专利名称：苦参凝集素和其抗虫、抗病编码基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。
植物凝集素是一类结合特异糖类的蛋白质，部分具有杀虫作用。近年来在抗虫植物基因工程研究领域，有关凝集素的研究逐渐引起了科学家们的重视。凝集素早期的定义“lectin”来源于拉丁文“legere”，意思是选择，以强调其能选择性地与糖复合物相结合的特性。后来由于lectin被广泛应用于表现出更广泛凝集行为的所有蛋白质，故“lectin”已失去早期选择的意思，而另外一个名字“agglutinin”作为lectin的同义词，能更准确地反映这类蛋白质的特性，因为它是指能通过与细胞表面结合碳水化合物的特异性结合而使细胞凝集的所有蛋白质。由于植物凝集素家族成员的增加，对其结构、功能研究的深入以及分子生物学水平上新的发现，使得植物凝集素的定义几经修正。Peumans和Van Damme(Plant Physiology,109:347-352,1995)认为凝集素的定义应为含有至少一个非催化结构域并能可逆结合到特异单糖或寡糖上的蛋白质总称。
植物凝集素由于其独特的生化性质而广泛用作科研工具，在生物学和医学研究中，用于分离和鉴定糖蛋白和糖脂，研究细胞和组织化学、细胞分型、分离淋巴细胞和骨髓细胞，评估疾病患者的免疫状态以及染色体分型等。近年来对凝集素在植物中的抗病、抗虫及抗逆作用，及其结构与生物学功能方面的研究也有许多报道。关于植物凝集素的杀虫机理，目前一般认为外源凝集素进入昆虫消化道后，与肠道围食膜细胞表面的糖蛋白结合，降低膜的通透性，从而影响营养物质的正常吸收。次外，这种结合还可能在昆虫的消化道内诱发病灶，引起消化道内细菌和病毒的繁殖等，从而对昆虫本身造成危害(Eisemann C.H.,et al.EntomologiaExperimental et Applicata.72:1-10,1994)。对于植物凝集素的抗病作用，则认为是由于凝集素与病源微生物表面结合从而阻碍其繁殖或杀死病源微生物。
目前国际上主要有PSA、WGA、GNA、PTA等几种植物凝集素用于杀虫基因工程育种，而其显著功效也只限于杀虫作用，未表现出良好的抗病能力。能用于抗病，特别是抗真菌病害基因工程育种的凝集素及其编码基因甚少报道。植物病害一直是造成作物产量损失的主要原因之一，特别是真菌病害，占病害的80％左右。虽然传统的常规育种也选育出了大量抗病品种，但是选育历程较长，病源小种的分化速度又往往超过品种更新换代的速度，通常情况下育种家花费十几年努力育成的一个新的抗性品种，几年内就可能被一个新的病原菌征服，这无论在时间上和精力上都是极大的浪费，更兼之所借助的化学杀菌剂不仅成本高，而且构成对环境的极大威胁。因此，自植物基因工程问世以来，它在植物抗病育种中的应用前景就受到了广泛的关注，建立在现代分子生物学技术基础上的基因工程方法，突破了物种间难以杂交的生殖隔离屏障，为培育抗病植株提供了新的可能，而其中的关键在于抗性基因的获得，但目前植物抗病基因的缺乏极大地制约了基因工程的发展，因此，基因工程的发展关键落到了功能明确的基因分离克隆上，而获得功能明确的基因的一个极佳方法便是基于功能蛋白的氨基酸序列。在作物的病害中苦萎病被比喻为棉花的肿瘤，其流行时，棉花将大量减产，稻瘟病则是水稻三大病害之一，全国主要产区都有发生，对水稻的危害极大，流行严重时将颗粒无收；而赤霉病对小麦也是传播广、严重影响产量的病害。
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种从天然中药植物苦参中分离纯化的苦参凝集素蛋白，它不仅表现出对蚜虫的毒杀作用，且表现出对以上三种病菌的显著抑制作用，因此，苦参凝集素蛋白的分离纯化及其编码基因的分离克隆为现代基因工程育种提供了功能明确的功能基因。
本发明的目的通过以下技术方案达到一种从植物苦参根茎中分离的苦参凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:13，并具有杀虫，抗病作用的凝集素蛋白。
上述的凝集素蛋白基因是具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列(a)具有SEQ ID No:13氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:13的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。
