金属蛋白酶抑制剂的制作方法

专利名称：金属蛋白酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于金属蛋白酶抑制的化合物，更具体地说，涉及包括这类化合物的药用组合物及其使用。
本发明的化合物为一种或多种金属蛋白酶的抑制剂。金属蛋白酶是蛋白酶(酶)的一个超家族，其数目近年来急剧增加。如N.MHooper(1994)FEBS Letters3541-6中所述，基于结构与功能方面的考虑，这些酶被分成家族与亚家族。金属蛋白酶的实例包括基质金属蛋白酶(MMP)如胶原酶(MMP1，MMP8，MMP13)、明胶酶(MMP2，MMP9)，溶基质素(MMP3，MMP10，MMP11)、基质蛋白溶素(matrilysin)(MMP7)、金属弹性蛋白酶(MMP12)、enamelysin(MMP19)、MT-MMPs(MMP14，MMP15，MMP16，MMP17)；包括分泌酶和shedases如TNF转化酶(ADAM10和TACE)的reprolysin或adamalysin或MDC家族；包括原胶原加工蛋白酶(PCP)的虾红素；及其它金属蛋白酶如聚集蛋白聚糖酶(aggrecanase)、内皮素转化酶家族和血管紧张肽转化酶家族。
金属蛋白酶被认为在涉及组织重新模造(remodelling)如月经期间的胚胎发育、骨形成和子宫重新模造的生理疾病过程的多血症方面是重要的。这是基于金属蛋白酶裂解种类繁多的基质底物如胶原、蛋白多糖和纤维结合素。金属蛋白酶也被认为对生物重要细胞介质如肿瘤坏死因子(TNF)的生成和分泌起重要作用；对生物学上重要的膜蛋白如低亲和力IgE受体CD23(更完整的列表见N.M.Hooper等的(1997)Biochem j.321265-279)的后转移蛋白水解加工或脱落(shedding)，也是重要的。
金属蛋白酶与许多疾病状态相关。对一种或多种金属蛋白酶的活性的抑制对医治这些病是有益的，比如各种炎症和变应性疾病如关节炎(尤其是类风湿性关节炎、骨关节炎和痛风)、胃肠道炎症(尤其是炎性肠道疾病、溃疡性结肠炎和胃炎)、皮肤炎症(尤其是牛皮癣、湿疹、皮炎)；肿瘤转移和侵入；与细胞外基质的非控制降解相关的疾病如骨关节炎；骨吸收疾病(如骨质疏松症和培吉特氏症)；与异常血管生成有关的疾病；与糖尿病有关的增强的胶原重新模造，牙周炎(如龈炎)、角膜溃疡、皮肤溃疡、手术后疾病(如结肠吻合下)和皮肤创伤愈合；中枢和外周神经系统的脱髓鞘疾病(如多发性硬化)；阿尔茨海默氏病；及见于心血管疾病如再狭窄和动脉粥样硬化的细胞外基质重新模造。
已知许多金属蛋白酶抑制剂；不同种类的化合物抑制各种金属蛋白酶可有不同的效果和选择性。我们已经发现一类新的化合物，它们为金属蛋白酶抑制剂并在抑制MMP-13方面具有特别的重要性。本发明的化合物具有有益的效果和/或药物动力学性质。
MMP-13，或胶原酶3，最初是以衍生自乳房肿瘤的cDNA基因库克隆的[J.M.P.Freije等(1994)Journal of Biological Chemistry269(24)16766-16773]。对取自各种组织的RNAs的PCR-RNA分析表明，MMP13表达受限于乳房癌，因为它在乳房纤维腺瘤、正常或静止期乳腺、胎盘、肝、卵巢、子宫、前列腺或腮腺中或在乳癌细胞系中未被发现(T47-D、MCF-7和ZR75-1)。继该观察之后，在转化表皮角质化细胞[N.Johansson等的(1997)Cell Growth Differ.8(2)243-250]、鳞状细胞癌[N.Johansson等的(1997)Am.J.Pathol.151(2)499-508]和表皮肿瘤[K.Airola等的(1997)J.Invest.Dermatol.109(2)225-231]中检测到MMP13。这些结果提示MMP13由转化的上皮细胞所分泌，并可能涉及与转移尤其是在侵入的乳癌病变和皮肤癌发生中恶性的上皮生长所观察到的转移相关的细胞外基质的降解和细胞-基质的相互作用。
最近发表的数据表明，MMP13在其它结缔组织的更新中起作用。如，与MMP13的底物特异性和优先降解II型胶原[P.G.Mitchell(1996)J.Clin.Iuvest.97(3)761-768；V.Knauper等，(1996)The BiochemicalJournal 2711544-1550]相一致，MMP13已被假定在最初的骨化和骨骼重新模造期间[M.Stahle-Backdahl等的(1997)Lab.Invest.76(5)717-728；N.Johansson等的(1997)Dev.Dyn.208(3)387-397]、在破坏性关节疾病如类风湿性关节炎和骨关节炎中[D.Wernicke等的(1996)J.Rheumatol.23590-595；P.G.Mitchell等的(1996)J.Clin.Invest.97(3)761-768；O.Lindy等的(1997)Arthritis Rheum40(8)1391-1399]及在髋置换的无菌松驰(loosening)[S.Imai等的(1998)J.Bone Joint Surg.Br.80(4)701-710]期间起作用。因为MMP13定位于慢性炎性粘膜牙龈组织的上皮中，它也与慢性成人牙周炎有关[V.J.Uitto等的(1998)Am.J.Pathol152(6)1489-1499]并与慢性创伤中的胶原基质的重新模造有关[M.Vaalamo等(1997)J.Invest.Dermatol.109(1)96-101]。
