单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用的制作方法

单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。该构建方法包括以下步骤：对单细胞中的RNA进行反转录得到cDNA；用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。本发明的上述构建方法，通过将预扩增引物中的dTTP替换为dUTP，使得在接头连接之后的酶消化步骤能将带接头片段中含有预扩增引物的片段打断，并在后续高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而大大提高了产出数据的有效数据量。
【专利说明】单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建 方法及其应用。

【背景技术】
[0002] 对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞 中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前 市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品一般在获得预扩 增cDNA后米用Illumina公司的DNA文库构建试剂盒（illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)〇
[0003] Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对 cDNA进行打断的方式建库。单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预 扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断的同时 会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破 碎片段的两端带上标签序列（index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签， 以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。Illumina公司的上述DNA 文库构建试剂盒具有能从低至Ing的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但采用上述试 剂盒所构建的测序文库存在插入峰很宽的问题，大约在300bp?IOOObp之间。文库峰宽的 宽窄会对上机定量的准确性产生影响，进而影响上机量和产出。文库峰宽越宽，定量的偏差 就越大。因而存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出 过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。
[0004] 为了克服上述缺陷，现有技术中采用物理破碎的方式对反转得到的CDNA进行打 断，使破碎片段较小且相对均匀，进而使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集 中；且片段化后的样品不经纯化步骤减少了样品损失不仅能够实现微量样品的单细胞转录 组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组 文库高通量测序的可靠性。
[0005] 但在打断之前都需要经过预扩增的步骤，以使cDNA的量能够满足建库所需，然而 这种物理破碎的方式对cDNA进行打断，会使得所构建的文库中含有预扩增的引物污染，约 占数据总量的20%，造成数据的浪费。
[0006] 因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库的构建方法进行改进，以减少所构 建的文库中的预扩增引物污染。


【发明内容】

[0007] 本发明的主要目的在于提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，用 以减少所构建的文库中的预扩增引物污染片段。
[0008] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单细胞转录组测序文库 的构建方法，该构建方法包括以下步骤：直接对单细胞的RNA进行反转录得到cDNA ;用扩增 引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA ;对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的 转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。
[0009] 进一步地，对cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：步骤SI，对cDNA采用物理破 碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2,对片段化不经过纯化直接进行末端修复， 同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3,对修复后样品进行接头连接， 得到带接头样品；步骤S4,对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。
[0010] 进一步地，在得到带接头样品之后，以及对带接头样品进行扩增之前，还包括对带 接头样品进行消化的步骤，消化步骤中用ESUR酶进行消化。
[0011] 进一步地，物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪CovariS S220对 cDNA进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化时的参 数设置为：循环数8%?12%，峰值入射功率170?180瓦；循环数/爆发200?220个； 时间300?360s ;温度4?8°C。
