具有促进3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法

专利名称：具有促进3t3细胞转化功能的新的人蛋白及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
人基因组学研究目前是国际上的热点，除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)的方法外，还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤，目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此，本领域迫切需要开发研究与癌细胞生长相关的人蛋白及其激动剂/抑制剂。
本发明的目的是提供一类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码上述的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO3、6、9、12、15、18、21、24、27、30的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了制备具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了与上述的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续10个核苷酸至全长核苷酸，较佳地它含有连续的约10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可用于促进细胞的生长。本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的针对本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽的拮抗剂(如抗体)以及药学上可接受的载体。该药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
3T3细胞是一种小鼠成纤维细胞(J.Cell.Biol.，17299，1963)。在癌症研究领域中，常将外源基因(尤其是人基因)引入3T3细胞，观察其对3T3细胞生长的影响情况。通常认为，对3T3细胞生长(或恶性转化)有影响的基因是癌症相关基因，其中对3T3细胞生长或转化有抑制作用的基因大多是抑癌基因，而对3T3细胞生长或转化有促进作用的基因大多是(原)癌基因。
本发明采用大规模cDNA克隆转染小鼠胚胎成纤维细胞3T3，在获得具有促进生长作用的基础上，经测序证明为新的基因，进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明，本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白对3T3细胞具有促进克隆形成的作用，其促进率≥50％。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白或多肽”是指具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有促进3T3细胞转化功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以PP3659蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO3所示的编码区序列有差别的核酸序列。再以PP6318蛋白(在本申请中，蛋白质的命名采用其克隆编号)为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。对于其他具有促进3T3细胞转化功能的蛋白，依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO2所示的成熟多肽(以PP3659蛋白为例)有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时，DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时，DNA序列的直接化学合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因的功能出现或丧失；(3)测定具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2kb之内，较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或具有促进3T3细胞转化功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)直接做为药物治疗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如，该抗体可用于治疗癌症或细胞异常增殖。用重组表达的本发明蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂可以与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合并消除其功能，或是抑制具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将具有促进3T3细胞转化功能的蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响具有促进3T3细胞转化功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明蛋白的拮抗剂可直接用于疾病治疗，例如，各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有促进3T3细胞转化功能的蛋白或其特异性抗体，可按有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达所致的细胞发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白，以抑制内源性的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白活性。例如，一种变异的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗具有促进3T3细胞转化功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。由于本发明蛋白具有促进3T3细胞转化的功能，因此本发明蛋白编码序列的反义序列，可被引入细胞以抑制细胞的异常增殖(如癌变)。
本发明还提供了针对具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
抗具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白。
与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以阻断具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的产生或活性，从而抑制癌细胞的生长和/或细胞的异常增殖。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭有关的阳性细胞(如癌细胞)。
多克隆抗体的生产可用具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler andMilstein.Nature，1975，256495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的单链抗体。
能与具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验为本领域所熟知，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白水平，可以用作解释具有促进3T3细胞转化功能的蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白起作用的疾病。
具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有促进3T3细胞转化功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的异常表达。如具有促进3T3细胞转化功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(即基因芯片)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有促进3T3细胞转化功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白的转录产物。
检测具有促进3T3细胞转化功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有促进3T3细胞转化功能的蛋白相关的疾病。具有促进3T3细胞转化功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有促进3T3细胞转化功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。这些序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。然而现在只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。为了将这些序列与疾病相关基因相关联。第一步就是将本发明DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。
本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
此外，由于本发明的具有促进3T3细胞转化功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。注意，在核苷酸和氨基酸组合序列中，(1)给出的是起始和终止编码子第一个核苷酸的位置，(2)分子量单位是道尔顿。