MMP9(明胶酶B；92kDa IV型胶原酶；92kDa明胶酶)为一类分泌的蛋白质，它于1989年被首先纯化，然后被克隆和测序(S.M.Wilhelm等(1989)J.Biol Chem.264(29)17213-17221)。勘误见J.BiolChem.(1990)265(36)22570.)。对MMP9的最近的综述提供了有关这类蛋白酶的详尽信息和参考文献的最佳来源T.H.Vu &Z.Werb(1998)(见Matrix Metalloproteinases.1998.W.C.Parks &R.P.Mecham编辑，115-148页。学院出版社(Academic Press)，ISBN0-12-545090-7)。从T.H.Vu & Z.Werb(1998)的综述中得出下列几点。
MMP9的表达一般只限于包括滋养层、破骨细胞、中性白细胞和巨噬细胞在内的几种细胞类型。然而，通过几种介质，包括细胞对生长因子或细胞因子的接触，可在这些相同的细胞和其它类型细胞中诱导其表达。这些相同的淋巴因子往往与引发炎性反应有关。如同其它分泌的MMP一样，MMP9作为一种失活的酶原被释放出来，其随后被裂解形成活性酶。尚未知在体内需要这种活化的蛋白酶。通过与TIMP-1(金属蛋白酶-1的组织抑制剂)-一种天然存在的蛋白质的相互作用，活性MMP9与非活性酶的平衡在体内被进一步调节。TIMP-1结合到MMP9的C-端区域，导致MMP9的催化结构域的抑制作用。MMP9原(ProMMP9)的诱导的表达的平衡、MMP9原裂解成活性的MMP9和TIMP-1的存在联合确定现场存在的催化活性MMP9的量。蛋白水解酶活性的MMP9攻击包括明胶、弹性蛋白和天然的IV型和V型胶原在内的底物；它对天然I型胶原、蛋白聚糖或层粘连蛋白无活性。
越来越多的资料提示MMP9在各种生理学和病理学过程中起作用。生理作用包括在胚胎植入的早期阶段通过子宫上皮对胚胎滋养层的侵入；在骨生长和发展中的某些作用；从脉管系统到组织的炎性细胞的迁移。已观察到在某些病理学状态下的增加的MMP9表达，由此说明在疾病过程如关节炎、肿瘤转移、阿尔茨海默氏病、多发性硬化和动脉粥样硬化中的蚀斑破裂的MMP9导致急性冠状疾病如心肌梗塞。
在本发明的第一个方面，我们提供式I化合物 其中环B为包括最高可达12个环原子并含一个或多个独立选自N、O和S的杂原子的单环或双环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基环。或者环B可为联苯基；环B可任选通过连接环B2-位与相对于X2的α碳原子的C1-4烷基或C1-4烷氧基链连接至环A；每个R3独立选自氢、卤素、NO2、COOR，其中R为氢或C1-6烷基、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基、C1-6烷氧基和最多可达C10的芳氧基，n为1、2或3；P为-(CH2)n，其中n＝0、1、2，或P为最多可达6个碳原子的烯链或炔链；其中X2为C，P可为-Het-、-(CH[R6])n-Het-、-Het-(CH[R6]n-或-Het-(CH[R6])n-Het-，其中Het选自-CO-、-S-、SO-、-SO2-、-NR6-或-O-，其中n为1或2，或P可选自-CO-N(R6)-、-N(R6)-CO-、-SO2-N(R6)-和-N(R6)-SO2-，且R6为氢、C1-6烷基、最多可达C10的芳烷基或最多可达C9的杂烷基；环A为5-7元脂族环并可任选被任选取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基单-或双-取代，各取代基独立选自卤素、C1-6烷基或氧代基；X1和X2独立选自N和C，其中环A上的环取代基为氧代基，它优选与环氮原子相邻；Y选自-SO2-和-CO-；Z为-CONHOH，Y为-CO-且Q选自-C(R6)(R7)-、-C(R6)(R7)-CH2-、-N(R6)-及-N(R6)-CH2-，其中R6定义如上，并只与如在此定义的Q相关联，R6也可代表最多可至C10的芳基和最多可至C9的杂芳基，而R7为H、C1-6烷基或与R6一起形成碳环或杂环螺的5、6或7元环，后者至少含一个选自N、O和S的杂原子；Z为-CONHOH，Y为-SO2-而Q选自-C(R6)(R7)-和-C(R6)(R7)-CH2-；或Z为-N(OH)CHO而Q选自-CH(R6)-、-CH(R6)-CH2-和-N(R6)-CH2-；R1为H或C1-6烷基；Z选自-COOH、-CONHOH、-N(OH)CHO和N(OH)COR，其中R为C1-6烷基、最多可至C10的芳基和最多可至C9的芳烷基及R2为有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被下列基团所取代(i)Y-R9，其中R9为C1-6烷基、最多可至C10的芳基、最多可至C12的芳烷基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基，或(ii)Y-T-R9，其中Y和R9如先前所定义，而T为氧或N-R8，其中R8为氢或C1-6烷基，杂原子独立选自氧、氮和硫；R9和R8独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代。
