专利名称：用于改进胰岛素和胰岛素类似物的制备方法的c肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胰岛素原C肽的合成衍生物。含有该衍生物的胰岛素原在多方面具有优于传统猴胰岛素原的特性，尤其是通过重组制备，特定胰岛素衍生物的终产率得到了提高。
世界上糖尿病患者的数目在不断增加。对胰岛素或胰岛素衍生物的需求也在成比例增加。因此目的是优化现有的与活性成分产生相关的方法。欧洲专利EP-B1 0 489 780提供了一种制备胰岛素或其衍生物的方法。其中所述的载体为用来制备人胰岛素的质粒pINT90d，或其它用于构建记载在欧洲专利EP-A 0 821 006中并被用于制备一种His(B31)His(B32)Gly(A21)-胰岛素衍生物的质粒pINT302d的起始质粒，或被用来构建记载在欧洲专利EP-A 0 885 961中的并被用于制备Lys(B3)Glu(B29)-胰岛素衍生物的载体pINT329d。
目前已发现特别优选的胰岛素原衍生物是式I所示的衍生物，Fus-B(1-30)-RDVP-Yn-A(1-21)(I)；其中Fus是一种任一合适序列的任选存在的融合部分；B(1-30)是人胰岛素的B链；Y 是一种C端终止于一个碱性氨基酸的氨基酸链；n 从2至50，表示氨基酸链Y的长度；和A(1-21)是人胰岛素的A链，并且A和/或B链可通过氨基酸的交换、缺失和/或插入来进行修饰。令人惊奇地是，在本文中观察到的相同和相互不同的优点取决于A或B链的组成。
人的B链通过优选的C肽与人的A链连接产生一种胰岛素原，该胰岛素原在表达率方面与野生型胰岛素原类似，但其转化为胰岛素的酶加工过程可被更容易地控制，因而不产生裂解痕量的通过精氨酸延伸的B链，并且在制备过程中也不需要引起产率损失的将其去除步骤。
具有C-端双组氨酸延伸的B链通过利用本发明的C肽与在位点A21含有甘氨酸的人胰岛素A链进行连接，结果发现其表达率比通过质粒pINT90d获得的表达率高大约20％，并且产率几乎比通过pINT302d获得的产率高5倍。另外，如上所述，酶加工的控制同样被简化了。
Lys(B3)Glu(B29)-修饰的B链通过修饰的C肽与人胰岛素A链进行连接，结果发现与由pINT329d编码的胰岛素原相比，胰岛素原衍生物的折叠特性得到改进。粗制融合蛋白的产率增加了并且发现达到与质粒pINT90d相同的水平。另外，酶加工的控制被简化了。
一个特定优选技术方案的新型C肽的特征在于以下氨基酸序列CGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGCGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGR D V P Q V E L G G G P G A G S L Q P L -GCGCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGC(SEQ ID NO.1)A L E G S L Q K R (SEQ ID NO.2)同样也表示了多种编码所示C肽的可能DNA序列中的一种。
本发明的一方面涉及一种人胰岛素的前体或一种式I所示胰岛素类似物的前体Fus-B(1-30)-RDVP-Yn-A(1-21)(I)；其中Fus 是一种任一合适序列的任选存在的融合部分；B(1-30) 是人胰岛素的B链；Y 是一种C端终止于一个碱性氨基酸的氨基酸链；n 从2至50，并表示氨基酸链Y的长度；和A(1-21) 是人胰岛素的A链，
并且A和/或B链可通过氨基酸的交换、缺失和/或插入来进行修饰。特别是其中Yn是人或猴胰岛素的C肽中的第5至35位氨基酸，优选地其中Yn是人胰岛素的第11至35位氨基酸。
本发明的另一方面涉及如上所述的前体，其中人胰岛素的B链含有修饰部分Lys(B3)Glu(B29)，或其中人胰岛素的B链和A链含有修饰部分His(B31)His(B32)Gly(A21)。
本发明的另一方面是一种编码上述前体的DNA。
本发明的另一方面还涉及一种含有编码上述前体的DNA的载体，优选地其中载体是一种适合于在大肠杆菌中表达的载体。
本发明的另一方面还涉及一种含有上述载体的大肠杆菌细胞。
本发明的另一方面还涉及一种制备上述前体的方法，其中(a)将一种上述DNA导入上述载体中；(b)将由(a)得到的载体导入大肠杆菌细胞中；(c)由(b)得到的含有由(a)得到的载体之大肠杆菌细胞被用来进行表达；和(d)从培养基上清液中分离出所述的前体。
本发明的另一方面还涉及一种制备上述DNA的方法，其中(a)通过PCR手段和其它的分子生物学技术从人或猴胰岛素的cDNA中制备所述DNA；和(b)分离所述DNA。
