件，并很可能对于子宫内膜异位转化为癌症是关键的。实施例7. 0_BAF250a表达的缺失在子宫内膜癌中是常见的，但不常见于其它类型的恶性肿瘤为了说明BAF250a丧失是否常见于其它恶性肿瘤，在超过3000个癌中在组织微点阵(TMA)上进行了对于BAF250a的免疫组化(IHC)筛选，所述癌包括乳腺、肺、甲状腺、子宫内膜、肾、胃、口腔、子宫颈、胰、结肠和直肠的癌，以及子宫内膜间质肉瘤，肠胃道间质瘤(GIST)，性索间质细胞瘤，和四种主要类型的淋巴瘤(弥散性大B细胞淋巴瘤[DLBCL]，原发性纵隔B细胞淋巴瘤[PMBCL]，套细胞淋巴瘤[MCL]，和滤泡性淋巴瘤)。本发明人已表明，BAF250a丧失常见于子宫内膜癌，但不常见于其他类型的恶性肿瘤，其中在29%的I或2级和39%的3级子宫内膜的子宫内膜样癌，18%的晚期重症癌，和26%的透明细胞癌中观察到丧失。因为子宫内膜癌显示BAF250a丧失，本发明人在9个非典型增生病例和10个非典型子宫内膜异位病例中对全组织切片进行BAF250a表达染色。在9个复杂非典型子宫内膜增生病例中，所有均显示BAF250a表达，然而10个非典型子宫内膜异位(对于透明细胞和卵巢癌推定的前体病变)病例中，一个病例显示在非典型区中BAF250a染色的丧失而在非非典型子宫内膜异位的区中保留染色；这是唯一作为子宫内膜样癌复发的病例，表明BAF250a丧失可为致癌作用中的早期事件。因为BAF250a丧失以与透明细胞癌和子宫内膜异位样卵巢癌类似的比例见于子宫内膜癌，并不常见于其它恶性肿瘤，BAF250a缺失是来源于子宫内膜腺上皮的癌的特定特征。实施例7.1-材料和方法实施例7.1.1-样品收集使用来自Vancouver General Hospital, St. Paul，s Hospital,和 theBritishColumbia Cancer Agency的档案的病例以构建来自一式两份的0.6mm核心的组织微阵列(TMA)，如前所述46。滤泡性淋巴瘤TMA使用一式两份的1. Omm核心构建。对于子宫内膜非典型增生的研究，使用无共存癌的子宫切除术病例，并将全切片免疫染色。对于非典型子宫内膜异位的病例的免疫染色亦对全切片进行。所有有意收集的患者样品均遵守研究论理部门(REB)批准的步骤下在患者表示同意的情况下收集，且存档样品的分析均事先得到REB批准。实施例7.1. 2-免疫组化(IHC)染色对于BAF250a的免疫组化(IHC)染色对于所有本研究包含的病例进行。IHC在半自动化的 Ventana Discovery XT 装置(Ventana Medical Systems, Tucson, AZ)上使用Ventana ChromoMap DAB制剂盒对组织微阵列的4 ii m厚的石腊切片或全组织切片进行。抗原回收以标准的CCl进行，进行两小时一级温育。将BAF250a小鼠克隆3H2 (Abgent，SanDiego, CA)以 1:50 施用，接着用预稀释的 UltraMap Mouse HRP(Ventana)进行 16 分钟的二级温育。组织图像使用ScanScope XT数字扫描系统(Aperio TechnologiesInc. , Vista, CA)获得。实施例1.1. 3-1HC评分对于BAF250a的评分如前所述进行47。非赘生物细胞，包括内皮细胞，成纤维细胞，和淋巴细胞，通常显示BAF250a细胞核染色，并充当阳性内部对照。阳性评分的组织核心是含有任何阳性肿瘤细胞核染色的那些，无论其强度。阴性评分的组织核心是显示完全缺乏肿瘤细胞核染色，以及阳性的非赘生物细胞核染色的的那些。缺乏肿瘤细胞的组织核心不进行评分。其中无论间质中的正常细胞还是肿瘤细胞均无免疫反应性的病例视为技术失败的结果。在组织微阵列上的每个病例作为一式两份的核心表示，一式两份中一个阳性核心足以将该病例计为阳性。实施例7. 2-结果总体而言，通过IHC测量的BAF250a表达的缺失在非妇科的恶性肿瘤中并非常见的事件(图17和18)，而在给定肿瘤类型超过10%的病例中BAF250a的丧失仅见于胃癌(14%)和间变性甲状腺癌(14%)。子宫内膜来源的癌症显示最高频率的BAF250a丧失，其中29%的I级或2级子宫内膜样癌，39%的3级子宫内膜样癌，26%的透明细胞癌，和18%的子宫内膜的晚期重症癌显示BAF250a表达丧失(图17和19)，而14%的子宫癌显示BAF250a丧失。对九个子宫内膜复杂非典型增生病例进行BAF250a染色，所有九个与都显示邻近的正常子宫内膜相同样式的染色(即温和至强烈的细胞核阳性)。在十个非典型子宫内膜异位病例中，除了一个之外均显示BAF250a的保留(即正常染色样式)。一个病例在细胞学非典型区显示染色丧失而在非非典型子宫内膜异位中显示染色的保留(图20)。该患者在2年之后在该位置(直肠子宫凹陷)发展出明显的子宫内膜样的癌。实施例7. 3-讨论BAF250a，由ARIDlA(富AT相互作用域IA基因)编码的蛋白，是SWI/SNF染色质重构复合物的一个辅助亚基，认为其在基因表达的调节中赋予特异性27’28。SWI/SNF复合物由多个组分组成，其中其核心催化亚基利用ATP驱动核小体，因此通过改变转录机器对启动子区的可接近性来提供对基因的转录调控。SWI/SNF复合物，其在真核生物中遍在，对于多样化的细胞过程的调节是重要的，这些细胞过程包括发育、分化和增殖，乃至DNA修复和肿瘤抑制26。该实施例的结果证实BAF250a的丧失是广泛范围的来源于正位以及异位的子宫内膜的肿瘤的特征，但不常见于研究的其它肿瘤类型。子宫内膜的癌，特别是那些较晚期的，显示更加频繁的BAF250a丧失。在显示BAF250a丧失的子宫内膜的癌中，ARIDlA基因的突变状态未知。然而在卵巢的透明细胞癌和子宫内膜样癌中，ARIDlA的突变与BAF250a表达关联良好，尽管并非绝对。因此，本发明人提出下述假说在具有BAF250a丧失的子宫内膜的癌中，大部分会在ARIDlA基因中携带突变。在不显示BAF250a丧失的病例中，可能SWI/SNF染色质重构复合物的其它组分会显示功能丧失。此外，因为在一个等位基因上的ARIDlA丧失导致小鼠中胚胎致死，导致BAF250a表达部分丧失的ARIDlA突变可能在肿瘤中有生物作用，且ARIDlA的作用可能在通过IHC对于总BAF250a丧失进行筛选时过低估计48。