专利名称：一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的制作方法
自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来，单克隆抗体作为一类用于基础研究，实验室诊断，临床治疗和预防的新型产物，其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定。分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程抗体的产生和发展。80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术兴起和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景。人源基因工程抗体作为一类新型特异性治疗生物药物或被动免疫疫苗，使其越来越受到投资界关注和显示其不可估量的商业价值和社会效益。当今世界人源基因工程抗体的开发研究已取得很大进展并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。目前美国FDA批准上市或待批的生物制品中，各种形式的单克隆抗体和基因工程抗体占到一定比例，目前以批准上市的67种生物制品中，治疗和预防用单克隆抗体和基因工程抗体共有9种。正在待批中等抗体有35种。基因工程抗体作为一类生物药的前景已无可置疑。
80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术侧已成为当今世界人源基因工程抗体研究的热点。从抗体库筛选的抗体表达形式主要以Fab段抗体和scFv为主。其基本原理是将PCR扩增的全套抗体轻链基因组和全套重链基因组插入噬菌体载体中，经辅助噬菌体感染后组成噬菌体抗体库。通过使用特异性抗原对抗体库进行富积筛选获得特异性抗体基因。1990年Scripps研究所从破伤风毒素免疫的供者外周血B细胞中首次获得人抗体基因库并获得人抗破伤风毒素单克隆抗体。至今此技术已较广泛用构建鼠和人抗体基因库并已基本成熟。通过噬菌体载体表达系统建立抗体库从而获得特异性基因工程抗体在国内外已有许多成功的报道，这些来自噬菌体抗体库的抗体不外乎两种形式，即Fab抗体或scFv单链抗体形式。
人源或人源化抗体研制最主要的目的并非用于临床诊断，而是作为一种新型治疗性生物工程药物制剂而用于临床抗肿瘤和抗病毒感染。上述Fab和scFv抗体通常在大肠杆菌中表达，其天然抗体特性及在体内的稳定性均较全抗体IgG形式差，并缺乏天然抗体具有的Fc段恒定区功能，由其在抗病毒感染中，作为一种治疗用抗体，IgG全抗体远远优于Fab和scFv不完全抗体。虽然噬菌体抗体库技术已日益成熟，但其下游的全IgG工程抗体系统则尚未完全成熟，尤其是在真核细胞中迅速、稳定、高效表达基因工程全抗体方面。较为成功的全抗体表达系统为CHO细胞表达系统，虽然该表达系统的载体系统发展众多，但至今无商业化载体可供选择使用。
本发明涉及一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体制备及应用，其主要特征为集强真核细胞表达启动子EF-1a，抗体恒定区基因，真核细胞表达扩增基因DHFR基因及核糖体内部结合位点IRES基因为一体，使来自噬菌体筛选的针对任一抗原的特异性抗体可变区基因或Fab基因以及来自其他来源的不同种属的任一抗原的特异性抗体可变区基因或Fab基因可通过载体中设置的克隆位点而被克隆入本载体系统，转染哺乳类细胞，如常用的中华地鼠卵巢(CHO)细胞后，在筛选压药的条件下建立表达全抗体的生产细胞系，由此产生的全抗体的有可能成为商业化抗体制剂而被用于临床上预防或治疗相应的疾病。
本发明陈述的一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体制备及其用途，主要内容包括以下几点
1、一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体，如说明书附
图1和附图2所示。图1是哺乳类细胞人源抗体高效表达载体骨架载体示意图，包括图1A和图1B。图2是哺乳类细胞人源抗体高效表达载体表达盒示意图，图中“重链A1，B1”表明骨架载体A和B共有的表达载体盒1，以此类推。其中符号EF-1a为启动子，CH1，CH2和CH3分别为重链恒定区1，2和3。BGHpolyA为牛生长因子多聚腺苷酸尾，DHFR为二氢叶酸还原酶基因，IRES为核糖体内部结合位点。该组包括由不同元件定向组合而成的12种载体，其主要特征由下列关键DNA元件组成1〕有较强启动基因表达功能的启动子EF-1α。
2〕来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因重链全长恒定区基因或Fc基因和人源IgG基因Kappa轻链恒定区基因或Lambda轻链恒定区基因。
3〕来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因重链全长恒定区基因和人源IgG基因Kappa轻链恒定区基因。
4〕用于分别可隆重链可变区基因、Kappa轻链可变区基因或Lambda轻链可变区基因的酶切位点。
5〕位于目的基因下游的用于目的基因筛选和扩增的二氢叶酸还原酶基因。
6〕位于目的基因下游和扩增基因二氢叶酸还原酶基因之间的核糖体内部结合位点(IRES)。
