专利名称：适于体内应用治疗与折叠成淀粉样蛋白、淀粉样蛋白样沉积物的异常蛋白或其富含β－折 ...的制作方法
本申请要求1999年11月5日申请的美国临时申请第60/163,911号的优先权。
背景技术：
发明领域本发明涉及β-折叠破坏肽的肽类似物和肽模拟物，所述肽类似物和肽模拟物适于体内应用治疗哺乳动物蛋白质构象疾病，例如阿耳茨海默氏病和朊病毒病。更具体地说，本发明涉及新型肽类似物和肽模拟物、包含所述肽类似物和肽模拟物中的一种或它们的混合物的药用组合物，以及涉及用于预防、治疗或检测与以下成分有关的障碍或疾病折叠成淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物的异常蛋白或其具有致病β-折叠结构的前体。
相关技术的描述已经积累了大量数据表明几种不同的障碍具有相同的分子基础，即蛋白质构象改变(Thomas等，Trends Biochem.Sci.20456-459，1995；Soto，J.Mol.Med.77412-418，1999)。这些蛋白质构象疾病包括阿耳茨海默氏病、朊病毒相关性障碍、系统性淀粉样变性、serpin缺陷障碍、亨廷顿病和肌萎缩性脊髓侧索硬化(Soto 1999，见上文)。蛋白质构象障碍的标志是正常蛋白的一级结构没有改变，但二级结构和三级结构发生改变。构象改变蛋白可能通过直接的毒性活性、缺乏正常折叠蛋白的生物学功能或不适当运输而引起疾病(Thomas等，1995，见上文)。在所述蛋白有毒性的情况下，所述蛋白通常在不同器官中自缔合并沉积成为淀粉样原纤维，引起组织损伤(Thomas等，1995，见上文；Kelly，Curr.Opin.Struct.Biol.611-17，1996；Soto，1999，见上文)。
阿耳茨海默氏病(AD)是破坏性神经变性疾病，其特征在于丧失短期记忆、定向力障碍以及判断力和推理能力削弱。AD是老年人群中最常见的痴呆。据估计，全球有超过两千五百万人不同程度地受到AD的影响(Teplow，Amyloid5121-142，1998)。AD的一个标志是不可溶蛋白聚集体(称为淀粉样蛋白)沉积在脑实质和大脑血管壁中。淀粉样蛋白的主要成分是称为淀粉样蛋白β肽(Aβ)的4.3KDa疏水肽，所述肽作为一种更长前体蛋白(APP)的一部分由染色体21编码(Selkoe，Science275630-631，1997)。过去10年积累的遗传学、生物化学和神经病理学证据强烈暗示淀粉样蛋白在AD的早期发病机制中起重要作用，并且可能触发该疾病(Soto等，J.Neurochem.631191-1198，1994；Selkoe，1997，见上文；Teplow，1998，见上文；Sisodia和Price，FASEB J.9366-370，1995；Soto，Mol.Med.Today 5343-350，1999)。
淀粉样蛋白是一个通用术语，描述具有共同结构基序(即β-折叠构象)的原纤维聚集体(Serpell等，Cell Mol.Life Sci.53887，1997；Sipe，Ann.Rev.Biochem.61947-975，1992)。所述聚集体显示特异性染色特性，包括用刚果红染色后发出绿色双折射光的能力，以及结合荧光染料硫黄素S的能力(Sipe，1992，见上文；Ghiso等，Mol.Neurobiol.849-64，1994)。有超过十二种不同病因学的人类疾病的特征在于淀粉样蛋白在不同组织中细胞外沉积，引起细胞损伤、器官功能异常和死亡。在这些涉及淀粉样变性的疾病中，较突出的是阿耳茨海默氏病、朊病毒相关性障碍(也称为传染性海绵状脑病)和系统性淀粉样变性(表1)。淀粉样原纤维通常由正常或突变基因产物的蛋白水解片段组成。有超过16种涉及在不同组织中淀粉样沉积的不同蛋白(表1)(Ghiso等，1994，见上文)。
淀粉样蛋白形成的基本问题是蛋白质折叠，其中主要的随机卷曲可溶性肽采取β-折叠构象聚集在一起(Kelly，1996，见上文；Soto，1999，见上文)。淀粉样蛋白的形成是这样的在构象改变的淀粉样生成中间体之间发生疏水相互作用，所述中间体在肽相互作用时在结构上形成β-折叠构象。疏水性看来对于诱导引起聚集的单体相互作用是重要的，而β-折叠构象可能决定淀粉样原纤维中的聚集顺序。在抑制淀粉样原纤维形成的努力中，通过设计短合成肽来分开这两种特性，所述短合成肽具有与涉及构象改变的肽域的序列同源性以及相似程度的疏水性，但采取β-折叠构象的倾向非常低(称为β-折叠破坏肽)(Soto等，1996，见上文；Soto等，1998，见上文)。目标是设计具有以下能力的肽特异性结合淀粉样变性生成肽，生成稳定生理学构象、破坏所述肽异常构象的稳定性的复合物(Soto，1999，见上文)。
表1.涉及淀粉样变性的障碍以及淀粉样原纤维的蛋白成分
目前，已经设计β-折叠破坏肽以阻断分别涉及阿耳茨海默氏病和朊病毒病的发病机制的Aβ蛋白和朊病毒蛋白(PrP)中出现的构象改变。在先技术已经显示与Aβ中心疏水区同源的11残基和5残基β-折叠破坏肽(分别称为iAβ1和iAβ5)抑制引起淀粉样蛋白形成的肽构象变化，并且在体外溶解预先形成的原纤维(Soto等，Biochem.Biiophys.Res.Commun.226672-680，1996；Soto等，Nature Med.4822-826，1998)。此外，在细胞培养实验中，所述5残基肽能够预防由于形成富含β-折叠的寡聚Aβ结构而引起的神经元死亡(Soto等，1998，见上文)。此外，通过使用脑内注射Aβ1-42诱导淀粉样变性大鼠模型，在先技术已经显示共注射所述5残基β-折叠破坏肽减少脑Aβ沉积，并完全阻断大鼠脑中原纤维淀粉样病变的沉积(Soto等，1998，见上文)。最后，在注射Aβ八天后注射所述β-折叠破坏肽能够在体内分解大鼠脑内预先形成的Aβ原纤维，导致淀粉样沉积的大小减少(Sigurdsson，Frangione，Soto，提交的手稿)。有趣的是，通过β-折叠破坏肽去除淀粉样蛋白质恢复相关的脑组织学损伤，包括神经元皱缩和小神经胶质细胞激活。
