人重组软骨寡聚基质蛋白的纯化与应用的制作方法

专利名称：人重组软骨寡聚基质蛋白的纯化与应用的制作方法
透明软骨是一种特殊的结缔组织，其在关节分散负荷中起重要作用。其提供了光滑，低摩擦力的滑动表面，对压力和冲击力有缓冲和抵抗作用。它由包埋在由细胞自身产生，合成及供养的胞外基质中的终末分化的软骨细胞组成。软骨的胞外基质由三类分子组成。第一类是高度交联的三螺旋II型胶原纤维，其与其它软骨特异的胶原包括XI型和IX型胶原相互作用。第二类包括丰富的大聚集的聚集蛋白聚糖以及一些小蛋白聚糖如双链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖。这些蛋白聚糖含有硫酸软骨素作为它们的糖胺聚糖侧链。第三类蛋白质是非胶原蛋白，包括软骨寡聚基质蛋白(COMP；有时也称为钙结合糖蛋白-5)和连接蛋白。软骨胞外基质的合适组成和排列对基质中保留适当水分和电解质，从而赋予其机械性能是非常重要的。表面上软骨是稳定的并能耐受巨大的物理应力，但软骨可被各种机械性，化学性和微生物因子破坏，通常导致疼痛，肿胀，活动丧失，及最后导致伤残性关节炎。软骨的最大限制是其不能愈合。这种固有的不能修复性是由于其没有血管，软骨细胞的固定性，及成熟软骨细胞对增殖和改变其合成模式的限制性所致。已经使用的各种刺激软骨修复的方法取得不同程度的成功。治疗骨关节炎的主要外科方法包括组织移植，软骨细胞和间充质干细胞移植，及移植人工基质包括胶原凝胶，碳纤维垫，和多孔聚乳酸和其它可生物降解的合成基质。由于可用于移植的软骨组织的来源有限，治疗努力主要集中于移植细胞和基质，以产生在结构及生物化学和机械性能上类似于关节软骨的再生组织。然而，尽管许多研究实验室和公司作了大量努力，这些方法的成果通常是混杂的，且不是非常令人满意的。需要研究出一种更有效的软骨修复的方法。
重组人软骨寡聚基质蛋白(COMP)在哺乳动物系统中已经产生并纯化。此纯化的人COMP比先前报道的纯化的COMP有更多的优点。人COMP以钙充满(calcium replete)构象纯化，其维持了3型钙结合重复序列的结构与功能，并从而维持蛋白质的天然结构与功能。人COMP是一种糖胺聚糖(GAG)结合蛋白。它与GAG如肝素和硫酸软骨素结合。硫酸软骨素是软骨中发现的蛋白聚糖的主要成分。肝素结合性还提供了一种从条件培养基中纯化人COMP的非常便利的方式。这与先前在存在EDTA情况下纯化的COMP不能与肝素结合的报道相反。人COMP被证实在钙充满的形式下具有与GAG更好的亲和力。COMP被证实毫无疑问是软骨细胞的粘着蛋白，无论软骨细胞是分化的还是未分化的。数据还表明COMP需要在钙充满形式下使其细胞粘着活性最大。COMP还示出作为能动因子促进软骨细胞迁移。COMP的这些性质，与其结合胶原，及分化调节试剂视黄酸和维生素D3及其代谢物的能力，使COMP成为用于软骨修复研究中的非常好的引诱剂。COMP可用于软骨修复中软骨细胞移植和人工基质移植，依靠的是COMP能作为细胞的化学引诱物和粘着底物，并作为输送视黄酸和维生素D3及其代谢物的试剂，促进和维持软骨细胞分化及正确软骨基质的产生。
本发明包括纯化的CMOP，如人COMP(hCOMP)，包括通过在存在钙的情况下表达和/或纯化hCOMP而制备的hCOMP，本发明还包括在存在钙的情况下纯化COMP(如hCOMP)的方法。COMP可在钙充满的环境中纯化，例如钙以毫摩尔范围(水平)存在，如至少300μM(0.3毫摩尔)。在一实施方案中，将hCOMP导入例如能表达及分泌hCOMP的细胞中，培养细胞，如在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养；并在存在钙的情况下纯化hCOMP。hCOMP克隆可通过用编码全长hCOMP的DNA(“hCOMP DNA)(Newton等，1994)转染合适细胞而产生。hCOMP可在钙充满条件下例如毫摩尔水平(即在毫摩尔范围)下纯化。细胞可在钙充满培养基中培养。hCOMP可在特征在于钙浓度至少为300μM的环境(如溶液)中表达和/或纯化。能表达COMP的细胞包括某些成纤维细胞，软骨细胞，肌腱，韧带，平滑肌细胞，周细胞和人胚肾细胞，或用编码COMP的DNA转染的其它细胞。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的hCOMP当被胰蛋白酶酶解时，消化为50kDa或55kDa的条带。在另一实施方案中，纯化的hCOMP可被胰蛋白酶消化为62kDa或67kDa的条带。