实施例1cDNA基因的获得及对3T3细胞克隆形成的促进作用PP3659、PP6318、PP6425、PP7518、PP9484、PP9964、PP10394、PP10436、PP12613和PP12708是通过用常规方法构建人胎盘cDNA文库获得的。取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞，获得了1×106cfu/μg滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染小鼠成纤维细胞3T3。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μlH2O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的3T3细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现以上克隆有促进细胞克隆形成作用，结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(3T3)克隆形成情况
对cDNA克隆采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后，确定为新基因克隆，进行另一端测序。对于仍未获得全长cDNA序列的，设计引物，再次进行测序，直到获得全长序列(SEQ ID NO1、4、7、10、13、16、19、22、25、28)。
实施例2从胎盘cDNA中PCR获得全长基因取3、6、10月龄的胎盘组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-SuperscriptII(GIBCO BRL)，反转录酶在42℃进行反转录反应，获得胎盘cDNA。利用各个基因的转异引物(如下表所示)，按97℃3分钟、1个循环；94℃30秒→60℃30秒→72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟，1个循环，进行PCR扩增，获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证，与实施例1测得的序列相符。随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞，从而获得重组蛋白(SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29)。
基因特异引物
实施例3cDNA克隆序列分析1.PP3659A核苷酸序列(SEQ ID NO1)长度47151 GTCTCGAGTT TTTTTTTTTT TTTTTTCCGT TTTTAATAAA TAGTTTATTC ATCCAGCAGT61 TTCAGCCCTG ATACTGAAGC CTGTTGCGGT GTTTCTTATT TTTCTGGCTG GAGCCTGATT121 ATGAGAACAT GGCCTCACCA CGGGGCCAGC GCTCAGATTC CTGCCCTGCC GATCATCCAG181 ACATCAGAGG AAATGAGAGT ATTGCTCAAA TGAGGGAGAC TGGAGCTTTA TTAAGGAAAC241 AAAAAATACC AGTAAGACTA GAGAGGGGTG GTTAATGTTT CTGGAGGCAG CTGTGGAATT301 TCCTGTTTGC TCCCCCTCTC CTGCCTGCCG CAGATGAGGA CACACGGGGA AGACTCGCTG361 GAGAGGCTTC TCGCACTTAA TAAGGCCCCC CGTCGGGGTG CTTCTGGAGC CTGCCTCCCA421 GGGAGCAGGC TGAGGAGCTG GCGGGAGGGC CGGTGGGCGG CGGCGCGGAC GCTGCTCCCT481 TGTGGCCGGC AGGGGGCAGC CTGCAGCCAC TGCGCCTCTC CCGCCGCCAA GAGCCGCGGC541 CGGGGTAACA GAAACGCCGG CTGCGCTGAA GTTCTTGTTA AACAGCCCCG CGTCGGGCTG601 TGGTCACAGT AAAGCAAGGC GATCTTCGAC ACAGCAAGTG CGAGGCTCTG GGCCCTGACG661 CAGGGCTCCC AAGCTCCCGG AATCGGCGTT CTGGCTGCAG GCCTGGTCTA GAGTCGCAGC721 TTCTGTGAGA AGCAACACTG AGGCGGGCCC GCCCAGACCC TCCTCTCTGC TCTCAGCCCC781 AGTCCCTACT TCGGGATCCT CCCAGGAGGC TGTGCCGGCT GCTCACTCCT CCTGACCTGA841 GGGACCGTGT GTCTGGGCCT GGTGTTTCTA GACGGTCCCC CCTACAGTCA CTTGTTCTAA901 TTTCTAGCAC CTTCCCTCTT CAGGATAGAG GCCCAGCCAG CCAGAGCACA GGCTTTCTCC961 CTTCACCCTG GAGCTCTCAG GTAACAACCC CCTGAAGGCA CATGGACCAA GCTGCTCCCC1021 ATCCCGCCAC CCGAAACACC ATCCTTGCCC CACCTCCCAG GTGACAGACT CCCTGGCGTG1081 CCATGCCCCA GCCCACCAGC CCCACGCTTG TCAGCTGGGC CTGACAGCTG CTGCTCTTGT1141 TTTCTATTCA TGAAAACTCA ACCCTTCTCC CCGTTTCTGC CAGCACAACA GGGCAGAGTC1201 TGGGCTATCA CCCTGGCTTC TCCCCCTCCC TTTAAAGGAA GCCCACATTT TCCTGCGAGC1261 CGAACTCCTC TGAAGAGTAT GGCAGACCTT TGGAATCGTG TCAGGACGAG ACTGAAAGTC1321 AAGGCAAGTG TGAATTCAGC ACCGCAGGCC TGGTGACCCT CCTGTGCCTC TGGAGTGGGC1381 TGTCCTGGGA CAGGCTGACC AGGAACAAGT CCCCGCCCGG GGCTTATCGC TCTGAGTCAG1441 AGAAGGAAGA GGGCTTAGTC CATCTCCACA CCAGCATGTC CTCTCCTGCA ACGCGGTGGG1501 ACTCCGTCTG GATCCGGGAT TCGTTGGAGG CCAGGAACTC CACAGCTCGG TCCCAGACAC1561 GCTTCATGCG CCTCCGGCTC TGTGGAGGGA TCAAGCTGTC GCGCACGTGC AGGATGCCTA1621 CATATGGATA GCGCTCCATG TCCTGCTCCC AGTCCACGTA ATGGTCCTGG ACCACGTCTA1681 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TCCAGACCCT GCCCCGGGCG CTGGGGGCAT GGTCCACCAC3421 AGGCACCGCA GCTCATCTAC CAGGAGTGGC GGTGGGGACC TGACACTAGG GCTGGAGCCC3481 TCTGAAGAGG AGGCCCCCAG GTCTCCACTG GCACCCTCCG AAGGGGCTGG CTCCGATGTA3541 TTTGATGGTG ACCTGGGAAT GGGGGCAGCC AAGGGGCTGC AAAGCCTCCC CACACATGAC3601 CCCAGCCCTC TACAGCGGTA CAGTGAGGAC CCCACAGTAC CCCTGCCCTC TGAGACTGAT3661 GGCTACGTTG CCCCCCTGAC CTGCAGCCCC CAGCCTGAAT ATGTGAACCA GCCAGATGTT3721 CGGCCCCAGC CCCCTTCGCC CCGAGAGGGC CCTCTGCCTG CTGCCCGACC TGCTGGTGCC3781 ACTCTGGAAA GGCCCAAGAC TCTCTCCCCA GGGAAGAATG GGGTCGTCAA AGACGTTTTT3841 GCCTTTGGGG GTGCCGTGGA GAACCCCGAG TACTTGACAC CCCAGGGAGG AGCTGCCCTC3901 AGCCCCACCC TCCTCCTGCC TTCAGCCCAG CCTTCGACAA CCTCTATTAC TGGGACCAGG3961 ACCCACCAGA GCGGGGGGCT CCACCCAGCA CCTTCAAAGG GACACCTACG GCAGAGAACC4021 CAGAGTACCT GGGTCTGGAC GTGCCAGTGT GAACCAGAAG GCCAAGTCCG CAGAAGCCCT4081 GATGTGTCCT CAGGGAGCAG GGAAGGCCTG ACTTCTGCTG GCATCAAGAG GTGGGAGGGC4141 CCTCCGACCA CTTCCAGGGG AACCTGCCAT GCCAGGAACC TGTCCTAAGG AACCTTCCTT4201 CCTGCTTGAG TTCCCAGATG GCTGGAAGGG GTCCAGCCTC GTTGGAAGAG GAACAGCACT4261 GGGGAGTCTT TGTGGATTCT GAGGCCCTGC CCAATGAGAC TCTAGGGTCC AGTGGATGCC4321 ACAGCCCAGC TTGGCCCTTT CCTTCCAGAT CCTGGGTACT GAAAGCCTTA GGGAAGCTGG4381 CCTGAGAGGG GAAGCGGCCC TAAGGGAGTG TCTAAGAACA AAAGCGACCC ATTCAGAGAC4441 TGTCCCTGAA ACCTAGTACT GCCCCCCATG AGGAAGGAAC AGCAATGGTG TCAGTATCCA4501 GGCTTTGTAC AGAGTGCTTT TCTGTTTAGT TTTTACTTTT TTTGTTTTGT TTTTTTAAAG4561 ATGAAATAAA GACCCAGGGG GAGAATGGGT GTTGTATGGG GAGGCAAGTG TGGGGGGTCC4621 TTCTCCACAC CCACTTTGTC CATTTGCAAA TATATTTTGG AAAACAAAAA AAAAAAAAAA4681 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAB核苷酸序列 (SEQ ID NO2)长度4121 MALESILRRR FTHQSDVWSY GVTVWELMTF GAKPYDGIPA REIPDLLEKG ERLPQPPICT61 IDVYMIMVKC WMIDSECRPR FRELVSEFSR MARDPQRFVV IQNEDLGPAS PLDSTFYRSL121 LEDDDMGDLV DAEEYLVPQQ GFFCPDPAPG AGGMVHHRHR SSSTRSGGGD LTLGLEPSEE181 EAPRSPLAPS EGAGSDVFDG DLGMGAAKGL QSLPTHDPSP LQRYSEDPTV PLPSETDGYV241 APLTCSPQPE YVNQPDVRPQ PPSPREGPLP AARPAGATLE RPKTLSPGKN GVVKDVFAFG301 GAVENPEYLT PQGGAALSPT LLLPSAQPST TSITGTRTHQ SGGLHPAPSK GHLRQRTQST361 WVWTCQCEPE GQVRRSPDVS SGSREGLTSA GIKRWEGPPT TSRGTCHARN LSC.