也已经设计β-折叠破坏肽以预防和恢复由朊病毒(PrP)引起的构象改变。根据同样原则并使用PrP序列114-122作为模板，在先技术已经显示当合成一组β-折叠破坏肽时，13残基肽(iPrP13)显示最高活性(Soto，1999，见上文)。使用几种体外细胞培养和体内测定来测试抑制活性，结果明确指出有可能不仅预防PrPc→PrPsc转化，更有意义的是恢复传染性PrPsc构象子到与PrPc相似的生物化学和结构状态(Soto等，提交的手稿)。
已经广泛应用短肽作为医学中的药物(Rao等，C.Basava和G.M.Anantharamaiah，编辑BostonBirkhauser，第181-198页，1994)。然而，由于体内酶促降解引起肽药物口服生物利用度差并且作用持续时间短，肽药物的发展受到强烈限制(Fauchere和Thurieau，Adv.Drug Res.23127-159，1992)。近年来在生产对蛋白水解具有更低敏感性的肽类似物(如假肽和肽模拟物)上的进步，已经增加了获取与其母肽结构相关的有用药物的可能性(Fauchere和Thurieau，1992，见上文)。改善肽对蛋白酶的稳定性不仅增加了所述化合物在血液循环中的半寿期，而且增加其在不同水平上被转运或吸收的能力(包括肠吸收和血脑屏障通透性)，因为转运和吸收看起来高度依赖于膜或屏障暴露于各种生物活性物质的时间(Fauchere和Thurieau，1992，见上文)。
如下化学改变所述肽(1)修饰所述肽的N末端和C末端；(2)改变侧链，可以涉及氨基酸取代；(3)修饰α-碳原子，包括甲基化、烷基化和脱氢；(4)用D-残基取代L-残基，改变手性；(5)头尾环化；和(6)引入酰胺键取代，即改变参与肽(或酰胺)键的原子。
本发明还包括能够抑制淀粉样变性相关性朊病毒PrP蛋白构象变化的抑制肽，所述抑制肽是β折叠破坏肽类似物，通过化学修饰能够抑制淀粉样变性相关性朊病毒PrP蛋白构象变化的β折叠破坏肽而设计获得。
此外，本发明包括具有下列结构的肽模拟物 在另一实施方案中，所述肽模拟物具有以下结构 在又一实施方案中，所述肽模拟物具有如下结构 本发明还包括用于预防、治疗或检测与以下成分有关的障碍或疾病的方法折叠成淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物的异常蛋白或其具有病理学β-折叠结构的前体。
图2描述了阿耳茨海默淀粉样变性的11残基β-折叠破坏肽抑制物(Seq.RDLPFYPVPID)采用其天然L构型和非天然D-形式时的药物动力学。
图3A和图3B分别是阿耳茨海默氏病β-折叠破坏肽iAβ5和朊病毒β-折叠破坏肽iPrP13的三维结构图示。
图4a和图4b分别显示了iAβ5和Ac-iAβ5-Am与时间有关的生物利用度和稳定性。
图5a提供了与各种其它肽温育的Aβ1-40的图形比较。
图5b是淀粉样蛋白形成与Ac-iAβ5-Am浓度的关系的图。
图5c是淀粉样蛋白形成与iAβ5浓度的关系的图。
图6显示了一个模型，其中脑室区内83％的沉积分解，杏仁核内30％的淀粉样斑点分解。
发明详述在本发明中，通过化学修饰母肽以产生对于体内应用(最好是口服给予)更稳定的衍生物，改善抑制肽的生物利用度和稳定性。所述抑制肽能够抑制淀粉样蛋白β肽的β折叠形成。此外，所述抑制肽是β折叠破坏肽类似物，通过化学修饰能够抑制淀粉样β-肽β折叠形成的β折叠破坏肽而设计获得。
本发明还包括能够抑制涉及淀粉样变性的朊病毒PrP蛋白构象变化的抑制肽，所述抑制肽是β折叠破坏肽类似物，通过化学修饰能够抑制涉及淀粉样变性的朊病毒PrP蛋白构象变化的β折叠破坏肽而设计获得。
在
图1中，显示了一般化肽骨架，其中突出显示了化学修饰的可能靶。可能的靶包括以下(1)修饰所述肽的N末端和C末端(靶a和靶b)；(2)改变侧链(靶c)，这通常涉及氨基酸取代；(3)修饰α-碳原子(靶d)，包括甲基化、烷基化和脱氢；(4)用D-残基取代L-残基，改变手性；(5)头尾环化；和(6)引入酰胺键取代(靶e)，即改变参与肽(或酰胺)键的原子。后一种衍生物被称为假肽或酰胺键替代物。
天然肽通常受到专一性内肽酶和非特异性外肽酶的协同作用而降解。内肽酶常常存在于组织和细胞区室中，将肽转变成为两个或多个无活性的片段。外肽酶一般存在于血液和外周器官中，将完整的肽或它们的片段降解成组成氨基酸，并因此使肽从血液循环中消失。外肽酶识别肽中的游离氨基基团或羧基基团。因此，修饰这些基团常常减弱或消除了外肽酶降解。头尾肽环化导致缺失自由末端基团，也因此最小化外肽酶的切割。另一方面，内肽酶识别参与酰胺键的原子。因此，酰胺键取代可明显降低内肽酶的降解作用。修饰α-碳原子通常获得相同效果。由于大多数(如果不是所有)外肽酶和内肽酶是立体特异性的，所以用D-立体异构体取代天然L-氨基酸导致明显增加肽的稳定性。最后，肽模拟物通常对蛋白降解具有完全抗性，并且常常是可以口服给予的。通过化学修饰前导肽来设计β-折叠破坏肽类似物从5残基阿耳茨海默氏抑制肽(iAβ5，Seq.LPFFD-也表示为LeuPro Phe Phe Asp)和13残基朊病毒抑制肽(iPrP13，Seq.DAPAAPAGPAVPV-也表示为Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly ProAla Val Pro Val)开始，设计如下文所述的修饰。使用由Bergmann等公开和通过引用结合到本文中的标准方法合成在本发明中使用的肽。(Bergmann & Zervas，Berichte der Deutschen ChemischenGesellschaft(1932)651192-1201)a)修饰N末端和C末端。N末端乙酰化或脱氨赋予对许多氨肽酶消化的保护，而取代C末端羧基基团的酰胺或醇的存在防止几种羧肽酶的切割，包括羧肽酶A和羧肽酶B的切割。包括上述修饰的改变的肽序列如下所示，其中ac是乙酰化，am是酰胺化，des是脱氨，alc是醇化。