本发明的另一方面还涉及一种制备人胰岛素或胰岛素类似物的方法，其中(a)通过上述方法制备一种上述前体；(b)由(a)得到的前体在适当的条件下进行折叠，以便能够象在人胰岛素中一样形成二硫键和RDVP-Yn部分，如果合适，所述融合部分Fus被酶解切除；和(c)纯化人胰岛素或胰岛素类似物。
本发明的另一方面还涉及上述前体用于制备胰岛素或胰岛素类似物的用途，优选地其中通过上述方法进行胰岛素或胰岛素类似物的制备。
本发明的另一方面还涉及利用上述DNA制备上述前体。
本发明的另一方面还涉及上述载体用于制备上述前体的用途。
本发明的另一方面还涉及上述大肠杆菌细胞用于制备上述前体的用途。
本发明通过实施例方式被进行详尽的解释，但并不受实施例的限制。实施例1胰岛素原衍生物的表达表达按照EP-B1 0 489 780中记载的方式进行。在这种情况下，通过大容量发酵培养能够引进修饰。然而，为了比较表达率，需要一直保持相同的条件。
下列发酵通式用于大规模的操作，该操作通过7.5升体积的实施例进行描述发酵体积7.5l；灭菌条件121℃，20分钟，pH3.5，灭菌后采用NH3调到7.0；发酵温度37℃；Ph控制pH7.0，采用25％的氨水调节；搅拌速率1500rpm；通气15 Sl/分钟(2vvm)；周期大约24小时；补料当OTR达到200mmol-1h-1时，以计量器控制的65％葡萄糖溶液的流速恒定在12gl-1h-1；预培养用种子安瓿接种振荡培养基并在37℃下，以250rpm培养3-4小时直至OD A540大约为1；接种采用大约40ml的预培养物接种发酵罐；诱导在A540≥40时，采用40mg/l(300mg/发酵罐)溶解在大约10ml的Na2CO3水溶液(0.17g Na2CO3)中的吲哚丙酸。
其中的含义为Sl＝标准条件的升，vvm＝体积/体积/分钟，OTR＝氧气传递速率。发酵培养基配方序号GAI 100/95-000 含量g/l葡萄糖1-水合物，D(+)最小80％44柠檬酸1-水合物 3.48硫酸铵最小95％ 6.0正磷酸，85％2.99磷酸氢二钾 1.18硫酸钠 3.0硫酸镁7-水合物，最小98％2.0硫酸铁(III)x H2O 0.5痕量元素溶液RL 1/85-000 1.0ml硫胺素HCl 0.005Desmophen3600 0.5痕量元素溶液RL 1/85-000 含量g/l硫酸铜(II)5-水合物 1.6碘化钾 4.0钼酸铵4-水合物 8.0硫酸镁(II)1-水合物 12.3硫酸锌7-水合物 16硼酸20在摇瓶中的含量 含量g/l酵母抽提物 8.0葡萄糖 1.0NaCl3.5KH2PO41.32K2HPO43.68实施例2 胰岛素的制备通过例如在EP-B1 D 489 780或EP-A 0 885 961中记载或建议的已知方法制备胰岛素。EP-B1 0 668 282中记载的方法(参见实施例2)适于特定融合蛋白的折叠和加工。此外在折叠后和进一步加工前可以根据EP 0 288 809过滤所述混合物。实施例3 编码C-链衍生的人胰岛素原B-RDVP C11-35-A的质粒pINT358d的构建利用EP-B1 0 489 780中记载的引物Tir和Insu11制备所述质粒。另外，合成两种新的引物序列。
引物PINT358fIII具有下列序列5′-CCC AAG ACC CGC GAT GTT CCT CAG GTG GAG CTG GGC GGG GGC CCT-3′(SEQ ID NO.3)B28 B29 B30 Arg Asp Val Pro C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18(SEQ ID NO.4)引物PINT358revII具有序列5′-CAGCTCCACCTGAGGAACATCGCGGGTCTTGGGTGTGTAG-3′(SEQ ID NO.5)采用引物对Tir/PINT358revII和Insu11/PINT358FIII中的每一种并以质粒pINT90d作为模板，按照EP-B1 0 489 780中的方法进行PCR。合并两个反应的产物等分并用来与引物对Tir/Insu11进行第三个PCR。用Sal1/Nco1酶双消化该反应的产物，并且该限制性消化的产物经纯化后被插入Nco1/Sal1酶切的质粒pINT91d之载体DNA中，如在EP-B1 0 489 780中所述。以这种方式构建的质粒被称作pINT358d.。通过DNA序列分析证实了所述结构。感受态大肠杆菌细胞被所述质粒的DNA所转化。如实施例1，在细菌中进行胰岛素原的表达。按照实施例2中方式折叠后，所述胰岛素原被酶促转化为胰岛素，并按照EP-B1 0 347 781中记载的方法进一步进行纯化。此外，通过参照源于pINT90d的方法能够另外收集到离子交换层析步骤中的一种边界(marginal)级分，这是由于该级分没有受到Arg(B31)-胰岛素的污染。实施例4 用于制备Lys(B3)Glu(B29)-RDVP-C11-35-胰岛素原的质粒pINT362d的构建构建质粒所需的是作为模板的质粒pINT329d和pINT358d的DNA以及引物Tir和Insu11。另外，合成了两种引物Salforward和329rev。
