专利名称：采用高沸点溶剂的寡核苷酸合成的制作方法
技术领域：
本发明总地涉及在载体支持物表面上采用高沸点有机溶剂进行的化学反应，更具体地涉及在载体支持物表面上空间分开的小的、敞开的、各个反应部位上进行的固相合成。
背景技术：
DNA、RNA和肽片段的测序在医学诊断、法医学、分子生物学研究和药物遗传学的发展中仍然起着重要的作用。但在最近，更多的关注从序列测定本身转移到鉴定序列在生化途径和疾病状态中的功能上来。由于遗传对大多数生化途径的影响比最初所想的要更为复杂，通常涉及到多个基因、基因中的多个突变以及复杂的相互作用，因此就需要提高同时测试多个DNA序列的效率。
实现多个测定同时进行的一种方式是将大量数目的DNA、RNA或肽探针试验置于显微阵列上，然后对复杂的生物学样品同时进行探测。阵列中的各个探针通过与例如未知样品中的DNA或RNA杂交(特异性结合)或不杂交，提供了关于该序列存在或不存在于样品中的信息。
这些类型的试验通常测试的是特异性核酸序列(通常是DNA或RNA序列)的存在，但是也可采用其它特异性结合试验。如本领域所熟知的，这是用合成的带有感兴趣的特异性既定序列的寡核苷酸来实现的。通常，这些特异性序列根据的是对基因组或突变数据库的搜索结果，或例如根据与已知或推定基因或氨基酸序列的同源性，或根据的是这些序列的目录分类突变。然后，通过在只允许完全或接近匹配的序列结合的条件下的杂交，可同时确定许多序列的存在与否。
关于用显微阵列同时分析来进行重要的多重试验有许多例子。为了提高疾病诊断的效率，一个阵列可以由500个不同的探针组成，每个探针对应于已知会引起(例如)囊性纤维化的一个突变，使探针与患者的DNA杂交，因此如果存在任何引起疾病的突变，阵列上代表该突变的特定特征将会发出荧光。在另一个有用的例子中，将对应于许多功能未知的基因的DNA序列形成一个显微阵列。然后在对应于许多不同基因的许多不同序列上同时测定探针杂交的差异性密集度，比较从正常组织样品和疾病组织样品制得的信使RNA。疾病组织中与正常组织相比杂交方式有所不同的那些基因可能与该疾病途径有关，并起着某种功能。另外，在分子生物学和药物学发现的许多例子中，也需要分析大量的DNA序列是否存在，以确定某疾病状态的重要特性，如抗生素抗性、严重程度的基因型征兆等。
最后，有许多应用，其中可以通过将候选药物(如小的有机分子)或生物受体束缚在显微阵列表面并观察两者结合的程度，以测定药物/受体的相互作用。
因此，通常需要在显微阵列上产生大量相关、但性质各异的化学特征。寡核苷酸或肽的结合阵列的合成通常也是本领域中所知的。在一种平行合成方法(称为T-bag法或圆片设计方法)中，将固体载体珠粒的单个信息包(packet)或圆片的阵列物理分成四个亚酰胺(amidite)亚组，以使用所选亚酰胺进行处理。在每一珠粒信息包经过试剂处理后，必须再次将其人工分成四个亚组以便于进行随后的合成循环。对于制备大的寡核苷酸阵列来说，这种分组和再分组过于繁琐和费力。
与合成载体支持物结合的寡核苷酸的另一种阵列方法是Southern等人在美国专利No.5,436,327中描述的方法，该方法是在两个玻璃板之间非常狭窄的间隙中进行合成的。由于必须将多种不同的试剂准确施加到玻璃表面的特定部位上，因此该技术不仅麻烦，在实践中难以实施，而且该方法不能连续地合成寡核苷酸。另外，由于Southern采用标准的试剂来进行亚磷酰胺的合成，因此该技术需要在密闭的环境中进行，以防止高挥发性溶剂(如乙腈和二氯甲烷，这在下文中会有更详细地描述)迅速蒸发。