阿耳茨海默氏抑制物朊病毒抑制物ac-Leu Pro Phe Phe Asp-am ac-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-amdes-Leu Pro Phe Phe Asp-am des-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-amac-Leu Pro Phe Phe Asp-alc ac-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-alcdes-Leu Pro Phe Phe Asp-alcdes-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-alcb)改变侧链。非天然氨基酸存在通常增加肽稳定性。此外，至少一种非天然氨基酸(α-氨基异丁酸或Aib)对模式肽施加了显著的限制，减低它们的构象柔性。具体地说，在β-折叠模式肽中掺入Aib导致该结构的完全破坏。Aib的β-折叠阻滞活性与在肽中用作β-折叠阻滞剂的天然残基脯氨酸的所述活性相当或甚至更高。因此，引入Aib预期会同时增强肽的稳定性和抑制活性。阿耳茨海默氏抑制物朊病毒抑制物Leu Aib Phe Phe Asp Asp Ala Aib Ala Ala Aib Ala Ala Aib Ala Gly Aib Ala Val Aib Valc)修饰α-碳原子。改善肽稳定性最常用的α-碳修饰是α-甲基化。此外，已经显示取代连接Phe、Val或Leu α-碳原子的氢原子有利于采用β-弯曲构象，极不利于形成β-折叠结构。根据本发明，对抑制肽中这些残基的甲基化预期会增强稳定性和效力。阿耳茨海默氏抑制物(Me)Leu Pro Phe Phe AspLeu Pro(Me)Phe Phe AspLeu Pro Phe(Me)Phe Asp(Me)Leu Pro(Me)Phe(Me)Phe Asp朊病毒抑制物Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala(Me)Val Pro ValAsp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro(Me)ValAsp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala(Me)Val Pro(Me)Vald)改变手性。用D-对映异构体取代天然L-残基显著增加对蛋白水解降解的抗性。已经证实11-残基β-折叠破坏肽(iAβ1)中引入D-残基增加稳定性。体内研究显示具有天然序列的肽在大鼠血浆中快速降解。事实上，约90％的iAβ1在静脉注射后几分钟内降解。相反，所有残基以D形式存在的iAβ1衍生物在注射15分钟后几乎没有降解。为进行检测，使用标准程序放射性碘化所述肽。对大鼠静脉内快速浓注后，通过用三氯乙酸沉淀，评估肽稳定性。还通过纸层析定量完整肽。这样，本发明的化合物包括包含全部D-残基的iAβ5肽和iPrP13肽(分别是图3A和图3B)以及仅在N末端和C末端包含D-残基以防止外肽酶降解的肽。除后者外，在每个脯氨酸后面使用D-残基，因为据报道一种称为脯氨酰内肽酶的一个常见内肽酶切割位点在该残基之后。阿耳茨海默氏抑制物朊病毒抑制物leu pro phe phe asp asp ala pro ala ala pro ala gly pro ala val pro valleu Pro Phe Phe asp asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro valleu Pro phe Phe asp asp Ala Pro ala Ala Pro ala Gly Pro ala Val Pro val以小写字母表示的氨基酸指示D-残基。
e)环肽。构象受到限制的环肽代表了比线性肽更好的药物候选物，因为它们的构象柔性更低，而对外肽酶切割的抗性改善。已经使用两种替代策略将线性肽转化为环肽。一种策略是引入半胱氨酸残基，通过形成二硫键实现环化；另一种策略是涉及树脂结合的头尾环化的侧链附加策略。为避免对肽序列的修饰，使用后一种方法。β-折叠破坏肽包含有利于大环化的理想序列，因为由于脯氨酸可促进折转与成环，所以它是许多天然存在或人工合成环肽的组成成分。阿耳茨海默氏抑制物朊病毒抑制物 f)假肽。假肽或酰胺键替代物是指包含化学修饰的一些(或所有)肽键的肽。酰胺键取代通常如下表示保留依照侧链的氨基酸命名，并使用称为“ 方括弧”的命名法，指出在α-碳原子之间发生的改变。
例如，术语Ala Gly是指部分NH2CH(CH3)CH2CH2CH2CO2H。下面的表2描述了几种酰胺键替代物。
表2.一些酰胺键替代物及其特性
其中部分见于天然肽类似物(如 、 、 )，而其它的已经人工合成。引入酰胺替代物不仅减少肽降解，而且可显著改变所述肽的一些生物化学活性，尤其是构象柔性和疏水性。可能增加构象柔性会有利于将抑制物引入Aβ和PrP结合位点。另一方面，由于淀粉样蛋白生成蛋白与所述抑制物之间的相互作用看起来很大程度上依赖于疏水性相互作用，因此增加疏水性的酰胺键取代有可能增强亲和力，因此增强所述抑制物的效力。此外，疏水性增强也可能增强所述肽的跨膜运输，因此改善屏障(血脑屏障和肠屏障)通透性。因此，为合成假肽，使用增加柔性和疏水性的酰胺键取代，如 和 。需要取代的酰胺键是那些位于肽末端的酰胺键，以防止外肽酶降解，以及位于每个脯氨酸之后的酰胺键，因为据报道一种称为脯氨酰内肽酶的一个常见的内肽酶切割位点出现在该残基之后。其它需要保护的酰胺键通过实验研究决定，研究涉及对β-折叠破坏肽在血浆和组织中降解的分析。阿耳茨海默氏抑制物Leuψ[CH2CH2]Proψ[CH2CH2]Phe Pheψ[CH2CH2]AspLeuψ[CH2S]Proψ[CH2S]Phe Pheψ[CH2S]Asp朊病毒抑制物Aspψ[CH2CH2]Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Proψ[CH2CH2]ValAspψ[CH2S]Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Proψ[CH2S]Valg)若干修饰混合。通过考查市场上销售和研究中的肽药物特性，可以清楚地认识到大多数成功地稳定于蛋白水解的肽混合存在上文所述几种类型修饰。考虑到许多不同的酶涉及肽降解，该结论是有意义的。