上述凝集素蛋白基因，具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因(a)具有SEQ ID No:1氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:1的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。上述凝集素蛋白基因具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:3的凝集素蛋白前导肽的核苷酸序列。
上述凝集素蛋白基因具有编码下述多肽(a)或(b)的苦参凝集素蛋白前导肽核苷酸序列(a)具有SEQ ID No:3氨基酸序列的多肽；(b)有在SEQ ID No:3的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并具有信号肽作用的多肽。
上述凝集素蛋白基因具有SEQ ID No:2、4、7核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因。上述凝集素蛋白基因具有SEQ ID No:9、10、11、12核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因扩增引物。
上述凝集素蛋白基因具有苦参凝集素蛋白基因部分核苷酸序列的基因片断。
上述的基因片断的核苷酸数目在从15到50的范围内。
本发明采用的基因工程技术可根据一般方法完成，例如，在“分子克隆实验指南第二版”(1989)，冷泉港实验室出版社，ISBN 0-87969-6；“当前分子生物学方法”(1987),John Wileyand Sons,Inc.ISBN 0-471-50338-X；和“当前蛋白科学方法”(1995),John Wiley and Sons,Inc.ISBN 0-471-11184-8中所述；凝集素凝血实验方法依照Van Damme et al.,Plant Mol.BioL.29,579-598(1995)中所述进行。
这里的苦参凝集素是指从中药苦参中分离的具有一级结构为SEQ ID No:1氨基酸序列的蛋白质，其分子量为32kD，对兔血及四种血型血都有凝集作用，其凝血活性可被甘露糖和果糖抑制，麦芽糖和葡萄糖有弱抑制作用，其分子含有2.89％的中性糖；对棉花枯萎病、小麦赤霉病和水稻稻瘟病菌丝体的生长有明显的抑制作用；苦参凝集素基因指具有编码苦参凝集素及其前导肽的全长cDNA核苷酸序列SEQ ID No:2，其中SEQ ID No:3为苦参凝集素前导肽氨基酸序列，SEQID No:4为编码前导肽氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID No:5为全长cDNA中3’非编码区，SEQ ID No:6为全长cDNA中5’非编码区，SEQ ID No:7为编码苦参凝集素蛋白基因的cDNA 3’核苷酸序列。
苦参为豆科槐属植物，其根作药用。其有抑制结核杆菌及皮肤真菌和灭蛆作用。根据本发明的一个优选实施方案，取苦参块根剪碎，生理盐水浸泡，48小时后用高速组织捣碎机捣碎，再经离心收集上清液，向上清中加入固体硫酸氨达70％-90％饱和度，调节pH至6.0-6.5，离心收集沉淀，按以上文献记载方法沉淀用PB(磷酸盐缓冲液)液溶解透析；透析液用DEAE-Sepharose纯化，收集具有凝血活性的部分制成丙酮粉；丙酮粉用适量PB液溶解，经Sephadex G-150分子筛层析，收集具有凝血活性的部分制成丙酮粉；丙酮粉用适量PB液溶解，上HPLC后可得到能用于测序的苦参凝集素蛋白；经美国CyberSn公司测序后得到苦参凝集素蛋白一级结构前30个氨基酸序列SEQ ID No:8。
根据本发明的优先实施方案二，在液氮中冷冻苦参块根，并用臼或其他物理方法研磨成细粉状组织碎片。通过一般方法从组织碎片中提取总RNA。在提取中可利用商业上可得到RNA提取试剂盒。通过乙醇沉淀从RNA提取物中分离总RNA。
具有编码具有SEQ ID No:1氨基酸序列蛋白核苷酸序列的苦参凝集素基因SEQ ID No:7的cDNA可用上面的总RNA以下面的方法获得。
以总RNA为模板，通过一般方法从总RNA逆转录得到第一条cDNA链。逆转录中可利用商业上获得第一条cDNA链的逆转录试剂盒，如GIBCO BRL公司的cDNA合成试剂盒。
根据SEQID No:8氨基酸序列，用一般的简并引物设计方法设计两条5’端引物1、2(SEQID No:9 SEQ ID No:10)。利用一般方法中常用的Oligo(dT)引物作为3’端引物，用以上文献所述的PCR方法，以以上cDNA作模板，进行PCR扩增；把扩增片段克隆到克隆载体中如pGEM-T、pUC18等中；经SyBerSn公司测序即可得到苦参凝集素基因SEQ ID No:7的cDNA序列。