对部分丧失进行的测量会需要精细评分的方法(nuanced approach to scoring)或使用多通路免疫荧光。在该研究中，本发明人并未在九个非典型子宫内膜增生病例任一个中鉴定出BAF250a丧失。十个非典型子宫内膜异位病例之一具有BAF250a表达的缺失。该患者两年之后在该非典型子宫内膜异位的位置发展出子宫内膜样癌。该发现可以有两种解释。首先，BAF250a缺失并因此ARIDlA突变是前体病变演进为癌中的晚期事件，或者研究的该特定病变已经完全恶性，尽管根据形态学基础并未识别为此。无论如何，该病例，以及在症状明显的癌中BAF250a丧失的频率，在正常组织和前体病变中丧失的罕见性(或缺乏)表明BAF250a表达的缺失是高度指示恶性肿瘤的特征。实施例8. 0-有希望的实施例实施例8.1-说明ARIDlA和其它SWI/SNF突变在卵巢癌亚型中的频率和临床重要性将在150个透明细胞癌和350个其它卵巢癌中，使用靶向的新一代测序分析大约30个基因的突变，包括所有15个SWI/SNF基因。当可获得时，将分析前体病变以评估SWI/SNF突变是否致癌中的早期事件。预测具有SWI/SNF突变的肿瘤将不会含有影响已知驱动类型I卵巢癌的途径的突变，因此亦分析样品中与这些途径相关的选定基因的突变。经靶向重新测序分析的400个病例以及另外1500个卵巢病例(具有临床结果数据)用免疫组化方法分析，以鉴定具有BAF250a表达丧失的病例，并确定是否这与ARIDlA突变状态相关。如上所述，本发明人已证实大约39%的CCC在ARIDlA基因中携带突变。其它两个病例在其它SWI/SNF复合物基因中具有突变。扩大该观察的范围，在较大的卵巢癌群C400个病例，包括该疾病的所有病病理亚型)中确定ARIDlA突变和其它15个编码SWI/SNF复合物蛋白的基因的突变26'49，以确定该复合物在卵巢癌中如何被频繁扰乱。预测SWI/SNF复合物中的改变代表具有根本重要性的致癌机理，其与之前在卵巢癌中鉴定出的分子途径不同。该预测将通过评估数种已知涉及卵巢癌的基因的突变状态来确认。预期染色体稳定的I型卵巢癌能进一步归类为两个组(i)在已知致癌途径中具有突变的癌症和(ii)具有影响染色质重构的突变的癌症。用免疫组化以在400个测序病例以及1500个其它卵巢病例中评估BAF250a表达。用代表所有亚型的400个冷冻卵巢肿瘤样品的DNA进行靶向重新测序。所有病例将具有相伴的种系DNA来源。大约150个这些样品将是CCC，而剩余250个将包含其它卵巢癌亚型(50个子宫内膜样，150个晚期重症,25个低级重症和重症边缘,和25个粘液样和粘液样边缘)。所有250个代表非CCC亚型的肿瘤加上35个CCC将从位于Vancouver GeneralHospital 的 Department of Pathology 的 OvCaRe Tissue Bank (http://www. ovcare. ca/research/platforms, php)获得。剩余115个CCC将从外界来源获得，如42个CCC来自Australian Ovarian Cancer Study, 30 个 CCC 来自 Institut du cancer de Montreal,33 个 CCC 来自 Mt. Sinai School ofMedicine, New York, 10 个 CCC 来自 Johns HopkinsUniversity,而9个CCC细胞系来自Michael Anglesio博士。使用155个CCC病例，将可以以8%或更少的误差界限(95%置信区间)确定CCC中的突变比例。对于BAF250a蛋白表达的免疫组化分析，除了上述的400个样品之外，将会检查另外1500个装配在组织微阵列中的卵巢癌样品。这些组织微阵列包括大约250个CCC，其它病例代表其它卵巢癌亚型，并已经如前所述4’5°。此外，将分析50个推定的CCC前体病变，即子宫内膜异位和非典型子宫内膜异位。将优先考虑如上所述用于靶向测序的肿瘤的病变，其它病例将来自 Vancouver General Hospital Pathology Archives。将对15个SWI/SNF基因以及已知在卵巢癌中突变的基因包括TP53，KRAS, BRAF,PTEN, PI3KCA, CTNNBI, BRCA1，和BRCA2进行测序。总体而言，这些包括406个外显子和涵盖120kb的内含子外显子边界序列。为了达成此，将使基因组DNA文库富含靶基因，其将通过下一代测序进行分析。替代性的方法吸引力较低，因为高通量Sanger测序昂贵且由于间质污染或肿瘤内杂合性而对于在少于15%的等位基因中发现的突变不那么敏感，多聚A+转录组的测序不会检测导致无义介导的mRNA衰变的突变，而且全外显子组(exome)测序将会过于昂贵。本发明人已从超过300个样品中提取DNA,且将使用QiagenMagAttract 试剂盒于Qiagen M48机器人上进行其它提取。DNA的定量将使用Quant_iT dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 荧光计(Invitrogen)在基于平板的文库构建之前进行。剪切的基因组片段的文库将在96孔板中使用Covaris E210声处理平台和Biomek FX液体处理器构建。文库构建以I U g的DNA起始，将其自动地I)剪切至 200bp的平均大小，2)转移至96孔板，3)末端优化(end polish) ,4)多聚A加尾,5)连接至有条码的接头,和6)用生成克隆簇所需的序列的特异性寡核苷酸进行PCR扩增。一旦构建，将文库汇总(在单轮中多达94个样品)，并通过固相或液相捕捉探针富集。祀富集的有效方法包括,用定制的Agilent和Nimblegen固相和溶液相捕捉平台，然而，迄今为止，这些平台并未针对多通路样品捕获得到验证，且我们需要在各个单独的捕获实验中检查这400个样品，其成本过于昂贵。因此，将使用由Febit开发的用于S0LiD 3. 5测序平台的固相微流动捕获平台(分别为Febit Biomed Gmbh和AppliedBiosystems)。该基于FebitHybSelect 微点阵的捕获方法通过将DNA样品与微流动芯片(Geni0mTMBi0Chip)51上由光活化的原位合成生成的特异性寡核苷酸杂交，来选择性地捕获复杂基因组文库的序列片段。