核苷酸及氨基酸组合序列 (SEQ ID NO3)克隆号PP3659起始编码子2950 ATG 终止编码子4186 TAA 蛋白质分子量44699.631 GTC TCG AGT TTT TTT TTT TTT TTT TTC CGT TTT TAA TAA ATA GTT TAT4849 TCA TCC AGC AGT TTC AGC CCT GAT ACT GAA GCC TGT TGC GGT GTT TCT9697 TAT TTT TCT GGC TGG AGC CTG ATT ATG AGA ACA TGG CCT CAC CAC GGG 144145 GCC AGC GCT CAG ATT CCT GCC CTG CCG ATC ATC CAG ACA TCA GAG GAA 192193 ATG AGA GTA TTG CTC AAA TGA GGG AGA CTG GAG CTT TAT TAA GGA AAC 240241 AAA AAA TAC CAG TAA GAC TAG AGA GGG GTG GTT AAT GTT TCT GGA GGC288289 AGC TGT GGA ATT TCC TGT TTG CTC CCC CTC TCC TGC CTG CCG CAG ATG336337 AGG ACA CAC GGG GAA GAC TCG CTG GAG AGG CTT CTC GCA CTT AAT AAG384385 GCC CCC CGT CGG GGT GCT TCT GGA GCC TGC CTC CCA GGG AGC AGG CTG432433 AGG AGC TGG CGG GAG GGC CGG TGG GCG GCG GCG CGG ACG CTG CTC CCT480481 TGT GGC CGG CAG GGG GCA GCC TGC AGC CAC TGC GCC TCT CCC GCC GCC528529 AAG AGC CGC GGC CGG GGT AAC AGA AAC GCC GGC TGC GCT GAA GTT CTT576577 GTT AAA CAG 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AAG4128378 Asp Val Ser Ser Gly Ser Arg Glu Gly Leu Thr Ser Ala Gly Ile Lys 3934129 AGG TGG GAG GGC CCT CCG ACC ACT TCC AGG GGA AAC TGC CAT GCC AGG4176394 Arg Trp Glu Gly Pro Pro Thr Thr Ser Arg Gly Thr Cys His Ala Arg 4094177 AAC CTG TCC TAA GGA ACC TTC CTT CCT GCT TGA GTT CCC AGA TGG CTG4224410 Asn Leu Ser *** 4134225 GAA GGG GTC CAG CCT CGT TGG AAG AGG AAC AGC ACT GGG GAG TCT TTG42724273 TGG ATT CTG AGG CCC TGC CCA ATG AGA CTC TAG GGT CCA GTG GAT GCC43204321 ACA GCC CAG CTT GGC CCT TTC CTT CCA GAT CCT GGG TAC TGA AAG CCT43684369 TAG GGA AGC TGG CCT GAG AGG GGA AGC GGC CCT AAG GGA GTG TCT AAG44164417 AAC AAA AGC GAC CCA TTC AGA GAC TGT CCC TGA AAC CTA GTA CTG CCC44644465 CCC ATG AGG AAG GAA CAG CAA TGG TGT CAG TAT CCA GGC TTT GTA CAG45124513 AGT GCT TTT CTG TTT AGT TTT TAC TTT TTT TGT TTT GTT TTT TTA AAG45604561 ATG AAA TAA AGA CCC AGG GGG AGA ATG GGT GTT GTA TGG GGA GGC AAG46084609 TGT GGG GGG TCC TTC TCC ACA CCC ACT TTG TCC ATT TGC AAA TAT ATT46564657 TTG GAA AAC AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA47044705 AAA AAA AAA AA 47152. PP6318A核苷酸序列(SEQ ID NO4)长度37221 GGAACTAGTC TCGAGTTTTT TTTTTTTTTT TTTGCAATTT TAAGCTCATC AGCTATCACT61 AGTGTTAGCA TATTTTATAG TGTGGCCCAA GACAATTATT TTCCTAATGT GGTCCAGGGA121 AGCCAAAAGA TTGGACACCC TGATATACTT AATTACCAGG GTAATATTCC TAACACCATC181 ACTTTTACTT GACAATTCTC CTGCTCTAAA AGTTATGAAC CTGACATTCT TGGTCTTACA241 CAATCTGGAC CCAGTCTACT CTTCTATAAC CATCTTCCAC TTAATTTACA AATCTTTATT301 AAGGCACAGG TACTCCTACT TATCCCCTAT TGCCTCTCTC ATGCTGAATC AATCATGCCA361 AAAGCTAAGA AAACATGAGC ATGCTTGGGA CTAAAGAAAC AGAACTGAGG ATTTCCTACA421 CATCCTAACT GCAAGGACAG TCCATCAAAA GCCAGAGATA AGTATTTTTA TTTGCTCTTT481 ATTTCTTAAA ATAATTTCCC CAATTTTGTT AACCCCTACC TCAAATGACT TTAGAGGTAT541 TTTAAAGGAT ATGTAATATA GTTACTAAGC ATTTCCACTG ATTGTAGCTG AAGGATTTTC601 TAATGTCTAT TACATGAAAC TTCTCCTTAA ACTCTCTTTT AACGAAACTG TCATTTTCCT661 CTCCAGAACG GTCTTGTCTT TTCTTTCTCC TATATATCGC ATATAAAATC AGCGGCCAAA721 TCTTCTAGAT CAAACATATT CATTTCATCC ATTCCTTCAA TTATCCAGTC ATTCAATCAA781 CATTATTATG TGTAAAGTAT GACCCACTTG CATTCCTAGA CATGGAAGAT CCAAAATTAA841 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AESC.核苷酸及氨基酸组合序列 (SEQ ID NO9)克隆号PP6425起始编码子2293 ATG 终止编码子3082 TGA 蛋白质分子量28249.801 GCC CGC CCG AGG CCT CAG TCC AGG TGC ACC GCA TTG AGA GCT CGA ACG 4849 CCG AGA GCG CAG CCC CCT CCC AGC ACC TGC TGC CGC ACC CCA AGC CCT 9697 CGC ACC CCC GGC CGC CCA CCC AGA AGC CCC TGG GCC GCT GCT TTC AGG 144145 ACA CTC TGC CCA AGC AGC CGT GTG GCA GCA ACC CCC TCC CCG GCC TCA 192193 CCA AGC AGG AAG ACT GCT GCG GTA GCA TCG GCA CTG CCT GGG GCC AGA 240241 GCA AGT GCC ACA AGT GTC CCC AGC TGC AGT ACA CAG GAG TGC AGA AGC 288289 CAG GGC CTG TAC GTG GGG AAG TGG GCG CTG ACT GTC CCC AGG GCT ACA 336337 AGA GGC TTA ACA GCA CCC ACT GCC AGG ACA TCA ACG AGT GCG CAA TGC 384385 CGG GCG TGT GTC GCC ATG GTG ACT GCC TCA ACA ACC CTG GCT CCT ATC 432433 GCT GTG TCT GCC CAC CTG GCC ATA GTT TAG GCC CCT CCC GTA CAC AGT 480481 GCA TTG CAG ACA AAC CGG AGG AGA AGA GCC TGT GTT TCC GCC TGG TCG 528529 AGC CCT GAG CAC CAG TGC CAG CAC CCA CTG ACC ACC CGC CTG ACC CGC576577 CAG CTC TGC TGC TGC AGT GTC GGC AAG GCC TGG GGC GCG CGG TGT CAG624625 CGC TGC CCA ACA GAT GGC ACC GCT GCG TTC AAG GAG ATC TGC CCA GCT672673 GGG AAG GGA TAC CAC ATT CTC ACC TCC CAC CAG ACG CTC ACC ATT CAG720721 GGC GAG AGT GAC TTT TCC CTT TTC CTG CAC CCT GAC GGG CCA CCC AAG768769 CCC CAG CAG CTT CCG GAG AGC CCT AGC CAG GCT CCA CCA CCT GAG GAC816817 ACA GAG GAA GAG AGA GGG GTG ACC ACG GAC TCA CCG GTG AGT GAG GAG864865 AGG TCA GTG CAG CAG AGC CAC CCA ACT GCC ACC ACG ACT CCT GCC CGG912913 