一种蝉花孢梗束液体培养基的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于人工培养蝉花孢梗束的液体培养基，该培养基的原料主要包括：酵母浸出粉0.2～3％，大豆水解蛋白0.1～2％，余量补水至100％；本发明培养基还可加入蔗糖1～8％、氯化钙0.005～0.1％和磷酸二氢钾0.01～0.5％。本发明培养基培养的蝉花孢梗束产量及其有效成分含量显著提高，产品质量稳定，适用于大规模工业化生产。
【专利说明】
一种蝉花孢梗束液体培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及蝉花人工培养孢梗束中液体培养基，具体的说，涉及蝉花人工培养的 亲if工艺。
【背景技术】
[0002] 蝴花（Isaria cicadae Miquel)属于真菌界（FUNGI)的子囊菌门（Ascomycota)、 盘菌亚门（Pezizomycotina)、奠壳菌纲（Sordariomycetes)、肉座菌目（Hypocreales)、虫 草科（Cordycipitaceae)、棒束抱属（Isaria)。
[0003] 4单花（Isaria cicadae Miquel)是广布种，其菌种可以自已采集分离也可以购买。 蝉花在我国秦岭-淮河以南的18个省、市、区有广泛分布。在我国长江以南的亚热带和热 带地区，且多在低洼地带及滇藏高原的金沙江、怒江、澜沧江和雅鲁藏布江等河谷地带。只 要在其生长季节，每年的6-8月，按照一般中药材的采集方法都可采到。
[0004] 蝉花是我国名贵的中药材，是寄生在蝉（俗称"知了"）上的一种虫草菌。其药用 已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值。主要成分有：腺 苷、虫草多糖、虫草酸（甘露醇）、虫草素、尿嘧啶、留醇、生物碱、维生素、无机盐、矿物质元 素等。
[0005] 蝉花具有调节人体免疫的功能，提高食欲，促进睡眠，增强自身抗病的能力。在这 些成分当中，虫草多糖具有独特的生物活性，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等 功效，免疫调节作用成为研究开发的热点。腺苷能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状 及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用。腺苷还具有抗血小板聚集、 抗辐射和抗肿瘤等作用。不仅如此，蝉花中的活性成分ISP-1具有双向免疫调节活性，可以 大大的提高器官移植手术的成功率，对患者的康复也有着明显的积极效果。
[0006] 自1993年陈祝安先生研究了蝉花的人工培养开始，蝉花人工培养孢梗束的种子 液和发酵液一直采用20%土豆煮汁，3%白砂糖，余量补水至100%。
[0007] 现有技术尚无使用相同的培养基配方用于蝉花人工培养孢梗束的相关报道和应 用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种用于人工培养蝉花孢梗束的液体培养基。
[0009] 本发明进一步提供一种用于人工培养蝉花孢梗束的方法。
[0010] -种用于人工培养蝉花孢梗束的液体培养基，该培养基的原料主要包括：酵母浸 出粉，大豆水解蛋白，水。
[0011] 进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.2~3%，大豆水 解蛋白〇. 1~2 %，余量补水至100 %。
[0012] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.3~1%，大豆 水解蛋白〇. 2~1 %，余量补水至100 %。
[0013] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.4~0.8%，大 豆水解蛋白〇. 3~0. 8 %，余量补水至100 %。
[0014] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0. 4%，大豆水解 蛋白0. 3%，余量补水至100%。
[0015] 进一步，所述培养基的原料组成中还可以加入鹿糖1~8% ;更进一步，鹿糖加入 量为2~5% ;更进一步，蔗糖加入量为3~4% ;更进一步，蔗糖加入量为3.5% ;更进一 步，所述蔗糖为白砂糖。