任何上述的烷基可为直链或支链。
上述基团的简明意义如下环A＝5-6个元脂族环，如哌嗪或哌啶环，并可任选被任选取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基单-或双-取代，各取代基独立选自卤素、C1-6烷基或氧代基；R3＝氢、卤素、NO2、CF3、C1-4烷基和C1-4烷氧基，n为1或2，如单独为4-氟、CF3、4-氯和3，4-二氯；环B＝含有最多可至10个环原子的单环或双环环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，尤其是含有最多可至7个环原子的单环芳基、芳烷基或杂芳基，更特别地为含有最多可至6个环原子的单环芳基或杂芳基，如苯基或吡啶基环；P＝-(CH2)n，其中n为0或1，或P为-NH-CO-X2和X1中的一个或两个为NY＝-SO2-或-CO-；Q＝-CH(R6)-、-CH(R6)-CH2-、-N(R6)-和-N(R6)-CH2-，其中R6为氢或C1-6烷基；当Q＝-N(R6)-或-N(R6)-CH2-，则Y也可为-CS-；特别地Q＝-CH(R6)-，其中R6为氢或C1-4烷基如丙基或丁基，尤其是丙基；且其中的Q联至R1或R2上以形成5-7元烷基环或杂烷基环如环己基环；R1＝氢或C1-4烷基；Z＝-CONHOH-或-N(OH)CHO而R2为有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被下列基团所取代(i)Y-R9，其中R9为C1-6烷基、最多可至C10的芳基、最多可至C12的芳烷基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基，或(ii)Y-T-R9，其中Y和R9如先前所定义，而T为氧或N-R8，其中R8为氢或C1-6烷基，杂原子独立选自氧、氮和硫；R9和R8独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代。
上述基团优选意义如下R3＝氢、氯、氟、NO2、CF3、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，尤其是甲氧基或氟；环B＝苯基、联苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，特别是苯基或吡啶基，更特别是苯基或2-吡啶基；环A＝哌嗪；P为直键；X2和X1都为N；Y＝-SO2-；Q＝-CH2-；R2为具有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被(i)Y-R9取代，其中Y为-SO2-或-CO-，而R9为C1-6烷基或烷基氨基、最多可至C10的芳基或芳基氨基、最多可至C12的芳烷基或芳基烷基氨基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基；R9独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代；R1为氢；Z为-N(OH)CHO；更优选的意义包括R3为甲氧基、氟或4-氟代基；环A为未被取代的；环B为苯基、吡啶基或2-吡啶基；R2为3-或4-哌啶基，任选被Y-R9 N-取代，其中Y为-SO2-或-CO-，而R9为C1-4烷基或烷基氨基、C6芳基或芳基氨基、最多可至C10的芳烷基或芳基烷基氨基或最多可至C10的杂芳基(杂)烷基；R9独立地任选被1或2个选自卤素、CF3和C1-4烷基的基团所取代；环A与环B优选的结合各自包括苯基和哌嗪基；吡啶基和哌嗪基。
具体的化合物包括那些环A未被取代的化合物。
环B的具体的脂族环、稠合杂环包括下列任何一个
具体的环A包括下列任何一个 及其相应的七元类似物。
可以理解要选择环A和B上的具体的取代基和取代基的数目，以避免空间上不需要的结合。
由于光学活性中心存在于式I化合物中，我们公开作为本发明各具体实施方案的所有单一的光学活性形式和这些形式的结合，以及它们相应的外消旋体。
上述化合物为有效的MMP13抑制剂，它们也有良好的聚集蛋白聚糖酶活性。如先前所述，本发明的化合物为金属蛋白酶抑制剂，具体地说，它们为MMP13的抑制剂。对式I化合物的上述每一说明表示本发明的一个独立和具体的实施方案。但我们不希望被理论原理所局限，对与任何MMP1抑制活性相关的任何一种上述适应症而言，相信本发明的化合物可显示出选择性抑制作用，通过非限止实施例，它们可表现出高于任何MMP1抑制活性100-1000倍的选择性。
本发明的化合物可以作为药学上可接受的盐提供。它们包括酸加成盐如氢氯酸盐、氢溴酸盐、柠檬酸盐和马来酸盐及与磷酸和硫酸所形成的盐。另一方面合适的盐为碱盐如碱金属盐如钠或钾，碱土金属盐如钙或镁，或有机胺盐如三乙胺。
它们也可作为体内可水解的酯来提供。存在药学上可接受的、在人体内可水解生成前体化合物的酯。这类酯可通过试验给药，如通过静脉内注射给试验动物，并不断检测试验动物的体液来确定。适用的体内可水解的酯，对于羧基而言，包括甲氧基甲基，而对于羟基而言，包括乙酰基。
为采用式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯医治(包括预防疗法)包括人在内的哺乳动物，往往根据标准的药学实践将其配制为药用组合物。