2、一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体，除共有氨苄青酶素抗性基因及大肠杆菌DNA复制基本元件外，包括12种由不同元件定向组合而成的载体系统，其特征概括在表1之中，主要由下列基本表达盒组成1)用于重链基因表达的表达盒表达盒1的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点BssHII和BstEII，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因重链全长恒定区基因，牛生长因子多聚腺苷酸尾(BGHPoly A)，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒2或3的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点XhoI和NheI或重链Fd基因可隆位点XhoI和SpeI，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因重链全长恒定区基因或Fc基，BGH Poly A，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒4的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可区基因(VH)的克隆位点BssHII和BstEII，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因重链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒5或6的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点XhoI和NheI或重链Fd基因可隆位点XhoI和SpeI，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因重链全长恒定区基因或Fc基，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 polyA)。
2〕用于轻链基因表达的表达盒表达盒1的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，轻链可变区基因(VL)的克隆位点EcoRV和XhoI，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因轻链全长恒定区基因及其转录终止信号，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒2或3的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，Kappa或Lambda轻链可变区基因(Vk或Vλ)的克隆位点EcoRV和HindIII，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因Kappa或Lambda轻链全长恒定区基因BGH Poly A，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒4的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，轻链可变区基因(VL)的克隆位点EcoRV和XhoI，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因Kappa链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
表达盒5或6的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，Kappa或Lambda轻链可变区基因(Vk或Vλ)的克隆位点EcoRV和HindIII，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因Kappa或Lambda轻链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40poly A)。
下面表1为上述一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的概括。
3、一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的用途，其特征在于无论来自噬菌体抗体库筛选的或分泌抗体的杂交瘤细胞株扩增的针对任何一种抗原的抗体人源或鼠源的VH和VL基因(Vk或Vλ)均可被选择性地通过载体中设置的克隆位点，克隆入根据权利要求1和2中所描述的任何一种组建的载体中，从而在哺乳类细胞如CHO细胞中获得全人IgG抗体或嵌合抗体的表达。
4、一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的用途，其特征在于用此载体系统可建立高效表达IgG全抗体的永久性表达细胞系而用于生产全IgG抗体，根据其抗原结合特异性和市场需求，可被用来作为一种新型抗体制剂而进行规模生产，具有商业开发价值。