本发明也包括COMP(例如人COMP，如由本发明方法纯化的hCOMP)的片段，突变体和其它衍生物和类似物，以及生产和使用这种片段，突变体和其它衍生物和类似物的方法。在一个实施方案中，这种衍生物包括COMP的，尤其钙充满构象中的COMP的结合位点(如钙结合位点)。本发明还涉及包括COMP和/或COMP衍生物的组合物。
本发明也包括在存在钙的情况下纯化的hCOMP的抗体，例如本发明方法纯化的hCOMP的抗体。在一实施方案中，抗体是纯化的hCOMP的抗体，制备该纯化的hCOMP是通过将hCOMP克隆导入能表达和分泌hCOMP的细胞，在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养细胞，并在存在钙的情况下纯化hCOMP。在另一实施方案中，抗体是在钙充满环境下，例如钙以毫摩尔范围(水平)如至少300μM(或0.3毫摩尔)存在的情况下纯化的hCOMP的抗体。此抗-COMP抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明还包括包含纯化的hCOMP的ELISA的试剂盒，该纯化的hCOMP的制备是通过将hCOMP克隆导入能表达和分泌hCOMP的细胞，在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养细胞，并在存在钙的情况下纯化hCOMP。在一实施方案中，本发明包含这种hCOMP的抗体。
本发明还包括组合物(如植入体)，其包含含有COMP(如hCOMP的基质。本发明的基质可以是生物学或非生物学的。它们可以是人工的。它们可以包含处理的软骨和骨基质，胶原，透明质酸，血纤蛋白凝胶，碳纤维，多孔聚乳酸，I型胶原凝胶和II型胶原凝胶。在一实施方案中，基质包含I型或II型胶原凝胶。基质可用细胞例如软骨发生细胞如间充质干细胞或软骨细胞种植(例如包埋)。一种分化剂(即分化因子)可与hCOMP结合。分化剂可以是例如维生素D3或至少一种维生素D3的代谢物(如1，25-二羟基维生素D3和24R，25-二羟基维生素D3)或视黄酸。植入体可包含至少一种蛋白聚糖，例如硫酸软骨素。在一实施方案中，基质包含纯化的hCOMP，此纯化的hCOMP是通过将hCOMP克隆导入细胞例如能表达和分泌hCOMP的细胞，在例如适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养细胞，并在存在钙的情况下纯化hCOMP而生产的。此COMP可以是重组人COMP，例如由在钙充满环境中培养的细胞分泌的，并在存在钙的情况下纯化的人COMP。此COMP可以是在钙充满环境中纯化的hCOMP。基质也可包括生长因子。
本发明还包括例如在软骨缺损区域修复(或产生)软骨的方法，包括在缺损区域植入包含与分化剂相联(如结合)的COMP的组合物。此缺损区域可以是需要软骨修复的部位。分化剂可以是维生素D3或维生素D3代谢物(如1，25-二羟基维生素D3，和24R，25-二羟基维生素D3)或视黄酸。一或多种蛋白聚糖如硫酸软骨素蛋白聚糖可在植入前加入组合物中。hCOMP可作为胶原和蛋白聚糖之间的桥梁。组合物可以是基质。COMP可以是人COMP。COMP可以由在钙充满环境中培养的细胞分泌，并在存在钙的情况下纯化。在一实施方案中，COMP是纯化的hCOMP，是通过将hCOMP克隆导入细胞例如能表达和分泌hCOMP的细胞，在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养细胞，并在存在钙的情况下纯化hCOMP而生产的。COMP可以是重组的。