具有编码具有SEQ ID No:3氨基酸序列蛋白核苷酸序列的苦参凝集素前导肽核苷酸序列SEQ ID No:4的可用上面的逆转录cDNA以下面的方法获得。
按一般方纯化逆转录得到的cDNA第一链。纯化中可利用商业上获得的纯化第一链cDNA的PCR产物纯化试剂盒，如Boehringer Mannheim公司的PCR产物纯化试剂盒。纯化后的cDNA可按一般方法在其5’末端加上多聚尾。加尾中可利用商业上提供的能给寡聚核苷酸5’加尾的试剂盒，如TaKaRa公司的末端转移酶试剂盒。
依据已获得的苦参凝集素基因cDNA 3’端核苷酸序列SEQ ID No:7，遵照引物设计的一般规则，设计合成特意性3’端引物3、4(SEQ ID No:11,12)。并遵照5'-RACE的基本方法合成5’端引物Oligo(dT)17，以上面纯化并加尾的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物按以上提到的方法克隆测序，就可获得具有编码具有SEQ ID No:3氨基酸序列蛋白核苷酸序列的苦参凝集素前导肽核苷酸序列SEQ ID No:4。
根据以上两个序列(SEQ ID No:7、SEQ ID No:4)及苦参凝集素蛋白已测序的氨基酸序列(SEQ ID No:8)，就可推导出苦参凝集素蛋白的一级结构为SEQ ID No:1氨基酸序列，编码苦参凝集素及其前导肽的全长cDNA核苷酸序列SEQ ID No:2，苦参凝集素前导肽氨基酸序列SEQ ID No:3，苦参凝集素蛋白氨基酸全序列SEQ ID No:12。
实施例一苦参凝集素蛋白的获得取苦参块根50克剪碎，在4度1L生理盐水浸泡，48小时后用高速组织捣碎机捣碎，继续浸提24小时(间隙搅拌)，纱布过滤，滤液经3000r/min离心15分钟，收集上清液，向上清中加入固体硫酸氨达80％饱和度，氨水调节pH至6.3，放置过夜经4000r/min,4度离心30分钟，收集沉淀，沉淀用pH8.0,0.01mol/L PB(磷酸盐缓冲液)液溶解透析。
取DEAE-Sepharose(fast flow)经处理后装柱(2.6cm×40cm)，用PB液平衡，将上述凝集素粗品备用液上柱，用相同缓冲液洗柱，分步收集，流速为30ml/h、6ml/管，当流出液在280nm吸收值＜0.02时，改用pH5.0、0.01mol/L(内含0.5mol/L NaCl)的PB液进行线性离子梯度洗脱，分步收集同前。经280nm紫外和凝血检测，收集3个具有强凝集活性的蛋白峰，制成丙酮粉。
取经处理的Sephadex G-150装柱(1.6cm×100cm)，用PB液平衡，将上述丙酮粉PB液溶解，经离心后的上清液进行Sephadex G-150分子筛层析，PB液洗脱，分步收集，流速15mL/h、3mL/管，经紫外和凝血活性检测，收集凝集活性最强的峰，制成丙酮粉。
将分子筛层析的凝集素蛋白再经LKB2150快速蛋白液相色谱仪(HPLC)进行纯化，条件为柱2135-330TSKG 3000S W，流动相为pH6.8的0.05mol/L PB液，内含0.3mol/L NaCl,流速0.6mL/min，检测波长206nm，检测仪为0.08AUFS，纸速2mm/min，灵敏度0.2×50mV，柱压1.5mPa，收集凝血活性峰，透析出盐，冷冻干燥，送SyBerSn公司测序，得到苦参凝集素蛋白N末端30个氨基酸序列。
实施例二苦参凝集素蛋白对真菌的抑制作用实验用具均经灭菌处理，并在超净台上进行实验。将棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌和水稻稻瘟病菌菌种经传代培养后，冰箱放置备用。取苦参凝集素用灭菌生理盐水配制0μg/mL、31μg/mL、62μg/mL、93μg/mL和124μg/mL不同浓度的样品液，冰箱放置备用。
取灭菌的马铃薯培养基或麦芽糖培养基分装于培养皿中，经28度培养箱中培养48小时，选无菌培养皿三套，用打孔法均匀地在培养基上打5个孔，依次在1-5孔中加入1mL不同浓度的样品液，使每孔中苦参凝集素的加入量为0μg、31μg、62μg、93μg和124μg，分别在3套培养皿的中间位置接种棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌(在马铃薯培养基上)和水稻稻瘟病菌菌种(在麦芽糖培养基上)。在28度培养4天后取出棉花枯萎病菌培养皿，7天后取出小麦赤霉病菌和水稻稻瘟病菌培养皿，进行观察，测量抑菌圈大小，结果如下表。Table 1 Growth inhibition of lectin of S.flevascens with different concentrations on F.vasinfectum,G.saubinetii and P.oryzae.
