肿瘤坏死因子拮抗剂及其在子宫内膜异位症上的应用的制作方法

专利名称：肿瘤坏死因子拮抗剂及其在子宫内膜异位症上的应用的制作方法
技术领域：
以肿瘤坏死因子拮抗剂的治疗有效量给药治疗和/或预防子宫内膜异位。本发明的拮抗剂一般在多种分子中选择。但优选的是可溶性TNF受体。该类拮抗剂对子宫内膜异位损害的退化有用。如与其他活性成分合用可使相关的疾病如不育症得以改善。
背景技术：
子宫内膜异位是妇女生殖系疾病，其特点为由于子宫内膜腺和子宫内膜腔外基质以及子宫肌肉系统的存在。最常受影响的解剖学部位为卵巢、子宫骶骨的韧带、骨盆的腹膜、直肠阴道隔、子宫颈、阴道、输卵管及外阴。一般子宫内膜异位似从直肠阴道隔较深地浸润下面组织而表面看不到，有时子宫内膜异位的病灶能出现于卵巢外的部位，如肺、膀胱、皮肤、胸膜及淋巴结。子宫内膜异位是进行性的在开始时看到为透明的囊泡，然后在数年内变成红色并进展为黑色的纤维化损害(MacSwee，1993)。
子宫内膜异位被认为是良性疾病，但子宫内膜的损害有时会变恶性，与其他恶性疾病一样，由子宫内膜异位衍生的肿瘤是由于并发活动包括生长因子和/或致癌基因调节的变化而发生的。
子宫内膜异位是属于流行于育龄妇女中最常见的妇科疾病，此病见于育龄妇女的约5-10％(Barbieri，1988)。子宫内膜组织完全依靠雌激素而继续生长，在异位部位也是如此。因而，子宫内膜异位在妇女缺少雌激素的月经初期前和绝经期后罕见，子宫内膜的激素敏感是某些常见症状如骨盆疼痛和痛经的基础。
子宫内膜异位源自于子宫内膜细胞，从子宫播散到其他的能生存细胞可移植和生长的部位。初始细胞的散布曾有二种可能性机制解释。逆行月经为在有月经周期妇女的普通现象，可使分离的子宫内膜碎片通过月经回流液到达生殖器附近的结构，或者，子宫内膜细胞可以通过子宫静脉播散并经过淋巴系统扩展(血行或淋巴播散)，以解释生殖器结构部位外子宫内膜异位的发生。妇科手术也能发生这些播散(MacSween，1993)。
除了子宫内膜细胞播散外，其他因素诸如遗传体质(Malinak等，1980)，以及免疫学上的变化(Ho等，1997)可决定妇女对子宫内膜异位的易感性。由于子宫内膜细胞在所有妇女的月经期的腹膜液中常能见到，因此，哺乳动物应能以与免疫系统有关的方法防止子宫内膜异位的发生。一般，逃避宿主免疫反应并有足够雌激素刺激的子宫内膜细胞可以增生，形成大的、肉眼可见的病灶，子宫内膜异位因而被认为是一种动态过程，存在的损害可生长或被宿主的免疫反应消灭，而新的病灶不断地形成。
通常与子宫内膜异位相伴随的炎症反应，因其增加了腹膜液的容量及腹膜巨噬细胞的数量和活力而改变腹膜的环境。因此，有人提出单核细胞/巨噬细胞系统在子宫内膜异位的发生中起关键作用。巨噬细胞的分泌产物包括RANTES(Hornung等，1997)、白介素-6(Harada等，1997)、白介素-8(Arici等，1996a)、α-肿瘤坏死因子(Overton等，1996)、单核细胞趋化性蛋白-1(Arici等，1997)在患有这种疾病的妇女的腹膜液中被发现存在的浓度较高。患有子宫内膜异位症的妇女的免疫变化已有阐述，但它们是子宫内膜异位的起因还是子宫内膜异位所致炎症的结果则未阐明(Rana等，1996)。
关子宫内膜异位及其与其他疾病相关性的知识至今有限，甚至诊断水平亦如此。虽然子宫内膜异位被认为是不育症的主要病因，但对该疾病的病理生理学研究是矛盾的且未确定的。由于早期的损害代谢活跃，疼痛或不育症的程度与疾病的严重程度间的相关性不大。不育率高于正常群体，并在家兔研究中表明手术诱发子宫内膜异位后使生育力从75％下降至25％(Hahn等，1986)。现今发现患有骨盆疼痛的病人有71％有内膜异位，而84％的骨盆痛及不育症的患者诊断患有子宫内膜异位(Koninckx等，1991)。通常当子宫内膜异位扩展到正常的阴道结构被破坏时可发生不育症，同时当子宫内膜异位在最低限度时妊娠率正常。