表1 一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体重链表达载体 主要元件及排列顺序VH-dhfr1 EF-1α-先导分泌肽-VH可隆位点(BssHII+BstEII)CH1-内含子-CH2-内含子-CH3-BGHpolyA-SV40ori-DHFR-SV40polyAVH-dhfr2 EF-1α-先导分泌肽-VH可隆位点(Xho+NheI)-CH1-CH2-CH3-BGHpolyA-SV40ori-DHFR-SV40polyAVH-dhfr3 EF-1α-先导分泌肽r-VH可隆位点(Xho+SpeI)-Fc-BGHpolyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyAVH-IRES-dhfr1 EF-1α-先导分泌肽r-VH可隆位点(BssHII+BstEII)-CH1-intron-CH2-intron-CH3-intron-IRES-DHFR-SV40 polyAVH-IRES-dhfr2 EF-1α-先导分泌肽-VH可隆位点(XhoI+NheI)-CH1-CH2-CH3-intron-IRES-DHFR-SV40 polyAVH-IRES-dhfr3 EF-1α-先导分泌肽-VH可隆位点(XhoI+SpeI)-Fc-intron-IRES-DHFR-SV40 polyA轻链表达载体 主要元件及排列顺序VK-dhfr1 EF-1α-先导分泌肽-VK orVL可隆位点(EcoRV+XhoI)-CK-intron-CK polyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyAVK-dhfr2 EF-1α-先导分泌肽-VK可隆位点(EcoRV+HindIII)-CK-CKpolyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyAVL-dhfr3 EF-1α-先导分泌肽-VL可隆位点(EcoRV+HindIII)-CL-CKpolyA-SV40ori-DHFR-SV40 polyAVK-IRES-dhfr1 EF-1α-先导分泌肽-VK orVL可隆位点(EcoRV+XhoI)-CK-intron-IRES-DHFR-SV40 polyAVK-IRES-dhfr2 EF-1α-先导分泌肽-VK可隆位点(EcoRV+HindIII)-CK-IRES-DHFR-SV40 polyAVL-IRES-dhfr3 EF-1α-先导分泌肽-VL可隆位点(EcoRV+HindIII)-CL-IRES-DHFR-SV40 polyA
作为一种治疗用抗体，IgG全抗体远远优于Fab和scFv不完全抗体。虽然噬菌体抗体库技术已日益成熟，但其下游的全IgG工程抗体系统则尚未完全成熟，尤其在我国。本发明陈述的是一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体载体及其用途，此载体系统共包括上述12种构建不同的IgG表达载体，它们具有相同或相似的骨架载体，各自不同的IgG表达组件，可被用于抗体可变区或Fab基因的克隆而快速表达和生产IgG全抗体。此载体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制，转染哺乳类细胞后可获得生产全人IgG抗体稳定生产细胞系，获得一种可行性的临床治疗用抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，担不意味着限制本发明的内容在这些实施例中，为说明本发明，载体构建中涉及的中间载体所用中间载体EF-VH和EF-VL由Bautz教授朋友馈赠，pSV2-dhfr和pIRESneo分别购自美国Invitrogen，Premerg和Clontech公司，pTA-IgGH，pTA-IgGK，pAc-K-CH3，pAc-K-Fc及pAc-L-CH3为双方实验室构建创造。主要菌株XLI-Blu购自Strategene公司。权利要求书中的所用表达盒中的抗体基因基因来自本发明人创造。实施例1-3为一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体制备方法及其载体特征说明；实施例4为一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体应用性特征。
实例1载体构建及应用中所用的引物均由自己设计，在MWG(德国)商业化公司合成，以下为所有引物序列编号1.BssHII-F5′-TATCCGCGCGCACTCCCCAGGTGCAACTGCTCGAGTCTGGG-3′2.XbaI-R5′-TGCTCTAGATTATTTTCCCGGACTTAAGGAGAG-3′3.BstEII-HR5′-GGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTC-3′4.XhoI-KR5′-CTTGATCTCGAGCTTGGTCCCCTGGTC-3′5.HindIIIR5′-CGCAAGCTTATTGAATCAAAGGATATATGAC-3′6.XohI-LR5′-TAGGACCTCGAGCTTGGTCCCCTCCGCC-3′7.SpeI-LR5′-GGACTAGTCCTATGAACATTCTGTAGG-3′8.SpeI-KR5′-GGACTAGTCCTAACACTCTCCCCTGTTGA-3′9.EcoRV-VL25′-CCGGATATCGCCCTCACGCAGCCTGCCTCCGTG-3′10.EcoRV-VL55′-CCGGATATCGTGCTCACGCCGCCCTCAGTG-3′11.EcoRV-VK1a5′-CCGGATATCGTGCTCACCCAGTCTCCA-3′