[0012] 进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化后得到的 片段化样品的长度为150?200bp。
[0013] 进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之 前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNASpeedlllV 离心浓缩系统。
[0014] 进一步地，在步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对片段化样品不经纯 化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，末端修复酶试剂组合包括IOX的 NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；在步骤S3中采用NEB公司的 平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对修复后样品进行接头连接；在步骤S4 中采用KAPA BIO公司的2X的KaPA HiFi反应混合物对接头样品进行扩增。
[0015] 进一步地，当片段化样品的量低至3ng时，在步骤S3中，对接头进行稀释后再进行 接头连接；优选将接头稀释至1. 0?2. 0 μ M ;更优选稀释至1. 5 μ M。
[0016] 进一步地，在步骤S4中，扩增的循环次数为10?15次，优选13次。
[0017] 根据本发明的另一方面，提供了上述任一种构建方法在研究细胞异质性方面的应 用。
[0018] 应用本发明的技术方案，在常规的单细胞转录组文库构建的基础上，通过将预扩 增引物中的dTTP替换为dUTP，使得本发明的在接头连接之后进行的酶消化步骤，不仅能够 将U型接头打断使双链分别带上接头序列，而且能将带接头片段中含有预扩增引物的片段 打断，并在后续文库扩增步骤的高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物 的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而 大大提高了产出数据的有效数据量。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0020] 图1示出了本发明的单细胞转录组测序文库构建流程的示意图；
[0021] 图2示出了本发明的实施例中反转录得到的片段的大小；
[0022] 图3示出了按照本发明的方法所构建的文库的大小；
[0023] 图4示出了本发明所构建的文库中GC分离度和GC含量图；以及
[0024] 图5示出了对本发明的文库中的插入片段的评估结果。

【具体实施方式】
[0025] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0026] 在本发明中的术语"单细胞"是指单一类型细胞的单个细胞；"微量样品"是指起 始量在3?20ng的cDNA样品。
[0027] 正如【背景技术】部分提到的，为了减少所构建的单细胞转录组测序文库的产出数据 中的引物污染数据，在本发明一种典型的实施方式中，如图1所示，提供了一种单细胞转 录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：对单细胞中的RNA进行反转录得到 cDNA ;用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA ;对扩增cDNA进行片段化文库构建， 得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。
[0028] 本发明的上述构建方法，在常规的单细胞转录组文库构建的基础上，通过将预扩 增引物中的dTTP替换为dUTP，使得本发明的在接头连接之后进行的酶消化步骤，不仅能够 将U型接头打断使双链分别带上接头序列，而且能将带接头片段中含有预扩增引物的片段 打断，并在后续文库扩增步骤的高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物 的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而 大大提高了产出数据的有效数据量。
[0029] 在本发明的上述文库构建方法中，在单细胞样品裂解后，直接将细胞中的mRNA反 转录成双链cDNA。反转录的步骤通常包括：由细胞样品进行反转录，得到第一链cDNA ;对第 一链cDNA进行扩增，得到双链的cDNA。
[0030] 对上述得到的第一链cDNA和双链cDNA最好都经过纯化的步骤，纯化的步骤能够 使得样品的纯度更高，提高后续构建所得到文库的质量。该步骤中可以采用市售的纯化试 剂盒进行相应的纯化步骤，在本发明中，优选使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠进 行纯化，该纯化方法纯化效率高，纯化速度快，且操作更方便。
[0031] 在本发明的一种优选的实施例中，对cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：步骤 SI，CDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2,对片段化样品不经过 纯化直接进行末端修复和添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3,对修复 后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4,对带接头样品进行扩增，得到单细胞转录 组的测序文库。