每个Geniom Biochip含有8个可单独寻址(addressable)的阵列，每个包含>15，，000个捕获探针，其根据不同的数量和大小的特征而区段化。特征的数量、密度和探针长度可定制，高至最多800kb每阵列。十二个有条码的SOLiD 测序文库汇总用于每个阵列(每个GenioM Biochip有96个文库)，并在Geniom RT装置上进行序列捕捉，洗漆，和洗脱。序列捕获步骤由Febit的Genomics服务单元进行。 将评估富集的样品，并对其分别使用DNA 1000系列11测定(Agi lent)和Quant-1T dsDNA HS测定试剂盒和Qubit 突光计(Invitrogen)进行定量。将进一步汇集文库的组(高至每载玻片96个样品)，并对其进行大量乳化PCR(bulkemulSion PCR, emPCR)，富集，和在S0LiD 3. 5平台上进行测序。将对每个大量emPCR进行在SOLiD 平台上运行的工作流分析(WFA)以确保信噪比在规格之内。一旦批准，将使用emPCR进行大规模的珠沉积，靶向每载玻片 5亿读取结果，每次运行10亿读取结果。数据分析图像加工至颜色辨识将在装置上进行，且所得的文件将与参照人基因组(NCBI build 36.1, hgl8)使用 Bioscope vl. 01 (AppliedBiosystems)比对。在所得比对中的变体将使用diBayes包(Applied Biosystems)检测。杂合子或非参照纯合子存在的可能性将使用之前SNP为“错误颜色辨识”、“位置错误”或“探针错误”可能性进行衡量。此夕卜，将独立于diBayes方法通过将所有在颜色空间中的读取使用Mosaik比对程序(http: //bioinformatics, be. edu/marthlab/Mosaik)比对来分析数据。该算法对于竞争性方法具有多个优势其使用带式Smith-Waterman方法进行比对,其更可能检测出插入和缺失,其利用颜色空间读取的所有优势，且可更加不易于发生错比对。而且，Mosaik无瑕地转化回碱基空间，并因此允许我们利用本发明人已就SNF检测开发的癌特异性框架，称作SNVMix 56，其用于发现卵巢中的颗粒细胞肿瘤\和在小叶乳腺癌中分析基因组范围突变演化25。在比对之后，我们将预测SNV，并针对已知SNP的数据库对所有非同义蛋白编码预测进行相互参照以丰富对于体细胞变体的结果25。下文中，所有剩余的非同义SNV和蛋白编码插入和缺失将称作体细胞突变候选(SMV)。SMV将通过在肿瘤和正常DNA中在Illumina GAllx机器上进行靶向超深扩增子测序来验证25。预期该方法产生等位基因频率信息，并足够敏感以确认SMC，甚至存在于极少数细胞中的那些。将读取与人参照基因组使用Maq 0.7.1比对，并将使用二项式精确验证继以使用Benjamin1-Hochberg方法对多重比对进行校正来评估变体。所有变体在肿瘤中但非正常情况下统计学上显著地存在的位置将视为经验证的体细胞突变。一旦完成了测序，将使用所述数据以鉴定并定量所有突变。潜在突变的验证将通过来自肿瘤来源的DNA的PCR扩增子的illumina测序来进行25。将对匹配的正常DNA就所有经验证的突变的存在进行评估以确定相比于种系状态的体细胞状态。估计在已经测序的基因中每个病例会有五个潜在的突变(因此在400个病例中有2000个突变。本发明人对于已知癌基因已有工作引物组，并估计需要另行开发200个引物组以验证SWI/SNF基因中的突变。将所有突变的扩增子置于两个集合中，用每个生成文库以便在Illumina Gllx分析仪的单泳道上运行。将来自正常和肿瘤DNA的扩增子汇入分开的文库以消除条形码化的需要。若在多个病例中发现完全相同的变化，则这些将通过Sanger测序来验证。在其中发现ARIDlA突变的情况下，将使用FISH评估在第二等位基因处的LOH。若HybSelect方法并不如上述概括那样运行，则将视需要使用替代性测序策略将使用对选择的扩增子进行的基于Illumina的测序，或进行Sanger测序。若使用基于Sanger的测序，则分析的病例数将减少至100，这是由于与该方法相关联的成本增加。实施例8. 2-对卵巢癌中BAF250a表达的频率的验证如上所述，本发明人已阐明了 ARIDlA的突变状态与BAF250a表达相关联。使用针对BAF250a(克隆3H2Abgent Inc.)的ARID域的C端的111个氨基酸区(氨基酸1216-1326)的小鼠单克隆抗体进行了上述实验。因为该抗体靶向蛋白质的中间区，因此甚至当C端的无义突变导致蛋白的截短形式时仍可能存在阳性染色。因为数个本发明人鉴定出的突变落在C端内(图2)，本发明人正在开发针对BAF250a的C端特异性抗体。所述C端特异性抗体将用于对所有病例重新进行免疫染色。具有错义突变或框内缺失的病例将不会期待显示BAF250a表达的缺失(无论使用哪个抗体)。实施例8. 3-BAF250b表达水平的衡量亦将评估BAF250b (由ARIDlB编码)的表达。因为SWI/SNF复合物无法同时含有BAF250a和BAF250b，预期排除BAF250a会与BAF250b增加相关。基于如上所述的RNA-seq数据，似乎ARIDlB表达水平不受ARIDlA中的突变影响，并事实上当在所有癌症类型之间比较时是不变的。然而，为了确保BAF250b蛋白表达不因为BAF250a缺陷而增加，将所有BAF250a阴性病例就BAF250b的表达进行免疫染色。因为SffI/SNF复合物无法同时含有BAF250a和BAF250b，这可能会导致BAF250a的缺乏对应于含BAF250b复合物的富集。这会具有功能性后果，因为已显示BAF250a排除特异性抑制细胞周期停滞，而BAF250b对细胞周期停滞无作用52。此外，将会对所有组织微点阵进行BRM、BRG1和BAF47免疫组化。将会对具有未解释的BAF250a、BRM, BRGl或BAF47表达的缺失的病例就启动子超甲基化进行重新检查，使用通过访问已知的工具如http://www. urogene. org/methprimer/index, html设计的引物或公开的引物，已经对BRM和BRG126描述了启动子超甲基化。所有病例的免疫染色将会在Genetic Pathology Evaluation Centre进行8’14’5°。