本发明还包括生产用于修复软骨的植入体的方法，包括将分化剂与hCOMP结合，并向基质中加入与hCOMP结合的分化剂。此hCOMP可介导分化剂的输送(如输送至细胞)和分化剂的释放，并作为软骨细胞的化学引诱剂(迁移因子)。一个实施方案还另外包括在基质中添加(如种植)软骨发生细胞。hCOMP介导分化剂输送至细胞和分化剂的释放，有助于维持和促进软骨发生细胞成熟与分化，从而产生天然发生的非创伤性软骨基质。
在另一实施方案中，本发明包括移植细胞(例如软骨发生细胞如软骨细胞如自身软骨细胞)的方法，包括在存在hCOMP(其可以与分化剂结合)的情况下培养细胞。细胞可分离自动物如哺乳动物如人(例如病人)。hCOMP可介导扩增的软骨细胞的附着，并输送和释放分化剂。细胞可以在用与分化剂结合的hCOMP包被的组织培养平板上培养。分化剂可以是维生素D3或维生素D3的代谢物或视黄酸。细胞例如软骨细胞和间充质干细胞可与结合的分化剂一起在存在hCOMP时注射入缺损区域，从而有助于维持软骨细胞分化并通过软骨细胞刺激II型胶原和其它软骨成分在缺损区域产生。细胞可以是在存在hCOMP(其可与分化剂结合)情况下培养的。hCOMP可以是通过本发明方法纯化的。本发明还包括用这些方法生产自身移植的软骨细胞，及通过这些方法生产软骨细胞。
本发明还包括在移植(非自身或自身移植)中，介导细胞例如软骨发生细胞(如软骨细胞和间充质干细胞)附着的方法，包括将细胞在存在结合分化剂的COMP时注入缺损区，从而产生及有助于维持细胞分化阶段，并刺激细胞在缺损区产生II型胶原和其它软骨成分。
本发明还包括制备修复软骨的组合物(如植入体)的方法，包括在存在钙的情况(如钙充满环境)下培养及纯化COMP，并将其加入基质例如本发明所述基质中。基质可在植入前用细胞如软骨细胞或间充质干细胞种植。COMP可表达自用COMP转染的细胞，并在适于加工和分泌COMP的条件下在钙充满环境中培养。软骨发生细胞可在体外在存在所述COMP的情况下增殖，并且软骨发生细胞可加入(如种植在)基质中。这些细胞可与COMP一起种植于基质中。
本发明还包括例如在样品中检测及定量COMP(如降解的COMP和未降解的COMP，包括片段)和COMP抗体的分析和方法。样品可以是生物学样品如血清或滑液。COMP可以是hCOMP，如由本发明方法生产或纯化的hCOMP。抗COMP抗体可以是本发明所述的抗体。样品可以是连续稀释的。COMP可以用标记的试剂检测如酶缀合的二级抗体。分析中结合的COMP或结合的抗COMP抗体或降解的COMP(如COMP的降解片段)可通过ELISA测定，如竞争性ELISA。
在一实施方案中，生物学样品可在适于抗COMP抗体与生物学样品中hCOMP结合的条件下，与抗COMP抗体(如本发明所述的抗体)接触，从而产生结合的hCOMP。可检测结合的hCOMP，并将样品中结合的hCOMP的量与形成标准曲线的结合的hCOMP的已知量相对比，从而测定样品中hCOMP的量。在另一实施方案中，生物学样品中存在的hCOMP可通过在适于抗COMP抗体与生物学样品中hCOMP结合的条件下，用抗COMP抗体保温生物学样品而测定。生物学样品可加入已用本发明所述纯化的hCOMP包被的平板中，冲洗之后，可检测生物样本中与平板结合的hCOMP，可将样品中结合的hCOMP量与形成标准曲线的hCOMP的已知量相对比，从而测定hCOMP的量。另一实施方案包含一种检测生物样本中抗COMP抗体的分析，包括将纯化的hCOMP包被在平板上，连续稀释样本，将连续稀释液与hCOMP接触，并用与hCOMP特异结合的标记试剂检测结合的抗hCOMP抗体的存在情况。哺乳动物(如人，例如病人)是否患有关节炎或其进展(如风湿性关节炎或骨关节炎)可通过本发明方法检测。降解的COMP可以相似方式，用识别COMP降解片段的抗体检测。