Brennan在美国专利No.5,474,796中描述了一种在敞开的固相载体支持物表面上合成寡核苷酸阵列的较佳方法，该方法通过按需滴加(drop-on-demand)喷墨装置来控制具体试剂的输送。Brennan提供了一种在载体表面进行大量化学反应的通用方法，该方法是利用一个压电泵将极少量的化学反应物溶液加到载体表面的功能化结合位点上。用具有不同表面张力的非功能化涂覆材料将功能性结合位点相互分开。
尽管Brannan没有具体指出用于该系统以使该敞开表面方法适用于通用化学合成的溶剂的性质，但是在实践中，大多数化学反应是在高挥发性、低沸点溶剂(如乙腈或二氯甲烷)中进行。在敞开的合成排列中采用这些常规溶剂产生了这样一个问题，即当输送的液滴非常小时，溶剂会迅速蒸发。这对于Brennan中采用的压电输送泵装置来说尤其如此，因为输送的液滴体积通常在大约20皮升至2微升之间。在此非常小的范围内，液滴的蒸气压以及表面积与总体积之比非常高，从而使这些标准的高产DNA合成溶剂在完成反应前已迅速蒸发掉。
蒸发速度与液滴表面积存在函数关系，其与1/R2(R是液滴半径)有关，即液滴越小，在蒸发速度越快。在23℃下，100微米的乙腈(ACN)液滴会在移动1厘米过程中蒸发。溶剂一旦蒸发，亚酰胺偶联反应基本上会终止而形成厚的、胶状或晶状残余物。
在孔径控制的玻璃(CPG)上进行常规固相寡核苷酸合成时，例如对于四唑激活的、二甲氧基三苯甲基保护的核苷酸亚磷酰胺偶联步骤来说，较佳的溶剂是乙腈。已经确定该溶剂要远远优于偶联亚磷酰胺所用的其它常规类型溶剂(如四氢呋喃、二甲氧基乙烷和硝基甲烷)。乙腈具有理想的酸度、粘度、介电常数、溶解度以及促使高偶联得率(＞99％)的其它性能的组合。每步偶联得率低于97％会产生没有用的截短和/或缺失型产物的混合物。
不幸的是，乙腈(ACN)具有较低的沸点(81℃)，在敞开系统中，其在载体表面上的液滴会迅速蒸发。上述常用于DNA合成的其它溶剂(即四氢呋喃、二甲氧基乙烷和硝基己烷)也具有和乙腈相似的沸点以及蒸发速度。因此，这些溶剂同样会在敞开的合成系统中迅速蒸发。
对于直径较大的反应部位来说，一种解决方法是迅速输送一连串试剂液滴，以建立起较大的体积。然而，该技术对于直径小于约500微米的情况却是无效的，而500微米以上的直径在许多阵列方法中则太大。另外，可以通过降低溶剂和反应表面温度来降低蒸发速度，但是偶联反应的速度也可能会大大降低。最后，液滴的蒸发速度还可通过提高ACN液上蒸气的相对湿度或饱和度来降低。然而，在实践中，很难稳定地控制ACN湿度，而合成装置有起云室作用的倾向。
发明公开因此，本发明的一个目的是提供一种在敞开表面上合成某些材料的方法和组合物，其大大减少了试剂溶剂在极少量输送时的蒸发。
本发明的另一个目的是提供一种维持非常高反应得率的方法和组合物。
本发明还有一个目的是提供一种方法以及试剂溶液的组合物，该试剂液组合物可通过常规的按需滴加组合件输送方法来输送。
根据前述目的，本发明提供了一种在敞开环境固相载体支持物表面上以显微规模固相化学合成含有亚单位的分子期间减少液体试剂溶液蒸发的方法。该方法包括下列步骤(A)提供一个敞开的固体载体表面，该表面包括至少一个以反应性化学基团功能化的结合位点；和(B)将精确控制的微量液体试剂液沉积到载体表面上并使其与结合部位接触。根据本发明，试剂液包括的反应物包含在至少一种沸点较高的溶剂中(与用于该试剂的标准有机溶剂相反)。这种高沸点溶剂大大减少了在固体载体上进行合成期间试剂液在敞开环境中的蒸发，同时维持了非常高的反应得率。
本发明的另一方面提供了一种在敞开表面上合成某些材料的阵列的方法，该方法包括下列步骤提供一个基本上平的敞开的固体载体支持物表面，该表面上含有经功能化的结合部位阵列。每个结合部位被无反应性疏水材料的表面张力屏障所隔开。下一步包括将精确控制的微量液体试剂液沉积到载体表面上每个功能化结合部位处，使其与固定在各个结合部位上的分子的至少一个亚单位接触。每个试剂液包括的核苷试剂包含在沸点至少约140℃的质子惰性极性溶剂中。由于沸点的升高，在分子生长期间，微量试剂液在敞开环境中的蒸发大大减少。另外，也基本上保持了高的偶联得率。