[0016] 进一步，所述培养基的原料组成中还可以加入氯化钙0. 005~0. 1%，磷酸二氢钾 0. 01~0. 5 % ;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 008~0. 05%，磷酸二 氢钾0. 02~0. 2% ;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 01~0. 02%，磷 酸二氢钾〇. 05~0. 1 %;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 01 %，磷酸二 氛钟0? 05%。
[0017] 本发明所述的培养基用于蝉花菌种经斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐液体 培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草培养，通过上述培养步骤得到孢梗束、孢子粉和菌 质；其中斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种子罐液体培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草 培养均可采用常规方法。
[0018] 本发明进一步提供一种人工培养蝉花孢梗束的方法，该方法包括斜面菌种培养、 液体摇瓶培养、种子罐液体培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草培养步骤，其中所述液体 摇瓶培养、种子罐液体培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草培养步骤中液体培养基原料 主要包括：酵母浸出粉，大豆水解蛋白，水。
[0019] 所述培养方法步骤还包括种子罐扩大培养。
[0020] 进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.2~3%，大豆水 解蛋白〇. 1~2 %，余量补水至100 %。
[0021] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.3~1%，大豆 水解蛋白〇. 2~1 %，余量补水至100 %。
[0022] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0.4~0.8%，大 豆水解蛋白〇. 3~0. 8 %，余量补水至100 %。
[0023] 更进一步，所述培养基的原料配比为（重量百分比）：酵母浸出粉0. 4%，大豆水解 蛋白0. 3%，余量补水至100%。
[0024] 进一步，所述培养基的原料组成中还可以加入鹿糖1~8% ;更进一步，鹿糖加入 量为2~5% ;更进一步，蔗糖加入量为3~4% ;更进一步，蔗糖加入量为3.5% ;更进一 步，所述蔗糖为白砂糖。
[0025] 进一步，所述培养基的原料组成中还可以加入氯化钙0. 005~0. 1 %，磷酸二氢钾 0. 01~0. 5 % ;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 008~0. 05%，磷酸二 氢钾0. 02~0. 2% ;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 01~0. 02%，磷 酸二氢钾〇. 05~0. 1 %;更进一步，氯化钙和磷酸二氢钾的加入量为氯化钙0. 01 %，磷酸二 氛钟0? 05%。
[0026] 本发明中所用4单花（Isaria cicadae Miquel)是广布种，可以自制也可以购买。虫单 花在我国秦岭-淮河以南的18个省、市、区有广泛分布。在我国长江以南的亚热带和热带 地区，且多在低洼地带及滇藏高原的金沙江、怒江、澜沧江和雅鲁藏布江等河谷地带。只要 在其生长季节，每年的6-8月，按照一般中药材的采集方法都可采到。采到的蝉花可以依下 法分离到蝉花菌种，具体步骤如下：
[0027] 菌株的分离方法是：在超镜工作台上，在无菌条件下，将采来的新鲜虫草用无菌 水冲洗干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分（虫体）用打湿 的脱脂棉包裹，以保湿。虫草的子实体下方放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片 垫起，以使可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约〇. 5cm左右。然后将培养皿放置于 20°C ±0. 5°C的光照培养箱培养，待蝉花孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的 PDA培养基少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑 取少量菌丝转另一平皿（SDAY培养基）培养（同上），直至长出单一的纯化的菌落为止。并 经形态学或分子生物学方法验证，该菌株为蝴花虫草（Isaria cicadae Miquel)无性型。
