高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，具体涉及高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株。本发明首先所要解决的技术问题是对嗜酸环境微生物进行氟耐受性驯化，提供一种高耐氟的铁氧化菌株。本发明的菌株最适pH为2.0，最适温度30-35℃，该菌在含氟100mg/L的9K培养基中71小时将5g/LFe2+完全氧化；可使其在需求高氟浓度的工业生产上应用。
【专利说明】高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体涉及高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株。
【背景技术】
[0002]氟，气体元素，符号F，原子序数9，是非金属中最活泼的元素。其在地壳中元素排名第13位，是地球上分布最广的元素之一。卤族元素，淡黄色，有毒，腐蚀性很强，化学性质很活泼，可以和部分惰性气体在一定条件下反应。氟离子对多种细菌如变形链球菌、氧化硫硫杆菌、中度嗜热嗜酸菌等细菌具有抑制和杀伤作用。氟离子杀菌机制包括:破坏细胞膜的结构，影响细胞的ATPase的活性，抑制多种代谢酶如烯醇酶等。细菌对氟离子的抗性机制包括:将无机氟离子转化为有机氟离子， [0003]由氣化物核糖开关控制相关蛋白表达和逆向运输蛋白EriC对F的运输等。
[0004]许多研究发现较低浓度的氟离子(超过lmg/L)就会对人体的健康产生很明显影响。然而世界上许多地区的人还在大量饮用含高浓度氟化物的饮用水。氟化物的毒性作用已成为一个重要的公共安全问题。因此，如果找到一种能够在自然条件下吸附或转化饮用水中氟离子的微生物，这个安全问题将会得到解决。近来，微生物降解氟的能力越来越受关注，如果我们知道了微生物抗氟机制，将对利用抗氟微生物来治理被氟污染的水资源问题有很大帮助，也将有潜在的工业应用价值。另外，氟化物被用作防龋剂已有很长的历史，1933年Ainsworth等人注意到在斑釉流行地区，龋患率较低，说明氟化物对引起龋齿的变形链球菌等有很好的抑制作用。但是，随着近年来为提高并维持菌斑内较高氟水平而在局部高频、高浓度、长时间应用氟化物，导致耐氟菌株的选择性生长，而耐氟菌株的出现，严重影响了利用氟化物的防龋效果。如果我们对微生物抗氟机制有了深入的了解，将对氟化物防龋齿的原理理解的更加透彻，从而应用到生产中，制造出有更好防龋齿能力的产品。
[0005]饮用水安全问题和防龋齿的问题都关系到人类的健康，与我们的生活密切相关。所以需要加强针对微生物抗氟机制的研究，找到一种安全的、高效的途径来吸附和转化氟离子变得更加迫切。
[0006]生物冶金技术中，一些金属矿石中常因氟含量较高抑制冶金菌的活性而制约了金属的提取效率。选育具有强抗氟性能的嗜酸性冶金菌并研究其抗氟机制，是解决该类金属矿石生物冶金技术工业应用的前提。
[0007]但是目前关于微生物对氟离子的抗性方面的研究很少，因此，分离和确定与细菌耐氟相关的基因，并研究其耐氟的机制，将对深入理解细菌对氟的抗性以及细菌对阴离子的抗性机制有着重大的理论意义，同时也为解决一些需要在高氟环境下发挥功能的细菌的生长问题以及更好的利用氟离子来杀死有害菌等应用问题奠定良好的基础。
[0008]本发明从某铀矿含氟浸铀尾液这一极端嗜酸环境中分离出嗜酸氧化亚铁硫杆菌，并利用 pHl.8 的 9K (Σ Fe 约 5g/L，其中 Fe2+ 约 4.8g/L)+NaF (其中[ ]在 60mg/L_120mg/L之间)培养基，30°C，120rpm振荡驯化。驯化试验表明，该菌在含氟100mg/L的9K培养基中71小时将5g/L Fe2+完全氧化；在含氟120mg/L的9K培养基中则生长迟缓，经99.5小时仅可氧化2.4g/L Fe2+。为解决一些需要在高氟环境下发挥功能的细菌的生长问题以及更好的利用氟离子来杀死有害菌等应用问题奠定良好的基础。
【发明内容】
[0009]基于目前关于微生物对氟离子的抗性方面研究的不足，本发明的目的是从特色的嗜酸环境-某铀矿含氟浸铀尾液中分离嗜酸氧化亚铁硫杆菌，并进行耐氟驯化，从而研究高氟环境下发挥功能的细菌的生长问题以及更好的利用氟离子来杀死有害菌等应用问题。
[0010]本发明提供了高耐氟的菌株，该细菌菌株命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillus ferrooxidans LLS-4,于2012年4月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是:CGMCC N0.5988。
[0011]根据本发明的【具体实施方式】，从某铀矿含氟浸铀尾液中分离嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株，其分离方法是:取尾液20mL，加入到80mL9K培养基(pH3.0)中30°C、160rpm振荡培养至其中95%以上Fe2+氧化为Fe3+后，经三次转代培养，使24小时内可完全氧化4.5-5.0g/L Fe2+。取富集培养物在iFeO琼脂糖双层固体培养基上划线分离，获得单菌落，重复划线
2-3次以获得纯培养，挑取单菌落至lmL9K培养基中活化至Fe2+完全氧化，扩大培养后保藏于-80°C超低温冰箱。
[0012]因此，本发明还提供了上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillusferrooxidans LLS-4用于高氟环境下氧化Fe2+的应用。