SFL 0μgSFL 31μgSFL 62μg SFL 93μgSFL 124μgInhibition d(mm) Inhibition d(mm) Inhibition d(mm) Inhibition d(mm) Inhibition d(mm)F.vasinfectumNoUnclear 5-7 1013G.saubinetii No 4-510 1112-14P.oryzae NoUnclear 5-6 7 9实施例三苦参凝集素基因cDNA全序列的获得1.1苦参凝集素基因cDNA 3’端核苷酸序列的获得A引物设计根据实施例一获得的苦参凝集素蛋白测序结果的氨基酸序列SEQ ID No:8，以简并引物设计的一般方法，设计合成5’端简并引物(TaKaRa公司合成)1、2(SEQ ID No:9 SEQ IDNo:10),3’末端依mRNA特有的poly A，以Oligo(dT)为引物。
BcDNA第一链的制备将约1g的苦参块根冻于液氮中且然后以臼研磨，向其中加入10mL抽提缓冲液(4M异硫氰酸胍，1％SDS,1mM巯基乙醇)，研磨彻底后，将研磨的材料转入离心管中，向其中加入4mL氯仿，4mL苯酚，并将混合物在旋涡混合器搅拌且然后于4度以6500转离心10分钟。收集水层，向其中加入10mL异丙醇，并搅拌混合物且然后于4度以6500转离心10分钟。将得到的沉淀物以10mL70％的乙醇洗且然后容于0.5mL缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5,1mM EDTA,0.1％SDS)中。将溶液置于60度10分钟且然后以10000转。离心1分钟以去处不溶物质。向得到的上清液中加入等体积的Oligo text-dT30(TaKaRa)，并且搅拌混合物且然后置于65度5分钟。将混合物置于冰上且然后放置3分钟，向其中加入0.2mL5M的NaCl，并将混合物置于37度10分钟。将混合物热闹后以10000转离心3分钟。收集沉淀物且然后悬于1mL TE缓冲液，并将悬液置于65度5分钟，然后再置于冰上3分钟，接着于4度以10000转离心3分钟以去处沉淀物。
向得到的上清液中加入0.1mL3M的醋酸钠和2mL的乙醇，RNA以乙醇沉淀并收集。将收集的RNA以70％的乙醇洗2次且然后溶于0.02mL灭菌水中，用于cDNA第一链的合成。
对于cDNA第一链的合成，使用用于RT-PCR的第一链合成试剂盒(GIBICO BRL公司)。并且所有操作根据说明书。
C苦参凝集素基因cDNA 3’端核苷酸序列的获得以上述cDNA第一链为模板，用引物1及Oligo(dT)引物进行第一次PCR扩增，扩增产物再用引物2与Oligo(dT)引物配对进行第二次PCR扩增。
二次PCR扩增产物在1％琼脂糖胶上电泳，回收目的片段。方法依据华顺公司胶回收试剂盒操作手册。回收纯化后的目的片段克隆到克隆载体pGEM-T中。方法按照Promega公司提供的pGEM-T试剂盒操作手册。重组载体经PCR及酶切鉴定正确后，由SyBerSn公司测序而得到苦参凝集素基因cDNA 3’端核苷酸序列SEQ ID No:7。1．2苦参凝集素基因cDNA 5’端核苷酸序列的获得以上述方法获得的cDNA第一链，用Boehringer Mannheim公司的PCR产物纯化试剂盒进行cDNA的纯化，操作步骤按试剂盒内提供的方法。从而获得纯化的cDNA第一链，纯化的cDNA第一链用于以下的进一步的加尾实验。
取以上纯化的cDNA第一链19μl加到PCR管中，再加入2.5μl缓冲液(Roche公司)、2.5μl2mM的dGTP，混匀，在94度保温3分钟，立即置于冰上，加1μl末端转移酶(Roche公司生产，10U/μl)混匀，37度保温20分钟，最后在70度保温10分钟。这一加完尾的样品用于以下的PCR扩增。
依据上述已获得的苦参凝集素基因cDNA 3’端核苷酸序列SEQ ID No:7，遵照引物设计的一般规则，设计合成两条特意性3’端引物3、4(SEQ ID No:11,12)。TaKaRa公司合成。
以上述加尾样品为模板，用3、4引物及0ligo(dG)进行如1.1中描述的PCR扩增，并进行同样的克隆测序，从而获得苦参凝集素基因cDNA 5’端核苷酸序列。
而苦参凝集素基因全长cDNA核苷酸序列则是按生物学的常识推导得到。
序列表1一般信息A申请人A名称云南省农科院生物技术研究所B地址昆明市较场东路农科院生物技术研究所C国家中国D邮编650223B发明名称苦参凝集素和其抗虫、抗病编码基因及其应用C序列数132 SEQ ID No:1的信息A序列特征A长度254个氨基酸B类型氨基酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型蛋白质F其他信息苦参凝集素抗菌蛋白G序列描述SEQ ID No:1A D S L S F T F S D F D P NGEDLLFQGDAHVTSNNILQLTKTSNGVPLQNTVGRALFSTPIHLWEKSTNRLSSFESTFTFVLTSPQSNPADGFAFFIAPPDTTIPEGSDGGLLGLFSPENALNPKANQVVAVEFDTFYDKSSNSWDPNYVHIGIDVNQIKSSATVRWDRKEGVIGTARINYNAATRNLSVVSSYPGGSQDYVVSYVVDLRTKLPEFVRVGFSASTGQQYQVHSIRSWFFSSSLHYTVAKQEDMYIARVV3 SEQ ID No:2的信息A序列特征A长度1072碱基对B类型核苷酸C链型双链D拓扑结构线性