沉积步骤可用按需滴加输送试剂液的方法来进行。这种输送可通过常规的阀门输送装置或通过压电泵装置来提供，只要输送的体积(约20皮升至2微升)是可控制的和准确的。另外，沉积步骤还可在每个结合部位以亚磷酰胺法作不连续(discreet)分步聚合物合成来进行。
本发明的另一方面提供了用于寡核苷酸合成的相当少量的核苷试剂溶液。该试剂液包括核苷酸试剂，以及质子惰性极性有机溶剂，该溶剂的沸点至少约为140℃。在输送的微小体积中，试剂液在寡核苷酸生长期间在敞开环境中的蒸发大大减少，同时维持非常高的偶联得率。
这些质子惰性溶剂宜为有机溶剂，其选自二腈类(dinitriles)、甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、二甲基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰三胺(HMPA)和磷酸三甲酯。这一组宜具有与乙腈溶液基本相似的酸度。更具体地说，二腈类基本上选自丙二腈、丁二腈、戊二腈和己二腈。然而，极性、质子惰性有机溶剂还可选自单腈类，如戊腈和己腈。
附图简述本发明的组合件具有的其它目的和优点的特征可以从下文描述的本发明最佳实施方式以及所附权利要求中并结合所附下列附图明显看出。
图1是合成装置的顶视图，该装置将本发明的试剂液沉积到载体表面功能化的结合部位之阵列中。
图2A和2B是载体表面以及功能化结合部位的放大的截面侧视图，该图说明了点-缝隙界面处的表面张力壁效应。
本发明最佳实施方式虽然本发明是参照几个具体的实施方案来进行描述的，但是这些描述只是说明了本发明，而并不应认为限制了本发明。本领域技术人员能在不脱离所附权利要求限定的本发明真实精神和范围内对本发明的较佳实施方案作各种改动。在这里应注意，为了更好地理解，在各附图中，相同的组件被赋予相同的参照数。
还应理解，尽管本发明特别适合构建序列确定的寡核苷酸，但是本发明的方法和组合物还可用来合成任何含有亚单位的分子，尤其是按顺序添加合成。因此，术语“顺序单位”或“亚单位”定义为与相同或不同类物质的其它部分结合从而形成更复杂分子(如寡核苷酸和肽链)的那一个部分。还应理解，术语“敞开(的)环境”定义为不是密闭的或蒸气饱和的系统(以控制挥发性溶剂蒸发)的任何环境。
现在参看图1和2，图中示出了一个显微规模的固相合成装置(通常命名为10)，该装置通过应用本发明的方法和组合物来构造含有亚单位的分子，其方法是将液体试剂液12中的亚单位或顺序单位按顺序加到敞开的固体载体表面11上。合成装置(在下文有更详细的描述)具有一定的图案，以便使试剂液的微小液滴13准确地沉积到固体载体表面11上受敞开环境影响的功能化结合部位14上。根据本发明，沉积的试剂液12包括化学反应物，该反应物包含在高沸点、质子惰性极性有机溶剂(有助于控制化学反应期间的蒸发)中。与现有技术中目前用于敞开系统的标准低沸点溶剂不同的是，这些高沸点溶剂大大减少了试剂液小液滴在外露载体表面11上的蒸发，这样，分子生长(如亚酰胺偶联)就能完全。因此，在敞开的环境中，分子合成能得到更充分地延长，同时维持了高的反应得率，而不需要密闭的或蒸气饱和系统来控制挥发性溶剂的蒸发。如上所述，溶剂一旦蒸发，偶联反应就会终止，而形成厚的、胶状或晶状残余物。