[0013]根据本发明的【具体实施方式】，上述嗜酸氧化亚铁硫杆菌在初始pHl.8的9K (Σ Fe约 5g/L，其中 Fe2+ 约 4.8g/L)+NaF (其中[F_] =60mg/L_120mg/L)培养基中接种 20%，30°C，120rpm培养。该菌在含氟100mg/L的9K培养基中71小时将5g/LFe2+完全氧化；在含氟120mg/L的9K培养基中则生长迟缓，经99.5小时仅可氧化2.4g/L Fe2+。
[0014]本发明首先所要解决的技术问题是对嗜酸环境微生物进行氟耐受性驯化，提供一种高耐氟的菌株。本发明的菌株最适pH为2.0,最适温度30-35°C,该菌在含氟100mg/L的9K培养基中71小时将5g/LFe2+完全氧化；可使其在需求高氟浓度的工业生产上应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1菌在不同初始PH值培养条件下的铁氧化速率；
[0016]图2菌在不同温度培养条件下的铁氧化速率。
[0017]嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillus ferrooxidans LLS-4,于 2012 年 4 月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏编号是:CGMCC N0.5988。
【具体实施方式】
[0018]实施例1菌株分离
[0019]9K 液体培养基(g/L):A 液:(NH4) 2S043.0，KC10.1，Κ2ΗΡ040.5，MgS04.7Η200.5，Ca(N03)20.01，蒸馏水600mL，pH2.0，灭菌备用。B液:FeS04.7Η2044.7，蒸馏水400mL，ρΗ2.0，
灭菌备用。接种前将Α液和B液混合。[0020]iFeO 琼脂糖双层固体培养基:A 液:50XHBS8ml、TES0.4ml、dH20276ml, pH2.5 ；B液:agarose (Sigma Typel) 2.8g, H20100ml ；C 液:FeS04.7H201mol/l ;最终 pH2.5。
[0021]该培养基制备方法:将上述A液和B液分别高压蒸汽灭菌，待冷却至50°C左右(B液可稍高至65°C )后混合，再加入10ml溶液C，混匀。立即将此混合液平均分装在两个无菌玻璃瓶中。瓶1 (瓶2置50-60°C水浴锅中保温，保持其溶解态)接种5ml的活性菌SJH，混匀后立即倒入直径9cm的培养皿作为下层培养基(约15-20ml )，待其凝固后再迅速倒入瓶2的混合液作为上层培养基。一般平板置于室温洁净处2-3d后方可使用，或置4°C冰箱冷藏备用。[0022]取含氟浸铀尾液20mL，加入到80mL9K培养基(pH3.0)中30°C、160rpm振荡培养至其中95%以上Fe2+氧化为Fe3+后，经三次转代培养，使24小时内可完全氧化4.5-5.0g/LFe2+。。取富集培养物在琼脂糖双层固体培养基上划线分离，获得单菌落，重复划线2-3次以获得纯培养，挑取单菌落至lmL9K培养基中活化至Fe2+完全氧化,扩大培养后保藏于_80°C超低温冰箱。
[0023]利用体视显微镜和相差显微镜分别观察分离到的菌株菌落形态和菌体形态。LLS-4单菌落在液体培养基中，培养液由浅绿色经淡黄色变为红棕色，过程中有沉淀产生。固体培养基上的菌落个体较小，形态呈自中心铁锈红色向外逐渐变浅褐、黄色的扩展的圆形，边缘光滑，无透明圈。该菌为革兰氏阴性菌，短杆状。本发明的菌株最适pH为2.0，生长温度为30-35°C。经16S序列比对发现其属于嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillusferrooxidans,因此，将菌株LLS-4命名为嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillusferrooxidans LLS-4。
[0024]实施例2嗜酸氧化亚铁硫杆菌Acidithiobacillus ferrooxidans LLS-4氟耐受性分析
[0025]氟耐受性驯化培养基:9Κ(Σ Fe约5g/L，其中Fe2+约4.8g/L)+NaF(其中[F-]=60mg/L-120mg/L), PH1.8。
[0026]具体方法如下:培养基初始PH1.8，30°C，120rpm条件下接种20%菌液驯化，驯化过程中，每一氟浓度中铁氧化活性稳定后接种至高一级氟浓度培养基。经驯化，该菌在含氟100mg/L的9K培养基中71小时将5g/L Fe2+完全氧化；在含氟120mg/L的9K培养基中则生长迟缓，经99.5小时仅可氧化2.4g/L Fe2+。该研究结果表明该菌株适合于生物浸矿的应用，尤其在生物脱硫、生物冶金、有色金属回收等领域。
【权利要求】
1.高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆 菌菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCN0.5988。
2.权利要求1所述高耐氟的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株用于高氟环境下氧化Fe2+功能的应用。
【文档编号】C22B3/18GK103642732SQ201310651859
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】李江, 刘亚洁, 徐玲玲, 王学刚, 孙占学, 徐蔚云, 陈功新, 万然, 石鹏君, 姚斌 申请人:东华理工大学