子宫内膜异位影响生育也有不同途径。如白介素-6、干扰素和肿瘤坏死因子等白细胞信使都增加，反过来影响卵母细胞-精子的相互作用。从子宫内膜异位的妇女取得的血清样品在小鼠胚胎模型上发现有胚胎毒性，并在体外能抑止精子的移动(Halme，1991)，当加入重组α-肿瘤坏死因子后效力增强(Eisermann，1989)。但是，这些研究并未说明细胞因子如何影响子宫内膜异位的进展而仅显示了这些分子对精子活力和胚胎细胞的影响。
激素疗法和手术是当今用于治疗子宫内膜异位的两种治疗方式，对子宫内膜异位的现代药理学治疗需要抑制雌激素的产生，使低激素环境阻断异位组织的生长。关于对子宫内膜异位相关的不育症的治疗，激素疗法对最轻病症未证实其益处，而其他研究显示它可提高妊娠率(Arici等，1996b)。
激素疗法包括高剂量的孕激素、雌激素与孕酮的混合物(在一个“假妊娠”的治疗方案中采用高剂量口服避孕药丸剂或OCP)、达那唑(Danazol)(一种炔孕酮的雄激素衍生物)和最近的GnRH激动剂。这些激素治疗对骨盆疼痛有效并导致病灶实质性退化，但有一些凹痕。雌激素可刺激及造成子宫内膜异位组织的增生，可能由于其对孕酮不能反应，甚至在高剂量亦然，因此OCP可对有限的病人提供部分的缓解(Dawood，1993)，促孕剂可引起不规则出血(50％)伴有抑郁、体重增加及液体滞留。达那唑抑制子宫内膜异位引起的多种反应，包括在血清中可溶性α-肿瘤坏死因子、白介素-1β和CD8水平的降低(Matalliotakis，1997；Mori，1990)，甾体重新生成的抑制和从其受体上取代雌二醇。达那唑能在近66-100％的疼痛患者中改善症状，但4年后自然复发率约为40-50％。达那唑治疗的其他缺点为体重增加和雄激素类副反应，可使多达80％的患者放弃这种治疗(Barbieri，1988)。GnRH类似物较天然GnRH更为有效和长效，其作用为去除使所有雌激素敏感组织生长的雌激素刺激物。GnRH类似物的副反应主要继发于深度血雌激素过少，如骨密度下降，五年后的复发率高达50％(Waller和Shaw，1993)。
根据病情，如希望生育，外科手术可以保守性，严重病例可切除子宫、输卵管和卵巢。在任何情况下，即使有限的外科治疗也可导致生育率显著下降。手术后妊娠率一般为35～65％，因此患者需要排卵诱导和子宫内受精以达到正常受孕(Koninckx和Martin，1994)。临床报告表明在剖腹术和子宫内膜增生切除后，多达40％的患者在五年内需再手术。甚至在过分的外科手术后，子宫内膜异位引起的疼痛复发始终是一个显著的问题。外科治疗失败的一些原因可能包括病灶的切除不完全，或未认识到或完全遗漏。许多病灶是显微的，即使用腹腔镜放大后肉眼也不能看见。因此，单用手术不能期望能治愈该疾病(Revelli等，1995)。
由于许多子宫内膜异位症患者受患于传统治疗的缺点(包括激素不平衡的后果、高复发率及不育症)，因此致力于提供子宫内膜异位的其他治疗。一种可能的治疗方法为以使用免疫调节分子为代表，它能改善子宫内膜异位损害和免疫状况。该方法对治疗一般症状被认为是适宜的(Rana等，1996)，但无实验证据表明在子宫内膜异位后表达水平改变的一些细胞因子中何种为优选的治疗介入的目标。
如前所述，子宫内膜异位炎症反应中涉及一些巨噬细胞分泌产物之一为肿瘤坏死因子(以后简称TNF)。TNF也定义为恶液质素，是一种由活性T细胞和巨噬细胞释放的多效性细胞因子。TNF是干扰素、白介素和集落刺激因子细胞因子网络中的一员，通过诱导很多炎症前变化，包括其他细胞因子和粘着分子的产生，而在与许多感染和炎症的发病机理有关的信号系统中，TNF起着关键作用(Fiers，1991)。
为了方便起见，在本发明申请的全文中，术语TNF表示来自动物或人的α或β-肿瘤坏死因子，及其天然存在的α-TNF等位基因的集合(Pennica等，1984)。β-TNF也名淋巴毒素，具有同样的活性，但由不同类型细胞(淋巴细胞及天然杀伤细胞)在对抗原性或促有丝分裂的刺激发生应答时产生(Gray等，1984)。