实施例8. 4-统计学分析具有约150个CCC病例，对于ARIDlA突变的速率的确定可评估至土 10%以内。对400个卵巢癌肿瘤的分析将会允许检测病例或分子定义的亚型之间在突变率方面的15%的差异(80%功能水平(power level))。将SWI/SNF基因中的突变频率使用Fisher精确检验在癌症亚型之间比较。将会通过与患者结果和肿瘤分期相关联来确定具有ARIDlA突变或表达丧失的CCC是否具有明显的临床表型。将会使用对数秩检验和Kaplan Meier图来评估存活特征方面的差异45°。与临床和生物标志物数据之间的联系将用卡方检验和列联表来评估。实施例8. 6-确认ARIDlA中的突变是致癌中的早期事件在所有发现SWI/SNF基因内的突变的情况下，将会通过对于BAF250a表达的免疫组化；对于基于染色体的LOH的FISH ;和激光捕捉显微解剖(LCM)接着进行克隆化PCR产物的Sanger测序以评估ARIDlA突变状态分析推定的前体病变(当存在时)。该方法已经用于上述讨论的病例CCC23。实施例8. 6-在CCC衍生的细胞模型中确定ARIDlA突变的功能性后果在透明细胞癌细胞和异种移植小鼠模型中确定了 ARID1A(野生型，丧失和突变体)如何影响细胞生长和存活。ARIDlA突变对于蛋白-蛋白相互作用的作用将会使用共免疫沉淀实验接着进行质谱来确定。为了确定ARIDlA突变是否影响至BAF250a靶的募集，将会使用染色质免疫沉淀与新一代测序的组合(ChlP-seq)。将会使用基因组范围核酸酶可接近性测定来验证在染色质免疫沉淀实验中鉴定出的SW1-SNF-染色质相互作用(图22)。发明人开发了来自V0A867 (CCC14)的可移植的异种移植物，V0A867 (CCC14)是在外显子3具有杂合ARIDlA截短体细胞突变(C 1680A(Y560*))的CCC，导致BAF250a表达的完全丧失。将会对于所有的功能性研究使用从V0A867(CCC14)异种移植物构建、用于构建同基因衍生物的ARIDlA-无效(null)细胞系(867CL)。将会进行对全长ARIDlA cDNA(pCMV6-XL4质粒，OriGene Technologies)的定点诱变以生成对应于通过RNA-seq鉴定出的突变的ARIDlA构建体。具体而言，将会用下述来构建876CL同基因系I)仅作为对照的载体(867CL-载体)，2)见于VOA120 (867CL-AR皿A- A L2007)的6018-6020delGCT (2007 A L) 3bp 缺失，和 3)野生型 ARIDlA (867CL-ARID1A-WT)。为 了 阻止由于BAF250a C端GFP融合而对BRGl结合的破坏，将具有GFP的载体通过IRES位点(内部核糖体进入位点)表达，并使用BAF250a抗体验证表达。将这些ARIDlA突变体和野生型构建物包装入pLVX-Puix)慢病毒表达载体，将会用该载体感染867CL细胞。将会使用嘌呤霉素和/或就GFP进行流式分选(flow sorting)来选择转导的细胞。将会通过有限稀释以选择具有类似于T0V-21G( —种内源表达野生型ARIDlA的CCC来源的细胞系)的ARIDlA表达的克隆来衍生稳定的克隆。将会对这些细胞(867CL，867CL-载体，867CL-ARID1A- A L2007,867CL-ARID1A-WT)进行 RNA-seq,并使用 Ingenuity Pathway Analysis 软件将差异表达的基因匹配于途径。亦将会使用这些数据验证ChlP-seq结果。实施例8. 7-ARID1A对细胞周期和生长的作用将会在体外就生长和细胞周期活性来分析这三种同基因和亲本867CL细胞。将会使用MTT (3-4，5- 二甲基噻唑-2-基)_2，5- 二苯基四唑溴化物，3-(4，5-dmethyIthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)测定来衡量作为线粒体活性的函数的增殖状态53。作为第二种对细胞存活的测量，将会使用细胞集落形成测定，其评估导致减少的集落形成的细胞周期停滞或细胞死亡54。因为ARIDlA的排除在细胞周期抑制中起作用52，将会通过测量组入DNA的[3H]胸腺嘧啶的DNA合成来评估细胞周期活性55。为了进一步阐明ARIDlA体内的生物功能，将亲本867CL细胞与三种衍生的同基因细胞一同使用异种移植物肾下胶囊技术(xenograft sub-renal capsule technique)36 移植入 N0D/SCID 小鼠，并将会比较肿瘤异种移植物的生长性质。若867CL-ARIDIA-WT异种移植物与ARIDlA-无效(867CL, 867CL-载体)或ARIDlA-突变体(867CL-ARID1A-A L2007)相比具有更长的肿瘤倍增时间(tumour doubling time),这将会进一步支持ARIDlA在CCC中充当肿瘤抑制物。如果异基因细胞系不能成功地从867CL细胞创建，选其它ARIDlA-裸细胞作为有效备选I)上述实施例中测序的丧失ARIDlA表达的9个CCC细胞系中任一个，或2)IOSE (永生化卵巢表面上皮)或HCTl 16细胞，稳定表达慢病毒ARIDlA ShRNA0初步数据证明HCTl 16细胞中BAF250a表达的有效的ARIDlA shRNA介导的敲低(图8)，缺乏BAF250a表达的细胞用嘌呤霉素和/或GFP流选(flow sorting for GFP)来选出。and/or. 实施例8. 8-SWI/SNF复合物的免疫沉淀发明人预测867CL和867-载体细胞将会在如上所述的细胞周期和生长测定中产生完全相同的结果。若确实如此，则将会得出结论，即载体不具有作用，并将仅会使用867CL细胞进行剩余实验。对于蛋白组成(在MS实验中)和染色质结合(在ChlP-seq实验中)的评估，需要对SWI/SNF复合物进行免疫沉淀(IP)。IP实验将会从无效(867CL)、突变体(867CL-ARID1A-AL2007)和野生型ARIDlA (867CL-ARID1A-WT)细胞系中的细胞核提取物使用靶向下述的三种SWI/SNF抗体进行1)复合物的一个核心组分(即BAF155、BAF170或BAF47)49 ；2)BAF250b ;和 3)BAF180 此外，发明人将会使用来自 867CL-ARID1A-A L2007、867CL-ARIDIA-WT 和 T0V-21G 细胞的 BAF250a 抗体对 SWI/SNF 进行 IP (图 22)。