E分子类型DNAF其他信息苦参凝集素抗菌蛋白基因序列G序列描述SEQ ID No:25′GATCCAAACCAAAACCCAAAGTCATAGTTGCATGCTAATTTCAACATCATG GCC ATC TTC CAG AAA CAC CTC TCC CTT CCT TTT CTC GTC TTT GCA ATT GCA ACC ATC GTC CTC ATGTCA CTT AGA GGA GTG AAC TCA GCA GAT TCA CTC TCC TTC ACC TTC AGT GAC TTC GAC CCA AAT GGA GAGGAT CTG TTA TTC CAG GGT GAT GCA CAC GTT ACA TCA AAC AAT ATC CAT CAG CTT ACC AAG ACT AGT AACGGT GTA CCA CTG CAA AAC ACC GTT GGC CGA GCC TTA TTC TCT ACG CCG ATA CAC CTT TGG GAG AAA AGCACA AAC AGA CTC TCA AGC TTT GAA AGC ACC TTC ACC TTT GTC CTC ACA TCA CCC CAA TCC AAC CCA GCCGAT GGC TTC GCA TTC TTC ATT GCA CCA CCT GAC ACT ACC ATA CCT GAA GGT TCC GAC GGA GGA TTA TTAGGA CTC TTC AGC CCA GAG AAT GCA CTT AAC CCC AAA GCA AAC CAA GTT GTT GCT GTT GAA TTC GAC ACTTTC TAT GAT AAA AGC TCT AAC AGT TGG GAT CCA AAT TAT GTG CAC ATT GGA ATC GAT GTG AAC CAA ATTAAG TCT TCG GCA ACC GTG AGA TGG GAT AGG AAA GAA GGG GTA ATA GGC ACT GCC CGC ATA AAC TAT AACGCT GCC ACT CGA AAT CTA AGT GTC GTT TCT TCT TAC CCT GGT GGT AGT CAA GAT TAT GTT GTC TCT TATGTG GTT GAC TTG AGA ACC AAG CTT CCG GAA TTT GTC AGA GTT GGA TTC TCA GCT TCG ACA GGG CAA CAATAT CAA GTG CAT AGC ATT CGC TCT TGG TTT TTC AGC TCA AGC TTG CAC TAC ACC GTG GCA AAG CAG GAGGAC ATG TAT ATT GCA CGT GTT GTG TGAGTGGAGTGCCTAAGTTGTATCGTGTCGTGTATGATATATGCCAATAAGGATGTGTAACTGTGTAAGGTTCGAAACCATGTTTTACGTACGTTCCAGTTTGAGTTATCCATGGTGTAGAGCCATCTGTGTAATAGAACTTTATCTATCTATCCAATAATTAATCGTTTAT 3′4 SEQ ID No:3的信息A序列特征A长度30个氨基酸B类型氨基酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型多肽F其他信息苦参凝集素抗菌蛋白前导肽G序列描述SEQ ID No:3M A I F Q K H L S L P F L V F A I A T I V L MS L R G V N S5 SEQ ID No:4的信息A序列特征A长度90碱基对B类型核苷酸C链型双链D拓扑结构线性E分子类型DNA