因此，本发明的另一方面提供了一种药用组合物，它包括式(I)的化合物或药学上可接受的盐或体内可水解的酯及药学上可接受的载体。
对需治疗的疾病，本发明的药用组合物可通过常规方式给药，如口服、局部、胃肠外、颊下、鼻、阴道或直肠给药或通过吸入法给药。为此目的，本发明的化合物可通过本领域所熟知的方法配制成如，片剂、胶囊、水性或油性溶液、悬浮液、乳液、乳膏、软膏、凝胶、鼻喷雾剂、栓剂、精细分散的粉末或用于吸入的气雾剂，以及不经肠使用(包括静脉的、肌内的或输注)的无菌水性或油性溶液或悬浮液或无菌乳液。
在治疗一种或多种上文所指的疾病时，除本发明的化合物之外，本发明的药用组合物也可含有一种或多种有用的药剂，或与一种或多种有用的药共同(同时或顺序)给药。
本发明的药用组合物一般给予人体的接受量为，如，每天0.5-75mg/kg体重(优选0.5-30mg/kg体重)。如果需要，该日剂量可分次给药，根据本领域所熟知的原则，本化合物的精确用量和给药途径取决于接受治疗的患者的体重、年龄和性别并取决于待治疗的疾病状况。
一般的单位剂型将包含约1mg-500mg的本发明化合物。
因此，另一方面，本发明提供了一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯，以用于人体或动物体的治疗方法中。
在又一方面，本发明提供了一种治疗金属蛋白酶介导的疾病的方法，它包括给与温血动物治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯。
另一方面，本发明提供制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯的方法，该方法包括a)使式(II)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯与式(III)化合物反应 其中，X11代表X或X的前体(无论通过修饰或取代)或适于与Y1反应的X的活化形式；Y1代表Y、Y的前体或适于与X11反应的Y的活化形式；通过非限止性实施例，当X为C时，为与式III化合物反应，则X1可被衍化而含有Y的前体，其中的Y1为Y的前体；Z1代表Z的被保护形式、Z的前体(无论通过Z1的修饰或取代)或Z的活化形式；或b)使式(IV)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯与式(V)化合物反应。 其中B1代表与Pi反应适用的环官能团或取代基；Z1如前所定义；且Pi代表与B1反应的连键(linker)P的适合的活化形式；或c)使通式(VIII)化合物 其中R2*为R2的前体，与合适试剂反应，经一步或多步生成R2。在这些步骤中可便利地保护Z基团。作为非限制性实施例，R2*为哌啶或哌嗪环；或(d)使式IX的化合物与适当的式R1-CO-R2的化合物反应，生成式X的烯烃，再将其转化为式XI化合物，其中Z*为Z基团的羟胺前体，再将Z*转化为Z基团，整个过程如下所示 通过使式(VI)化合物与式(VII)化合物反应，可方便地制备式(II)化合物 其中B1代表适合的环官能团或取代基，X21代表X或X的前体(无论用修饰还是取代)或适于与B1反应的X的活化形式，其中B1和X21一起反应时，在式(II)化合物的环B与环A之间提供连键P。作为非限制性实施例，当X2为N时，则环A易于通过B1衍化而引入连键P，而当X2为C时，则通过B1和X21的反应，环A和环两者适于被衍化而提供连键P。
易于从市场上购得的初始原料包括 例如可用下列测定法中的任一种来评估本发明的化合物分离的酶测定基质金属蛋白酶家族，包括如MMP13如Knauper等[V.Knauper等，(1996)The Biochemical Journal2711544-1550(1996)]所述，可表达和纯化重组体人体前MMP13(proMMP13)。纯化的酶可如下用于监测活性抑制剂于21℃下用1mM氨基苯基汞酸(APMA)活化纯化的MMP13原20小时；在存在或不存在抑制剂的情况下，活化的MMP13(每次测定11.25ng)在测定缓冲液(0.1M Tris HCl，pH7.5含0.1M NaCl，20mM CaCl2，0.02mM ZnCl及0.05％(重量/体积)Brij 35，用合成底物7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基.Pro.Leu.Gly.Leu.N-3-(2，4-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙酰基.Ala.Arg.NH2，于35℃下孵育4-5个小时。通过测定在λex328nm和λem393nm处的荧光来确定活性。抑制百分比计算如下抑制百分比等于[荧光加抑制剂-荧光背景]除以[荧光减抑制剂-荧光背景]。