[0032] 在上述实施例中，采用物理破碎的方式进行片段化，相比化学破碎的方式（转座 酶随机打断的方式），物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化具有使破碎得到的片段大 小的较小，且能使破碎片段大小较为集中，片段大小相对均匀，使得后续对文库定量检测的 准确度大大提高，进而使得上机扩增成簇步骤中各插入片段的扩增效率相对均等，减少了 偏差扩增现象，使数据量产出更稳定，进而避免因为数据量产出不足需要额外加测而耽误 项目周期或者数据量产出过多浪费成本。且对上述片段化样品不经过纯化直接进行后续步 骤，能减少样品损失，使本发明的上述构建方法能够适用于单细胞转录组的文库构建。
[0033] 在本发明又一种优选的实施例中，在上述接头连接得到带接头样品步骤后，进行 USER酶消化的步骤。在现有的单细胞转录组测序文库构建方法中，该步骤也存在，但现有技 术中，预扩增阶段所使用的引物中是带有dTTP的碱基序列，因此USER酶消化的目的仅是为 了将所加的U型接头打断，以使双链都带上接头序列。而在本发明中，在步骤中进行USER 酶消化的目的不仅为了将U型接头打开，另一个更主要的作用是：是为了将目的片段文库 带有dUTP的扩增引物片段进行消化，从而降低预扩增引物的污染，提到扩增后文库中目的 片段的相对含量，进而提到产出数据的有效量。
[0034] 在文库构建方法中，对样品进行物理破碎的方式通常采用超声破碎，适用于本 发明的超声破碎仪包括DNA切割超声破碎仪Q800R或自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220。物理破碎方式具有重复性好，得到的片段较小，使所构建的文库的峰宽较窄的优点。 在本发明一种优选的实施例中，采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片 段化。更优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片段化时的参数设置为： 循环数8?12%，峰值入射功率170?180瓦；循环数/爆发200?220个；时间300? 360s ;温度 4 ?8°C。
[0035] 在上述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化的步骤 中，得到的片段化样品的长度为150?200bp。发明人通过大量的实验发现，当设置Covaris S220的参数在上述范围内时，通常可得到长度为150?200bp的片段化样品，这使得所构建 的转录组测序文库的峰宽集中在270?320bp，提高文库定量的准确性，从而提高了产出数 据量的稳定性。
[0036] 在上述采用物理破碎方式得到片段化样品后，通常还需要经过磁珠纯化或过吸附 柱纯化的方法对片段化的样品进行纯化浓缩。但在本发明中，当片段化样品的体积大于末 端修复酶反应体系所要求的最小体积时，在进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样 品进行浓缩的步骤。此处的浓缩不是用磁珠纯化或者过柱子的浓缩方法，而是采用浓缩仪 浓缩的方法，能够更大程度地既避免片段化的样品损失。在本发明一种优选的实施例中，采 用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV 离心浓缩系统。通过浓缩 步骤使片段化样品的浓度得到相对提高，并且符合文库构建试剂盒的体系要求。当片段化 样品的体积小于反应体系所需的最小体积时，可通过加高纯水稀释至所需的最小体积。
[0037] 在上述所说的文库构建中，在上述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组 合，其末端修复酶试剂组合包括IOX的NEBNext末端修复反应缓冲液（IOXNEBNext End Repair Reaction Buffer)和 NEBNext 末端制备酶混合物（NEBNext End Prep Enzyme Mix);经发明人的大量实验验证,上述末端修复酶试剂组合在一步反应中完成修复与加 A 的步骤，方便快捷，减少出错几率。在上述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端 连接酶混合物（Blunt/TA Ligase Master Mix)和NEBNext接头进行接头连接的步骤，该连 接酶混合物对接头的连接效率较高，利于增加最终的文库产量。在步骤S4中采用2 XΚΑΡΑ. BIO公司的KaPAHiFi反应混合物进行扩增，采用这种聚合酶扩增稳定性好，保真性更高，且 对于高GC含量模板的扩增一样有效。上述各步骤中所用到的试剂并不仅限于上述几种，只 要能够达与上述几种效果相当或更好的市售试剂或自配制试剂同样适用于本发明。
[0038] 在上述转录组测序文库构建的过程中，根据所得到片段化样品的总量适当调整接 头的用量。根据发明人大量实验所得的经验，当片段化样品的量在低至3ng时，在进行接 头连接的步骤中，先对接头进行稀释至1. 〇?2. O μ M ;优选稀释至1. 5 μ M后再进行接头连 接。将上述接头浓度稀释至上述浓度范围时，既能与建库起始量低相匹配，又能减少接头使 用量，还可以避免接头污染。这样，本发明的这种方法也能够由相对较低的起始量实现单细 胞转录组测序文库的构建。
[0039] 由于Illumina公司的DNA文库构建试剂盒采用双标签序列（index)，当有多个样 品需要上机时，无法与其他样品混合在一个通道（lane)中进行测序，而需要单独占用一个 通道来进行测序，这样造成测序仪器空间的浪费和测序成本的增高。而本发明通过使用单 端带有标签序列的引物进行扩增，使得所构建的文库能够与其他具有单端标签序列的样品 的文库进行混合测序，从而减少资源浪费，降低成本。
[0040] 在本发明的上述扩增步骤中，一般扩增循环次数为10次，在此基础上，在不同的 样品测序文库的实际构建过程中，可根据片段化样品的起始量的多少对循环次数进行调 整。在本发明中优选上述扩增循环次数为10?15次，更优选13次。将扩增次数控制在上 述范围内，既能实现对片段化样品的有效扩增，使其满足上机测序浓度的要求；又不至于造 成片段化样品的过度扩增，造成非特异性扩增从而减少测序数据的实际有效量。