下面的结构包含不同类型化学修饰的各种组合。阿耳茨海默氏抑制物Ac-Leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe Asp-AmAc-Leu Proψ[CH2S]Phe Phe Asp-Am(Me)Leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe Asp-Amleu Proψ[CH2CH2]Phe Phe aspleu Proψ[CH2S]Phe Phe aspAc-Leu Aib Phe Phe Asp-Am(Me)Leu Aib Phe Phe Asp-AmLeu Proψ[CH2CH2]Phe Phe asp Ac-Leu pro Phe Phe Asp-AmAc-Leu Proψ[CH2CH2]Phe phe Asp-AmAc-Leu Proψ[CH2S]Phe Phe Asp-AmAc-Leu Proψ[CH2CH2]Phe(Me)Phe Asp-AmAc-Leu Proψ[CH2CH2]Phe(Me)Phe aspAc-Leu Pro phe Phe Asp-AmAc-Leu Pro(Me)Phe phe Asp-Amleu Proψ[CH2CH2]Phe phe aspleu Pro(Me)Phe phe aspAc-Leu Aib Phe phe Asp-Am朊病毒抑制物Ac-Asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro Val-Amasp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro valAc-Asp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro Val-Amasp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro valAc-Asp Ala Aib Ala Ala Aib Ala Gly Aib Ala Val Pro Val-AmAc-Asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro(Me)ValAc-Asp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro Val-Amasp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro(Me)Valasp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Valasp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Valasp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro(Me)ValAc-Asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Aib Ala Val Pro(Me)Val Ac-Asp Ala Proψ[CH2S]Ala ala Proψ[CH2S]Ala gly Proψ[CH2S]Ala(Me)Val Pro Val-AmAc-Asp Ala Aib ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Valasp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Aib ala Val Pro Val-AmAc-Asp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala gly pro Ala(Me)Val Pro Val-Amasp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala gly Proψ[CH2CH2]Ala val Pro valAc-Asp Ala pro Ala ala Aib Ala gly pro Ala(Me)Val Pro Val-AmAsp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Vai Pro ValAsp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Aib Ala(Me)Val Pro Val另一种改善稳定性、也产生口服有活性的化合物的方法是产生肽模拟物。肽模拟物是模拟肽的生物活性的分子，但在化学本质上不再是肽。有时使用术语肽模拟物来描述在本质上部分是肽的分子，如假肽、半肽或peptoid，但严格的定义和在本发明中使用的定义是不再含有任何肽键的有机分子。肽模拟物不是母肽的衍生物，而是在化学上重新合成并试图模拟肽的结构和功能特性。肽模拟物的合理设计需要对于负责所述肽活性的药效基团的足够了解以及所述肽的详细结构信息。目标是使用其装配有机模板重新构造药学活性基团的空间位置。模板的选择是重要的，必须考虑基于所述肽构象模型的大小和柔性。设计用以模拟β-折叠破坏肽特性的肽模拟物肽模拟物的合理设计需要对于负责所述肽活性的化学基团的足够了解以及所述肽的详细结构信息。目标是使用其装配有机模板重新构造药学活性基团的空间位置。模板的选择是重要的，必须考虑基于所述肽构象模型的大小和柔性。根据对带有单一氨基酸取代的不同β-折叠破坏肽序列活性的研究，已经确定了抑制作用关键性残基。此外，主要阿耳茨海默氏β-折叠破坏肽和朊病毒β-折叠破坏肽(图3A和图3B)的三维结构或者已经建模，或者已经实验确定。使用计算机程序ICM，已经通过能量最小化和Monte Carlo模拟将Aβ原纤维形成的5-残基抑制物模型化。应用2D-NMR实验性计算了朊病毒蛋白构象改变的13-残基抑制物的结构。
如Joachim Gante和Iwao Ojima等最新综述所述，有许多方法用来设计和合成肽模拟物，所述文献通过引用结合到本文中。