类似的方法可用于采用底物和对具体的MMP最适宜的缓冲条件的其它表达和纯化的MMP原(proMMP)，如C.Graham Knight等在(1992)FEBS Lett.296(3)263-266中所述。Adamalysin家族，包括如TNF转化酶采用部分纯化的分离的酶测定，可确定所述化合物对TNFα转化酶的抑制能力，如K.M.Mohler等在(1994)Nature370218-220中所述，该酶得自THP-1膜。通过将部分纯化酶在有或无测试化合物时，于26℃下，用在缓冲液(50mM Tris HCl，pH7.4，含0.1％(重量/体积)Triton X-100和2mM CaCl2)中的底物4′，5′-二甲氧基-荧光素基Ser.Pro.Leu.Ala.Gln.Ala.Val.Arg.Ser.Ser.Ser.Arg.Cys(4-(3-琥珀酰亚胺-1-基(succinimid-1-yl))-荧光素)-NH2孵育18小时，确定纯化酶活性及其抑制作用。如同测定MMP13的方法测定抑制量，但采用λex490nm和λem 530nm。底物如下所述合成。通过采用包括使用六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′，-四甲基脲鎓(uronium)(HBTU)作为偶合剂的标准方法，用至少4-5倍过量的Fmoc-氨基酸和HBTU，将底物的肽部分经手工或自动化的肽合成仪装配到Fmoc-NH-Rink-MBHA-聚苯乙烯树脂上。Ser1和Pro2被双偶合(double-coupled)。采用下列侧链保护方法Ser1(丁二烯t)，谷氨酰胺5(三苯甲基)，精氨酸8，12，(Pmc或Pbf)，丝氨酸9，10，11(三苯甲基)，半胱氨酸13(三苯甲基)。在随后的装配中，通过在DMF中处理Fmoc-肽基-树脂将N-末端Fmoc-保护基除去。这样得到的氨基-肽基-树脂通过用1.5-2当量的4′，5′-二甲氧基-荧光素-4(5)-羧酸[Khanna & Ullman，(1980)AnalBiochem.108156-161)，已用DMF中的二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑将其预活化]于70℃处理1.5-2小时被酰化。再用各含5％水和三乙基硅烷的三氟乙酸处理，使二甲氧基荧光素基-肽去保护的同时从树脂中裂解出来。通过蒸发、用乙醚研磨并过滤分离出二甲氧基荧光素基-肽。分离出的肽与含二异丙基乙胺的DMF中的4-(N-马来酰亚胺基)-荧光素反应，用RP-HPLC纯化产物，最后用冷冻-干燥法将其从含水乙酸中分离出来。用MALDI-TOF MS和氨基酸分析鉴定该产物的特征。天然底物作为聚集蛋白聚糖降解抑制剂的本发明化合物的活性可用如基于E.C.Arner等在(1998)Osteoarthritis and Cartilage6214-228中所公开的方法和在此所述的抗体的方法来测定。用作胶原酶抑制剂的该化合物效能可如T.Cawston and A.Barrett(1979)Anal.Biochem.99340-345所述确定。在基于活性的细胞/组织中对金属蛋白酶活性的抑制作为一种抑制膜sheddases如TNF转化酶的试剂的测试基本上如K.M.Mohler等在(1994)Nature370218-220中所述，用ELISA检测释放的TNF，可评估在THP-1细胞中本发明化合物对TNFα生产的细胞加工的抑制能力。用类似的方法，采用适当的细胞系并与适合的测定脱落蛋白的抗体一起，可检测如N.M.Hooper等在(1997)Biochem.J.321265-279所述的其它膜分子的加工或脱落。作为一种抑制基于侵入性的细胞的试剂的测试如A.Albini等在(1987)Cancer Research 473239-3245中所述，可确定本发明化合物在侵入测定中抑制细胞迁移的能力。作为一种全血TNF sheddase活性抑制剂的测试在人体全血测定中评估本发明的化合物对TNFα产生的抑制能力，其中的LPS用来刺激TNFα的释放。在加入20μl LPS(大肠杆菌0111B4；最终浓度10μg/ml)之前，用培养基(RPMI1640+碳酸氢盐、青霉素、链霉素和谷氨酰胺)将得自志愿者的肝素化(10单位/ml)人血稀释到1∶5，再于DMSO或适当的溶媒中，在37℃、潮湿的(5％CO2/95％空气)培养箱内，用20μl测试化合物(三份重复)培养(160μl)30分钟。每次测定包括对单独用培养基(6孔/培养板)或已知的作为标准品的TNFα抑制剂培养过的稀释血的对照品。再将培养板于37℃(潮湿的培养箱)培养6个小时、离心(2000转/分下10分钟；4℃)，于-70℃收集血浆(50-100μl)并在随后用ELISA分析TNFα浓度前贮存于96孔培养板中。作为一种体内软骨降解抑制剂的测试基本上如K.M.Bottomley等在(1997)Biochem J.323483-488中所述，可评估本发明化合物抑制软骨的聚集蛋白聚糖或胶原成分的降解的能力。药效学试验为评估本发明化合物的清除性和生物利用率，采用活体外药效学试验，它采用上述的合成底物试定或者采用HPLC或质谱分析。此为一种种属试验(generic test)，它可用来评估化合物在各种动物种类中的清除速度。经静脉注射或口服化合物的可溶制剂(如20％重量/体积DMSO，60％重量/体积PEG400)对动物(如鼠、狨猴)给药，在接下来的时间点(如5、15、30、60、120、240、480、720、1220分钟)从适当的容器中取出血样放入10单位肝素中。在离心后得到血浆部分，并用乙腈(最后浓度为80％(重量/体积))沉淀出血浆蛋白。30分钟后，于-20℃下通过离心将血浆蛋白沉淀并用Savant速度真空机(Savant speed Vac.)将上清液部分蒸发至干燥。