[0041] 由于本发明的上述构建方法能够有效提高单细胞转录组测序文库的测序质量，提 高所测数据的有效量，这为单细胞生物学的研究提供了一种新的研究手段。因此，本发明的 上述单细胞转录组测序文库的构建方法能够应用于细胞异质性的研究。
[0042] 下面将结合实施例来进一步说明本发明的有益效果。
[0043] 下列实施例是参照附图1，以猪卵细胞样品进行详细说明本发明的构建方法。下 列实施例中所涉及的方法如无特别说明均为常规方法，前期反转和预扩增所用的试剂来自 Clontech公司；2XKaPA HiFi反应混合物（Master Mix)购自美国ΚΑΡΑ. BIO公司；其他试 剂如无特别说明均为NEB公司的产品；所有水为超纯水。
[0044] 实验一、第一链cDNA的合成（在洁净工作室）
[0045] 1)配制细胞裂解液：裂解液（Triton-X-100溶液） 19 μ L
[0046] RNA酶抑制剂 IyL
[0047] 总体积 20 μ L。
[0048] 2)单细胞样品制备：取1 μ L含单个猪卵细胞的培养基转移至含有2. 5 μ L细胞裂 解液的无 RNA酶的200 μ L PCR管中，然后立即置于干冰上。
[0049] 3)将单细胞样品放置在经-20°C预冷的PCR管架上，向其中加入3'SMART⑶S引 物II A (12 μ M) 1 μ 1。混匀各组份，然后瞬时离心，将反应管放在PCR仪中，72°C，孵育3min。 然后将反应管放回预冷的PCR架中。
[0050] 与此同时，在室温中混匀以下试剂：
[0051]

【权利要求】
1. 一种单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步 骤： 对单细胞中的RNA进行反转录得到cDNA ; 用扩增引物对所述cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA ; 对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，将扩增引物 中的dTTP替换为dUTP。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对所述cDNA进行片段化文库构建的 步骤包括： 步骤S1，对所述cDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品； 步骤S2,对所述片段化不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷 酸，得到修复后样品； 步骤S3,对所述修复后样品进行接头连接，得到带接头样品； 步骤S4,对所述带接头样品进行扩增，得到所述单细胞的转录组测序文库。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述带接头样品之后，以及对 所述带接头样品进行扩增之前，还包括对所述带接头样品进行消化的步骤，所述消化步骤 中用USER酶进行消化。
4. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式为采用自动聚 焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA进行片段化；优选所述自动聚焦声波样本处 理仪Covaris S220对所述cDNA进行片段化时的参数设置为：循环数8%?12%，峰值入射 功率170?180瓦；循环数/爆发200?220个；时间300?360s ;温度4?8°C。
5. 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述自动聚焦声波样本处理仪 Covaris S220对所述cDNA进行片段化后得到的所述片段化样品的长度为150?200bp。
6. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述片段化样品之后，以及 对所述片段化样品进行所述末端修复的步骤之前，还包括对所述片段化样品进行浓缩的步 骤；优选米用 Thermo Scientific 公司的 Thermo Scientific DNA SpeedlllV离心浓缩系统。
7. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于， 在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直 接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10X的 NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物； 在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头 对所述修复后样品进行接头连接； 在所述步骤S4中采用KAPA BI0公司的2X的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品 进行扩增。
8. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述片段化样品的量低至3ng时， 在所述步骤S3中，对所述接头进行稀释后再进行接头连接；优选将所述接头稀释至1. 0? 2. 0 y M ;更优选稀释至1. 5 ii M。
9. 根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增的循环次 数为10?15次，优选13次。
10. 权利要求1至9中任一项所述的构建方法在研究细胞异质性方面的应用。
【文档编号】C40B50/06GK104389026SQ201410601383
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】王大伟, 王苗英, 蒋智, 李明洲, 朱海浩, 刘运超 申请人:北京诺禾致源生物信息科技有限公司