以下显示的肽模拟物代表本发明的又一方面。阿耳茨海默氏抑制物朊病毒抑制物 后者(PMiPrP5)是一种更短和更易合成的分子，其包含化学活性基团并且是5残基朊病毒β-折叠破坏肽的类似物。
作为预防或治疗与淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物或其富含致病性β-折叠的前体有关的障碍或疾病的方法，可以将有效量本发明的化合物给予需要所述化合物的接受者，所述接受者可以是人类或动物。同样，检测这样的障碍或疾病的方法也包括给予有效量的所设计的化合物，以通过众所周知的成像技术使所述化合物与原纤维沉积的结合或与其前体的结合显现。
本文使用的术语“预防”接受者病症，如阿耳茨海默氏病或其它淀粉样变性障碍，涉及在所述疾病临床发作前按照本发明给予所述化合物。“治疗”涉及在所述疾病发作后给予所述保护性化合物。例如，在障碍或疾病发生后成功给予本发明的化合物构成对所述疾病的“治疗”。本发明可用于人类治疗以及动物的兽医应用。
可以通过任何达到其既定目的的方法给予本发明的化合物，最好是口服给予。例如，可以通过多种不同胃肠外途径进行给予，包括但不限于皮下途径、静脉内途径、皮内途径、肌肉内途径、腹膜内途径、脑内途径、鼻内途径、口服途径、经皮途径或颊途径。胃肠外给予可以是快速浓注或在一定时间内逐步输注。
预防、抑制或治疗与淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物有关的病症的典型方案包括(1)给予一剂或两剂有效量的高浓度所述化合物，浓度范围是0.5到10mg，更优选0.5到5mg，或(2)在一定时间内，包括几个月到几年的时间内，多剂给予有效量的低浓度所述化合物，浓度范围是10-10,000μg，更优选是50-500μg。
当然，所给予的剂量取决于接受者的年龄、性别、健康和体重、同时进行治疗的类型(如果有的话)、治疗频率以及所要达到的效果的性质。通过多剂或单剂给予每次治疗所需的总剂量。“有效量”是指能够达到以下效果的化合物浓度减慢或抑制淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物或其致病性β-折叠前体的形成，或分解预先形成的原纤维沉积。这样的浓度可以由本领域内的技术人员常规确定。本领域内的技术人员也知道剂量将取决于所给予的化合物的稳定性。较不稳定的化合物需要多剂给予。
用于胃肠外给予的制剂包括无菌的水溶液和非水性溶液、悬浮液和乳浊液，所述制剂可以包含本领域已知的辅助剂和赋形剂。也可以按照常规方法制备药用组合物如片剂和胶囊剂。
包含本发明化合物的药用组合物包括其中包含达到既定目标的有效量所述化合物的所有组合物。此外，所述药用组合物可以包含合适的药学载体，其中包括有利于活性化合物加工成在药学上可用的制剂的赋形剂和辅助剂。合适的药学上可接受的载体是本领域内众所周知的，例如在本领域的一本标准参考书Gennaro，Alfonso主编，Remington’s Pharmaceutical Science，第18版1990，Mark PublishingCo.，Easton，PA中有描述。
可以根据给药方式和所述化合物溶解度和稳定性，常规选择在药学上可接受的载体。例如，静脉内给予的制剂可以包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可以包括缓冲剂、稀释剂和其它合适的添加剂。
用于胃肠外给予的合适制剂包括水溶解型(如水溶性盐)所述活性化合物的水溶液。此外，可以给予作为合适油性注射悬浮液的所述活性化合物悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酸酯。水针剂悬浮液可以包含增加所述悬浮液粘度的物质，所述物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖(destran)。所述悬浮液还可以任选包括稳定剂。
通过给予本发明的药用组合物，可以治疗或预防与折叠成淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物或折叠成所述沉积富含β-折叠的致病性前体的异常蛋白有关的障碍或疾病包括但不限于阿耳茨海默氏病、FAF、唐氏综合征、其它淀粉样变性障碍、人类朊病毒病如库鲁病、Creutzfeldt-Jacob病(CJD)、Gerstmann-Strausslet-Scheinker综合征(GSS)、朊病毒相关性人类神经变性疾病以及动物朊病毒病如瘙痒病、海绵状脑病、传染性水貂脑病以及黑尾鹿和麋鹿的慢性消耗病。
实施例肽用作药物的一个主要缺点是它们在生物液体和组织中快速蛋白水解降解。在体外实验中，iAβ5(Seq.LPFFD-本文也描述为LeuPro Phe Phe Asp)在体外与新鲜人类血浆温育后非常迅速地降解。如图4a中所述，存在血浆的情况下约5分钟后百分之五十的iAβ5肽消失。由于不可能鉴定作为蛋白水解消化结果的任何代谢片段，因此看起来降解主要是由非特异性的外肽酶完成的。该结论受到下面发现的支持分别通过乙酰化和酰胺化保护肽的氨基末端和羧基末端(形成Ac-iAβ5-Am-本文也称为Ac-Leu Pro Phe Phe Asp-Am)显著增加该肽在体外的稳定性。如图4b所示，本发明的末端保护修饰肽(Ac-iAβ5-Am)在人类血浆中保持稳定超过24小时。(所述修饰肽体外在人类和大鼠肝脏微粒体中也缓慢代谢，其中在37℃温育1小时后，人类组织匀浆物和大鼠组织匀浆物中分别有81.5％和76.3％的肽保持完整。)其它体外研究显示Ac-iAβ5-Am和iAβ5在抑制淀粉样蛋白形成上有相似活性(见图5a)，其效果遵循与未修饰肽的活性相似的剂量依赖性，如图5b和图5c所示。回到图5a，可以看到用Boc修饰N末端也保持iAβ5显示的体外活性，而相同浓度的几种不相关肽(CP1VHVSEEGTEPA，CP2GYLTVAAVFRG，CP10ISEVKMDAEF)或短Aβ片段(如Aβ18-21、Aβ1-16)对于原纤维生成没有作用，或者可能通过掺入原纤维而轻微增加淀粉样蛋白形成。