通常，为敞开环境下的分子合成所开发的溶剂系统包含沸点较低的溶剂。因此，通过使用沸点较高的、表现出与被代替溶剂性能相似的溶剂(见下文)来代替这些低沸点溶剂，敞开环境反应就能完全，而不需要控制这些溶剂的蒸发。尽管本发明总体上可用于，当使用低沸点溶剂在敞开环境中可能遇到问题的任何分子的合成，但是发现用沸点较高的溶剂来代替将特别适合和有利于有机分子的合成以及生物聚合物(如寡核苷酸、肽和肽核酸)的合成。
在较佳的形式中，与标准DNA溶剂乙腈之较低的沸点(约81℃)相比，该极性有机溶剂的沸点在1个大气压(atm)下至少约为140℃。因此，应理解较高的沸点将定义为溶剂在1个大气压下的沸点至少约为140℃，而对于标准的DNA溶剂乙腈、四氢呋喃、二甲氧基乙烷和硝基甲烷以及其它低沸点溶剂(如乙醇、丙酮和吡啶)来说，较低的沸点定义为在1个大气压下的沸点不超过100℃。
此较高的沸点确保了当体积微小(通常在约20皮升至约2微升之间)的液滴施加到敞开的环境中时，液滴不会在正常的实验室合成条件下在敞开的环境中过快地蒸发，这样化学反应就可延长或完全。重要的是，当蒸气压较低的高沸点溶剂加入到高蒸气压溶剂的混合物中时，它会使蒸气压大大低于现有技术的标准DNA溶剂的蒸气压。因此，在蒸发因素显著阻碍化学反应之前，就能够完成高得率的DNA合成。
另外，为了促使每步的高偶联得率至少约为97％(常规的DNA标准)，这些高沸点溶剂系统宜具有与目前使用的标准低沸点溶剂系统相似的酸度、介电常数和溶解度性能。根据本发明，这些沸点较高的溶剂不仅挥发性低于标准溶剂，而且具有模拟标准溶剂的相似的溶剂性能，从而可以维持非常高的反应得率。例如，已经发现一些高沸点溶剂/激活剂组合能提供类似于乙腈/四唑配对的亚酰胺偶联高得率，同时还降低了小液滴表面阵列合成所需的蒸发速度。与标准的DNA溶剂乙腈相比，不同候选溶剂的相对蒸发时间明显增加至少50倍。
已经确定，最佳的高沸点、极性、质子惰性有机溶剂来自二腈类，具体是丙二腈、丁二腈、戊二腈、己二腈和庚二腈。与乙腈的低沸点(81℃)相比，这些溶剂的沸点非常高，丙二腈为218℃，丁二腈为265℃，戊二腈为286℃，己二腈为298℃，庚二腈为310℃。因此，更佳的是，在一个大气压下，较高的沸点应至少约为200℃。
另外，这些溶剂系统的蒸气压大大低于更具挥发性的标准DNA溶剂(如乙腈在室温下为70mm)。因此，50皮升含二腈类溶剂的试剂液液滴的蒸气压及其表面积与总体积之比明显低于体积相似的含乙腈溶剂的液滴。
因此，这些溶剂在室温或标准的合成环境中以慢得多的速度蒸发。例如，与乙腈(大约10秒)相比，0.1微升的二腈溶剂液滴蒸发掉一半的时间大于约1小时。因此，在相似的反应环境下，聚合物合成期间蒸发引起不利的影响在本发明中可能很小。
重要的，如上所述，这些溶剂系统具有类似于亚磷酰胺用的乙腈的溶剂性能，如酸度、粘度、介电常数和溶解度性能。例如，二腈类/乙腈类似物具有与乙腈相似的酸度，并且和酸催化剂(如四唑和S-乙基四唑)以及标准的亚磷酰胺一起提供了罕见的高偶联得率(＞99％)。已经发现，己二腈或戊二腈和S-乙基四唑(作为酸催化剂)是最佳的溶剂/激活剂配对。
单腈类质子惰性有机溶剂也已被确定非常有利于敞开环境中的小液滴聚合物合成。这些单腈类溶剂包括戊腈，其具有的高沸点为141℃；己腈，其具有的高沸点为163℃；以及苄腈，其具有的高沸点为190℃。这些单腈在室温下的蒸气压分别为5.0mm，1.0mm和0.5mm，远远低于标准DNA溶剂。因此，这些单腈类在室温下的蒸发速度比乙腈要慢得多，0.1微升该溶剂的液滴蒸发掉一半的时间大于约1小时。
尽管已经确定，这些单腈类与二腈类相比是较差的亚磷酰胺溶剂(可能由于它们的烷基残基起支配作用)，但是对于亚磷酰胺单腈仍具有与乙腈相似的溶剂性能(例如酸度)。