CCC TAC CCC GAG CTG ATC TCC CGT CCC TCG CCC CCG ACC ATG CGC TGG960961 TTC CTG CCG GAC TTG CCT CCT TCC CGC AGC GCC GTA GAG ATC GCT CCC 10081009 ACT CAG GTC ACA GAG ACT GAT GAG TGC CGA CTG AAC CAG AAC ATC TGT 10561057 GGC CAC GGA GAG TGC GTG CCG GGC CCC CCT GAC TAC TCC TGC CAC TGC 11041105 AAC CCC GGC TAC CGG TCA CAT CCC CAG CAC CGC TAC TGC GTG GAT GTG 11521153 AAC GAG TGC GAG GCA CGA GCC CTG TGG CCC GGG GAG GGG CAT CTG CAT 12001201 GAA CAC CGG CGG CTC CTA CAA TTG CCA CTG CAA CCG CGG CTA CCG CCT 12481249 GCA CGT GGG CGC CGG GGG GCC TGC GTG CGT GGA CCT GAA CGA ATG CGC 12961297 CAA GCC CCA CCT GTG CGG CGA CGG CGG CTT CTG CAT CAA CTT TCC CGG 13441345 TCA CTA CAA GTG CAA CTG CTA CCC CGG CTA CCG GCT CAA AGC CTC CCG 13921393 GCC TCC TGT GTG CGA AGA CAT CGA CGA GTG CCG GGA CCC AAG CTC TTG 14401441 CCC GGA TGG CAA ATG CGA GAA CAA GCC CGG GAG CTT CAA GTG CAT CGC 14881489 CTG TCA GCC TGG CTA CCG CAG CCA GGG GGG CGG GGC CTG TCG CGA CGT 15361537 GAA CGA GTG CGC CGA GGG CAG CCC CTG CTC GCC TGG CTG GTG CGA GAA 15841585 CCT CCC GGG CTC CTT CCG CTG CAC CTG TGC CCA GGG CTA CGC GCC CGC 16321633 GCC CGA CGG CCG CAG TTG CTT GGA TGT GGA CGA GTG TGA GGC TGG GGA 16801681 CTG TGT GAC AAT GGC ATC TGC AGC AAC ACG CCA GGA TCT TTC CAG TGT 17281729 CAG TGC CTC TCT GGC TAC CAT CTG TCC AGG GAC CGG AGC CAC TGC GAG 17761777 GAC ATT GAT GAG TGT GAC TTC CCT GCA GCC TGC ATT GGG GGT GAC TGC 18241825 ATC AAT ACC AAT GGC TCC TAC AGA TGT CTT TGC CCC CAG GGG CAT CGG 18721873 CTG GTG GGT GGC AGG AAA TGC CAA GAC ATA GAT GAG TGC AGC CAG GAC 19201921 CCG AGC CTG TGC CTT CCC CAT GGG GCC TGC AAG AAC CTT CAG GGC TCC 19681969 TAT GTG TGT GTC TGC GAT GAG GGC TTC ACT CCC ACC CAG GAC CAG CAC 20162017 GGT TGT GAG GAG GTG GAG CAG CCC CAC CAC AAG AAG GAG TGC TAC CTG 20642065 AAC TTC GAT GAC ACA GTG TTC TGC GAC AGC GTA TTG GCC ACC AAC GTG 21122113 ACC CAG CAG GAG TGC TGC TGC TCT CTG GGG GCC GGC TGG GGC GAC CAC 21602161 TGC GAA ATC TAC CCC TGC CCA GTC TAC AGC TCA GCC GAG TTC CAC AGC 22082209 CTC TGC CCA GAC GGA AAG GGC TAC ACC CAG GAC AAC AAC ATC GTC AAC 22562257 TAC GGC ATC CCA GCC CAC CGT GAC ATC GAC GAG TGC ATG TTG TTC GGG 23041 Met Leu Phe Gly 42305 TCG GAG ATT TGC AAG GAG GGC AAG TGC GTG AAC ACG CAG CCT GGC TAC 23525 Ser Glu Ile Cys Lys Glu Gly Lys Cys Val Asn Thr Gln Pro Gly Tyr 202353 GAG TGC TAC TGC AAG CAG GGC TTC TAC TAC GAC GGG AAC CTG CTG GAA 240021 Glu Cys Tyr Cys Lys Gln Gly Phe Tyr Tyr Asp Gly Asn Leu Leu Glu 362401 TGC GTG GAC GTG GAC GAG TGC CTG GAC GAG TCC AAC TGC CGG AAC GGA 244837 Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Leu Asp Glu Ser Asn Cys Arg Asn Gly 522449 GTG TGT GAG AAC ACG CGC GGC GGC TAC CGC TGT GCC TGC ACG CCC CCT 249653 Val Cys Glu Asn Thr Arg Gly Gly Tyr Arg Cys Ala Cys Thr Pro Pro 682497 GCC GAG TAC AGT CCC GCG CAG CGC CAG TCC CTG AGC CCG GAA GAG ATG 254469 Ala Glu Tyr Ser Pro Ala Gln Arg Gln Ser Leu Ser Pro Glu Glu Met 842545 GAC GTG GAC GAG TGC CAG GAC CCG GCA GCC TGC CGC CCT GGC CGC TGC 259285 Asp Val Asp Glu Cys Gln Asp Pro Ala Ala Cys Arg Pro Gly Arg Cys1002593 GTC AAC CTG CCG GGC TCC TAC CGC TGC GAG TGT CGC CCG CCC TGG GTG 2640101 Val Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Glu Cys Arg Pro Pro Trp Val1162641 CCC GGG CCC TCC GGC CGC GAT TGC CAG CTC CCC GAG AGC CCG GCC GAG 2688117 Pro Gly Pro Ser Gly Arg Asp Cys Gln Leu Pro Glu Ser Pro Ala Glu1322689 CGT GCC CCG GAG CGG CGC GAC GTG TGC TGG AGC CAG CGC GGA GAG GAC 2736133 Arg Ala Pro Glu Arg Arg Asp Val Cys Trp Ser Gln Arg Gly Glu Asp 1482737 GGC ATG TGC GCT GGC CCC CTG GCC GGG CCT GCC CTC ACC TTC GAC GAC2784149 Gly Met Cys Ala Gly Pro Leu Ala Gly Pro Ala Leu Thr Phe Asp Asp 1642785 TGC TGC TGC CGC CAG GGC CGC GGC TGG GGC GCC CAA TGC CGA CCG TGC2832165 Cys Cys Cys Arg Gln Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gln Cys Arg Pro Cys 1802833 CCG CCG CGC GCC GCG GGG TCC CAT TGC CCG ACA TCG CAG AGC GAG AGC2880181 Pro Pro Arg Gly Ala Gly Ser His Cys Pro Thr Ser Gln Ser Glu Ser 1962881 AAT TCC TTC TGG GAC ACA AGC CCC CTG CTG TTG GGG AAG CCC CCA AGA2928197 Asn Ser Phe Trp Asp Thr Ser Pro Leu Leu Leu Gly Lys Pro Pro Arg 2122929 GAT GAG GAC AGT TCA GAG GAG GAT TCA GAC GAG TGT CGC TGC GTG AGT2976213 Asp Glu Asp Ser Ser Glu Glu Asp Ser Asp Glu Cys Arg Cys Val Ser 2282977 GCC GCT GCG TGC CGC GGC CGG GCG GCG CCG TGT GCG AGT GTC CCG GCG3024229 Ala Ala Ala Cys Arg Gly Arg Ala Ala Pro Cys Ala Ser Val Pro Ala 2443025 GCT TCC AGC TCG ACG CCT CCC GCG CCC GCT GCG TGG ATA TCG ACG AGT3072245 Ala Ser Ser Ser Thr Pro Pro Ala Pro Ala Ala Trp Ile Ser Thr Ser 2603073 GCC GAG AGC TGA ACC AGC GCG GGC TGC TGT GCA AGA GCG AGC GCT GCG3120261 Ala Glu Ser *** 2643121 TGA ACA CCA GCG GCT CCT TCC GCT GCG TCT GCA AAG CCG CGT TCG CGC31683169 GCA GCC GCC CGC ACG GGG CCT GGG TTC CCC AGC GCC GCC TGG ACG CCG32163217 CCG ACG CCG CCC TCG GCC CAG ACC TCG GTG ATC ACT GAG GGA TTT CCG32643265 