为评估Ac-iAβ5-Am在体内的效果，我们使用了一个大鼠模型，其中通过脑内注射未聚集的Aβ1-42诱导淀粉样变性。一些时间后，所述肽在大鼠脑内聚集，导致在注射位点形成一个淀粉样蛋白样沉积。这些病变具有与阿耳茨海默氏淀粉样斑相同的染色(刚果红双折射和硫黄素S结合)和半透明(在电子显微镜下的原纤维结构)特性，诱导一些与在AD脑中观察到的脑损伤相似的脑损伤，包括广泛的神经元皱缩、星形细胞增生和小神经胶质细胞激活。使用该模型，我们以前已经显示共注射未保护的iAβ5和Aβ1-42导致抑制50％的淀粉斑形成，而在已经包含淀粉样斑的动物中i.c.注射iAβ5导致67％预先形成的沉积分解。(Sigurdsson，E.M.，Permanne，B.Soto，C.，Wisniewski，T.& Frangione，B.(2000)大鼠脑内淀粉样蛋白β-沉积的体内分解.J. Neuropath.Exp.Neurol.5911-17)。在以前的实验中，在淀粉样蛋白所位于的脑区内直接注射未保护的肽。在本实验中，将淀粉样蛋白β5肽注射入大鼠的杏仁核。7天后，即淀粉样沉积完全形成所需的时间，使用连接到侧脑室的ALZET输注泵，在三周内输注含13mg/ml Ac-iAβ5-Am的100μL溶液。处死动物并通过免疫组织化学分析脑中淀粉样蛋白沉积的存在情况。在该模型中，在沉积所述含Aβ1-42的溶液的地方(杏仁核)获得致密淀粉样蛋白斑，同时在更靠近脑室的区域内的整个导管轨迹观察到几个更小的淀粉样沉积(图6，左图)。结果显示输注所述肽使杏仁核中30％预先形成的淀粉样蛋白斑分解，在脑室附近83％的沉积分解。实验程序肽稳定性的体外分析。制备肽的1μg/μl水溶液。将20μl所述肽溶液稀释于80μl新鲜人类血浆。该溶液在37℃下温育不同时间长度，通过加入蛋白酶抑制剂的完全混合物终止反应。在冷乙醇(混合/MeOH，4/5，v/v)中-20℃一小时，沉淀大多数血浆蛋白(没有肽)。离心(10000g，10分钟，4℃)使沉淀蛋白沉积。含有肽的上清液真空浓缩5倍，通过反相HPLC分离。测量对应于完整肽的峰面积，并与未同血浆温育的同等样品相比较。
活性的体外测定。通过结合于淀粉样蛋白原纤维的硫黄素T(ThT)的荧光释放，定量评估淀粉样蛋白形成。以浓度0.5mg/ml在0.1M Tris，pH7.4中制备的Aβ等分物在缺乏或存在不同浓度iAβ5及其衍生物的情况下，于37℃温育7天。在温育期的终点，加入50mM甘氨酸，pH9.2和2μM ThT达到2ml的终体积。使用Perkin Elmer LS50B型荧光分光光度计，在激发435nm和发射485nm处测量荧光。
使用脑AP沉积的动物模型进行体内研究。雄性Fischer-344大鼠在到达时重250-300g，3-4月龄。每笼2只大鼠，保持12小时光暗周期，随意进食和饮水，在手术前使它们适应新环境2-3周。在戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内)麻醉下进行手术。一旦麻醉动物后，皮下注射硫酸阿托品(0.4mg/kg)和氨苄青霉素钠盐(50mg/kg)。Aβ1-42溶解于二甲亚砜(DMSO)，用水稀释到16.7％ DMS。使用Kopf立体定位器，门牙条设置为耳间线下3.3mm，双侧注射5.0nmol Aβ1-42入动物两个杏仁核。按照Paxinos和Watson的图谱根据经验确定从前囱和头盖骨表面开始计量的注射座标(AP-3.0，ML士4.6DV-8.8)。使用CMA/100微量调节注射器泵，在6分钟内注射3.0μl体积(流速0.5μl/分钟)。注射后导管原位保留2分钟，然后拔出0.2mm并保留3分钟，5分钟后慢慢拔出导管。动物术后置于取暖电毯上直到恢复正位反射。为评估Ac-iβ5-AM的效果，第一次手术一周后对动物进行第二次手术，其中将一台ALZET输注泵按照生产商的指示连接到脑室。在3周时间内传递100μlPBS/10％ DMSO内的总共1.3mg肽到侧脑室。在此之后，主动脉灌注过量戊巴比妥钠(150mg/kg，腹膜内注射)，处死大鼠。为进行组织学分析，连续进行脑冠状切片(40μm)，于乙二醇防冻剂中-20℃保存直至染色。如Soto，C.，Sigursson，E.，Morelli，L.，Kumar，R.A.，Castano，E.M.和Frangione，B.(1998)β-折叠破坏肽在淀粉样变性大鼠脑模型中抑制原纤维生成阿耳茨海默氏病治疗问题.Nature med.4882-886中所述，用抗Aβ1-42抗体染色组织切片。使用成像分析系统确定淀粉样沉积的大小。用双因素ANOVA分析，然后用Newman-Keuls多范围检验进行随后的比较，分析所述数据。使用非配对双侧t-检验分析脑总沉积。
在充分描述本发明后，本领域内的技术人员知道不需要进行预期的实验，就可以在同等参数、浓度和条件的广泛范围内实施同样的方案，而不会偏离本发明的精神和范围。
虽然已经就其特定实施方案描述了本发明，人们将认识到可以对本发明进行进一步的改变。本申请包括所有这样的本发明变更、应用和改变实施方案总体上遵循本发明原则，而所包括的与本发明公开内容不同的内容属于本发明本领域已知或常规实践并且属于以下所附权利要求书陈述的以上基本特征。
所有本文引用的参考文献，包括刊物文章或摘要、公开的或相应的美国或外国专利申请、已经授权的美国或外国专利、或任何其它参考文献，都通过引用完整地结合到本文中，包括在引用参考文献中的所有数据、表、图和正文。此外，在本文所引用的参考文献中所引用的参考文献的全部内容也完整地通过引用结合到本文中。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考在任何情况下都不是承认本发明的任何方面、描述或实施方案在相关文献中已经公开、指出或提出。
前面对于特定实施方案的描述如此完全地揭示了本发明的一般特征，以致其他人可以通过应用本领域内的知识(包括本文引用的参考文献的内容)不必进行过多实验，就可容易地对所述特定实施方案的各种应用进行变更和/或改变，而不偏离本发明总体构思。因此，根据本文所提出的教导和指导，这样的改变和变更将包括在所公开实施方案的等同实施方案意义和范围内。当然，本文的措词和术语是为了描述而不是限制本发明，因此本说明书的措词和术语应当由技术人员根据本文陈述的教导和指导结合本领域内技术人员的知识来解释。