12.EcoRV-VK3a5′-CCGGATATCGTGATCACGCAGCCTGCCTCCGTG-3′实例2载体系统中抗体表达盒元件的获得1，骨架载体主要元件EF-1a，DHFR基因及其IRES基因分别来自载体EF-VH，EF-VL，pSV2-DHFR及IRES。2，载体VH-dhfr1，VH-IRES-shfr1，VK-dhfr1，VH-IRES-dhfr1中的抗体轻重链恒定区基因来自发明人Bautz教授实验室研发载体pTA-IgGH，pTA-K。3，载体VH-dhfr2，VH-dhfr3，VH-IRES-dhfr2，VH-IRES-dhff3，VK-dhfr2，VK-dhfr3，VH-IRES-dhfr2，VH-IRES-dhfr3中的抗体基因来自发明人梁米芳和Bautz教授实验室共同研发载体pAc-K-CH3，pAc-K-Fc及pAc-L-CH3。
实例3.表达载体的构建如附图1和附图2，是本发明中系列载体的骨架载体和不同表达盒的示意图，其主要由以下关键步骤组成1)用BssHII和XbaI双酶且载体EF-VH，电泳回收载体带，此载体含有EF-1a启动子和BGHpolyA尾以及新酶素基因(NEO)，约5468个碱基对(bp)，2)以载体pTA-IgGH为模板，用引物BssHII-F和XbaI-R通过PCR方法扩增含有内含子基因的重链恒定区基因，电泳回收片断，约1796bp，含VH基因克隆位点BssHII和BstEII。
3)以载体pAc-K-CH3为模板，用引物BssHII-F和XbaI-R通过PCR方法扩增不含内含子基因的重链恒定区基因，电泳回收片断，约930bp，含VH基因克隆位点XhoI和NheI。
4)以载体pAc-K-CH3为模板，用引物BssHII-F和XbaI-R通过PCR方法扩增不含内含子基因的重链恒定区Fc基因，电泳回收片断，约630bp，含Fd基因克隆位点XhoI和SpeI。
5)将1〕和2〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGH1。将1〕和3〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGH2。将1〕和4〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGH3。
6)用SacI和XbaI双酶且载体EF-VK，电泳回收载体带，此载体含有EF-1a启动子和CKpolyA尾以及新酶素基因(NEO)，约5100个碱基对(bp)，7)以载体pTA-IgGK为模板，用引物SacI-F和SpeI-KR通过PCR方法扩增含有内含子基因的轻链恒定区基因，电泳回收片断，约？bp，含VL基因克隆位点EcoRV和XhoI。
8)以载体pAc-K-CH3为模板，用引物SacI-F和SpeI-KR通过PCR方法扩增不含内含子基因的轻链恒定区基因，电泳回收片断，约350bp，含VL基因克隆位点EcoRV和HindIII。
9)以载体pAc-L-CH3为模板，用引物SacI-F和SpeI-LR通过PCR方法扩增不含内含子基因的轻链Lambda链恒定区基因，电泳回收片断，约350bp，含VL基因克隆位点EcoRV和HindIII。
10)将6〕和7〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGK1。将6〕和8〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGK2。将6〕和9〕中的片断连接，获得中间载体EF-IgGL3。
11)用PvuII和BamHI双酶且载体pSV-dhfr，电泳回收长度为1852bp的片断，此片断含有图1中的SV40起始复制子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40polyA尾。将此片断用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
12)用srfI和Bst11071双酶且载体上述6个中间载体EF-IgGH1，EF-IgGH2，EF-IgGH3，EF-IgGK1，EF-IgGK2，EF-IgGL3，切除原载体中的新酶素抗性选择基因，电泳回收各自的载体片断，用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
13)将11〕中的DHFR基因片断和12〕中的不同载体片断连接，获得表1中列出的重链表达载体VH-dhfr1(图2中的重链A1)，VH-dhfr2(重链A2)和VH-dhfr3(重链A3)及轻链表达载体VK-dhfr1(图2中的轻链A1)，VK-dhfr2(轻链A2)和VL-dhfr3(轻链A3)。
14)用PvuII和HindIII双酶且载体pSV-dhfr，电泳回收长度约为4660bp的载体片断，此片断含有图1b中的，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40polyA尾。将此片断用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
15)用EcoR1和SmalI双酶且载体pIRESlneo，电泳回收长度为952bp的片断，此片断含有图1b中的核糖体内部结合位点(IRES)，将此片断用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
16)将14〕中的载体片断和15〕中的不同载体片断连接，获得中间载体pSV-dhfr-IRES.