极性、质子惰性的氧化溶剂类，如二甘醇二甲醚和三甘醇二甲醚，也被确定是适合聚合物合成的高沸点溶剂。这些氧化的溶剂同样为亚磷酰胺提供了良好的溶解度，只是其比二腈类稍具碱性。因此，为了获得更高的偶联得率，需要更具酸性的催化剂。一种这样的酸性催化剂是吡啶盐酸盐(Py.HCl)。
二甘醇二甲醚的沸点为162℃，而三甘醇二甲醚的沸点为216℃。另外，这些氧化溶剂在室温下的蒸气压分别为1.5mm和0.5mm。同样，由于其蒸气压低于标准DNA溶剂，0.1毫升的该溶剂液滴蒸发掉一半的时间也比标准DNA溶剂长。这些溶剂的偶联得率超过98％。
和Py·HCl一起产生良好的亚磷酰胺溶解度以及比上述溶剂更恰当的偶联得率的其它高沸点溶剂是六甲基磷酰三胺(HMPA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)和二甲基甲酰胺(DMF)。然而，这些溶剂可能更适合与吡啶组合用于H-磷酸酯偶联化学过程。
本发明的方法和溶剂系统还可用于除DNA合成外的其它有机合成。如下文实施例2所述的，高沸点溶剂同样可用于氨基酸异羟肟酸盐的组合性合成，该合成产生了500个不同氨基酸异羟肟酸盐磺胺衍生物的文库。
本发明特别适合采用Brennan的美国专利No.5,474,796(后面的′796专利)中的输送装置，该专利全部纳入本文作参考。简言之，如图1和2所示，经功能化处理的反应部位14由无反应性的疏水性表面张力屏障限定或分开，用按需滴加喷墨装置15将具体的试剂输送到各个部位上。较佳的，每个反应性或功能化结合部位14的大小通常约为20至2000微米。利用压电或螺线管喷嘴、或是能以可控制方式准确分配小液滴的任何其它喷嘴系统，将化学反应物溶液输送到载体表面11的功能化结合部位14上。喷射出的液滴的最初大小主要由喷嘴管口直径、液体介质的粘度和表面张力决定。液滴13的大小通常在约25至250微米之间。
含有化学反应物以及高沸点、质子惰性极性有机溶剂的试剂溶液可以通过压电泵(未示出)输送到功能化结合部位14上，输送量使得各结合部位上的化学反应物溶液与其它毗邻结合部位上的试剂溶液靠表面张力分开。简言之，在压电泵中，将试剂溶液通过入口加入由压电泵的上侧板和相对的下侧板形成的室内。在上侧板和下侧板之间施加电压差，使得压力压缩，迫使试剂液的微滴喷出喷嘴。
从图2A可以最好地看出，试剂液的微滴13沉积在功能化结合部位14上。由于试剂液12对功能化结合部位14以及周围表面16上的润湿性能不同(图2B)，试剂液微滴13在功能化结合部位14上成珠状，溶液中的反应物与固相载体表面反应。
可用于本发明的压电泵以非常精确的方式将细小的液滴13输送到载体表面11上。皮可泵(picopump)的设计与喷墨印刷中所用的泵相似，它能在高达3000Hz下产生50微米或65皮升的微滴。
从本装置的上述描述中，应理解提供本发明的方法是为了在敞开环境固体载体表面11上以显微规模固相化学合成含亚单位的分子期间，减少液体试剂液的蒸发。该方法包括下列步骤(A)提供一个敞开的固体载体表面11，包括至少一个用反应性化学基团功能化处理的结合部位14。下一步包括(B)将精确控制的微量液体试剂溶液12沉积到载体表面11上，使其与结合部位14接触。根据本发明，试剂液包括反应物，该反应物包含在至少一种沸点较高(与用于这些试剂的标准的有机溶剂相反)的溶液中。这种高沸点溶剂在固相载体11上进行合成期间大大减少了试剂液在敞开环境中的蒸发，同时维持非常高的反应得率。
沉积步骤可用按需滴加输送试剂溶液的方法来进行。这种输送方法可通过常规的输送装置或通过压电泵装置15来提供，只要输送的体积(约20皮升至2微升)是可控制的和准确的。另外，沉积步骤还可通过在每个结合部位以亚磷酰胺方法或H-磷酸方法不连续(discreet)分步合成来进行。