使沉淀物在测试缓冲液中重新组成，接着用合成底物测定以分析化合物的含量。简言之，为评估所述化合物，作出化合物浓度-响应曲线。评估重新组成的血浆提取物的系列稀释液的活性，用考虑了总的血浆稀释因素的浓度-响应曲线计算出存在于原始血浆样品中的化合物的量。活体内评估作为抗TNF试剂的测试在大鼠中评估作为活体外TNFα抑制剂的本发明化合物的能力。简言之，以化合物(6只大鼠)或药物赋形剂(10只大鼠)通过适当的途径如经口(p.o.)、腹膜内(i.p.)、皮下(s.c)向多组雄性[Wistar AlderleyPark(AP)]大鼠(180-210g)给药。90分钟后，增加CO2浓度处死大鼠，并经后腔静脉放血成5单位肝素钠/ml血。立即将血样放置在冰上并于4℃下以2000转/分的速度离心10分钟，于-20℃冷冻收获的血浆，以便随后用LPS-刺激的人血测定其对TNFα产生的作用。解冻大鼠血浆样品并将175μl各样品加入到一套格式化的96U孔培养板中。再将50μl肝素化人血加入各个孔内混合，再将培养板于37℃(增湿培养器)培养30分钟。将LPS(25μl；最终浓度10μg/ml)加入孔内并再继续培养5.5小时。仅用25μl培养基培养对照孔。再以2000转/分的速度离心培养板10分钟，将200μl上清液移至96孔培养板并于-20℃冷冻，以便随后用ELISA分析TNF浓度。
对各化合物/剂量用专用软件计算进行数据分析 作为抗关节炎药物的测试作为抗关节炎剂的化合物的活性测试在如D.E.Trentham等在(1977)J.Exp.Med.146，857中所定义的胶原-诱导的关节炎中进行。在该模型中，当以弗罗因德氏不完全佐剂给药时，酸溶性的天然II型胶原引起大鼠的多关节炎。可用同样条件诱发小鼠和灵长目动物的关节炎。作为抗癌剂的测试基本如I.J.Fidler(1978)在癌症的研究方法(Methods in CancerResearch)15399-439中所述，采用如B16细胞系(B.Hibner等在Abstract 283 p75 10thNCI-EORTC Symposium，Amsterdam June 16-191998中所述)评估作为抗癌剂的化合物的活性。
实施例干燥乙酸乙酯萃取物且蒸发至干。这样得到的胶状物经硅胶色谱法，先用乙酸乙酯∶异己烷混合物(3∶2v/v)再用乙酸乙酯∶甲醇混合物(9∶1)洗脱。得到230mg胶状的4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-苯乙基羰基哌啶-4-基)-2-{O-甲酰羟氨基}乙基磺酰基]-哌嗪，M+H＝547。 将4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-苯乙基羰基哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪(0.75g)和50％羟胺(5ml)水溶液在四氢呋喃(10ml)中的混合物搅拌48小时。将所述混合物蒸干再加水(20ml)。用乙酸乙酯(2×15ml)萃取混合物，用水洗涤萃取物并干燥。除去溶剂得到胶状的4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-苯乙基羰基哌啶-4-基)-2-羟氨基乙基磺酰基]-哌嗪(0.65g)，M+H＝519(518)。
将3-苯基丙酰氯(0.21ml)逐滴加入到溶于含三乙胺(0.2ml)的二氯甲烷的4-(4-氟苯基)-1-[2-(哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪(0.5g)溶液中。搅拌该混合物3小时，蒸发至干，用水稀释，再用乙酸乙酯(2×15ml)萃取。合并乙酸乙酯萃取物，用碳酸氢钠水溶液和水洗涤并干燥。除去溶剂得到胶状的4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-苯乙基羰基哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪，M+H＝486(485)。
将4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-叔丁氧基羰基哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪(1.96g)和三氟乙酸(5ml)的混合物在室温下搅拌5小时。将该混合物蒸发至干，用水稀释，用2M氢氧化钠水溶液碱化并用乙酸乙酯(2×20ml)萃取。除去溶剂得到4-(4-氟苯基)-1-[2-(哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪。
以类似的方式，用4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-叔丁氧基羰基哌啶-4-基)-2-{O-甲酰羟氨基}乙基磺酰基]-哌嗪作为初始原料，得到4-(4-氟苯基)-1-[2-(哌啶-4-基)]-2-{邻-甲酰羟氨基}乙基磺酰基]-哌嗪，M+H＝415。 于-78℃，将正丁基锂(8.6ml溶于THF中的1.6M溶液)逐滴加入到在THF(40ml)中的4-(4-氟苯基)-1-甲磺酰基哌嗪(3.52g)悬液中，搅拌混合物30分钟。逐滴加入氯代磷酸二乙酯(1.97ml)，在-78℃下将混合物再搅拌30分钟。逐滴加入正丁基锂(8.6ml溶于THF中的1.6M溶液)并搅拌30分钟。逐滴加入溶于THF(5ml)的1-(叔丁氧基羰基)-哌啶-4-醛(2.91g)溶液，再将混合物加热至室温并搅拌10小时。加入氯化铵饱和水溶液(5ml)，用乙酸乙酯(25ml)稀释反应混合物，再用水洗涤。除去溶剂得到胶状的4-(4-氟苯基)-1-[2-(1-叔丁氧基羰基哌啶-4-基)-乙烯基磺酰基]-哌嗪，静置可固化，M+H＝455(454)。