权利要求
1.一种能够抑制淀粉样蛋白β-肽形成β折叠的抑制肽，它是通过化学修饰能够抑制淀粉样蛋白β-肽形成β折叠的β折叠破坏肽而设计获得的β折叠破坏肽类似物。
2.权利要求1的抑制肽，其中所述β折叠破坏肽是5残基阿耳茨海默抑制肽iAβ5(Seq.Leu-Pro-Phe-Phe-Asp)。
3.权利要求2的抑制肽，其中所述化学修饰通过选自以下的方法实现改变所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5的N末端和C末端；用α-氨基异丁酸(Aib)取代所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5的至少一个残基；甲基化所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5至少一个残基的α碳原子；用D-对映异构体残基取代所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5的至少一个L-对映异构体残基，使所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5形成头尾环化，用酰胺键替代物取代所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5中的酰胺键；以及它们的组合。
4.权利要求3的抑制肽，其中通过选自以下的方法改变所述阿耳茨海默抑制肽iAβ5的N末端和C末端乙酰化、酰胺化、脱氨、醇化和它们的组合。
5.权利要求4的化合物，其中抑制肽选自ac-Leu Pro Phe PheAsp-am、des-Leu Pro Phe Phe Asp-am、ac-Leu Pro Phe Phe Asp-alc和des-Leu Pro Phe Phe Asp-alc。
6.权利要求5的抑制肽，其中所述抑制肽是ac-Leu Pro Phe PheAsp-am。
7.权利要求3的抑制肽，其中所述抑制肽选自Leu Aib Phe Phe Asp；(Me)Leu Pro Phe Phe Asp；Leu Pro(Me)Phe Phe Asp，Leu ProPhe(Me)Phe Asp；(Me)Leu Pro(Me)Phe(Me)Phe Asp，leu pro phe phe asp，leu Pro Phe Phe asp，leu Prophe Phe asp，Leuψ[CH2CH2]Proψ[CH2CH2]Phe Pheψ[CH2CH2]Asp；Leuψ[CH2S]Proψ[CH2S]PhePheψ[CH2S]Asp；Ac-Leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe Asp-Am；Ac-Leu Proψ[CH2S]Phe Phe Asp-Am；(Me)Leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe Asp-Am；leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe asp；leu Proψ[CH2S]Phe Phe asp；Ac-Leu Aib Phe Phe Asp-Am；(Me)Leu Aib Phe Phe Asp-Am；Leu Proψ[CH2CH2]Phe Phe asp； Ac-Leu pro Phe Phe Asp-Am；Ac-Leu Proψ[CH2CH2]Phe phe Asp-Am；Ac-Leu Proψ[CH2S]Phe phe Asp-Am；Ac-Leu Proψ[CH2CH2]Phe(Me)Phe Asp-Am；Ac-Leu Proψ[CH2CH2]Phe(Me)Phe asp；Ac-Leu Pro phe phe Asp-Am；Ac-Leu Pro(Me)Phe phe Asp-Am；leu Proψ[CH2CH2]Phe phe asp；leuPro(Me)Phe phe asp；Ac-Leu Aib Phe phe Asp-Am；and
8.一种能够抑制淀粉样变性相关性朊病毒PrP蛋白构象变化的抑制肽，所述抑制肽是通过化学修饰能够抑制所述淀粉样变性相关性朊病毒PrP蛋白构象变化的β折叠破坏肽而设计获得的β折叠破坏肽类似物。
9.权利要求8的抑制肽，其中所述β折叠破坏肽是13残基朊病毒抑制肽iPrP13(Seq.Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val ProVal)。
10.权利要求9的抑制肽，其中所述化学修饰通过选自以下的方法实现改变所述朊病毒抑制肽iPrP13的N末端和C末端；用α-氨基异丁酸(Aib)取代所述朊病毒抑制肽iPrP13的至少一个残基；甲基化所述朊病毒抑制肽iPrP13至少一个残基的α碳原子；用D-对映异构体残基取代所述朊病毒抑制肽iPrP13的至少一个L-对映异构体残基，使所述朊病毒抑制肽iPrP13形成头尾环化，用酰胺键替代物取代所述朊病毒抑制肽iPrP13中的酰胺键；以及它们的组合。
11.权利要求10的抑制肽，其中通过选自以下的方法改变所述朊病毒抑制肽iPrP13的N末端和C末端乙酰化、酰胺化、脱氨、醇化和它们的组合。
12.权利要求11的化合物，其中所述抑制肽选自ac-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-am，des-Asp AlaPro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-am，ac-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala ValPro Val-alc，and des-Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro Val-alc.