引物Salforward具有序列5′-TACACACCCGAGACCCGCGATGTTCCTCAGG-3′ (SEQ ID NO.6)其中粗体印刷的序列部分表示与质粒pINT358d杂交的序列，而其余部分与质粒pINT329d的B链-编码区段的序列同源。
引物329rev具有序列5′- CCTGAGGAACATCGCGGGTCTCGGGTGTGTAG -3′ (SEQ ID NO.7)其中粗体印刷的区段表示与形成B链端点的反义链同源的区域，并且描述了质粒pINT329d中的编码精氨酸的三联体。其余的序列与质粒pINT358d杂交。进行两个PCR循环。在所述循环中，质粒pINT329d的DNA用作引物对Tir/329rev的模板，并且pINT358d DNA用作引物对Salforward/Insu11的模板。
两个反应产生了通过引物Salforward的序列而重叠的片段。因而在第三个PCR循环中能够将两个片段连接起来，并且借助Tir和Insu11，能够将它们连成编码胰岛素类似物的DNA序列。该反应产物用限制性酶NcoI/SalI进行切割后插入到用SalI/NcoI打开的pINT91d载体片段中。大肠杆菌K12 MM294的感受态细胞被合适的连接混合物所转化。从转化体中分离质粒DNA并进行表征。正确的质粒被称作pINT362d。
发现融合蛋白表达后的粗产率与pINT90d相当。然而，却发现折叠率比pINT329d高大约40％。
由pINT362d编码的融合蛋白的结构如下MATTSTGNSAR FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPET RDVPQVELGGGPG融合蛋 B链 C链AGSLQPLALEGSLQKR GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO.8)C链(续) A链实施例5用于制备His(B31)His(B32)Gly(A21)-RDVP-C11-35-胰岛素原的质粒pINT349d的结构首先制备其DNA编码胰岛素类似物Gly(A21)胰岛素的质粒pINT140d。
此目的所需要的是两个在PCR中被用作引物的寡核苷酸寡核苷酸Tir被用作有义引物而寡核苷酸140drev被用作反义引物140drev5′-AAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTA-3′(SEQ ID NO.9)终止 终止 Gly Cys TyrA21 A20 A19所述两种引物与来源于质粒pINT90d的DNA共同被用于一个标准的PCR中。所述反应产物按照EP-B1 0 489 780中记载的方法与限制性酶NcoI和SalI反应，然后被插入到相应切开的载体pINT69d中。结果产生质粒pINT140d，该质粒被转化到大肠杆菌K12 MM294中后又被分离出来，并且通过限制性酶切和序列分析而被表征。
进行两个PCR循环，起始于质粒pINT140d的DNA。第一个反应使用了引物Tir和作为反向引物且具有以下序列的PINT349aVal Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr(SEQ ID NO.10)5′- CACCTGAGGAACATCGCGGTGGTGGGTCTTGGGTGTGTAG-3′ (SEQ ID NO.11)C12 C11 * * * * * * B30 B29 B28 B27 B26其中被星号标记的序列是指编码新插入的氨基酸的密码子。
利用引物Inu11和PINT349b进行第二个PCR。
引物PINT349b具有序列Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu (SEQ ID NO.12)5′- ACCCAAGACCCACCACCGCGATGTTCCTCAGGTGGAGCTG - 3′(SEQ ID NO.13)B28 B29 B30 * * * * * * C11 C12 C13 C14从DNA的序列位点34至位点1，引物与PINT349a互补。因此能够在第三个PCR中将来源于两个PCR的产物与引物Tir和Insu11连接起来，以便产生编码所需胰岛素原衍生物的DNA片段。该反应产物按照所记载的方法与酶NcoI和SalI进行反应，然后被插入到被所述酶切开的PINT91d载体片段中，并且被转化到大肠杆菌K12中。对来源于转化体的质粒表征后，正确的质粒构建体被称作pINT349d。