对于图22，首先，将会对五个细胞系就ARIDlA对细胞生长的作用进行评估867CL (无BAF250a表达)，867CL_载体(无BAF250a表达)，T0V-21G (衍生的透明细胞癌，其具有内源的正常ARIDlA表达)，867CL-ARIDIA-WT (在867CL细胞中的野生型ARIDlA表达)，和867CL-ARID1A- A L2007 (突变体ARIDlA以及BAF250a表达)。假定将空载体导入867CL细胞并不具有作用，将不会进一步对867CL-载体细胞就MS和ChlP-seq实验进行研究。剩余四个细胞系将会具有通过对下述进行IP所得的细胞核提取物分离的SWI/SNF复合物(l)BAF250b, (2) BAF180, (3) BAF170、BAF155 或 BAF47。此外，将通过对 BAF250a 进行IP从那些具有BAF250a表达的细胞(野生型或突变型)分离SWI/SNF复合物。多种SWI/SNF复合物的蛋白质组成和丰度将会使用MS进行调查。SWI/SNF对染色质的结合将会使用ChlP-seq进行调查。用于IP 的抗体 56 可从 Santa-Cruz (BAF170, sc-10757; BAF47, sc-16189; BAF250a,sc-32761)和 Bethy Laboratories (BAF180, A301-590A;BAF155, A301-019A;BAF250b, A301-047A)获得，并将对其进行测试以选择产生最干净结果的抗体。作为SWI/SNF复合物必须含有BAF250a、BAF250b或BAF180之一，ARIDlA丧失或突变可表现为野生型BAF250a复合物的急剧减少，和含BAF250b或BAF180的复合物的增加。ARIDlA突变的第二种后果可为SWI/SNF复合物内蛋白组合的改变。这些突变的第三种后果可为对于SWI/SNF复合物的染色质靶的改变，其会影响基因调节。这些将会使用如下所述的MS和ChlP-seq实验的组合进行调查。实施例8. 9-ARID1A突变对SWI/SNF复合物组成的影响本发明人会使用多重反应监视(multiple reaction monitoring, MRM)MS分析技术以在上述经IP的SWI/SNF复合物中对15种已知的SWI/SNF复合物的组分的指纹肽进行定量(图1)26。MRM是定量的、高度敏感的、三重四极MS扫描技术，其用于定量从特定肽(来自感兴趣的蛋白)散发的MS/MS片段(称作跃迁)56。对于15个待测量的蛋白质，将会涉及对于从 MS 谱数据库(http://www. peptideatlas. org/, http://gpmdb. thegpm. org/)获得的胰蛋白酶肽的MS/MS谱涉及MRM测定。将会对于所有SWI/SNF蛋白选择一个肽。每个将会在人蛋白质组是独特的，并具有鲁棒的(robust)MS/MS信号，除了在BAF250a的情况下将会选择三种肽(C端、中央和N端)从而使得将会检测到任何截短型式的BAF250a。将会在ABI 4000QTrap MS上收集MS数据，ABI4000QTrap MS可在单个多通路测定中使用每个肽三个跃迁来测量所有17个肽；对于每个肽的跃迁将会在MS分析中出现在同一张色层谱上。将会使用MultiQuant (ABI)计算色层谱中每个跃迁的信号容量。将对于每个肽的跃迁累加，并用其计算样品之间SWI/SNF蛋白的相对改变。数值将会针对起始细胞数归一化，并将会进行三个独立的重复实验以允许进行统计学分析。867CL对867CL-ARID1A-WT或T0V-21G细胞的比较将会鉴定出与总体SWI/SNF复合物组成的改变和相关于CCC中ARIDlA丧失的BAF250b和BAF180复合物组成的改变相联系的变化。预期 867CL-ARID1A- A L2007 的 SWI/SNF 组合物与 867CL-ARID IA-WT 和 T0V-21G的比较将会鉴定出由于与BAF250a相互作用(其依存于对Leu2007的接触或受Leu2007残基影响的三级结构)而获得或丧失的蛋白质。这可通过对SWI/SNF复合物使用BAF250a抗体在 867CL-ARID IA- A L2007,867CL-ARID IA-WT 和 T0V-21G 细胞中进行 IP 来验证。使用针对SWI/SNF核心蛋白的抗体对来自细胞核提取物的SWI/SNF复合物的IP和通过MS/MS的分析已成功地鉴定出了所有待监视的核心蛋白57，58，因此更加敏感的MRM技术亦应会是成功的。MRM分析技术重复的差异小于5%，因此预期将会在SWI/SNF组分的总体汇集中能够检测出各SWI/SNF蛋白相对水平的较小变化(10-20%)。所述实验将无法区分SWI/SNF复合物和不同组成，但应能检测出由于BAF250a的丧失所致的SWI/SNF复合物组成的主要调整。若数据鉴定出强烈的变化，将会进行用于在BAF250a突变系中表征各个SWI/SNF复合物的实验。使用生化大小分级层析和MRM测定，将会确定各个SWI/SNF复合物及其组分的摩尔化学比例。实施例8. 10-ARID1A与染色质的相互作用将会进行实验以确定ARIDlA中的突变是否导致明显的SWI/SNF-染色质相互作用。ARIDlA突变对BAF250a介导的反式激活的作用将会使用萤光素酶报道基因构建体来测定。将会使用ChlP-seq和核酸酶保护测定59来评估野生型和突变体BAF250a蛋白如何差异地与染色质相互作用。ARIDlA突变对反式激活的影响将会获得在萤光素酶报道基因上游含有多个糖皮质激素受体响应元件的XG46TL质粒，将其瞬时转染入四个细胞系(867CL，867CL-ARID1A-WT, 867CL-ARID1A-A L2007，T0V-21G)。将会用地塞米松处理细胞以刺激糖皮质激素，其与SWI/SNF复合物协同作用激活转录；这可通过如前所述对萤光素酶进行定量来评估6°。使用该报道蛋白系统，可直接评估ARIDlA突变对反式激活的作用。ARIDlA突变对BAF250a与DNA相互作用的作用。