13.权利要求10的抑制肽，其中所述抑制肽选自Asp Ala Aib Ala Ala Aib Ala Ala Aib Ala Gly Aib Ala Val Aib Val；Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala(Me)Val Pro Val；Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro(Me)Val；Asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala(Me)Val Pro(Me)Val；asp ala pro ala ala pro ala gly pro ala val pro val；asp Ala Pro Ala Ala Pro Ala Gly Pro Ala Val Pro val；asp Ala Pro ala Ala Pro ala Gly Pro ala Val Pro val；Aspψ[CH2CH2]Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]AlaVal Proψ[CH2CH2]Val；Aspψ[CH2S]Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Proψ[CH2S]Val，；Ac-Asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro Val-Am；asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro val；Ac-Asp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro Val-Am；asp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro val；Ac-Asp Ala Aib Ala Ala Aib Ala Gly Aib Ala Val Pro Val-Am；Ac-Asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro(Me)Val；Ac-Asp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro Val-Am；asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Proψ[CH2CH2]Ala Val Pro(Me)Val；asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Val；asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Val；asp Ala Proψ[CH2S]Ala Ala Proψ[CH2S]Ala Gly Proψ[CH2S]Ala Val Pro(Me)Val；Ac-Asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Aib Ala Val Pro(Me)Val； Ac-Asp Ala Proψ[CH2S]Ala ala Proψ[CH2S]Ala gly Pro；ψ[CH2S]Ala(Me)Val Pro Val-Am；Ac-Asp Ala Aib ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro(Me)Val；asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly Aib ala Val Pro Val-Am；Ac-Asp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala gly pro Ala(Me)Val Pro Val-Am；asp Ala Proψ[CH2CH2]Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala gly Proψ[CH2CH2]Ala val Pro val；Ac-Asp Ala pro Ala ala Aib Ala gly pro Ala(Me)Val Pro Val-Am；Asp Ala pro Ala Ala Proψ[CH2CH2]Ala Gly pro Ala Val Pro Val；Asp Ala Aib Ala Ala Proψ[CH2CH2] Ala Gly Aib Ala(Me)Val Pro Val；and，
14.一种肽模拟物，它具有如下结构
15.一种肽模拟物，它具有如下结构
16.一种肽模拟物，它具有如下结构
17.一种方法，该方法用于减少形成涉及淀粉样蛋白β肽异常折叠成β折叠结构的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物、或减少已经形成β折叠结构的所述淀粉样蛋白β肽的量，所述方法包括在所述淀粉样蛋白β肽异常折叠成β折叠结构之前或之后在存在的所述淀粉样蛋白β肽中引入有效量的权利要求1的肽。
18.一种方法，该方法用于减少形成涉及朊病毒Pr蛋白构象变化的淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物、或减少已经形成淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物的所述朊病毒Pr蛋白的量，所述方法包括在所述朊病毒Pr蛋白发生所述构象变化形成淀粉样蛋白沉积物之前或之后在存在的所述朊病毒Pr蛋白中引入有效量的权利要求8的肽。
19.一种减少形成淀粉样蛋白或淀粉样蛋白样沉积物的方法，该方法给予选自以下的肽模拟物
全文摘要
本发明是能够抑制淀粉样蛋白β－肽形成β折叠的抑制肽。所述抑制肽是β折叠破坏肽类似物，通过化学修饰能够抑制淀粉样蛋白β－肽形成β折叠的β折叠破坏肽而设计获得。本发明还包括能够抑制与淀粉样变性有关的朊病毒PrP蛋白构象变化的抑制肽。所述抑制肽是β折叠破坏肽类似物，通过化学修饰能够抑制与淀粉样变性有关的朊病毒PrP蛋白构象变化的β折叠破坏肽而设计获得。此外，本发明包括具有结构PMiAβ5的肽模拟物。在另一实施方案中，肽模拟物具有结构PMiPrP13。在又一实施方案中，肽模拟物具有结构PMiPrP5。
文档编号C07K5/00GK1437442SQ00819247
公开日2003年8月20日 申请日期2000年11月4日 优先权日1999年11月5日
发明者C·索托－亚拉 申请人:阿克松尼克斯公司