实施例2用类似方法制备下式化合物
实施例3用类似于实施例1中所述的方法制备 mpt 132 mpt 204 mpt 116-20 mpt 189 mpt 182 mpt 182 mpt 121实施例4用类似于实施例1中所述的方法制备 实施例5用类似于实施例1中所述的方法并使用1-(叔丁氧基羰基)-3-甲酰哌啶[CAS编号118156-93-7]为初始原料制备
权利要求
1.一种式I的化合物或其药学上可接受的盐或在体内可水解的前体 其中环B为包含最多可达12个环原子并含一个或多个独立选自N、O和S的杂原子单环或双环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳烷基环；或者环B可为联苯基；环B可任选通过连接环B2-位与相对于X2的α碳原子的C1-4烷基或C1-4烷氧基链连接至环A；每个R3独立选自氢、卤素、NO2、COOR，其中R为氢或C1-6烷基、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基、C1-6烷氧基和最多可达C10的芳氧基，n为1、2或3；P为-(CH2)n-，其中n＝0、1、2，或P为最多可达6个碳原子的烯链或炔链；其中X2为C，P可为-Het-、-(CH[R6])n-Het-、-Het-(CH[R6]n-或-Het-(CH[R6]n-Het-，其中Het选自-CO-、-S-、SO-、-SO2-、-NR6-或-O-，其中n为1或2，或P可选自-CO-N(R6)-、-N(R6)-CO-、-SO2-N(R6)-和-N(R6)-SO2-，且R6为氢、C1-6烷基、最多可达C10的芳烷基或最多可达C9的杂烷基；环A为5-7元脂族环并可任选被任选取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基单-或双-取代，各取代基独立选自卤素、C1-6烷基或氧代基；X1和X2独立选自N和C，其中环A上的环取代基为氧代基，它优选与环氮原子相邻；Y选自-SO2-和-CO-；Z为-CONHOH，Y为-CO-且Q选自-C(R6)(R7)-、-C(R6)(R7)-CH2-、-N(R6)-及-N(R6)-CH2-，其中R6定义如上，并只与如此处所定义的Q相关，R6也可代表最多可至C10的芳基和最多可至C9的杂芳基，而R7为H、C1-6烷基或与R6一起形成碳环或杂环螺5、6或7元环，后者含至少一个选自N、O和S的杂原子；Z为-CONHOH，Y为-SO2-而Q选自-C(R6)(R7)-和-C(R6)(R7)-CH2-；或Z为-N(OH)CHO而Q选自-CH(R6)-、-CH(R6)-CH2-和-N(R6)-CH2-；R1为H或C1-6烷基；Z选自-COOH、-CONHOH、-N(OH)CHO和N(OH)COR，其中R为C1-6烷基、最多可至C10的芳基和最多可至C9的芳烷基及R2为具有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被下列基团所取代(i)Y-R9，其中R9为C1-6烷基、最多可至C10的芳基、最多可至C12的芳烷基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基，或(ii)Y-T-R9，其中Y和R9如先前所定义，而T为氧或N-R8，其中R8为氢或C1-6烷基，杂原子独立选自氧、氮和硫；R9和R8独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代。
2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体，其中环A为5-6元脂族环并可任选被任选取代的C1-6烷基或C1-6烷氧基单-或双-取代，各取代基独立选自卤素、C1-6烷基或氧代基；R3为氢、卤素、NO2、CF3、C1-4烷基和C1-4烷氧基；n为1或2；环B为具有最多可至10个环原子的单环或双环环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基；P为-(CH2)n，其中n为0或1，或P为-NH-CO-；X2和X1中的一个或两个为N；Y为-SO2-或-CO-；Q为-CH(R6)-、-CH(R6)-CH2-、-N(R6)-和-N(R6)-CH2-，其中R6为氢或C1-6烷基；当Q＝-N(R6)-或-N(R6)-CH2-，则Y也可为-CS-；Q也可连接至R1或R2上形成5-7烷基或杂烷基环；R1＝氢或C1-4烷基；Z＝-CONHOH-或-N(OH)CHO和R2为具有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被下列基团取代(i)Y-R9，其中R9为C1-6烷基、最多可至C10的芳基、最多可至C12的芳烷基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基，或(ii)Y-T-R9，其中Y和R9如权利要求1中所述，而T为氧或N-R8，其中R8为氢或C1-6烷基，杂原子独立选自氧、氮和硫；R9和R8独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代。