CGA GCT CGG CCT CAC TTC TGC CCC GAC TTG TGG CTC GGA CCC AGG GAC33123313 CTT CAG GGC CCG CAG ACC CTC CCG GCG CCT TGA GAC CGA GGC GCC CCT33603361 ACC GGC CCC CCT CCC CGG TTA GCG GGC GGT TGT AAG GTC TCC GGC GGG34083409 CGC TGC CTG CCT TCC TCC CAG AGG GTG TTT CCT AGA AAC TGA TAA ATC34563457 AGA TCG TGC CTC TTT ACC CTT GGC TTT CGA AGC AAA TTG ATG TTC ACG35043505 TCT GAC GTG GGC GCG GGC TGC GCA GGG CGG CGC CAG ACC CCA GCC GCC35523553 TCC CAG GGG CTA GAC TGA GCC CGG CAC AAG GGG TGT GAA ATA GAA TTT36003601 ATT GTG GCT CTG ATT ATG TAC ACG TGA GAT GGC CTG GCT GGG CCG GCC36483649 GGG CTC ACA TGG TTT GTA CAA TAA ATA CAT CTG TGG GGC GGG CTC TCC36963697 GCA GCC GGG AAG GGC CAC CGC CAC GGT TCA GTC CAA AAA AAA AAA AAA37443745 AAA AAA37504.PP7518A核苷酸序列(SEQ ID NO10)长度28201 GCTGTTCCTG AGGAAAGGAC CTTTGAGCTG AGACCTGCAG GATAAGTCTG GGTGGCACGG61 AGCAAAGTGG AGGCCAAGAG CCCAGGGGCA GCCCAGTTTC TCCAGCAGGA GGGAACAGGA121 TGCTTTTTGG AAATAAAAGT GAGGCACGGT GGCTTGCACC TGAGTCCCAG CTACGCTACT181 CGGGAGGCCA AGGCAGTAAG AGCGCTTGAG CCCAGGGAGT TCGAGGACAG CCTGGGCCAC241 AGAGTGCGAC CTCCGTCTCT AAGAACAAAC ACAAACATGG TCAGGGAGCT GTCACTCAGA301 GACAGGCAGA ATCAAGAGCT GGTCCTGGAG AGACCAGTGG GGCTGTGTAG ACTGGGAGCT361 TTGGTTGTCT TGCTGAGAGC AGGAAGCTGC AGGAAGAAGG CAGTGGTCCC CAGCCAGAAT421 ACGGAGTGGC TTGGAGGTGG TCAAAGGTTT GAAGACAGCC ACAGTAAAGT GGACAGAGAC481 AAGAAAAATA GGTACCAAAC CGTGCATCCA GGTAGTCACA GAAAGGAAAT GGGTTTAGAT541 TGAAGCAATG TGGGTTAAAG TTAGACCCTG GGGAAACCTT GCAGGGGTCT GTAGGCCTGT601 GAAGAACTGG ACTAGGTGAG AAGAAGAAGC TTTTGACCCA TGTCACTCCC TGGCCCAGAA661 CTATATCCTA CCCACAGGTG GGTTGAGTTC AGGACTGCTG CTTCCAGCCC CCAGCAGCAA721 GGTTCAAGTG AGAGCTGACT CACCTAGGGC CCCTTGTTAG AGCCTCAGAG CCAGGTGAAA781 AGCCACACAC AGGCTGGGCG CGATGGCTCA CGCCTGTAAT CCCAGCACTT TGGGAGGCCG841 AGGCAGGTGG ATCACCTGAG GTCAGGAGTT CAAGACCATC CTGGCCAACA TGGCAAAATC901 CCGTCTCTAC TAAAAATACA AAAATTAGTC CTGCCTGGTG GCACATGCCT GTAGTCCCAG961 CTACTCGGGA GGCTGAGGCA GGAGAATCGC TTGAACCCGG GAGGCGGAGG TTGCAGTGAG1021 CCGAGATCAT GCCACTGCAC TCCAGCCTGG GTGACAGAGC GGGACTCTGT CTCCAAAAAA1081 AGAAAAGCCA CACAGGTGTG TGTGTAGGGG CAAGGGAGTT TCCTACTGTC TTCCTAGCAG1141 AAAATGGGGA GAAACTGTTA AAGCCAGAAT GAGGGAGGGC TGTGTGTGGC CTGGGACTGG1201 CAACAGAAGT GTCAAGCTGC CAGGTTTCAG GCCAGTACAG AGCACGGTTC TACCTGGGTT1261 ATGTGTTGCC GGCACTAATG GTTAGAGACA TCTGTCACTG GTGAGGGCAG AAATGTATGC1321 AGGAGTGGGT GTGGGAAGCT GGCCTCACTG GTGGGTGGGG TTGGAGACTT TGCCAGGCGT1381 GGTCAGGAAA AGCTGCTACA AAACAGCAAA ACTGCTCCTA GTGCAGCGAT CCCCAACCTT1441 TTTGGCAACA GGGAGTATTT TCCTGGAAGA CCATTTTTCC ATGGAGAGGG AGGGCGGGGC1501 TGGTTTCGGG ATGGAAGTGT TCCATCTCCC ATCATCAGGC ATTAGTCAAA CTCTCCTAAG1561 GAGCACACAA AACCTACACT CCTGGTGTGC ACAGTTCACA GGAGGGCTTC TGCTTCTGTG1621 AGAACCAAAT GTCCCACTGA TGTGACAGGA TCAGAGCGCC ATCGCTGCTC ACTTCCTGCA1681 TGCGGCCCTG TTCCTGACAG GCCACGGACC AGTACCTGGG GTTTGGGGTC CCCCGCCCTA1741 GGGGATGAAA GAAGGGAAAC CTGGGTCTAA TGGGTTACTG TGATTCTCCC TGCGATGCAG1801 GGAAGAGACA GGACAGAGGT GGGAAGGAAC ATGGTCACCA GGAGTCGGGA CAGCACTCTT1861 CCAGGTCCTT CCCCTGGGGC TGAGTAAGCA CCCTGCGCGT AGCTCTTCCT GGCCGCCTGT1921 GGGCTCTGGG ATCTAAACGG ACTATGCAGC CATTCTCACT TTCATTCACA GCTCGGACAG1981 GGACAGTGTG TGTTGAGGCG GAAAGACAAA ACATGTATGT GAGAGACTTT GTATGAGCCG2041 GTTCCTGATG AAGTCCTATC TTTCAGCCTC GTATTTACTG CCCAGGCAGA TGGGGCTCTT2101 TTCTTCACCC TCCCGCTTTT TTTTTTTGAG ACAGAAAACT TAATAGAAAT TTTGTTTGCA2161 GTTCTTACAT TCTCAGTGTG AGCCAATCTG TGACCCACCG CCCCACCCAG AAGTGGCCCA2221 GTCCTGGTGC AGGGTAGGAA GGGAAGGGTG GAGTGAGAAG AGCCCCATTT TTCCTCAGTG2281 CCAGGGGGCT GGAGACACCA CCCCCTTCTC CTGCCTCTGG GCTCCAGGAA GGAGTGCAGA2341 TGGACTCTCA GGCCTATGGT TCCTCCTCCA CACCACTGTC CCCCAGGTTG GAGGGGAGTG2401 AGAGATACAG GGAGAGAAGG GGACAGAGGC AAGAAAAGGT GTTGATCAAG AAAGGCAAGA2461 ACCAGGGGTG AGGGCTGACA GAGAATCAAA GATAAAACAC TAGTAGGCCG GGCGCGGTGG2521 CTCATGCCTG TAATCCCAGC ACTTTCGGAA GCCAAGGCGG GCAGATCACC TGAGGTCGGG2581 AATTCGAGAC CAGCCTGACC AACATGGAGA AACCCTGTCT CTACTACAAA TATAAAATTA2641 GCCGGGTGTG GTGGCACATG CCTGTAATCC CAGCTGCTCA GGAGGCTGAG GCAGGAGAAT2701 CGCTTGAACC TGGGAGGCAG AGATTGCAGT GAGCCAAGAT CATGCCACTG CACTCCAGCC2761 TGGGCAACAA GAGCGAAACT CTGTTGGAAA AAAACAAACA GTAAAAAAAA AAAAAAAAAAB核苷酸序列 (SEQ ID NO11) 长度1021 MYAGVGVGSW PHWWVGLETL PGLVRKSCYK TAKLLLVQRS PTFLATGSIF LEDHFSMERE61 GGAGFGMEVF HLPSSGISQT LLRSTQNLHS WCAQFTGGLL LLC.