TNF作为成熟的17KDa蛋白被表达，以三聚物的形式起作用。该复合物集合细胞表面的受体而发挥其生物活性，这些受体在不同的器官及组织介导特定的效应。在子宫内膜，TNF表达是在位的和月经周期依赖性的(Hunt等，1992)，并在实验动物的子宫内膜中导致细胞调亡(Shalaby等，1989)。用TNF预处理间皮细胞后，子宫内膜基质细胞与间皮细胞的粘连显著地增加(Zhang等，1993)，由此支持了TNF可能对子宫内膜异位的发生和/或发展起作用的观点。
TNF通过结合一类膜结合受体分子，包括文献中定义为TNF-RI的p55TNF受体I，和文献中定义为TNF-RII的p75 TNF受体，以发挥其正常发育及免疫系统功能所需的活性(Bazzoni和Beatler，1996)。TNF-RI转导TNF信号的优势被假定为激动对受体特异的抗体以模拟大部分TNF诱导的反应的能力(Shalaby等，1990)。TNF结合到其膜结合受体后经过诸如TRADD和TRAP-1(TNF-RI)或TRAF-1和TRAF-2(TNF-RII)的胞浆调节剂触发信号通道，导致不同的细胞反应，如T细胞增殖、体外肿瘤细胞溶解、皮肤坏死、胰岛素抗性和细胞调亡。两种TNF受体的细胞外部分均可脱落，这些可溶性受体保持结合TNF的能力，与TNF形成高亲和力的复合物使TNF失活，从而减少TNF对靶细胞膜受体的结合(Nophar等，1990)。
小鼠在给予雌二醇和/或黄体酮后，在子宫内膜，膜结合TNF受体水平受影响，造成暂时的和细胞类型特异性TNF-RI的表达(Roby等，1996)。但是，这些研究与涉及子宫内膜异位的各种模型上进行的其他研究一样，在子宫内膜异位病灶的发展过程中，对TNF和TNF-RI的真正体内效应，不论是膜一结合或可溶性，都没有给出任何提示，仅对子宫内膜异位有关的免疫学异常作了叙述。
发明概述本专利申请基于这样的假定，即TNF拮抗剂可以通过隔绝循环TNF，阻断子宫内膜异位损害的进展。该假定由实施例中研究报告所确证，该报告表明在大鼠实验模型中TNF拮抗剂明显地减小子宫内膜异位样病灶。作为申请者的研究结果，在此提供了在个体治疗和/或预防子宫内膜异位的方法，包括给予治疗有效量的TNF拮抗剂。
在第二个实施方案中，本发明涉及在个体中治疗和/或预防与子宫内膜异位相关的不育症的方法，包括以TNF拮抗剂治疗有效量与其他药物组合的给药。
本发明的另一个目的是将TNF拮抗剂与药学上可接受的载体用于制备治疗子宫内膜异位的药物组合物。
在本发明中，TNF拮抗剂的给药可以是非胃肠道或其他有效的配方。非胃肠道给药的任何方式包括静脉内、肌内和皮下给药都合适。除了药学上可接受的载体外。本发明的组合物还可含有少量的添加剂，诸如稳定剂、赋形剂、缓冲剂和防腐剂。
在本发明方法中有用的TNF拮抗剂包括可溶性TNF受体分子、抗-TNF抗体和预防和/或抑制TNF受体发出信号的化合物。可以单独使用TNF拮抗剂或与其他TNF拮抗剂配合使用。与一种或多种药学活性产品配合也可以，特别用以改善子宫内膜异位相关的不育症患者的状况。
发明的描述本发明在此清楚地显示在大鼠实验模型中用TNF拮抗剂隔绝(sequestering)TNF(此为患子宫内膜异位症后的腹膜液内几种细胞因子中唯一的其表达水平增加者)减轻子宫内膜异位样病灶，得到意想不到的结果。这个模型还证明了在不明显影响激素平衡和自然杀伤细胞活力的情况下获得此效果。用TNF拮抗剂减轻子宫内膜异位损伤且还能改善生育率，因为生殖结构的正常化在植入率上有积极的效果。
因此，本发明的主要目的是提供在个体中给予治疗有效量的TNF拮抗剂以治疗和/或预子宫内膜异位的方法。
在第二个实施方案中，本发明涉及在个体中给予治疗有效量的TNF拮挤剂与其他药物的组合以治疗与子宫内膜异位相关的不育症状况的方法。