本发明的另一方面，更具体地说，是提供了一种在敞开环境固相载体表面上进行显微规模的寡核苷酸链固相化学合成的方法。该方法包括下列步骤(A)提供一个敞开的固相载体表面11，包括至少一个用反应性化学基团功能化处理的结合部位14；和(B)将精确控制的微量液体试剂溶液12沉积在载体表面11上，使其与结合部位14接触。在该实施方案中，试剂液12包括反应物，该反应物包含在高沸点、质子惰性极性有机溶剂中，该有机溶剂的沸点至少约140℃。该技术在固体载体上进行寡核苷酸合成期间大大减少了试剂溶液在敞开环境下的蒸发，同时维持了非常高的偶联得率。
步骤A和B可以用相同或不同的化学反应物重复进行，以形成至少一个连续的寡核苷酸链。当敞开的载体表面11包括功能化反应部位14的阵列(图1)时，沉积步骤可以通过将试剂液各个沉积到阵列中选定反应部位14上来实现。另外，沉积步骤还可通过将试剂液沉积到每个选定的反应部位14上来实现，沉积的量使得每个反应部位14上的试剂液与其它结合部位上的试剂液因表面张力而分开。这可通过提供各个功能化反应部位14的载体表面来实现，每个功能化结合部位14的表面张力高于其周围的载体表面16，这些周围载体表面最好由无反应性的疏水性材料组成。
下列实施例有助于更充分地描述上述发明的使用方式，并提出了为实施本发明各个方面所考虑的最佳方式。应理解，该实施例并没有限制本发明的确切范围，而只是出于说明的目的。
实施例1阵列板上的寡核苷酸合成在具有一定图案的玻璃阵列板上进行寡核苷酸的合成，该阵列板为合成提供了功能化的氨烷基硅烷位点，这些部位被亲脂性的氟烷氧基硅烷(fluoroalkylxysilane)分开。该阵列含有500个直径为0.5毫米的位点。如′796专利中所述的那样，用氨基丙基-和十四氟-1,1,2,2-四氢辛基硅氧烷进行初步构图，合成该阵列。用二噁烷∶DCM(1∶1)配的对硝基苯基氯甲酸酯处理该阵列2小时，将短的氨基丙基接头转变成长链羟烷基接头。用乙酸酐和吡啶的1∶1混合物对未反应的氨基丙基基团加帽。然后，通过与乙腈配的6-氨基己醇反应过夜，将所得氨基甲酸酯中间物转变成携带羟基的脲。用乙腈配的5′-DMT-核苷-3′琥珀酸盐处理此具有一定图案的表面(用TOTU作为激活剂)2小时，合成可切割的接头。
根据标准的亚磷酰胺程序，在如此制得的位点上组装寡核苷酸。将标准的亚磷酰胺和S-乙基四唑溶解在己二腈(ADN)或戊二腈(GLN)和乙腈(ACN)的混合液中。加入确定量的低沸点乙腈能控制溶剂粘度和在离开喷口时形成液滴。经证实，90％ADN和10％ACN的混合物对于液滴的形成以及试剂的粘度最为适合。用′796专利中描述的微量泵装置将适当保护的核苷酸和激活剂输送至各个位点上。用合适的试剂淹没该表面，以批量加工方式在该阵列上进行所有其它步骤(如DMT去封闭，洗涤)。然后高速旋转该阵列，除去表面上的试剂。
合成后，从表面上切割下寡核苷酸，用铵水去保护。用HPLC和HPCE分析该产物(如T10)，结果显示出与在CPG上进行标准寡核苷酸合成相当或比其更佳的质量。这样得出一个结论每步合成得率在大约98％以上。
实施例2氨基酸异羟肟酸盐衍生物的组合性合成采用如实施例1所述的有一定图案的阵列。首先将氨基酸偶联到阵列上，然后用不同的磺酰氯衍生处理，以获得多样性。将Fmoc保护的氨基酸以及激活剂(HATU)溶解在DMF∶CH2Cl2(9∶1)中。如′796专利中所述的那样，将两种试剂加至各个位点上。15分钟后，旋转该阵列，除去试剂。偶联后，用二氯乙烷洗涤该阵列。然后，将阵列表面浸没在含10％哌啶的DMF溶液中10分钟，除去氨基酸的Fmoc保护基团。用DMF和THF洗涤后，将溶于吡啶的不同磺酰氯加至各个位点上进行衍生处理。反应10分钟后，旋转除去试剂，用吡啶洗涤该阵列。在最后用吡啶、DMF、DMSO和DCE洗涤后，在密封室内用含2M羟胺的水/二噁烷(1∶7.5)断裂合成的化合物48小时，获得500个不同氨基酸异羟肟酸盐磺胺衍生物的库。