3.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体，其中R3为氢、氯、氟、NO2、CF3、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基；环B为苯基、联苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基；P为直键；X2和X1都为N；Y＝-SO2-；Q＝-CH2-；R2为具有5-7个环原子并包括1或2个独立选自氧、氮和硫的环杂原子的杂环烷基环，该环任选被(i)Y-R9所取代，其中Y如权利要求1中所述，而R9为C1-6烷基或烷基氨基、最多可至C10的芳基或芳基氨基、最多可至C12的芳烷基或芳基烷基氨基或最多可至C12的杂芳基(杂)烷基；R9独立地任选被1或2个选自卤素、NO2、CN、CF3、C1-6烷基、-S-C1-6烷基、-SO-C1-6烷基、-SO2-C1-6烷基和C1-6烷氧基的基团所取代；R1为氢；Z为-N(OH)CHO。
4.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体，其中R3为甲氧基、氟或4-氟代基；环A未被取代；环B为苯基、吡啶基或2-吡啶基；R2为任选被取代的3-哌啶基、4-哌啶基或N-取代的4-哌啶基，其中取代基如权利要求3中所述。
5.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体，其中R2为任选被Y-R9基团N-取代的3-或4-哌啶基，其中Y如权利要求1中所述，且R9为C1-4烷基或烷基氨基、C6芳基或芳基氨基、最多可至C10的芳烷基或芳烷基氨基或最多可至C10的杂芳(杂)烷基，R9独立地任选被1-2个选自卤素、CF3和C1-4烷基的基团所取代。
6.一种药用组合物，其包括权利要求1的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或其体内可水解的酯及药学上可接受的载体。
7.用于疗效性治疗人体或动物体的方法中的权利要求1的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或其体内可水解的酯。
8.一种治疗金属蛋白酶介导的疾病状态的方法，它包括给予温血动物治疗有效量的式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或在体内可水解的酯。
9.一种制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的酯的方法，它包括a)使式(II)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解酯与式(III)化合物反应 其中X11代表X或X的前体(无论通过修饰或取代)或适于与Y1反应的X的活化形式；Y1代表Y、Y的前体或适于与X11反应的Y的活化形式；通过非限制性实施例的方法，当X为C时，则X1可被衍化而含有可与式III化合物反应的Y的前体，其中Y1为Y的前体；Z1代表Z的被保护形式、Z的前体(无论通过Z1的修饰或取代)或Z的活化形式；或b)使式(IV)的化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解酯与式(V)化合物反应， 其中B1代表与Pi反应的适用的环官能团或取代基；Z1如前所定义；且Pi代表与A1反应的连键P的适合的活性形式；或c)使通式(VIII)化合物 其中R2*为R2的前体，与合适的试剂反应，经一步或多步生成R2；在这些步骤中可便利地保护Z基团；作为非限制性实施例，R2*为哌啶或哌嗪环；或(d)使式IX的化合物与适当的式R1-CO-R2的化合物反应，生成式X的烯烃，再将其转化为式XI化合物，其中Z*为Z基团的羟胺前体，再将Z*转化为Z基团，整个过程如下所示
10.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体在制备用于由一种或多种金属蛋白酶介导的疾病状态的药物中的用途。
11.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体在制备用于治疗关节炎的药物中的用途。
12.式(I)化合物或其药学上可接受的盐或体内可水解的前体在制备用于治疗动脉粥样硬化的药物中的用途。
全文摘要
在R2上具有杂环烷基取代基的式(I)芳基哌嗪,它可用作金属蛋白酶抑制剂,尤其可用作MMP13抑制剂。
文档编号C07D211/96GK1390200SQ0081122
公开日2003年1月8日 申请日期2000年5月31日 优先权日1999年6月4日
发明者H·塔克 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司