ARIDlA突变对SWI/SNF复合物结合于染色质的作用将会使用ChlP-seq评估，以鉴定出与SWI/SNF复合物在上述四个细胞系中相互作用的启动子。将会如上所述一式两次进行IP。之前已经描述了 ChlP-seq及其相关分析所需的工具61。选择的覆盖(每文库飞Gbp)将会获得寻找高置信峰同时维持预算范围所需的冗余度。将会用甲醛处理细胞系以交联DNA及其相关蛋白。将会对澄清的细胞裂解液进行声处理以剪切染色质，然后将其与选定的SWI/SNF抗体温育，接着进行过夜Protein A/GSepharose沉淀。将会洗漆并洗脱染色质IP，用其构建Illumina测序文库,并在Illumina流动池的一条泳道中测序。将配对的读取用Exonerate (http://www. eb1. ac. uk厂guy/exonerate)或Maq与参照人基因组进行比对62。对应于染色质的簇集的(clustered)序列标记(峰)的区将会使用FindPeaks软件定义63。不存在于两种生物复制物中或发现与ARIDlA-野生型(867CL-ARID1A-WT, T0V21G)，ARIDlA-突变体(867CL-ARID1A-A L2007，以及ARIDlA-无效(867CL)相同的序列将会从分析中去除。数据将会用MEME64分析以检测任何过度表现的(over-represented)基序,并用TRANSFAC分析以发现已知的转录因子结合位点。最后，将会鉴定接近峰的基因和高度保守的基因间位点。预期在1000个峰的数量级会发现0. 05的假发现率(false discovery rate)。将基于其位置(即祀基因上游的启动子区)，可由这些区转录调节的基因的重要性，和通过从靶向测序和MS实验获得的数据来将这些区域进行优先级排序(prioritize)。该方法会允许在初级数据组中鉴定出高置信DNA-蛋白相互作用，并消除由于散发的或非特异性DNA-蛋白结合所致的信号。感兴趣的相互作用将用正交技术(orthogonaltechnique)包括BAF250a与萤光素酶报道基因上游选定的启动子的相互作用来进行验证。为了确定是否来自ChlP-seq实验的发现受牵涉的基因的表达变化所支持，将从来自867CL、867CL-载体、867CL-ARIDIA-WT 和 867CL-ARID1A- A L2007 细胞系的一式三份的文库生成的数据通过RNA-seq使用edgeR Bioconductor统计学程序包就不同基因表达进行分析65。简言之，edgeR模型根据负二项分布读取对于具体基因的计数数据。使用过度散布的Poisson模型进行差异性基因表达分析，该模型能够说明技术差异和生物学差异二者。所有显示差异性表达和在其启动子区显示伴随的差异ChlP-seq峰检测的基因将选为受ARIDlA突变影响的候选基因。ARIDlA突变对体内核体重构的作用无核体DNA对低浓度核酸酶的消化敏感，ARIDlA突变可反映为核酸酶敏感性的变化。将会评估20个经ChlP-seq鉴定出的ARIDlA靶的核酸酶敏感性，重点关注已知为药物靶的基因或癌基因，它们的ChlP-seq数据对应于经RNA-seq测出的基因表达中的变化。简言之，将来自CCC细胞系的细胞核用低浓度的微球菌核酸酶或DNAaseI处理，导致仅无核体区的DNA被降解。剩余的受保护的DNA用特异于每个靶的引物测序。在有ARIDlA突变时未鉴定出SWI/SNF组成或DNA结合中的变化的情况下，额外评估是否这些突变导致组蛋白的遍在蛋白化的改变，因为近来已证明，BAF250b(ARIDlB的基因产物)是组蛋白H2B在赖氨酸⑷120处的E3遍在蛋白连接酶66。实施例8. 11-在具有ARIDlA突变的CCC中治疗性靶的鉴定将会使用SiRNA文库鉴定对于表达突变体ARIDlA的细胞的存活是必需的基因。任何鉴定出的基因将会是用于开发具有ARIDlA突变的透明细胞癌的治疗剂的潜在靶。将会在ARIDlA突变体透明细胞癌的异种移植小鼠模型中筛选siRNA文库。一种在癌症中鉴定出治疗靶的确立的方法是检索“合成致死”，以称作条件遗传学(conditional genetics)。合成致死的原型实例是BRCAl或BRCA2缺陷条件下的PARP抑制67’68。为了限定将会在携带ARIDlA突变的肿瘤中普遍独特地有效的治疗靶，将会使用构建的siRNA/高内涵(high content)筛选方法进行合成致死(生活力)筛选。完全整合的siRNA筛选设施配置有机器人、流体处理和INCELL 1100高内涵成像仪。本发明人将会使用公开的siRNA/高内涵多参数筛选方法69以测量七个相关于细胞生活力、增殖、细胞周期和相关检查点(checkpoint)的表型参数。筛选的siRNA文库将会是Hannon/El ledge慢病毒-shRNA人文库(大约66，000个构建体)和Dharmacon siGenome汇集,代表大约22，000个基因座。两个文库均内部地就96孔和384孔筛选格式化。优选地，将会使用siRNA文库汇集进行在25nM的筛选。若由于任何原因发现siRNA转染是困难的，则将会使用shRNA文库。将会使用867CL、867CL-ARID1A-AL2007和867CL-ARID1A-WT细胞。若发现使用这些细胞系进行的筛选是无法追踪的，则将会使用HCT116细胞中的ARIDlA的同基因敲除作为第二选择(图8)。将细胞系在384孔板中逐对比较。每个转染平板将会含有对于转染效率，转染毒性和siRNA有效性，以及表型基线测量的对照。在初级筛选中，将会使用所有22，000个siRNA汇集/66000个shRNA (代表目前为止构建的全人基因互补物)。该筛选将会在384孔平板中对三个同基因细胞系进行一式三次。将会使用对照平板(所有平板用相同的非革巴向siRNA转染)以线性混合作用模型(linear mixed effects model)来校正位置作用。将会用25nM的siRNA汇集或慢病毒颗粒视需要以3的MOI来进行转导。每个siRNA汇集或shRNA对细胞生活力、细胞形状和转导效率的作用将会在转染后4日进行测量。将会使用来自每个筛选平板的对照孔(含有PLKl siRNA)来衡量转导效率。所有条件将会一式三份进行评估以允许对于差异的充分评估。在如上所述的图像区段化和定量之后，将会用线性混合作用模型7°分析数据以减少筛选矫作物如孔板边缘作用(wellplate edgeeffect),试剂分配器移液尖作用(reagentdispenser pipette tip effect)等等。