权利要求
1．一种在敞开环境固体载体表面上以显微规模固相化学合成含亚单位的分子期间减少液体试剂液蒸发的方法，所述方法包括下列步骤(A)提供一个敞开的固相载体表面，该表面包括至少一个用反应性化学基团功能化的结合部位；和(B)将精确控制的微量液体试剂液沉积到所述载体表面上，使其与所述结合部位接触，所述试剂液包括反应物，该反应物包含在至少一种与用于该试剂的标准有机溶剂相反的沸点较高的溶剂中，以大大减少所述试剂液在所述固体载体上进行合成期间在敞开环境下的蒸发，同时维持非常高的反应得率。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述分子通常用沸点较低的溶剂进行合成。
3．根据权利要求2所述的方法，其中所述低沸点溶剂选自乙腈、二氯甲烷、丙酮、乙醇、吡啶和四氢呋喃。
4．根据权利要求3所述的方法，其中所述分子是有机分子。
5．根据权利要求4所述的方法，其中所述分子基本上选自寡核苷酸、肽和肽核酸。
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述高沸点溶剂是极性、质子惰性有机溶剂。
7．根据权利要求6所述的方法，其中所述高沸点的沸点至少为140℃。
8．根据权利要求6所述的方法，其中所述高沸点的沸点至少约为200℃。
9．根据权利要求6所述的方法，其中所述质子惰性有机溶剂基本上选自二腈类、单腈类、甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、二甲基甲酰胺DMF、六甲基磷酰三胺HMPA和三甲基磷酸酯。
10．根据权利要求9所述的方法，其中所述二腈类包括的酸度与乙腈溶液基本上相似。
11．根据权利要求10所述的方法，其中所述二腈类基本上选自丁二腈、戊二腈、己二腈和庚二腈。
12．根据权利要求11所述的方法，其中重复步骤A和B，以形成至少一个连续的寡核苷酸链。
13．根据权利要求12所述的方法，其中合成用亚磷酰胺方法进行。
14．根据权利要求12所述的方法，其中合成用H-磷酸酯方法进行。
15．根据权利要求6所述的方法，其中所述质子惰性溶剂选自单腈类。
16．根据权利要求15所述的方法，其中所述单腈类基本上选自戊腈、苄腈和己腈。
17．根据权利要求1所述的方法，其中所述分子通过按顺序在其上加亚单位来合成。
18．根据权利要求17所述的方法，其中所述分子是寡核苷酸链、肽链之一或是两者的杂合物。
19．根据权利要求1所述的方法，其中所述敞开的载体表面包括功能化反应部位的阵列。
20．根据权利要求19所述的方法，其中所述沉积步骤通过将试剂液各个沉积到所述阵列的所选反应部位上来实现。
21．根据权利要求20所述的方法，其中所述固相载体表面基本上是平的。
22．根据权利要求20所述的方法，其中所述沉积步骤还通过这样的方式来实现，将试剂液沉积到每个选定的反应部位上，沉积的量使得每个反应部位上的试剂液与其它结合部位上的试剂液因表面张力而分开。
23．根据权利要求22所述的方法，其中每个功能化反应部位的载体表面所具有的表面张力高于每个功能化结合部位周围载体表面的表面张力。
24．根据权利要求23所述的方法，其中所述每个功能化结合部位周围的载体表面由无反应性的疏水性材料组成。
25．根据权利要求22所述的方法，其中沉积到选定反应部位上的试剂液的体积为20皮升至2微升。