本发明的另一个目的是用TNF拮抗剂配以药学上可接受的载体用于制备治疗和/或预防子宫内膜异位的药物组合物。用这种方法制备药物组合物也是本发明的另一个目的。
本申请要求保护的组合物的活性成分为TNF拮抗剂。要求保护的TNF拮抗剂以一种或两种方式发挥其作用。第一，拮抗剂以其足够的亲和力及特异性自身结合于或隔绝TNF分子以实质地中和负责TNF受体结合的TNF表位(以后称为“隔绝拮抗剂”)。此外，TNF拮抗剂可以抑制在TNF结合后由细胞表面受体活化的TNF信号通道(以后称为“信号拮抗剂”)。按照本发明，在治疗子宫内膜异位上此两种拮抗剂不论单独或一起使用都是有用的。
TNF拮抗剂可用常规从待选物中筛选出其在体外易感细胞系(例如人类B细胞，TNF可使增殖并分泌Ig)上对天然TNF的活性，容易地鉴别和评定其效果。测定包括不同稀释程度的待选拮抗剂的TNF制剂，例如，在测定中所用的TNF摩尔量的0.1至100倍，对照组不加TNF或仅加拮抗剂(Tucci等，1992)。
隔绝拮抗剂是本发明的优选TNF拮抗剂。在隔绝拮抗剂中以高亲和力结合TNF和低免疫原性的多肽为优选。可溶性TNF受体分子和TNF中和抗体为特别优选。可溶性TNF受体分子和中和TNF抗体为特别优选。例如，TNF-RI和TNF-RII在本发明中有用。按照本发明，这些受体的截短形含有受体的细胞外结构或其功能部位的为特别优选的拮抗剂。TNF受体的截短形为可溶性的且在尿和血清中检出为30kDa和40kDa TNF抑制结合蛋白，原名分别为TBPI和TBPII(Engelmann等，1990)。受体分子的衍生物、片断、区域和生物活性部分功能性地组成了能用于本发明的受体分子。受体分子的一些生物活性等同物或衍生物指所述多肽的部分，或编码受体分子的序列，其具有足够的大小，并能与TNF结合，其亲和力使与膜结合TNF受体的相互作用受抑制或阻断。在一个优选的实施方案中，人可溶性TNF-RI是对患者投药的TNF拮抗剂。天然的和重组的可溶性TNF受体分子及其制备方法在欧洲专利申请EP308,378，EP98,327和EP433,900中已有阐述。
本发明方法中有用的受体分子的另一些例子是TNF受体多亚基(multimeric)分子和TNF免疫受体融合分子。本发明中有用的TNF受体多亚基分子包括通过一个或多个多肽连接物连接的两个或多个TNF受体的细胞外结构的全部或一个功能部分。多亚基分子还可包括一个分泌性蛋白的信号肽以直接表达多亚基分子。这些多亚基分子及其产生方法已在欧洲专利申请EP526,905中叙述。
本发明方法中有用的TNF免疫受体融合分子含有一个或多个免疫球蛋白分子的至少一部分及一个或多个TNF受体的全部或功能性部分。这些免疫受体融合分子可以装配成单体或异多亚基或同多亚基。免疫受体融合分子亦可为单价或多价。TNF免疫受体融合分子及其产生方法曾在欧洲专利申请EP620,739，相应于PCT专利申请WO94/06476中叙述。
本发明方法中有用的另一类隔绝拮抗剂以抗TNF抗体为代表，包括单克隆、嵌合人源化和重组抗体及其片断，其特征为在体内高亲和力地与TNF结合和低毒性。可用于本发明的抗体其特征是对患者进行足够时间的治疗使子宫内膜异位的损害退化有效至良效，减轻症状和低毒性。中和抗体可由TNF免疫兔或小鼠等动物而容易地产生。免疫小鼠特别有用于提供B细胞的来源，用于制造杂交瘤，再经培养产生大量的抗TNF单克隆抗体。嵌合抗体为免疫球蛋白分子，其特征为具有二个或多个来自不同动物种族的片段或部分。通常嵌合抗体的可变区来自非人类的哺乳动物抗体如鼠单克隆抗体，免疫球蛋白恒定区来自人的免疫球蛋白分子。优选地，二个区域及其组合具有常规测定的低免疫原性(Elliott等，1994)。人源化抗体是由基因工程技术制造的免疫球蛋白分子，其中鼠恒定区用人的对应部分替代而保留鼠的抗原结合区域。生成的鼠—人嵌合抗体对人类有降低免疫原性及改善药代动力学(Knight等，1993)。在本发明方法中有用的优选的高亲和力单克隆抗体及其嵌合衍生物的例子在欧洲专利申请EP186,833和PCT专利申请WO92/16553中叙述。