将会使用Benjamin1-Hochberg方法对p值进行多重比较调整，并视需要将会使用经验性Bayes收缩(empirical Bayesshrinkage)对于作用估计进行多重比较调整71’72。为了测量合成相互作用的程度，将会根据线性模型调整的值计算出相互作用指数(对于给定siRNA，Wt表型大小对突变体表型大小定标的比例(scaled ratio)。将会对基于排序的合成作用大小和排序的P值最高5%的候选shRNA祀进行分拣(triage)以供随访验证。在初级筛选和初始命中的选择之后，将会对其分别进行重新筛选(汇集解卷积)以供最大程度的区分。重新验证的siRNA亦将会与qRT-PCR(定量逆转录PCR) —同就靶转录物进行测定以确定是否表型与转录物敲低的程度分离。在这些过滤之后仍留下的siRNA将会通过GO-条件和结构等级(GO-termsand structural class)进行分组，以供进一步随访。尽管上文讨论了多种例示性方面和实施方案，本领域技术人员将会知道其一些修饰、排列、添加和亚组合。因此意欲所附权利要求和之后加入的权利要求不受本公开中列出的优选实施方案和实施例的限制，但应给予其与本说明书整体相一致的最广泛解释。参考文献1. Shah SP, Kobel M, Senz J, Morin RD, Clarke BA, Wiegand KC, Leung G, ZayedA, Mehl E, Kalloger SE, Sun M, Giuliany R, Yorida E,Jones S, Varhol R,SwenertonKD, Miller D, Clement PB, Crane C，Madore J, Provencher D, LeungP, DeFazio A, KhattraJ, TurashviIi G, Zhao Y, Zeng T,Glover JN, Vanderhyden B,Zhao C,Parkinson
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1.BAF250a表达的缺乏或ARIDlA作为生物标志物在确定子宫内膜异位进展为卵巢癌的风险中的用途。
2.BAF250a表达的缺乏或ARIDlA作为生物标志物给遭受卵巢癌的受试者提供预后的用途。
3.BAF250a表达的缺乏或ARIDlA作为生物标志物在确定卵巢癌是否很可能响应标准的化疗剂中的用途。
4.权利要求3中限定的用途，其中所述标准化疗剂包括钼或紫杉烷治疗。
5.权利要求1-4中任一项限定的用途，其中所述癌是卵巢的透明细胞癌，子宫内膜样癌，或子宫癌。
6.一种用于确定受试者的子宫内膜异位是否很可能进展为癌的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位的组织样品；和 分析样品的BAF250a表达， 其中BAF250a表达的缺乏表示所述子宫内膜异位有可能进展为癌。
7.一种用于确定癌症受试者的预后的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品的BAF250a表达， 其中BAF250a表达的缺乏表示不良预后。
8.一种用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品的BAF250a表达， 其中BAF250a表达的缺乏表示标准的化疗剂不太可能有效。
9.权利要求6-8任一项限定的方法，其中分析样品的BAF250a表达的步骤包括使用对BAF250a具特异性的抗体进行的免疫组化。
10.一种用于确定受试者的子宫内膜异位是否很可能进展为癌的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在， 其中ARIDlA基因中显著突变的存在表示所述子宫内膜异位有可能进展为癌。
11.一种用于确定癌症受试者的预后的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在， 其中ARIDlA基因中显著突变的存在表示不良预后。
12.一种用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得所述癌的组织样品；和 分析样品中ARIDlA基因突变的存在， 其中ARIDlA基因中显著突变的存在表示标准的化疗剂不太可能有效。
13.权利要求10-12中任一项限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括对ARIDlA基因进行测序。
14.权利要求13中限定的方法，其中对ARIDlA基因进行测序包括Sanger测序或对由ARIDlA基因产生的mRNA进行测序。
15.权利要求10-12中任一项限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括使用突变检测方法。
16.权利要求15中限定的方法，其中分析样品中ARIDlA基因突变的存在的步骤包括使用基于PCR的检测方法或荧光原位杂交。
17.权利要求10-16中任一项限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变包括无义突变或显著的错义突变。
18.权利要求10-16中任一项限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变包括SEQID NO:2至SEQ ID NO: 122中列出的突变之一。
19.一种用于确定子宫内膜异位是否可能进展或转化为癌，用于确定癌症受试者的预后，或用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位或癌的组织样品；和 分析样品中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的表达； 其中作为SWI/SNF复合物组分的至少一种蛋白质的表达的缺乏表示子宫内膜异位有进展或转化为癌的风险，预后不良，或标准的治疗剂不太可能有效地治疗该癌。