F其他信息苦参凝集素抗菌蛋白前导肽核苷酸序列G序列描述SEQ ID No:4ATG GCC ATC TTC CAG AAA CAC CTC TCC CTT CCT TTT CTC GTC TTT GCA ATT GCA ACC ATC GTCCTC ATG TCA CTT AGA GGA GTG AAC TCA6 SEQ ID No:5的信息A序列特征A长度169碱基对B类型核苷酸C链型双链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息苦参凝集素抗菌蛋白基因3’非编码区G序列描述SEQ ID No:55’ GTGGAGTGCCTAAGTTGTATCGTGTCGTGTATGATATATGCCAATAAGGATGTGTAACTGTGTAAGGTTCGAAACCATGTTTTACGTACGTTCCAGTTTGAGTTATCCATGGTGTAGAGCCATCTGTGTAATAGAACTTTATCTATCTATCCAATAATTAATCGTTTAT 3′7 SEQ ID No:6的信息A序列特征A长度169碱基对B类型核苷酸C链型双链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息苦参凝集素抗菌蛋白基因5’非编码区G序列描述SEQ ID No:65’ GATCCAAACCAAAACCCAAAGTCATAGTTGCATGCTAATTTCAACATC 3’8 SEQ ID No:7的信息A序列特征A长度934碱基对B类型核苷酸C链型双链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息苦参凝集素抗菌蛋白基因3’编码区
G序列描述SEQ ID No:75’GCA GAT TCA CTC TCC TTC ACC TTC AGT GAC TTC GAC CCA AAT GGA GAGGAT CTG TTA TTC CAG GGT GAT GCA CAC GTT ACA TCA AAC AAT ATC CAT CAG CTT ACC AAG ACT AGT AACGGT GTA CCA CTG CAA AAC ACC GTT GGC CGA GCC TTA TTC TCT ACG CCG ATA CAC CTT TGG GAG AAA AGCACA AAC AGA CTC TCA AGC TTT GAA AGC ACC TTC ACC TTT GTC CTC ACA TCA CCC CAA TCC AAC CCA GCCGAT GGC TTC GCA TTC TTC ATT GCA CCA CCT GAC ACT ACC ATA CCT GAA GGT TCC GAC GGA GGA TTA TTAGGA CTC TTC AGC CCA GAG AAT GCA CTT AAC CCC AAA GCA AAC CAA GTT GTT GCT GTT GAA TTC GAC ACTTTC TAT GAT AAA AGC TCT AAC AGT TGG GAT CCA AAT TAT GTG CAC ATT GGA ATC GAT GTG AAC CAA ATTAAG TCT TCG GCA ACC GTG AGA TGG GAT AGG AAA GAA GGG GTA ATA GGC ACT GCC CGC ATA AAC TAT AACGCT GCC ACT CGA AAT CTA AGT GTC GTT TCT TCT TAC CCT GGT GGT AGT CAA GAT TAT GTT GTC TCT TATGTG GTT GAC TTG AGA ACC AAG CTT CCG GAA TTT GTC AGA GTT GGA TTC TCA GCT TCG ACA GGG CAA CAATAT CAA GTG CAT AGC ATT CGC TCT TGG TTT TTC AGC TCA AGC TTG CAC TAC ACC GTG GCA AAG CAG GAGGAC ATG TAT ATT GCA CGT GTT GTG TGAGTGGAGTGCCTAAGTTGTATCGTGTCGTGTATGATATATGCCAATAAGGATGTGTAACTGTGTAAGGTTCGAAACCATGTTTTACGTACGTTCCAGTTTGAGTTATCCATGGTGTAGAGCCATCTGTGTAATAGAACTTTATCTATCTATCCAATAATTAATCGTTTAT 3’9 SEQ ID No:8的信息A序列特征A长度30个氨基酸B类型氨基酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型多肽F其他信息苦参凝集素抗菌蛋白测序片断G序列描述SEQ ID No:8ADSLSFTFSDFDPNGEDLLF10 SEQ ID No:9的信息A序列特征A长度26碱基B类型核苷酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息寡聚核苷酸引物G序列描述SEQIDNo:95′ GA(AG)GA(CT)(CT)T(ACGT)(CT)T(ACGT)TT(CT)CA (AG)GG(ACGT)GA(CT)GC 3′11 SEQ ID No:10的信息A序列特征A长度26碱基B类型核苷酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息寡聚核苷酸引物G序列描述SEQIDNo:105′AC(ACGT)TT(CT)(AT)(CG)(ACGT)GA(CT)TT(CT)GA(CT)CC(ACGT)AA(CT)GG 