核苷酸及氨基酸组合序列 (SEQ ID NO12)克隆号PP7518起始编码子1313 ATG 终止编码子1619 TGA 蛋白质分子量11212.391 G CTG TTC CTG AGG AAA GGA CCT TTG AGC TGA GAC CTG CAG GAT AAG 4647 TCT GGG TGG CAC GGA GCA AAG TGG AGG CCA AGA GCC CAG GGG CAG CCC 9495 AGT TTC TCC AGC AGG AGG GAA CAG GAT GCT TTT TGG AAA TAA AAG TGA142143 GGC ACG GTG GCT TGC ACC TGA GTC CCA GCT ACG CTA CTC GGG AGG CCA190191 AGG CAG TAA GAG CGC TTG AGC CCA GGG AGT TCG AGG ACA GCC TGG GCC238239 ACA GAG TGC GAC CTC CGT CTC TAA GAA CAA ACA CAA ACA TGG TCA GGA286287 GGC TGT CAC TCA GAG ACA GGC AGA ATC AAG AGC TGG TCC TGG AGA GAC334335 CAG TGG GGC TGT GTA GAC TGG GAG CTT TGG TTG TCT TGC TGA GAG CAG382383 GAA GCT GCA GGA AGA AGG CAG TGG TCC CCA GCC AGA ATA CGG AGT GGC430431 TTG GAG GTG GTC AAA GGT TTG AAG ACA GCC ACA GTA AAG TGG ACA GAG478479 ACA AGA AAA ATA GGT ACC AAA CCG TGC ATC CAG GTA GTC ACA GAA AGG526527 AAA TGG GTT TAG ATT GAA GCA ATG TGG GTT AAA GTT AGA CCC TGG GGA574575 AAC CTT GCA GGG GTC TGT AGG CCT GTG AAG AAC TGG ACT AGG TGA GAA622623 GAA GAA GCT TTT GAC CCA TGT CAC TCC CTG GCC CAG AAC TAT ATC CTA670671 CCC ACA GGT GGG TTG AGT TCA GGA CTG CTG CTT CCA GCC CCC AGC AGC718719 AAG GTT CAA GTG AGA GCT GAC TCA CCT AGG GCC CCT TGT TAG AGC CTC766767 AGA GCC AGG TGA AAA GCC ACA CAC AGG CTG GGC GCG ATG GCT CAC GCC814815 TGT AAT CCC AGC ACT TTG GGA GGC CGA GGC AGG TGG ATC ACC TGA GGT862863 CAG GAG TTC AAG ACC ATC CTG GCC AAC ATG GCA AAA TCC CGT CTC TAC910911 TAA AAA TAC AAA AAT TAG TCC TGC CTG GTG GCA CAT GCC TGT AGT CCC958959 AGC TAC TCG GGA GGC TGA GGC AGG AGA ATC GCT TGA ACC CGG GAG GCG 10061007 GAG GTT GCA GTG AGC CGA GAT CAT GCC ACT GCA CTC CAG CCT GGG TGA 10541055 CAG AGC GGG ACT CTG TCT CCA AAA AAA GAA AAG CCA CAC AGG TGT GTG 11021103 TGT AGG GGC AAG GGA GTT TCC TAC TGT CTT CCT AGC AGA AAA TGG GGA 11501151 GAA ACT GTT AAA GCC AGA ATG AGG GAG GGC TGT GTG TGG CCT GGG ACT 11981199 GGC AAC AGA AGT GTC AAG CTG CCA GGT TTC AGG CCA GTA CAG AGC ACG 12461247 GTT CTA CCT GGG TTA TGT GTT GCC GGC ACT AAT GGT TAG AGA CAT CTG 12941295 TCA CTG GTG AGG GCA GAA ATG TAT GCA GGA GTG GGT GTG GGA AGC TGG 13421 Met Tyr Ala Gly Val Gly Val Gly Ser Trp101343 CCT CAC TGG TGG GTG GGG TTG GAG ACT TTG CCA GGC CTG GTC AGG AAA 139011 Pro His Trp Trp Val Gly Leu Glu Thr Leu Pro Gly Leu Val Arg Lys261391 AGC TGC TAC AAA ACA GCA AAA CTG CTC CTA GTG CAG CGA TCC CCA ACC 143827 Ser Cys Tyr Lys Thr Ala Lys Leu Leu Leu Val Gln Arg Ser Pro Thr421439 TTT TTG GCA ACA GGG AGT ATT TTC CTG GAA GAC CAT TTT TCC ATG GAG 148643 Phe Leu Ala Thr Gly Ser Ile Phe Leu Glu Asp His Phe Ser Met Glu581487 AGG GAG GGC GGG GCT GGT TTC GGG ATG GAA GTG TTC CAT CTC CCA TCA 153459 Arg Glu Gly Gly Ala Gly Phe Gly Met Glu Val Phe His Leu Pro Ser741535 TCA GGC ATT AGT CAA ACT CTC CTA AGG AGC ACA CAA AAC CTA CAC TCC 158275 Ser Gly Ile Ser Gln Thr Leu Leu Arg Ser Thr Gln Asn Leu His Ser901583 TGG TGT GCA CAG TTC ACA GGA GGG CTT CTG CTT CTG TGA GAA CCA AAT 163091 Trp Cys Ala Gln Phe Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu *** 1031631 GTC CCA CTG ATG TGA CAG GAT CAG AGC GCC ATC GCT GCT CAC TTC CTG 16781679 CAT GCG GCC CTG TTC CTG ACA GGC CAC GGA CCA GTA CCT GGG GTT TGG 17261727 GGT CCC CCG CCC TAG GGG ATG AAA GAA GGG AAA CCT GGG TCT AAT GGG 17741775 TTA CTG TGA TTC TCC CTG CGA TGC AGG GAA GAG ACA GGA CAG AGG TGG 18221823 GAA GGA ACA TGG TCA CCA GGA GTC GGG ACA GCA CTC TTC CAG GTC CTT 18701871 CCC CTG GGG CTG AGT AAG CAC CCT GCG CGT AGC TCT TCC TGG CCG CCT 19181919 GTG GGC TCT GGG ATC TAA ACG GAC TAT GCA GCC ATT CTC ACT TTC ATT 19661967 CAC AGC TCG GAC AGG GAC AGT GTG TGT TGA GGC GGA AAG ACA AAA CAT 20142015 GTA TGT GAG AGA CTT TGT ATG AGC CGG TTC CTG ATG AAG TCC TAT CTT 20622063 TCA GCC TCG TAT TTA CTG CCC AGG CAG ATG GGG CTC TTT TCT TCA CCC 21102111 TCC CGC TTT TTT TTT TTG AGA CAG AAA ACT TAA TAG AAA TTT TGT TTG 21582159 CAG TTC TTA CAT TCT CAG TGT GAG CCA ATC TGT GAC CCA CCG CCC CAC 22062207 CCA GAA GTG GCC CAG TCC TGG TGC AGG GTA GGA AGG GAA GGG TGG AGT 22542255 GAG AAG AGC CCC ATT TTT CCT CAG TGC CAG GGG GCT GGA GAC ACC ACC 23022303 CCC TTC TCC TGC CTC TGG GCT CCA GGA AGG AGT GCA GAT GGA CTC TCA 23502351 GGC CTA TGG TTC CTC CTC CAC ACC ACT GTC CCC CAG GTT GGA GGG GAG 23982399 TGA GAG ATA CAG GGA GAG AAG GGG ACA GAG GCA AGA AAA GGT GTT GAT 24462447 CAA GAA AGG CAA GAA CCA GGG GTG AGG GCT GAC AGA GAA TCA AAG ATA 24942495 AAA CAC TAG TAG GCC GGG CGC GGT GGC TCA TGC CTG TAA TCC CAG CAC 25422543 TTT CGG AAG CCA AGG CGG GCA GAT CAC CTG AGG TCG GGA ATT CGA GAC 25902591 CAG CCT GAC CAA CAT GGA GAA ACC CTG TCT CTA CTA CAA ATA TAA AAT 26382639 TAG CCG GGT GTG GTG GCA CAT GCC TGT AAT CCC AGC TGC TCA GGA GGC 26862687 TGA GGC AGG AGA ATC GCT TGA ACC TGG GAG GCA GAG ATT GCA GTG AGC 27342735 CAA GAT CAT GCC ACT GCA CTC CAG CCT GGG CAA CAA GAG CGA AAC TCT 27822783 GTT GGA AAA AAA CAA ACA GTA AAA AAA AAA AAA AAA AA 28205. PP9484A核苷酸序列(SEQ ID NO13)长度18001 GGGAGAACAA GGACCGGAAG GAGCAGGCGG CGAAGGCAGA GAGGAGGAAG CAGCAGCTGG61 CGGAGGAGGA GGCGCGGCGG CCTCGGGGAG AGGACGGGAA GCCTGTCAGG AAGGGGCCCG121 GGAAGCAGGA GGAGGTGTGT GTCATCGATG CCCTGCTGGC TGACATCAGG AAGGGCTTCC181 AGCTGCGGAA GACAGCCCGG GGCCGCGGGG ACACCGACGG GGGCAGCAAG GCAGCCTCCA241 TGGATCCCCC AAGAGCCACA GAGCCTGTGG CCACCAGTAA CCCTGCAGGA GACCCCGTGG301 GCAGCACGCG CTGTCCCGCC TCTGAGCCCG GCCTTGATGC TACAACAGCC AGCGAGTCCC361 GGGGCTGGGA CCTTGTAGAC GCCGTGACCC CCGGCCCTCA CCCACCCTGG AGCAGTTGGA421 GGAGGGTGGT CCCCGGCCCC TGGAGAGGCG TTCTTCCTGG TATGTGGATG CCAGCGATGT481 CCTAACCACT GAGGATCCCC AGTGCCCCCA GCCCTTGGAG GGGGCCTGGC