TNF拮抗剂可由多种途径对个体给药。给药途径包括皮内、经皮(例如，在缓释制剂中)，肌内、腹腔内、静脉、皮下、口服、硬膜外、局部及鼻腔内途径。任何其他治疗有效的给药途径均可应用，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗，其中，将编码TNF拮抗剂的DNA分子对患者投药(如通过载体)使TNF拮抗剂在体内表达和分泌。此外，TNF拮抗剂可与其他生物活性剂如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、稀释剂或任何其他载体一起给药。
“药学上可接受”的定义指包括任何不影响活性成分生物活性的有效性和对服药的宿主无毒性的载体。例如，TNF拮抗剂可在诸如盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白及林格氏液中配制成单剂量注射剂型供非胃肠道给药。
TNF拮抗剂可与药学上可接受的非胃肠道用载体(如水、盐水、右旋糖溶液)和维持等渗的添加剂(如甘露醇)或化学稳定剂(如防腐剂和缓冲剂)一起配伍成溶液、混悬剂、乳剂或冻干粉，供非胃肠道(如静脉、皮下、肌内)给药。制剂用常用技术灭菌。
可用接合方法使在人体内的半衰期增加而改善TNF拮抗剂的生物利用度，例如在PCT专利申请WO92/13095所述将此分子与聚乙二醇结合。
TNF拮抗剂的治疗有效量是许多变量的函数，包括拮抗剂的类型、拮抗剂对TNF的亲和力、拮抗剂显示的任何残留细胞毒性、给药途径、患者的临床状况(包括维持内源性TNF活性的无毒性水平的需要性)、隔绝剂中多个TNF结合部位的存在，如抗体。
“治疗有效量”为注射后该TNF拮抗剂引起TNF生物活性抑制的剂量。给予个体单剂或多剂量时，给药剂量根据多种因素而不同，包括TNF拮抗剂的药代动力学性质、给药途径、患者状况和特性(性别、年龄、体重、健康状况、体型)、症状程度、并存的治疗、治疗频率和期望的效果。已建立的剂量范围的调节和操作是在本领域技术人员的能力之内及测定个体TNF抑制的体外和体内方法范围内的。
由于在人临床试验中TNF最大耐受剂量范围达约25微克/米2体表面/24小时，拮抗剂的给药剂量通常不需要超过中和该TNF量计算所得的剂量。因而TNF拮抗剂的摩尔剂量可以变化约从0.001至10倍于TNF最大耐受摩尔剂量，尽管如上所述它在很大程度上受治疗离散性的影响。
此外，在临床研究中所得的数据，其中罹患子宫内膜异位妇女的腹膜液中TNF浓度的增加已用多种方案证明(Eisermann等，1988；Halme，1991；Overton等，1996)，也可用于对拟给药的TNF拮抗剂有效剂量的测定。
通常活性成分的每日剂量可为每公斤体重约0.01至100毫克。一般每日每公斤体重1-40毫克，分次或以缓释剂型给药，可有效地得到期望的结果。对个体的第二次或以后的给药可以用相同的、少于或大于开始剂量或以前的剂量。第二次或以后的给药可以在子宫内膜异位或有关症状复发前给药。术语“复发”或“再出现”定义为包括子宫内膜异位症状的一次或更多次的出现。
TNF拮抗剂可以对个体在以其他治疗方案或制剂(如多种药物治疗方案)治疗之前、同时或相继以治疗有效量进行预防或治疗，特别对不育症的治疗。TNF拮抗剂在与其他治疗剂同时给药时可以同一组合物或不同的组合物给药。特别在希望治愈子宫内膜异位伴有的不育症时，可以给予生物活性人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体化激素(LH)或卵泡刺激素(FSH)，以天然的高度纯化形式或以重组形式给药。这些分子及其制备方法曾在欧洲专利申请EP160,699，EP211,894和EP322,438中叙述。