[0028] 本发明优选 CN102851353A 公开的蝴拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae (Miq.) Samson]已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No. 3453。
[0029] 本发明与原有培养基技术相比具如下优点：去掉了原使用土豆煮汁的繁琐工艺， 节约了劳动力，提高了劳动生产率；解决了土豆不同品种和不同季节的质量不一问题；本 发明首次提供了大豆水解蛋白与酵母浸出粉配比用于人工蝉花孢梗束液体培养中，蝉花孢 梗束产量及其有效成分含量显著提高，保证产品质量稳定，改善了生产环境，适用于大规模 工业化生产。
【具体实施方式】：
[0030] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明：
[0031] 实施例1
[0032] 培养基配方：大豆水解蛋白0.3%，酵母浸出粉0.4%，白砂糖3. 5%，氯化钙 0. 01 %，磷酸二氢钾0. 05 %，余量蒸馏水补足100 %。
[0033] 实施例2
[0034] 培养基配方：大豆水解蛋白0. 3%，酵母浸出粉1 %，白砂糖2%，氯化钙0. 05%，磷 酸二氢钾〇. 02 %，余量蒸馏水补足100 %。
[0035] 实施例3
[0036] 培养基配方：大豆水解蛋白1%，酵母浸出粉0.2%，白砂糖5%，氯化钙0.008%， 磷酸二氢钾〇. 2 %，余量蒸馏水补足100 %。
[0037] 实施例4
[0038] 培养基配方：大豆水解蛋白0. 1 %，酵母浸出粉3 %，白砂糖1 %，氯化钙0. 1 %，磷 酸二氢钾0.01%，余量蒸馏水补足100%。
[0039] 实施例5
[0040] 培养基配方：大豆水解蛋白2%，酵母浸出粉0. 2%，白砂糖6%，氯化钙0. 005%， 磷酸二氢钾〇. 5 %，余量蒸馏水补足100 %。
[0041] 实施例6
[0042] 培养基配方：大豆水解蛋白0. 6%，酵母浸出粉0. 4%，白砂糖4%。
[0043] 实施例7
[0044] 培养基配方：大豆水解蛋白0. 5%，酵母浸出粉0. 4%，白砂糖3. 5%。
[0045] 实施例8
[0046] 培养基配方：大豆水解蛋白1. 5%，酵母浸出粉0. 3%，白砂糖3. 5%。
[0047] 实施例9培养基配方筛选实验
[0048] 1、一级斜面菌种培养
[0049] 培养基配方：20 %土豆煮汁+2 %蔗糖+2 %琼脂，余补水至100% ;pH6. 5。
[0050] 具体做法是：将土豆去皮煮熟，过滤去渣后，按照200克配制1升的比例配制，再加 入2%的蔗糖、定容，加入2%琼脂融化，分装进试管，在0.1 Mpa压力下，121°C，灭菌30min， 放气完毕，摆放成斜面自然冷却。无菌条件下将蝉花菌种CGMCCNo. 3453接到斜面上，24°C， 培养15天，获得生产母种（本发明所涉及的蝴拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.) Samson]已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No. 3453)。
[0051] 2、液体摇瓶种子培养
[0052] 培养基配方：配方1-15,详见表1。
[0053] 具体做法：500ml三角瓶装液量1/3,取生长良好的蝉花（Isaria cicadae Miquel)斜面种子，匀浆化，按2 %的接种量接种于摇瓶中，在恒温水浴摇床上25°C、140r/ min培养3天。培养好的种子呈灰黑色，内有大量的小米粒大小的菌球，緻密，菌液有蘑菇香 甜味；
[0054] 表1不同液体培养基人工培养蝉花出草情况及主要成份对比表
[0055]
[0056] 3、种子罐扩大培养
[0057] 种子罐所用的培养基同液体种子。
