一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片的制作方法
【专利摘要】一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，该基因诊断芯片共有96个突变点序列，其中Parkin23个，PINK119个，DJ-16个，ATP13A214个，PLA2G625个，FBXO79个。其检测步骤包括：制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数据分析。本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，耗资少，能方便、快速进行帕金森病隐性致病遗传基因的筛查。
【专利说明】一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因诊断芯片，尤其是涉及一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片 O
【背景技术】
[0002]帕金森病(parkinson，sdisease, F1D),又称震颤麻痹(paralysis agitans),是一种常见的神经系统退行性疾病，病理以黑质多巴胺(Dopamine，DA)能神经元的丢失和残存神经元胞体内路易小体(Lewy body，LB)的形成为特点。一般认为帕金森病与遗传、环境、衰老等多种因素有关。随着分子生物学的发展，遗传因素在帕金森病的发病机制中起到的作用越来越受到关注。目前至少定位了 18个帕金森病的致病基因位点，并克隆了 13个致病基因。从遗传方式看，F1D可呈常染色体显性遗传(autosomal dominant prkinson’ sdisease, AD-PD)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive parkinson，s disease,AR-PD)，一些病例呈散发。通常帕金森病多见于老年人，英国人群中H)发病率为140/十万，约3.6%的H)病人发病年龄小于45岁，称为早发性帕金森病，较晚发性帕金森病人更容易表现出家族聚集性。ro可由不同基因的不同突变引起，因此，找寻及鉴定本病的致病基因不仅是了解、阐明本病发病的必须途径，同时也是建立本病的基因诊断和基因治疗的先决条件。
[0003]由于基因的突变是本病发生的原因之一，从长远看，对突变的鉴定使我们有可能使用纠正突变的基因疗法或其他针对这一突变的生物学效应的方法去治疗本病。迄今为止，PD已发现了 13个致病基因，其中与AD-H)相关的致病基因有7个，分别为5ΛΟ、UCH-L1、LRRK2、GIGYF2、0mi/HTRA2、VPS35、EIF4G1,与 AR-PD 相关的致病基因有 6 个，分别为Parkin、PINK1、DJ-1、ATP13A2、PLA2G6、FBXO7。这些致病的突变类型包括:错义突变、无义突变、插入突变、缺失突变、剪切位点突变、重排突变、移码突变、大片段缺失等多种类型，而点突变占有很重要的地位。对于基因微突变检测，目前多采用PCR结合DNA直接测序法，结果直观、可靠，但由于H)致病基因多，且很多致病基因序列长，应用PCR结合DNA直接测序法逐个进行基因检测筛查耗时长、耗资大。而目前已知在某些致病基因中可能存在相对常见的突变热点，如国内外报导的基因IVS9+18CXT可能为隐性遗传H)的热点突变，如能建立对ro隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术将大大提高ro的基因诊断效率，降低基因检测成本。
[0004]由于帕金森病存在临床异质性及多基因遗传，给基因检测带来巨大困难，且需要耗费相当大的人力和物力。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种耗资少，能方便、快速进行筛查的帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片。
[0006]本发明解决所述技术问题所采用的技术方案是:本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片共有96个突变点序列，包含Parkin23今、PINKl 19 个、DJ-1 6个、ATP13A2 14个 个、PLA2G6 25 个、9 个。
[0007]本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片96个突变点序列的设计步骤:(I)利用 pubmed 数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed)和万方数据库(http://www.wanfangdata.com.cn)在线查阅帕金森病隐性遗传致病基因相关文献,检索词分别为“parkinson’ s disease OR PD”和“帕金森病OR H)”，选择帕金森病导致隐性遗传方式各基因中已报导的点突变(错义突变或剪切位点突变)位点，UCSC Genome Bioinformatics网站(http://genome, ucsc.edu)在线查询相应序列，突变点上下游各包含60个碱基,突变位点等位基因用“/”分开(TAG[T/G]ACG)，将每个位点编号，输入序列、染色体定位信息，以EXCEL文档保存；(2)将初步选定的点突变位点的序列文档，用芯片设计软件(AsaayDesign Tool, ADT)进行评分,得到评分文件,包含设计成功率、最小等位基因频率(minorallele frequencies.MAFs)； (3)合分析各位点评分结果,除去错误序列，选择设计成功率评分大于0.5的位点，进入下一步分析；(3)选择热点突变，选择的突变点，确保两序列之间距离大于60bp，突变点上下游各包含60bp，以避免交叉，影响芯片质量，最终确定96个突变点序列；(4)将SNPs资料交由Illumina公司制备成HSP GoldenGate Universal-32BeadChips基因诊断芯片。
[0008]本发明之帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针。
[0009]本发明建立起基于这一基因的诊断技术，对临床上可疑隐性遗传帕金森病及散发早发性患者进行确凿的基因水平的诊断，能立即得到较可靠的结果，其早期诊断率将大大提高，从而降低误诊率，有利于治疗。
[0010]本发明可建立ro隐性遗传致病基因常见突变热点的基因筛查技术，将本发明之芯片应用于ro隐性遗传家系病人及散发早发性ro病人突变检测，耗资少，能方便、快速的对ro隐性遗传家系患者及散发早发性ro患者进行筛查，由于有多位点，可以有效地减少因个体差异所引起的漏检。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为Parkin基因c.850G>C突变位点的基因分型示意图。
【具体实施方式】
[0012]以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
[0013]本发明之帕金森病基因诊断芯片共有96个突变点序列，均为AR-PD，其中Parkin23个、PINKl 19 个、C7 6 个、ATP13A2 14 个、PLA2G6 25个、FBX07 9 个。
[0014]本发明之帕金森病基因诊断芯片是在光纤微珠上固定能与突变点杂交的探针，所述探针的序列表为:
【权利要求】
1.一种帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，其特征在于，帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片共有96个突变点序列，均为常染色体隐性遗传，其中Parkin 23个，PINKl 19个，DJ-1 6个，ATP13A2 14个，PLA2G6 25个，FBX07 9个；所述96个突变点序列分别位于SEQ ID NO: 1- 96 的序列。
2.根据权利要求1所述的帕金森病隐性遗传致病基因诊断芯片，其特征在于，采用Illumina GoldenGate高通量基因芯片，检测步骤包括:制作SUD板；沉淀SUD板；重悬SUD板；制作ASE板；加MEL ；PCR前期工作；PCR产物的结合；芯片前样品准备；芯片杂交；清洗芯片；芯片扫描及数据读取；数`据分析。
【文档编号】C40B40/06GK103667500SQ201310734649
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】郭纪锋, 唐北沙, 严新翔, 娄明星 申请人:中南大学湘雅医院