本发明现在可用实施例说明，该实施例并不企图以任何方式限制本发明，并参照附图进行说明。


图1表示抗排卵肽(2毫克/公斤，每3日皮下给予)，重组可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，一星期内分二个日剂量皮下给予)对实验性子宫内膜异位大鼠在最后一次治疗后2天及9天的移植物大小的治疗效果。这些数据得自每组6个动物的第一次处死时间点和每组5个动物的第二次处死时间点，代表平均抑制百分率±SEM。
图2表示重组可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射，一周内分二次每日剂量给药)和抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每三日给药一次)在最后治疗后二天(组A)和9天(组B)大鼠脾细胞对YAC细胞的大鼠NK活性(释放51Cr)的效应。数据代表平均溶解百分率±SEM。
图3表示与对照组及抗排卵肽(2毫克/公斤皮下注射，每3天给药一次)相比，重组可溶性TNF-RI(10毫克/公斤皮下注射在一周内分二个日剂量给予)对大鼠实验性子宫内膜异位的17β-雌二醇血清水平的影响。数据代表17β-雌二醇的平均浓度±SEM。
实施例材料及方法动物雌性Sprague-Dawley大鼠(250-275克)购自意大利Charles River(Calco，Lecco，意大利)。动物在如下环境中饲养温度22±2℃，相对湿度55±10％，通过HEPA99.997％过滤器以每小时15±3次换气通风，用24小时周期内12小时(700-1900)进行人工照明。实验前动物在该环境中适应至少一周。动物用标准粒状饲料任意进食饲养。
研究药物抗排卵肽由Bachem(加州，美国)制备和提供，实施例中所用的人重组可溶性TNF-RI分子具有相当于人TNF-RI片段20-180的序列(Nophar等，1990)，在CHO细胞中制备并由Interpharm Laboratories Ltd.(以色列)以r-hTBP-1的名称提供。
材料通用细胞培养材料系购自Gibco BRL，Life Technologies(Paisley，英国)。17β-雌二醇RIA药盒购自DPC(Los Angeles CA，美国)。Inoketam购自Virbac(Carros，法国)。[51Cr]铬酸钠购自NEN Dupont(Boston，MA，美国)。Rompun购自Bayer AG(Leverkusen，德国)。丝缝线7.0购自Ethicon(Pomezia，意大利)。
大鼠子宫内膜异位实验模型用以前曾叙述过的实验模型(Jones，1987)经过稍许改良以探查重组可溶性TNF-RI在子宫内膜异位中的作用。在Inoketam/Rompun的麻醉下，从右子宫角切下自体子宫内膜组织片段(长1公分)放入37℃的PBS中。纵向切开子宫部分，不除去子宫肌层而将5×5厘米的切片四角用非吸收性丝缝线移植至腹壁内表面上。
子宫内膜异位实验模型中研究药物效果的探察术如上所述，在麻醉大鼠上手术引发实验性子宫内膜异位。此外，另一组大鼠从一个子宫角同样移除一个片段，但植入5×5厘米见方的子宫周围的脂肪(假手术组)。另一组大鼠不经任何手术作为正常对照组。在引发子宫内膜异位后三个星期，动物接受第二次剖腹(治疗前剖腹)以评价异位子宫内膜组织的大小和存活力。用卡尺测量并记录表面积(长×宽)。移植物存活的动物如表1中所示归纳入指定的治疗组，由此在实验结束时得到第一次处死时间点每组六个动物及第二次处死时间点每组五个动物。治疗在一周的恢复期后开始进行。对照组单给盐水，另一组用以前提出的给药方案每三天接受皮下注射抗排卵肽2毫克/公斤共三次，以抑制卵巢和下丘脑的活性(Sharpe等，1990)。另外一组在一星期内接受10毫克/公斤重组可溶性TNF-RI，分成两个日剂量给药。
表1