[0058] 具体做法：在30L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95 °C、pH 值为6.0~7.0,在14.7 X104Pa压力下，通入蒸汽加热到121°C，并保压30~45分钟；灭 菌后，冷却至20 °C时将6瓶上述培养好的500ml摇瓶种子接入培养，培养温度为25~26 °C， 通气量为1 5V/V ^化，保压4. 5~7. 0 X 104Pa，经20-48h通气培养，达到对数生长期后 即可，最终培养体积为20L。在气泡量较多时，可加入食用消泡剂，加入量为0.03%，；
[0059] 种子罐中1-18小时为延滞期，18-38小时为快速生长期（对数生长期），38-48小 时为快速生长后期。培养时间以48小时为宜。
[0060] 4、发酵罐发酵培养
[0061 ] 发酵罐所用的培养基同液体种子。
[0062] 具体做法：在300L发酵罐中装入200L液体培养基，pH值为6. 0~7. 0,并加入食用 消泡剂，加入量为〇. 03 %，通蒸汽和原位加热到121°C，在14. 7 X 104Pa压力下，保压30~ 45分钟；灭菌后，冷却至26°C时，将种子罐的50L液体种子全部接入发酵罐培养，培养温度 25~26°C，通气量为1 :0. 5V/V "化，保压4. 903~7. 0845 X 104Pa，经过36-48h通气培养， 达到对数生长期后即可，最终培养体积为200L。在气泡量较多时，可加入食用消泡剂，加入 量为0.03% ;
[0063] 发酵罐中0-12小时为延滞期，12-38小时为快速生长期，38小时后为生长稳定期， 48小时达高峰，后进入衰退期。以48小时终至发酵，转入固体培养。
[0064] 在更大规模生产时，可将发酵罐作为二级种子罐，然后将发酵好的发酵液转入更 大容积的发酵罐，以期取得更多的培养液。
[0065] 5、固体出草培养
[0066] 将小麦装入清洗槽内清洗干净，将清洗后的小麦滤水，分装至培养盒，每盒装料 330克，加470ml纯净水，加盖密封。置高压蒸汽灭菌锅，121°C，蒸汽灭菌50min，自然冷却。 用接种器将上述4中的发酵罐中的种子液按5 %比例注入灭菌后的前述表1的培养基中，充 分震动混匀。将接种后的培养盒移至培养室培养。采用立体培养架培养，初期，培养室温度 为22°C~24°C，暗培养3~5天，直至菌丝体向培养料生长直至长满料面；之后改为全光谱 光照培养，光照强度l〇〇lux~2001ux，保持培养室温度为20°C~22°C，定时通风排气，保持 培养室空气新鲜。当孢梗束成熟时（培养23-25天，生物量最大时），及时采收。将子实体 从培养盒取出，将菌质与子实体分离，除湿、50°C烘干，包装。
[0067] 同时在培养结束后测定了孢梗束产出率（即出草率）和主要的有效成分腺苷、多 糖、蛋白含量。结果见表2。
[0068] 表2不同液体培养基人工培养蝉花出草情况及主要成份对比表
[0069]
[0070] 实验结论：
[0071] 从上表数据可以看出，在加入大豆水解蛋白的配方中（配方1-12)，所产蝉花孢梗 束数量均高于未加大豆水解蛋白的配方（配方13-15)，说明大豆水解蛋白在蝉花培养中是 至关重要的；除产量外，蝉花的主要活性成分腺苷和多糖均高于未加入大豆水解蛋白的配 方。所以大豆水解蛋白应用于蝉花的液体发酵培养基配方中是虫草发酵工艺中的一个大突 破。
[0072] 从试验检测的结果也可以看出，只添加酵母粉的培养液（配方4、10、11、12、14)， 活性成分明显低于添加酵母浸出粉的培养液（配方1-3)。
[0073] 实施例10稳定性考察
[0074] 按实施例9方法进行培养，考察不同批次的液体培养基生产蝉花的产量及质量， 结果见表3。（培养基配方为实施例1的配方，蝉花菌种为CGMCCNo. 3453)。
[0075] 表3本发明液体培养基孢梗束中有效成分的变化及稳定性
[0076]
[0077] 结果表明，本发明液体培养基生产的蝉花孢梗束出草率在10%以上，多糖含量高 于5 %，腺苷含量高于0. 09 %，产品质量稳定性良好。
[0078] 实施例11考察不同菌株的液体培养基配方生产蝴花的产量和质量
[0079] 菌株获得：按照《虫生真菌蝉拟青霉的研究》（陈祝安，真菌学报，1991年）、《蝉 花的人工培养及其药理作用研究》（陈祝安等，真菌学报，1993年，12(2))文献所公开的方 法。菌株的分离方法是：在超镜工作台上，在无菌条件下，将采来的新鲜虫草用无菌水冲洗 干净，置于已灭菌的直径为15cm的培养皿中，虫草的内菌核部分（虫体）用打湿的脱脂棉 包裹，以保湿。虫草的子实体下方放置一灭菌的载玻片，虫草菌核部分用小玻片垫起，以使 可孕部分不要直接接触载玻片，其距离约〇. 5cm左右。然后将培养皿放置于20°C ±0. 5°C 的光照培养箱培养，待蝉花孢子弹射于载玻片上时，在孢子周围滴加刚溶化的PDA培养基 少许，移出玻片，置于另一灭菌的培养皿中保湿培养，待长出菌丝后用接种针挑取少量菌丝 转另一平皿（SDAY培养基）培养（同上），获得五个菌株：BACC0019、BACC0033、BACC0036、 BACC0041