融合蛋白的表达在融合蛋白的产率方面显示出明显的增加。令人惊奇地是，该产率比通过pINT90d获得的产率高大约20％，并且比通过质粒pINT30d获得的产率高大约5倍。此外，折叠率相当于通过由pINT90d编码的猴胰岛素原所获得的折叠率。
序列表<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH<120>用于改进胰岛素和胰岛素类似物的制备方法的C肽<130>1999/L059<140>19947456.7<141>1999-10-02<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>87<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码C肽变异体的DNA<400>1cgcgatgttc ctcaggtgga gctgggcggg ggccctggcg caggcagcct gcagcccttg 60gcgctggagg ggtccctgca gaagcgc 87<210>2<211>29<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述变异的C肽胰岛素<400>2Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser1 5 10 15Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg20 25<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物PINT 358fIII<400>3cccaagaccc gcgatgttcc tcaggtggag ctgggcgggg gccct 45<210>4<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述源于PINT 358fIII的蛋白部分序列<400>4Arg Asp Val Pro1<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物PINT 358revII<400>5cagctccacc tgaggaacat cgcgggtctt gggtgtgtag 40<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物Salforward
Salforward<400>6tacacacccg agacccgcga tgttcctcag g 31<210>7<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物329rev<400>7cctgaggaac atcgcgggtc tcgggtgtgt ag 32<210>8<211>91<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述变异的胰岛素前体<400>8Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Lys Gln His1 5 10 15Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu20 25 30Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr Arg Asp Val Pro Gln Val Glu35 40 45Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu50 55 60Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile65 70 75 80Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Ash Tyr Cys Asn85 90<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物140drev<400>9aaaggtcgac tattagccgc agta24<210>10<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述源于PINT 349a的蛋白部分序列<400>10Val