(1)从手术移植之日起(第1天)在指定的处死时间点(末次治疗后的第2和第9天，即手术移植后的36和43天)，将动物麻醉，从腹主动脉采集血样，分离出血清贮于-20℃直至测定雌二醇-17β水平。切下脾脏，用于测量自然杀伤细胞(NK)活性。在每个处死时间点测定子宫内膜异位样病灶的表面积。为了使数据标准化，对治疗前剖腹值的变化百分率由下式计算X-XoXo×100]]>式中Xo为治疗前剖腹时的大小，X是处死时的大小，然后计算每组中变化百分率的平均值。
NK活性测定用51Cr-释放试验测定NK活性程度。在对数生长期收集小鼠淋巴瘤YAC-1细胞，用培养基(RPMI1640，含青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和10％热灭活的胎牛血清)洗涤一次。细胞小粒用100微居里的[51Cr]-铬酸钠于37℃、5％CO2中培养2小时。然后用10ml的试验培养基将细胞洗涤三次，再以合适的浓度重新悬浮并在大鼠脾细胞存在下加至测定平板中。在加入51Cr-标记靶细胞前将其以合适浓度(2×106毫升)再悬浮在试验培养基中，在U形底的96孔平板中以一式三份用试验培养基进行系列稀释。测定板每个孔中加入51Cr-标记的靶细胞(5×103)。每个样品以三种效应物靶比例(200∶1，100∶1和50∶1)进行测定，含效应物靶细胞混合物的板以200×g离心4分钟后在37℃、5％CO2中培养4小时。再将板在200×g离心4分钟后，从每个孔中取出20微升上清液移至玻璃纤维滤器中，用β-计数器估测其相应的放射性。
按下式计算溶解百分率 此处cpm样品＝有效应细胞存在下的51Cr释放平均值cpmspont＝在培养基存在下的51Cr释放平均值cpm总＝有1％Triton-X100存在下靶细胞的51Cr释放平均值17β-雌二醇的测定用市售药盒测定血清17β-雌二醇浓度可不经提取步骤以定量血清中的雌二醇(DPC，Los Angeles，CA，美国)。简言之，125I-标记的雌二醇与血清样品中的雌二醇竞争抗体位置。培养后用倾出法从游离的雌二醇中隔绝出结合的雌二醇。试管在伽码计数器(LKB-Pharmacia Wallak)中计数，计数值与血清样品中存在的雌二醇量呈逆相关。将计数值与校正曲线比较，测得样品中雌二醇的量。抗血清对雌二醇高度特异，较其他天然来源的甾体有相对低的交叉反应性。从同一实验活动中来的样品在一次免疫测定中进行分析。
统计分析用Statgraphics Plus软件(1.4版)中的ANOVA对治疗组中观察到的差异进行统计学显著性评价，进行Tukey’s多重范围试验(p＜0.05)。
结果实验性子宫内膜异位中重组可溶性TNF-RI作用的探察大鼠手术移植子宫内膜异位组织的成功生长和发育提供了研究模型用于研究不能在人类中恰当研究的子宫内膜异位的某些方面(Dudley等，1992)。以前的大鼠实验性子宫内膜异位研究表明抗排卵肽可以恰当地用作阳性对照(Sharpe等，1990)。在本实施例中，将抗排卵肽的效果与用重组可溶性TNF-RI所得的治疗前后移植物尺寸大小进行比较。结果总结于表II。
表II

图1中的结果表示为移植的子宫内膜片段的平均抑制百分率(计算如上述)。
抗排卵肽在缩小子宫内膜样病灶上有效(图1)，在停止治疗后于二个观察时间点均能导致几乎完全的(与原来尺寸相比分别为94％和88％)以及统计学显著性(p＜0.05，ANOVA和Tukey’s试验)的缓解。用人重组可溶性TNF-RI(10毫克/公斤，二个日剂量)治疗一星期，结果在二种观察时间点时子宫内膜异位样病灶的大小均有明显减缩(与原来相比分别为33％和64％)。但仅在第9天有统计学显著意义(P＜0.05，ANOVA和Tukey’s试验)。在假手术动物中任何时候均未观察到移植物。
