专利名称：从动物血液中提取血红素的方法
技术领域：
本发明涉及一种血红素的提取方法，特别是涉及一种利用血红素在不同酸碱度溶液中溶解性不同的性质提取血红素的方法。
血红素是从猪血或其它动物血液中提取出来的一种含铁的卟啉化合物，它是制备抗癌特效药——血卟啉衍生物药物的主要原料，也是一种高效的天然补Fe2+剂，可用于治疗缺铁性贫血和铅中毒，还可以作为食品制作中的色素添加剂，应用范围十分广阔，市场上供不应求。
关于血红素的提取方法，迄今已有多种方法报导。其中最常用的方法是冰乙酸法，该方法是将动物血液与冰乙酸、NaCl混合后，在90℃下加热回流，静置得到血红素结晶，经洗涤干燥后获得产品，其中的冰乙酸经蒸馏回收后再循环利用。目前的工业生产中大都采用此方法，但其缺点是冰乙酸耗用量大，成本高，而且从溶解有蛋白质的冰乙酸废液中蒸馏回收冰乙酸，处理比较困难。丙酮盐酸法是另外一种提取血红素的常用方法，该方法需要采用新鲜的动物血液作为原料，即需要在新鲜血液中加入抗凝血剂柠檬酸钠，放置分层，除去上层血清后，利用新鲜的血细胞作为提取原料，用盐酸丙酮溶液提取血细胞中的血红素，过滤除去沉淀物后，滤液中加入醋酸钠的氢氧化钠溶液，静置析出血红素沉淀，洗涤干燥后获得产品。该方法得到的血红素产品纯度不高，需要进一步精制，而且工艺中丙酮用量很大，由于丙酮是易挥发物质，使得工艺操作和设备要求比较严格苛刻，工艺制备比较复杂。
碱基物有机溶剂法和离子交换法是另外两种提取血红素的方法。碱基物有机溶剂法是利用含碱基物质的有机溶剂，使得血细胞中的珠蛋白与血红素分离从而获取血红素的方法，其中的碱基试剂如二乙氨、吡啶等有机胺对人体有毒副作用，有机溶剂的挥发性也比较大，特别是在血红素的制备操作中需要反复多次进行离心、升温和降温，步骤繁琐、复杂，使生产成本增加许多。离子交换法是将血红素吸附在离子交换树脂上，再用适当的洗脱剂解吸下来的制备血红素方法，离子交换法获得的血红素纯度较高，但是该方法制备数量有限，需要耗用大量的淋洗剂和解吸剂，而且离子交换树脂使用几次后需要进行再生处理，制备工艺比较复杂。
本发明的目的是提供一种简便、快速提取血红素的方法，以适合工业化大批量生产。
本发明是利用血红素能够溶解于碱性溶液中的性质，在由除去血清的凝固血块制成的血匀浆中加入碱性溶液，搅拌使血红素充分完全溶解到碱性溶液中，与不溶于碱性溶液的珠蛋白分离，过滤除去珠蛋白后的滤液用盐酸调节pH=2-3，静置使析出血红素沉淀，收集沉淀，经洗涤烘干后，得到纯的血红素产品。
经过试验，发现多种不同组合的碱性溶液都具有使血红素与珠蛋白分离的作用，本发明采用的碱性溶液是下述溶液组合中的一种a)1mol/L(NH4)2SO4碱性溶液，称取132g(NH4)2SO4，用0.4mol/LNaOH溶液溶解并定容至1000mL；b)1.5mol/L NaCl碱性溶液，称取87gNaCl，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；c)1mol/L Na2SO4碱性溶液，称取117gNa2SO4，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；d)1mol/L Zn(OH)2碱性溶液，称取99gZn(OH)2，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；e)0.8mol/L CuSO4碱性溶液，称取200g CuSO4·5H2O，用0.4mol/LNaOH溶液溶解并定容至1000mL；f)0.5mol/L Pb(Ac)2碱性溶液，称取135gPb(Ac)2，用0.4mol/L NaOH溶液溶解并定容至1000mL；g)60％碱性丙酮溶液，0.4mol/L NaOH溶液400mL与600mL丙酮混合；h)70％碱性甲醇溶液，0.4mol/L NaOH溶液300mL与700mL甲醇混合；f)60％碱性乙醇溶液，0.4mol/L NaOH溶液400mL与600mL乙醇混合；i)30％三氯乙酸碱性溶液，称取300g三氯乙酸，用1mol/L NaOH溶解并定容至1000mL。
其中碱性溶液中的溶剂除采用NaOH溶液外，还可以用KOH溶液、NH3·H2O溶液等替代。
用于分离溶解血红素的碱性溶液的用量是血匀浆体积的2-3倍。
在向溶解有血红素的碱性溶液中加入盐酸之前，应先将碱性溶液在60℃-80℃下进行常压蒸馏或者在1Kpa-2Kpa真空度下进行减压蒸馏，一方面除去溶液中的可挥发物质，另一方面蒸走溶液中的大部分水分，使溶液浓度增加，便于血红素的沉淀析出。
加入的沉淀剂盐酸的浓度为1mol/L。
沉淀得到的血红素产品经洗涤后应在60℃-70℃温度下烘干。
本发明所提供的血红素提取方法工艺简单，操作容易，适合于工业化大批量生产，生产周期短、回收率高。而且本发明采用的溶剂对人体无毒副作用，使用安全，对生产设备也无特殊要求，生产成本低。
以下是本发明的几个具体应用实施例。