26．一种在敞开环境固体载体表面上以显微规模固相化学合成寡核苷酸链的方法，所述方法包括下列步骤(A)提供一个敞开的固体载体表面，该表面包括至少一个用反应性化学基团功能化处理的结合部位；和(B)将精确控制的微量液体试剂液沉积到所述载体表面上，使其与所述结合部位接触，所述试剂液包括反应物，该反应物包含在高沸点、极性、质子惰性有机溶剂中，该有机溶剂与用于该试剂的标准有机溶剂相反，其沸点至少为140℃，在所述固体载体上寡核苷酸合成期间能大大减少该试剂液在敞开环境下的蒸发，同时维持非常高的偶联得率。
27．根据权利要求26所述的寡核苷酸合成方法，其中所述高沸点的沸点至少为200℃。
28．根据权利要求26所述的寡核苷酸合成方法，其中所述质子惰性有机溶剂基本上选自二腈类、单腈类、甘醇二甲醚、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、二甲基甲酰胺DMF、六甲基磷酰三胺HMPA和三甲基磷酸酯。
29．根据权利要求28所述的寡核苷酸合成方法，其中所述二腈类包括的酸度与乙腈溶液基本上相似。
30．根据权利要求29所述的寡核苷酸合成方法，其中所述二腈类基本上选自丁二腈、戊二腈、己二腈和庚二腈。
31．根据权利要求26所述的寡核苷酸合成方法，其中所述质子惰性溶剂选自单腈类。
32．根据权利要求31所述的寡核苷酸合成方法，其中所述单腈类基本上选自戊腈、苄腈和己腈。
33．根据权利要求26所述的寡核苷酸合成方法，其中所述沉积步骤用按需滴加输送所述试剂液的方法来进行。
34．根据权利要求33所述的寡核苷酸合成方法，其中所述按需滴加输送是用压电泵装置来进行所述试剂液的输送。
35．根据权利要求34所述的寡核苷酸合成方法，其中还通过在每个所述结合部位上以亚磷酰胺法进行不连续的分步寡核苷酸合成来进行所述沉积步骤。
36．一种用于在敞开环境的固体载体表面上以相当少的用量来合成寡核苷酸的核苷试剂溶液，该溶液包含一种核苷酸试剂；和一种沸点至少为140℃的极性、质子惰性有机溶剂，能大大减少寡核苷酸生长期间该试剂液在敞开环境下的蒸发，同时维持非常高的偶联得率。
37．根据权利要求36所述的核苷试剂液，其中沉积的试剂液的体积为20皮升至2微升。
38．根据权利要求37所述的核苷试剂液，所述高沸点的沸点至少为200℃。
39．根据权利要求38所述的核苷试剂液，其中所述质子惰性溶剂选自二腈类。
40．根据权利要求39所述的核苷试剂液，其中所述二腈类包括的酸度性能与乙腈溶液基本上相似。
41．根据权利要求40所述的核苷试剂液，其中所述二腈类基本上选自丙二腈、丁二腈、戊二腈、己二腈和庚二腈。
42．根据权利要求41所述的核苷试剂液，其中所述质子惰性溶剂选自单腈类。
43．根据权利要求42所述的核苷试剂液，其中所述单腈类基本上选自戊腈、苄腈和己腈。
全文摘要
一种在敞开环境固体载体表面上以显微规模固相化学合成含亚单位分子期间减少液体试剂溶液蒸发的方法。该方法包括下列步骤:提供一个敞开的固体载体表面,该表面包括至少一个经反应性化学基团功能化处理的结合部位:和将精确控制的微量液体试剂液沉积到载体表面上,使其与所述结合部位接触。该试剂液包括反应物,该反应物包含在至少一种与用于该试剂的标准有机溶剂相反的沸点较高的溶剂中。采用高沸点溶剂可在所述固体载体上进行合成期间大大减少所述试剂液在敞开环境下的蒸发,同时能维持非常高的反应得率。
文档编号C40B50/14GK1286691SQ98812350
公开日2001年3月7日 申请日期1998年11月10日 优先权日1997年11月13日
发明者T·M·布伦南, A·W·弗劳恩多夫 申请人:普罗托吉安实验室股份有限公司