NK细胞活力评价用脾细胞对YAC细胞的体外试验评测NK细胞活力，各组间没有显示任何差异(图2)。与在狒狒上观察到的相同，在有或无子宫内膜异位的狒狒上未见抗子宫内膜细胞毒性和NK细胞活力的差异(D’Hooghe等，1995)。这个发现与人的数据相反，曾有报导子宫内膜异位患者的NK活性抑制，腹膜NK活力的降低与子宫内膜异位的严重程度显著相关(Oosterlynck等，1992)。
血清17β-雌二醇的评价在两个观察时间点均用放射免疫法测定血清17β-雌二醇浓度。在第二个观察时间点抗排卵肽治疗组与未治疗的对照组有明显差异，而重组可溶性TNF-RI与对照组比较无统计学显著差别(图3；p＜0.05，ANOVA和Turkey试验)。
结论在子宫内膜异位的大鼠实验模型中，给予TNF拮抗剂，即可溶性TNF-RI，首次对这种病理学状况提供了以细胞因子为基础的、非激素相关性治疗潜在有效性的证据。因此TNF拮抗剂在降低副反应方面作为现有医学治疗的一个替代物。这些结果评估了TNF拮抗剂在治疗子宫内膜异位相关性不育症上的应用。
本技术领域的熟练人员将知道或能肯定，此处用不多于常规的实验叙述了许多相当于本发明的具体实施方案，这些和所有其他的相当部分均包含在以下权利要求中。
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权利要求
1.TNF拮抗剂与一种药学上可接受的载体在制备治疗和/或预防子宫内膜异位的药物组合物上的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述的TNF拮抗剂是一种可与TNF特异性表位结合的多肽，其结合方式使TNF不能再与膜结合的TNF受体相结合。
3.如权利要求2所述的应用，其中TNF拮抗剂是结合于TNF的一种受体分子、其衍生物或其片段。
4.如权利要求3所述的应用，其中受体分子选自包括TNF-RI和TNF-RII的一组。
5.如权利要求3所述的应用，其中受体分子是TNF-RI的细胞外结构。
6.如权利要求3所述的应用，其中受体分子是人可溶性重组TNF-RI。
7.如权利要求3所述的应用，其中受体分子是TNF受体多亚基分子或其功能部分。
8.如权利要求7所述的应用，其中TNF受体多亚基分子包含通过1个或多个多肽连接物连接的2个或更多个TNF受体细胞外结构的全部或一个功能部分。
9.如权利要求3所述的应用，其中受体分子是一种免疫受体融合分子或其功能部分。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述免疫受体融合分子包含TNF受体的全部或功能部分和一个免疫球蛋白链。
11.如权利要求1所述的应用，其中TNF拮抗剂是一个抗TNF抗体或其片段。
12.如权利要求11所述的应用，其中单克隆抗体选自嵌合的单克隆抗体、人源化单克隆抗体或其片段。
13.如权利要求1所述的应用，其中TNF拮抗剂预防或抑制TNF受体信号。
14.TNF拮抗剂与药学上可接受的载体在制备用于治疗和/或预防子宫内膜异位相关的不育症的药物组合物上的应用。
15.治疗和/或预防子宫内膜异位的方法，该方法包括给予患者治疗有效剂量的TNF拮抗剂。
16.治疗和/或预防子宫内膜异位的药物组合物，含有TNF拮抗剂与药学上可接受的载体。
17.治疗和/或预防子宫内膜异位相关的不育症的药物组合物，含有TNF拮抗剂与药学上可接受的载体。
18.如权利要求16或17所述的药物组合物，其中TNF拮抗剂具有 1-13之一所述的特征。
全文摘要
肿瘤坏死因子拮抗剂以治疗有效剂量给药以治疗和/或预防子宫内膜异位。本发明的拮抗剂一般选自各类分子但优选的为可溶性TNF受体。该拮抗剂对子宫内膜异位损害的消退有用,如与其他活性成分合用可改善相关的疾患,例如不育症。
文档编号C07K14/715GK1337883SQ00803030
公开日2002年2月27日 申请日期2000年1月19日 优先权日1999年1月22日
发明者F·博雷利列, M·德安东尼奥, F·马尔泰利 申请人:应用研究系统Ars股份公司