Gln Pro Val Asp Arg His His Thr Lys Pro Thr Tyr1 5 10<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物349a<400>11cacctgagga acatcgcggt ggtgggtctt gggtgtgtag 40<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述源于PINT 349b的蛋白部分序列<400>12Pro Lys Thr His His Arg Asp Val Pro Gln Val Glu Leu1 5 10<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物PINT 349b<400>13acccaagacc caccaccgcg atgttcctca ggtggagctg 40
权利要求
1.一种式I所示的胰岛素类似物或人胰岛素的前体，Fus-B(1-30)-RDVP-Yn-A(1-21)(I)；其中Fus 是一种任何合适序列的任选存在的融合部分；B(1-30) 是人胰岛素的B链；Y 是一种C端终止于一个碱性氨基酸的氨基酸链；n 从2至50，并表示氨基酸链Y的长度；和A(1-21) 是人胰岛素的A链，并且A和/或B链能够通过氨基酸的交换、缺失和/或插入被修饰。
2.如权利要求1所述前体，其中Yn是人或猴胰岛素的C肽的第5至35位氨基酸。
3.如权利要求1所述前体，其中Yn是人胰岛素的第11至35位氨基酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的前体，其中人胰岛素的B链含有修饰部分Lys(B3)Glu(B29)。
5.如权利要求1至3中任一项所述的前体，其中人胰岛素的B链和A链含有修饰部分His(B31)His(B32)Gly(A21)。
6.一种编码如权利要求1至5中任一项所述前体的DNA。
7.一种含有权利要求6所述DNA的载体。
8.如权利要求7所述的载体，其中所述载体是一种适合于在大肠杆菌中表达的表达载体。
9.一种含有权利要求8所述载体的大肠杆菌细胞。
10.一种制备如权利要求1至5中任一项所述前体的方法，其中(a)将权利要求6所述的DNA导入权利要求7所述的载体中；(b)将由(a)得到的载体导入大肠杆菌细胞中；(c)由(b)得到的含有由(a)得到的载体之大肠杆菌细胞被用来进行表达；和(d)从培养基上清液中分离出所述的前体。
11.一种制备权利要求6所述DNA的方法，其中(a)通过PCR手段和其它的分子生物学技术从人或猴胰岛素的cDNA中制备权利要求6所述的DNA；和(b)分离所述DNA。
12.一种制备人胰岛素或胰岛素类似物的方法，其中(a)通过权利要求10所述的方法制备前体；(b)由(a)得到的前体在适当的条件下进行折叠以便能够象在人胰岛素中一样形成二硫键和RDVP-Yn部分，如果合适，所述融合部分Fus被酶解切除；和(c)纯化人胰岛素或胰岛素类似物。
13.如权利要求1至5中任一项所述的前体用于制备胰岛素或胰岛素类似物的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中胰岛素或胰岛素类似物是通过权利要求12中所述的方法制备的。
15.权利要求6所述的DNA用于制备权利要求1至5中任一项所述的前体的用途。
16.权利要求8所述的载体用于制备权利要求1至5中任一项所述的前体的用途。
17.一种权利要求9所述的大肠杆菌细胞用于制备权利要求1至5中任一项所述的前体的用途。
18.如权利要求15、16或17任一项所述的用途，其中所述前体是通过权利要求10的方法制备的。
全文摘要
本发明涉及一种式(I)所示的胰岛素类似物或人胰岛素前体:Fus－B(1－30)－RDVP－Yn－A(1－21)(I);其中Fus是一种任选存在的任一序列的融合部分,B(1－30)是人胰岛素的B链,Y代表一种终止于一个C－末端碱性氨基酸的氨基酸链,n从2至50并表示氨基酸链Y的长度,且A(1－21)是人胰岛素的A链。A和/或B链能够通过氨基酸的交换、缺失和/或插入的手段来修饰。本发明还涉及一种编码其的DNA。本发明进一步涉及所述前体和DNA的生产和用途,以及生产人胰岛素或胰岛素类似物的方法。
文档编号C07K19/00GK1377370SQ00813713
公开日2002年10月30日 申请日期2000年9月15日 优先权日1999年10月2日
发明者P·哈伯曼, J·艾尔特, J·美韦斯, G·塞普克 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司