17)用BamHi酶且载体pSV-dhfr-IRES，电泳回收长度约为2464bp的插入片断，此片断含有图1b中的，中的核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40polyA尾。将此片断用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
18)用XbaI和Bst11071双酶且载体条例5〕中所述中间载体EF-IgGH1，EF-IgGH2，EF-IgGH3，切除原载体中的BGHpolyA和新酶素抗性选择基因，电泳回收各自的载体片断，用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
19)用SpeI和Bst11071双酶且载体条例10〕中所述中间载体EF-IgGK1，EF-IgGK2，EF-IgGL3，切除原载体中的新酶素抗性选择基因，电泳回收各自的载体片断，用Klenow大片断酶补平，并去磷酸化。
20)将17〕中的pSV2-dhfr-IRES插入片断和18〕中EF-IgGH1，EF-IgGH2，EF-IgGH3三个分别载体片断连接，获得表1中的载体VH-IRES-dhfr-1(图2中的重链B1)，VH-IRES-dhfr2(重链B2)和VH-IRES-dhfr3(重链B3)。
21)将17〕中的pSV2-ddhfr-IRES插入片断和19〕中EF-IgGK1，EF-IgGK2，EF-IgGL3三个分别载体片断连接，获得表1中的载体VK-IRES-dhfr-1，(图2中的轻链B1)，VK-IRES-dhfr2(轻链B2)和VL-IRES-dhfr3)(轻链B3)22)综上所述，最终共获表1中所述12种不同结构的哺乳类细胞高效表达载体。
实例4人源IgG抗体在真核细胞中的高效瞬时表达为了测试本载体系统的特性，我们将本实验室研制的来源于噬菌体抗体库筛选的单链抗体scFv基因和Fab基因，根据其轻链成份的组成分别克隆入此载体系统的不同载体，构建成不同的IgG表达载体。用Llipofactin Min转染试剂盒(GIBCO BRLKit)将纯化的载体质粒DNA和LipofectAMINE Plus共转染Cos7细胞，获得重组完全人源IgG抗体的表达。图3是重组完全人源IgG抗体以本发明载体系统中不同载体的表达水平显示。
权利要求
1.一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体，除共有氨苄青酶素抗性基因及大肠杆菌DNA复制基本元件外，包括12种由不同元件定向组合而成的载体系统，其特征在于由下列基本表达盒组成1)用于重链基因表达的表达盒表达盒1的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点BssHII和BstEII，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因重链全长恒定区基因，牛生长因子多聚腺苷酸尾(BGH Poly A)，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒2或3的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点XhoI和NheI或重链Fd基因可隆位点XhoI和SpeI，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因重链全长恒定区基因或Fc基，BGH Poly A，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒4的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可区基因(VH)的克隆位点BssHII和BstEII，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因重链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒5或6的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，重链可变区基因(VH)的克隆位点XhoI和NheI或重链Fd基因可隆位点XhoI和SpeI，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因重链全长恒定区基因或Fc基，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。2)用于轻链基因表达的表达盒表达盒1的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，轻链可变区基因(VL)的克隆位点EcoRV和XhoI，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因轻链全长恒定区基因及其转录终止信号，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒2或3的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，Kappa或Lambda轻链可变区基因(Vk或Vλ)的克隆位点EcoRV和HindIII，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因Kappa或Lambda轻链全长恒定区基因BGH Poly A，SV40病毒转录起始子和启动子(SV40 ori)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒4的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，轻链可变区基因(VL)的克隆位点EcoRV和XhoI，来自人淋巴细胞基因组DNA的包括内含子在内的IgG基因Kappa链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。表达盒5或6的组成依次由启动子EF-1α，抗体基因先导序列，Kappa或Lambda轻链可变区基因(Vk或Vλ)的克隆位点EcoRV和HindIII，来自人淋巴细胞mRNA的IgG1基因Kappa或Lambda轻链全长恒定区基因，核糖体内部结合位点(IRES)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)及SV40转录终止信号(SV40 poly A)。
2.根据权利要求1，一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的用途，其特征在于无论来自噬菌体抗体库筛选的或分泌抗体的杂交瘤细胞株扩增的针对任何一种抗原的抗体人源或鼠源的VH和VL基因(Vk或Vλ)均可被选择性地通过载体中设置的克隆位点，克隆入根据权利要求1和2中所描述的任何一种组建的载体中，从而在哺乳类细胞如CHO细胞中获得全人IgG抗体或嵌合抗体的表达。
3.根据权利要求1、2，一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体的用途，其特征在于用此载体系统可建立高效表达IgG全抗体的永久性表达细胞系而用于生产全IgG抗体，根据其抗原结合特异性和市场需求，可被用来作为一种新型抗体制剂而进行规模生产，具有商业开发价值。
全文摘要
一组生产用哺乳类细胞人源抗体高效表达载体,包括12种由不同元件定向组合而成的载体,其主要特征由真核细胞表达元件包括强启动子EF－1α、来源于人类基因组DNA或信使RNA的抗体分子轻、重链恒定区基因、内在核糖体识别位点及二氢叶酸还原酶基因的不同形式的定向组合而成,可被用来克隆抗体可变区或Fab基因,导入中华地鼠卵巢(CHO)细胞后获得不同来源抗体基因的永久性高效表达。其用途在于可被用来持续规模生产全人IgG抗体或人－鼠嵌合抗体制剂而用于临床治疗。
文档编号C07K16/40GK1363682SQ0110221
公开日2002年8月14日 申请日期2001年1月18日 优先权日2001年1月18日
发明者梁米芳, 李德新, 爱克哈德·博茨, 爱丽丝·奎滋 申请人:梁米芳, 爱克哈德·博茨