实施例1取1L非抗凝血，待其凝血析出血清后，弃去上层血清，得到凝固血块约500mL。将凝固血块用超速粉碎器粉碎成血匀浆，在搅拌下往血匀浆中缓慢地加入1000mL 1mol/L(NH4)2SO4碱性溶液，之后停止搅拌，静置2小时，将溶液通过布氏漏斗抽滤，除去珠蛋白沉淀，接着用0.7mo1/L(NH4)2SO4碱性溶液2000mL冲洗沉淀物，直至将沉淀中的血红素之紫色洗干净为止，收集滤液约3000mL，合并于真空干燥器中，于1.33Kpa真空度下减压蒸馏，除去可挥发物质和大部分的水分，馏余物剩余约1000mL时，停止蒸馏，用1mol/L HCl溶液调节使溶液pH=2，并静置30min，此时有大量的紫红色沉淀出现，将沉淀物通过漏斗过滤，并用蒸馏水洗涤沉淀，除去水溶性杂质，最后收集的沉淀物置于干燥箱中于60℃温度下烘干，得到2.8g纯血红素，回收率93％。经分析产品纯度99％。
实施例2取1L非抗凝血，待其凝血析出血清后，弃去上层血清，得到凝固血块约500mL。将凝固血块用超速粉碎器粉碎成血匀浆，在搅拌下往血匀浆中缓慢地加入1000mL1mol/L Zn(OH)2碱性溶液，之后停止搅拌，静置过夜，将溶液通过布氏漏斗抽滤，除去珠蛋白沉淀，接着用1mol/LZn(OH)2碱性溶液2000mL冲洗沉淀物，直至将沉淀中的血红素之紫色洗干净为止，收集滤液约3000mL，合并于真空干燥器中，于1.58Kpa真空度下减压蒸馏，除去可挥发物质和大部分的水分，馏余物剩余约1000mL时，停止蒸馏，用1mol/L HCl溶液调节溶液的pH=2，并静置30min，此时有大量的紫红色沉淀出现，将沉淀物通过漏斗过滤，并用蒸馏水洗涤沉淀，除去水溶性杂质，最后收集的沉淀置于干燥箱中于60℃温度下烘干，得到2.3g纯血红素，回收率77％，产品纯度99％。
实施例3取血匀浆500mL，加入1200mL60％碱性乙醇溶液，静置2小时，抽滤除去珠蛋白沉淀，再用2400mL60％碱性乙醇溶液冲洗沉淀物，收集滤液约4000mL，于蒸馏瓶中进行常压蒸馏并回收60℃-80℃之馏份。馏余物剩余约800mL时停止蒸馏，用1mol/L HCl溶液调节体系pH=3，静置30min析出血红素沉淀，沉淀经过滤洗涤后于干燥箱中烘干，烘干温度60℃，得到2.8g纯血红素，回收率93％，产品纯度99.5％。
实施例4采用30％三氯乙酸碱性溶液作为血红素的抽提剂，其余步骤同实施例1，最后得到血红素2.3g，回收率77％，产品纯度99％。
实施例5为验证得到产品的纯度，在0.4mol/L NaOH+正丁醇+95％乙醇=30+35+35(V/V)的展开剂体系中，对血红素标准品和得到的产品同时进行纸层析展开，在同一位置均出现一个紫色的椭园形斑点，其Rf=0.59。用0.5％丙酮茚三酮溶液对层析纸进行显色反应，均无蛋白质的显色斑点，说明得到产品纯度较高。
用0.4mol/L NaOH溶液分别溶解血红素标准品和得到产品，制作紫外吸收曲线，两个溶液均在405nm处有最大吸收峰，未发现其它波长的吸收峰。
上述两项试验均说明所得到的产品是血红素，而且产品纯度较高。
权利要求
1.从动物血液中提取血红素的方法，是采用由除去血清的凝固血块制成的血匀浆提取血红素，其特征是在血匀浆中加入碱性溶液，溶解其中的血红素，并与不溶于碱性溶液的物质分离；用盐酸调节溶解有血红素的碱性溶液，至溶液pH=2-3，溶液中析出沉淀，收集沉淀物，经洗涤、烘干，得到血红素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是采用的碱性溶液是下述溶液中的一种a)1mol/L(NH4)2SO4碱性溶液；b)1.5mol/L NaCl碱性溶液；c)1mol/L Na2SO4碱性溶液；d)1mol/L Zn(OH)2碱性溶液；e)0.8mol/L CuSO4碱性溶液；f)0.5mol/L Pb(Ac)2碱性溶液；g)60％碱性丙酮溶液；h)70％碱性甲醇溶液；i)60％碱性乙醇溶液；j)30％三氯乙酸碱性溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是碱性溶液的用量是血匀浆体积的2-3倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是溶解有血红素的碱性溶液在加入盐酸之前，先蒸馏以除去溶液中的可挥发物质和大部分水分。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是在60℃-80℃下常压蒸馏。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征是采用减压蒸馏，真空度1Kpa-2Kpa。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是盐酸浓度1mol/L。
8.根据利要求1所述的方法，其特征是血红素的烘干温度是60℃-70℃。
全文摘要
一种从动物血液中提取血红素的方法,是在由除去血清的凝固血块制成的血匀浆中加入碱性溶液,以溶解其中的血红素,并与不溶于碱性溶液的珠蛋白相分离,继而用盐酸调节除去珠蛋白的碱性溶液使其pH=2－3,并析出沉淀,收集沉淀物经洗涤、干燥,得到血红素产品。本发明生产血红素的方法简单、快速,适用于工业化大批量生产。
文档编号C07F15/02GK1306002SQ01102839
公开日2001年8月1日 申请日期2001年2月7日 优先权日2001年2月7日
发明者尹兆明, 段黎萍, 杨勇 申请人:尹兆明