[0080] BACC0056。并经形态学和分子生物学方法验证，分离的菌株均为蝉花虫草（Isaria cicadae Miquel)无性型。
[0081 ] 培养方法：按实施例9方法进行培养。
[0082] 培养基配方：同实施1的配方。
[0083] 表4本发明液体培养基不同菌株培养的孢梗束的变化及稳定性
[0084]
[0085] 结果表明，本发明液体培养基生产的不同蝉花菌株孢梗束出草率在8. 75%以上， 多糖含量高于4. 08%，腺苷含量高于0. 075%，产品质量稳定性良好。
[0086] 实施例12稳定性考察
[0087] 本发明液体培养基，不仅用于实施例9特定的斜面培养基和菌丝体培养基能够获 得良好效果，而且当斜面培养基改变，或在蝉花液体培养菌丝体中，使用该培养基同样可获 得良好效果。
[0088] 斜面培养基的改变：将实施例9中的培养基改为SDAY培养基，即蛋白胨10g/L，酵 母浸出膏l〇g/L，葡萄糖40g/L，琼脂20g/L。种子液及固体培养同实施例9,培养结果为：出 草率12. 6%，多糖含量5. 23%，腺苷含量0. 105%。
[0089] 发酵罐培养菌丝体：将实施例9中的1、2、3、4步培养相同，发酵罐培养的菌丝体， 通过离心后干燥，得到菌丝体产品，测其主要化学成分含量，与原培养方法比较，结果见表 5 ：
[0090] 表5采用液体培养基后菌丝体中有效成分的变化
[0091]
[0092] 以上结果说明，本发明液体培养基与不同的斜面培养基或菌丝体培养组合，培养 得到的产品质量和数量都有明显提高，且产品质量稳定。
[0093] 实施例13
[0094] 液体培养基：实施例2-8 ;
[0095] 培养方法：同实施例9 ;
[0096] 结果见表6:
[0097]
【主权项】
1. 一种用于人工培养蝉花孢梗束的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料主要 包括：酵母浸出粉，大豆水解蛋白，水。2. 如权利要求1所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料配比为（重量百分 比）：酵母浸出粉0. 2~3%，大豆水解蛋白0. 1~2%，余量补水至100%。3. 如权利要求2所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料配比为（重量百分 比）：酵母浸出粉0. 3~1%，大豆水解蛋白0. 2~1%，余量补水至100%。4. 如权利要求3所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料配比为（重量百分 比）：酵母浸出粉0. 4~0. 8 %，大豆水解蛋白0. 3~0. 8 %，余量补水至100 %。5. 如权利要求1-4任一项所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料组成中 加入鹿糖1~8%。6. 如权利要求5所述的液体培养基，其特征在于，所述培养基的原料组成中加入氯化 钙0· 005~0· 1%，磷酸二氢钾0· 01~0· 5%。7. 如权利要求8所述的液体培养基，其特征在于，所述氯化钙和磷酸二氢钾的加入量 为氯化钙〇· 008~0· 05 %，磷酸二氢钾0· 02~0· 2 %。8. -种人工培养蝉花孢梗束的方法，该培养方法包括斜面菌种培养、液体摇瓶培养、种 子罐液体培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草培养步骤，其中所述液体摇瓶培养、种子罐 液体培养、发酵罐液体发酵培养及固体出草培养步骤中使用权利要求1-7任一所述的液体 培养基。9. 如权利要求8所述的方法，其中所述培养方法还包括种子罐扩大培养步骤。
【文档编号】C05G1/00GK105985150SQ201510044389
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月28日
【发明人】董建飞, 唐瑶, 纪伟, 胡建峰, 陈昳丽, 陈奇超, 吴迪芬, 高敏逸, 徐煜, 孙长胜
【申请人】浙江泛亚生物医药股份有限公司