3′12 SEQ ID No:11的信息A序列特征A长度24碱基B类型核苷酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息寡聚核苷酸引物G序列描述SEQ ID No:115′TTACTAGTCTTGGTAAGCTGTAGG 3′13 SEQ ID No:12的信息A序列特征A长度25碱基B类型核苷酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型DNAF其他信息寡聚核苷酸引物G序列描述SEQ ID No:125′AGAGAATAAGGCTCGGCCAACGGTG 3′14 SEQ ID No:13的信息A序列特征
A长度284个氨基酸B类型氨基酸C链型单链D拓扑结构线性E分子类型蛋白质F其他信息苦参凝集素抗菌蛋白初生肽G序列描述SEQ ID No:13MAIFQKHLSLPFLVFAIATIVLMSLRGVNSADSLSFTFSDFDPNGEDLLFQGDAHVTSNNILQLTKTSNGVPLQNTVGRALFSTPIHLWEKSTNRLSSFESTFTFVLTSPQSNPADGFAFFIAPPDTTIPEGSDGGLLGLFSPENALNPKANQVVAVEFDTFYDKSSNSWDPNYVHIGIDVNQIKSSATVRWDRKEGVIGTARINYNAATRNLSVVSSYPGGSQDYVVSYVVDLRTKLPEFVRVGFSASTGQQYQVHSIRSWFFSSSLHYTVAKQED M Y I ARVV
权利要求
1．一种从植物苦参根茎中分离的苦参凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:13，并具有杀虫，抗病作用的凝集素蛋白。
2．根据权利要求1所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因(a)具有SEQ ID No:13氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:13的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。
3．根据权利要求1所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码下述蛋白(a)或(b)的核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因(a)具有SEQ ID No:1氨基酸序列的蛋白；(b)具有在SEQ ID No:1的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并能够表现出凝血活性及杀虫抗病能力。
4．根据权利要求1所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码氨基酸序列为SEQ ID No:3的凝集素蛋白前导肽的核苷酸序列。
5．根据权利要求4所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有编码下述多肽(a)或(b)的苦参凝集素蛋白前导肽核苷酸序列(a)具有SEQ ID No:3氨基酸序列的多肽；(b)具有在SEQ ID No:3的氨基酸序列中通过缺失、替代、修饰或添加一个或几个氨基酸而衍生的氨基酸序列，并具有信号肽作用的多肽。
6．根据权利要求1所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有SEQ ID No:2、4、7核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因。
7．根据权利要求1所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有SEQ ID No:9、10、11、12核苷酸序列的苦参凝集素蛋白基因扩增引物。
8．根据权利要求2、3、4、6所述的凝集素蛋白基因，其特征在于具有苦参凝集素蛋白基因部分核苷酸序列的基因片断。
9．根据权利要求8所述的凝集素蛋白基因，其特征在于核苷酸数目在从15到50的范围内。
全文摘要
本发明提供从植物中药苦参中分离具有杀虫(蚜虫)、抗病包括棉花枯萎病菌、小麦赤霉病菌和水稻稻瘟病菌的苦参凝集素,涉及苦参凝集素的分离及抗菌效果,克隆编码这一蛋白的基因全长cDNA序列,这一蛋白及其前导肽氨基酸序列。这一蛋白对杀虫和抗病是有用的,这一基因对利用现代生物技术增强农作物的抗病虫害能力是有用的。
文档编号C07H21/00GK1313386SQ01107248
公开日2001年9月19日 申请日期2001年3月12日 优先权日2001年3月12日
发明者鄢波, 马志刚, 黄兴奇, 王玲仙, 曾仲奎 申请人:云南省农业科学院生物技术研究所