CGGTGACTCT541 GGGAGATGCT CAGGCCCTGA AGCCCCTCAA GTTCTCCAGC AACCAGCCCC CTGCAGCCGG601 AAGTTCAAGG CAAGATGCCA AGGATCCCAC GTCCTTGCTG GGCGTCCTCC AGGCCGAGGC661 CGACAGCACA AGTGAGGGGC TGGAGGACGC TGTCCACAGC CGTGGTGCCA GACCCCCTGC721 AGCAGGCCCA GGTGGGGATG AGGACGAGGA CGAGGAGGAC ACGGCCCCAG AGTCCGCACT781 GGACACATCC CTGGACAAGT CCTTCTCCGA GGATGCGGTT GACCGACTCC TCGGGGTCGG841 GCACACTCCC CAGGGCCCGG GGCCGGGCCT CAAAGGGGAC CGGGAAGCGA AGGAAGAAGC901 GTCCCTCCAG GAGCCAGGAA GAGGTTCCCC CTGATTCTGA TGATAATAAA ACAAAGAAAC961 TGTGTGTGAT CCAGTAAGGC CTCAGGCCCA GGCCCAAGGC CAAGTGAGAG AGCCCAGGCC1021 ACAGGACATG CTGCCATTCT GCCAAGAGAG GCTCTTCTGG GGGCCAGGCT GGGACTGGGC1081 CCCGGAAACC AAAACTCCGT GCCTTACCCA GCCGGGGCCC TCCTGGAGCC TTCTTGGGGT1141 GTTGTGGCTG GGAACCCGAC AGGCACCAGT GCCCTGCCAG GCCTGGTGCC CTCCTGGACC1201 GCCTGCACGT GCCAGCCTCC CACCTGCTTC CTAAAGGCAA CCCTGGCCCA CACCCGCATG1261 CGCCCGGTGC AGCCTGCCAA GGGCCAGTCG GGGGGTGCTG CGTCCTGCCA GTGTCCACCA1321 CAGCTCTGCC TGCCCTTCAG CCCAGCAAGG TTTAATCAAA ATGCAATGCT TTGCAAGTCT1381 TTACTGCTTG GAGGTGGCTG AGTTGGGGGC CCTGGGCAGG GGTAAGCTGG CAGGCAGTGC1441 CATGGCAGGC CAGGGTCCCC TCCCATGGGG TCTGGCCCCC GTTCCAGCAT GTCCAGCCCC1501 TGAAGTTGGA GTTGGGGGCG GTCTGCCTTT GCTGCCACTG CCAGGCCTCT GCCCTGCAGC1561 TGAAACTTGG CCATCACATC AACAGAAAAC CCCTCCCAGT GCCAGCTGCC CAGCGTGGGC1621 AGGCCCTGGG GACAATACAG GTCCACCTGA GGGGCTGCAG GGTGACACCC AGCAGCCGCT1681 GCCCCCTCAC TGCCCACCCA GCGAGGGCAG CCTACCCGAG CCTGCCCCCT GCCAGGTGTG1741 TGCCCTGAGG CTGGCGGCTG GATGCGTGGC CAATAAAAAG CAGACCTAAA AAAAAAAAAAB核苷酸序列 (SEQ ID NO14)长度1421 MQCFASLYCL EVAELGALGR GKLAGSAMAG QGPLPWGLAP VPACPAPEVG VGGGLPLLPL61 PGLCPAAETW PSHQQKTPPS ASCPAWAGPG DNTGPPEGLQ GDTQQPLPPH CPPSEGSLPE121 PAPCQVCALR LAAGCVANKK QTC.核苷酸及氨基酸组合序列 (SEQ ID NO15)克隆号PP9484起始编码子1361 ATG 终止编码子1789 TAA 蛋白质分子量14187.571G GGA GAA CAA GGA CCG GAA GGA GCA GGC GGC GAA GGC AGA GAG GAG 4647 GAA GCA GCA GCT GGC GGA GGA GGA GGC GCG GCG GCC TCG GGG AGA GGA 9495 CGG GAA GCC TGT CAG GAA GGG GCC CGG GAA GCA GGA GGA GGT GTG TGT142143 CAT CGA TGC CCT GCT GGC TGA CAT CAG GAA GGG CTT CCA GCT GCG GAA190191 GAC AGC CCG GGG CCG CGG GGA CAC CGA CGG GGG CAG CAA GGC AGC CTC238239 CAT GGA TCC CCC AAG AGC CAC AGA GCC TGT GGC CAC CAG TAA CCC TGC286287 AGG AGA CCC CGT GGG CAG CAC GCG CTG TCC CGC CTC TGA GCC CGG CCT334335 TGA TGC TAC AAC AGC CAG CGA GTC CCG GGG CTG GGA CCT TGT AGA CGC382383 CGT GAC CCC CGG CCC TCA CCC ACC CTG GAG CAG TTG GAG GAG GGT GGT430431 CCC CGG CCC CTG GAG AGG CGT TCT TCC TGG TAT GTG GAT GCC AGC GAT478479 GTC CTA ACC ACT GAG GAT CCC CAG TGC CCC CAG CCC TTG GAG GGG GCC526527 TGG CCG GTG ACT CTG GGA GAT GCT CAG GCC CTG AAG CCC CTC AAG TTC574575 TCC AGC AAC CAG CCC CCT GCA GCC GGA AGT TCA AGG CAA GAT GCC AAG622623 GAT CCC ACG TCC TTG CTG GGC GTC CTC CAG GCC GAG GCC GAC AGC ACA670671 AGT GAG GGG CTG GAG GAC GCT GTC CAC AGC CGT GGT GCC AGA CCC CCT718719 GCA GCA GGC CCA GGT GGG GAT GAG GAC GAG GAC GAG GAG GAC ACG GCC766767 CCA GAG TCC GCA CTG GAC ACA TCC CTG GAC AAG TCC TTC TCC GAG GAT814815 GCG GTT GAC CGA CTC CTC GGG GTC GGG CAC ACT CCC CAG GGC CGG GGG862863 CCG GGC CTC AAA GGG GAC CGG GAA GCG AAG GAA GAA GCG TCC CTC CAG910911 GAG CCA GGA AGA GGT TCC CCC TGA TTC TGA TGA TAA TAA AAC AAA GAA958959 ACT GTG TGT GAT CCA GTA AGG CCT CAG GCC CAG GCC CAA GGC CAA GTG 10061007 AGA GAG CCC AGG CCA GAG GAC ATG CTG CCA TTC TGC CAA GAG AGG CTC 10541055 TTC TGG GGG CCA GGC TGG GAC TGG GCC CCG GAA ACC AAA ACT CCG TGC 11021103 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CTGTATTCTC301 CTCTTGAAGC ATGTGCTCTG GCTCTTTCCC TCTATTATTT GTCTTCTGTG TAAATTATCT361 TCACTTGTCC TAGAAACCTC CTCATACACA CTGATATTTA ATAAAGATAG CCCTCTTTTG421 TGAATTTGCT TGAAAATGGA AGCATTAGAA GTAGGTAAAG TTATGAGCCA AGGAAATAAG481 TTATTCATTG AACAAATATT GAGCTGTAAT ATAATATTAT ATCATATTAT GTAACAAAAT541 ATTGAGTACC TATTATGTGG TGGACTGTGT TATCTGATTG GGGCTGTTAC AATGATCAAG601 AAAGACTATG TTCCTCCCTC ATTGAGCTTA TATCCCATTG CAATCAATAT GCAAAAATAA661 GTAGGTTGAC AGCCTGCCTT CAGAGTGCTT TTATAAACAT CTTACTTGAT CTGAACAGCA721 ATCCTGAAGT ACTTGAGAAA ACAGAAGTTC AGCTGGTCTC GAACTCCTGG CCTCTAGTGA781 TCTGCTTGCC TCAGGCTCCC ATAGTGCTGG GACTACAGGT GTGAGCCACC ACGCCCGGCC841 TGGCTTCATT GATTTTTCCA ATTGTAGTAA TAATCATGCT CATTGCTTAT AATTCAACCA901 GTACTAGAAA GTTCAAACAA CCCTCATAGT AATATAGATT TGTAAATTCC AAAATTCGTA961 TTTTATTATG TCTTTCTTTG CCACCTTCTC TTTTCTCCAC TTGGTATATC AAGAACATCA1021 TTTTTAAAGG CTAAATAGAC ACTGTATGGC TATTCCATAG CTGAATCAAC CAAACCTCTG1081 TTGAGAGGCT CTTAAAATGT TTCTTCTTGT ATAAAAAACA ACATTGTTAA ACTTTATTCT1141 CCATTTATCT TTTTATAATT ATTTCACTCT TAATTCCTTA GAAATAGAAT TCCTTAGTCA1201 AATTATCAGG TTTATTCAGT AGTCATGGTT TGTGCAAAAC CTGGTCTTCT GGGAGGGATA1261 AGTAAGAAAA ATGGACCATT TTTCTAATGA AGCTTAAGAG TTTATTTGGG GAAATAACAT1321 TCACTTTTGG AATTTCAAAA GAAAAGTTAA AAATTCTTGA CGATTTAACT TTGTTACCTT1381 TGTTAGTAAA ACAATATAAA ATGCTGTGGA GCTATAAGTT ACCAGGATCA GGTATAGTTA1441 TTTGGTCCAC ATTTCATGCA GTAATGGATT CAGAATGGAG AAGACAAAAT