20.权利要求19中限定的方法，其中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质包括下述一种或多种BAF250b，BAF200, BRM, BAF155, BAF60a, BAF60b, BAF60c, BAF57, BAF53a, BAF53b,或BAF47。
21.权利要求19中限定的方法，其中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质包括下述一种或多种BRG1，BAF180，或 BAF170。
22.权利要求19-21中任一项限定的方法，其中分析样品中作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的表达的步骤包括免疫组化。
23.一种用于确定子宫内膜异位是否可能进展或转化为癌，用于确定癌症受试者的预后，或用于确定在癌症治疗中标准的化疗剂是否很可能有效的方法，所述方法包括下述步骤 获得子宫内膜异位或癌的组织样品；和 分析样品中一种或多种作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的编码基因中突变的存在； 其中至少一种所述基因中的显著突变表示子宫内膜异位有进展或转化为癌的风险，预后不良，或标准治疗剂不太可能有效地治疗该癌。
24.权利要求23中限定的方法，其中分析样品中突变的存在的步骤包括对样品中的所述一个或多个基因进行测序。
25.权利要求23中限定的方法，其中分析样品中突变的存在的步骤包括使用基于PCR的检测方法或荧光原位杂交。
26.权利要求23-25中任一项限定的方法，其中所述一种或多种基因中的突变包括无义突变或显著错义突变。
27.权利要求23-25中任一项限定的方法，其中所述一种或多种基因包括ARID1B，ARID2, SMARCA2, SMARCCI, SMARCD1， SMARCD2， SMARCD3， SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B,或SCMARCBI ο
28.权利要求23-25中任一项限定的方法，其中所述一种或多种基因包括SMARCA4，PBRM1，或 SMARCC2。
29.权利要求28中限定的方法，其中所述一种或多种基因中的突变包括SEQIDNO: 123 或 SEQ ID NO: 124 所示 SMARCA4, PBRM1，或 SMARCC2 中的突变之一。
30.权利要求6-29中任一项限定的方法，其中所述癌是卵巢的透明细胞癌，子宫内膜样癌，或子宫癌。
31.权利要求8、12或23-30中任一项限定的方法，其中所述标准的化疗剂包括钼或紫杉烧治疗。
32.一种用于筛选有ARIDlA基因的一个或多个突变的细胞存活所必需的基因的方法，所述方法包括下述步骤 提供具有ARIDlA基因突变的细胞系； 使用基因文库进行合成性致死筛选；和 鉴定有ARIDlA基因突变的细胞系的存活所必需的基因。
33.权利要求32中限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变包括SEQIDNO:l至SEQ IDNO: 122中列出的突变之一。
34.权利要求32中限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变包括ARIDlA-ΛL2007。
35.权利要求32中限定的方法，其中ARIDlA基因中的突变编码由SEQIDΝΟ:1至SEQID NO: 122编码的BAF250的多种突变形式之一。
36.一种用于筛选有作为SWI/SNF复合物组分的蛋白质的编码基因一个或多个突变的细胞的存活所必需的基因的方法，所述方法包括下述步骤 提供具有所述一个或多个基因的突变的细胞系； 使用基因文库进行合成性致死筛选；和 鉴定对于在所述一个或多个基因中具有突变的细胞系的存活所必需的基因。
37.权利要求36中限定的方法，其中所述一种或多种基因包括ARID1B，ARID2，SMARCA2, SMARCCI, SMARCDI, SMARCD2, SMARCD3, SMARCEI, ACTL6A, ACTL6B，或 SCMARCB1。
38.权利要求36中限定的方法，其中所述一种或多种基因包括SMARCA4，PBRM1，或SMARCC2。
39.权利要求38中限定的方法，其中所述突变是SEQID NO: 123或SEQID NO: 124所示SMARCA4, PBRM1，或 SMARCC2 中的突变之一。
40.权利要求36中限定的方法，其中在所述一种或多种基因中的突变编码由SEQIDΝΟ:123 或 SEQ ID NO: 124 编码的 BRG1，BAF180，或 BAF170 的突变体形式之一。
41.权利要求32-40任一项中限定的方法，其中用于合成性致死筛选中的基因文库包括 Hannon/El ledge 慢病毒-shRNA 人文库或 Dharmacon siGenome 集合。
42.—种开发可用于处理癌症的治疗剂的方法,其包括筛选对权利要求32-4之一的方法鉴定出的任何基因的表达进行抑制的试剂，或对权利要求32-41之一的方法鉴定出的任何基因所编码的蛋白产物的功能进行抑制的试剂。
43.一种治疗癌症的方法，包括将治疗量的由权利要求42中限定的方法鉴定的试剂施用于患者。
44.权利要求43中限定的治疗癌症的方法，其中所述癌症包括卵巢的透明细胞癌、子宫内膜样癌、或子宫癌。
全文摘要
公开了与卵巢癌，特别是透明细胞癌、子宫内膜样癌和子宫癌相关的新颖的生物标志物和靶。在构成SWI/SNF染色质重构蛋白复合物一部分的蛋白质的编码基因包括ARID1A中的突变，或此类蛋白包括BAF250a的表达的缺失，可用于衡量子宫内膜异位会进展或转化为癌症的可能性，对于患有癌症的患者提供预后，评估常规治疗是否可能对于癌症有效，和/或在合成性致死筛选中鉴定用于治疗癌症的新颖的靶和治疗物。
文档编号C40B30/00GK103026227SQ201180031350
公开日2013年4月3日 申请日期2011年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者D.G.亨茨曼, M.马拉, K.威甘德, M.赫斯特, S.P.谢 申请人:不列颠哥伦比亚省癌症分社