GCAGAACTGA1501 ACTTAATTAC AAATAAGCAT TTTTTAAAAA ATCTACAATC TAAGCATTTA GATGTAAAAA1561 TATTAAAAAC CAAGAATAAG CTTGTGGAAG GAATTTAATT ATGAAGTAAA CTACTTGTCT1621 TTTTTTGAGA TGGAGTTTCG CTCTTGTTGC CCAGGCTGGA GTGCAATGGT GTGATCTTGG1681 CTCACCGCAA CCTCTGCCCC CCAGGTTCAA GCTATTCTGC CTCGGCCTCC CGAGTAGTTG1741 GGATTGCAGG CATGCACCAC CACGCCCGGC TAATTTTGTA TTTTTTTAGT AGAGAGGAGG1801 TTTCTCCATG TTGGTCAGGC TGTTCTCAAA CTCCCAACCT CAGGTGATCT GCCCGCCTCG1861 GCCTCACAAA GTGCTGGAAT TATAGGCGTG AGCAACTGCA CCCAGCAACT ACTTGTTAAA1921 TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AB核苷酸序列 (SEQ ID NO29) 长度1031 MKLKSLFGEI TFTFGISKEK LKILDDLTLL PLLVKQYKML WSYKLPGSGI VIWSTFHAVM61 DSEWRRQNAE LNLITNKHFL KNLQSKHLDV KILKTKNKLV EGIC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO30)克隆号PP12708起始编码子1287 ATG 终止编码子1596 TAA 蛋白质分子量12014.721 GT TTC TTC TGG TCA ATC CAT CTA GTG TTA ATG GTT CTG AAA CAT GGA 4748 TTT TAT TGT GTC GTA TTT CTG CCT GAG TAG TCA AGC ATT CTT CTT TGC 9596 CTA CAG AAT AAA TTC TGC ATT TTT TTT GAC TCA TTT TCA GAC TCT TTC143144 ACC ATC TAG TCA GAG GCT GTA AAC TAG TGG CCT GTG GGC CAG TAT AAT191192 CCT ACA TCC CCT TTT CCC CCC ATC ATT TTC CTT TAT CTT CTA GTA GAA 239240 ATC TTC TCG TTC CAG TTA AGT TGT TCC TCT TTA TTT TCC CGA TAG GAA 287288 ATA CTG TAT TCT CCT CTT GAA GCA TGT GCT CTG GCT CTT TCC CTC TAT 335336 TAT TTG TCT TCT GTG TAA ATT ATC TTC ACT TGT CCT AGA AAC CTC CTC 383384 ATA CAC ACT GAT ATT TAA TAA AGA TAG CCC TCT TTT GTG AAT TTG CTT 431432 GAA AAT GGA AGC ATT AGA AGT AGG TAA AGT TAT GAG CCA AGG AAA TAA 479480 GTT ATT CAT TGA ACA AAT ATT GAG CTG TAA TAT AAT ATT ATA TCA TAT 527528 TAT GTA ACA AAA TAT TGA GTA CCT ATT ATG TGG TGG ACT GTG TTA TCT 575576 GAT TGG GGC TGT TAC AAT GAT CAA GAA AGA CTA TGT TCC TCC CTC ATT 623624 GAG CTT ATA TCC CAT TGC AAT CAA TAT GCA AAA ATA AGT AGG TTG ACA 671672 GCC TGC CTT CAG AGT GCT TTT ATA AAC ATC TTA CTT GAT CTG AAC AGC 719720 AAT CCT GAA GTA CTT GAG AAA ACA GAA GTT CAG CTG GTC TCG AAC TCC 767768 TGG CCT CTA GTG ATC TGC TTG CCT CAG GCT CCC ATA GTG CTG GGA CTA 815816 CAG GTG TGA GCC ACC ACG CCC GGC CTG GCT TCA TTG ATT TTT CCA ATT 863864 GTA GTA ATA ATC ATG CTC ATT GCT TAT AAT TCA ACC AGT ACT AGA AAG 911912 TTC AAA CAA CCC TCA TAG TAA TAT AGA TTT GTA AAT TCC AAA ATT CGT 959960 ATT TTA TTA TGT CTT TCT TTG CCA CCT TCT CTT TTC TCC ACT TGG TAT10071008 ATC AAG AAC ATC ATT TTT AAA GGC TAA ATA GAC ACT GTA TGG CTA TTC10551056 CAT AGC TGA ATC AAC CAA ACC TCT GTT GAG AGG CTC TTA AAA TGT TTC11031104 TTC TTG TAT AAA AAA CAA CAT TGT TAA ACT TTA TTC TCC ATT TAT CTT11511152 TTT ATA ATT ATT TCA CTC TTA ATT CCT TAG AAA TAG AAT TCC TTA GTC11991200 AAA TTA TCA GGT TTA TTC AGT AGT CAT GGT TTG TGC AAA ACC TGG TCT12471248 TCT GGG AGG GAT AAG TAA GAA AAA TGG ACC ATT TTT CTA ATG AAG CTT12951 Met Lys Leu 31296 AAG AGT TTA TTT GGG GAA ATA ACA TTC ACT TTT GGA ATT TCA AAA GAA13434 Lys Ser Leu Phe Gly Glu Ile Thr Phe Thr Phe Gly Ile Ser Lys Glu 191344 AAG TTA AAA ATT CTT GAC GAT TTA ACT TTG TTA CCT TTG TTA GTA AAA139120 Lys Leu Lys Ile Leu Asp Asp Leu Thr Leu Leu Pro Leu Leu Val Lys 351392 CAA TAT AAA ATG CTG TGG AGC TAT AAG TTA CCA GGA TCA GGT ATA GTT143936 Gln Tyr Lys Met Leu Trp Ser Tyr Lys Leu Pro Gly Ser Gly Ile yal 511440 ATT TGG TCC ACA TTT CAT GCA GTA ATG GAT TCA GAA TGG AGA AGA CAA148752 Ile Trp Ser Thr Phe His Ala Val Met Asp Ser Glu Trp Arg Arg Gln 671488 AAT GCA GAA CTG AAC TTA ATT ACA AAT AAG CAT TTT TTA AAA AAT CTA153568 Asn Ala Glu Leu Asn Leu Ile Thr Asn Lys His Phe Leu Lys Asn Leu 831536 CAA TCT AAG CAT TTA GAT GTA AAA ATA TTA AAA ACC AAG AAT AAG CTT158384 Gln Ser Lys His Leu Asp Val Lys Ile Leu Lys Thr Lys Asn Lys Leu 991584 GTG GAA GGA ATT TAA TTA TGA AGT AAA CTA CTT GTC TTT TTT TGA GAT1631100 Val Glu Gly Ile *** 1041632 GGA GTT TCG CTC TTG TTG CCC AGG CTG GAG TGC AAT GGT GTG ATC TTG16791680 GCT CAC CGC AAC CTC TGC CCC CCA GGT TCA AGC TAT TCT GCC TCG GCC17271728 TCC CGA GTA GTT GGG ATT GCA GGC ATG CAC CAC CAC GCC CGG CTA ATT17751776 TTG TAT TTT TTT AGT AGA GAC GAG GTT TCT CCA TGT TGG TCA GGC TGT18231824 TCT CAA ACT CCC AAC CTC AGG TGA TCT GCC CGC CTC GGC CTC ACA AAG18711872 TGC TGG AAT TAT AGG CGT GAG CAA CTG CAC CCA GCA ACT ACT TGT TAA19191920 ATT AAA AAA AAA AAA AAA AAA A 194权利要求
1.一种分离的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白，其特征在于，它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29；或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2、5、8、11、14、17、20、23、26、29。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组SEQ ID NO3、6、9、12、15、18、21、24、27、30的编码区序列或全长序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10.一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-800个核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有促进3T3细胞转化功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
文档编号C07K14/435GK1369505SQ0110532
公开日2002年9月18日 申请日期2001年2月13日 优先权日2001年2月13日
发明者顾健人 申请人:上海市肿瘤研究所