本发明还包括检测COMP降解的方法，包括用免疫印迹分析检测COMP，例如用本发明所述的识别COMP降解形式(如降解的片段)的抗COMP抗体进行免疫印迹分析。抗COMP抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。由免疫印迹方法产生的条带的常规强度可被扫描，且可以计算降解的条带的百分率。COMP可以是例如由本发明所述方法纯化的hCOMP。一种分子量标准可用于鉴别COMP的完整及降解形式。这些免疫印迹分析可用于检测炎症性关节疾病如风湿性关节炎或骨关节炎，其是通过将测定的降解的COMP的量与其它哺乳动物中COMP的量相对比而检测的，其它哺乳动物例如是具有这种关节疾病或不具有这种关节疾病的。


图1是纯化的重组COMP的SDS-PAGE图。由人胚胎肾293细胞表达的重组人COMP纯化自条件培养基。纯化的hCOMP在非还原(NR)或还原(R)条件下，在SDS中经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。用大小标准物作标记。TSP1是人血小板反应蛋白1。MUT3是COMP的突变体形式。
图2是人重组COMP的旋转投影电子显微镜图象。(A)为在含有CaCl2的Tris缓冲盐水中的纯化的COMP，(B)在喷涂前调整为5mM EDTA的COMP。Bar等于50nm。
图3是在不同钙浓度下，胰蛋白酶对COMP的限制性消化图。分子大小标准物如所指示的。ND为未消化的蛋白质。
图4是在单层细胞中培养的软骨细胞衍生的细胞系TCla与COMP或包含COMP的3型重复的融合蛋白的吸附图。COMP(上栏)或3型重复融合蛋白(下栏)存在CaCl2(/C，三角形)或EDTA(/E，空心圆)或存在EDTA，并用DTT处理(/E/R，实心圆)处理。进行吸附分析。结果为四次试验的平均值±标准偏差。
图5是在用藻酸盐培养后的软骨细胞衍生的细胞系TCla与COMP的吸附图。结果为四次试验的平均值±标准偏差。
图6是软骨细胞向COMP的迁移图。COMP，TSP1或Vitrogen(Cohesion；PaloAlto，CA)包被在转孔膜的下面。确定已迁移的软骨细胞量，并在此以平均值±标准偏差表示。
软骨寡聚基质蛋白(COMP)是一种五聚体胞外基质蛋白，它主要位于软骨细胞基质中，且也发现于滑膜，肌腱和韧带中(Hedbom等，1992；DiCesare等，1994；DiCesare等，1997；Hecht等，1998)。COMP是血小板反应蛋白(TSP)家族的第5个成员。与其它TSP相对比，COMP是缺失NH2-末端肝素结合功能域的唯一成员，且已报道其不与肝素-琼脂糖结合(DiCesare等，1994；Hauser等，1995)。与其它TSPs相类似，COMP具有一个负责多聚化和链内二硫键的卷曲螺旋区，4个类EGF2型重复，7个由13个钙结合环组成的高保守的3型重复，和一个COOH端球状结构域(Oldberg等，1992；Newton等，1994)。COMP突变导致人体骨骼发育异常，包括假性醛甾统发育不全(Pseudoachondroplasia)，和多发性骨后发育异常，Fairbanks型。大多数突变位于3型重复中，有一些位于C-球状区域中(Briggs等，1995；Hecht等，1995)。
大量相连续的钙结合共有序列重复是TSPs所独有的。富含天冬氨酸的序列类似于一类钙结合蛋白包括钙调蛋白，小白蛋白和血纤蛋白原的钙结合位点中的序列(Lawler和Hynes，1986)。钙结合共有序列DXDXDGXXDXXDX的变化在TSP亚单位内发生13次，并已提示形成钙结合环(Lawler和Hynes，1986；Sun等，1992；Misenheimer和Mosher，1995)。对TSP1的平衡透析，圆二色性和限制性胰蛋白酶消化的研究推测，每个TSP1亚单位以协同方式结合11-12个钙离子。大部分钙结合活性可归因于3型重复。这些研究还推测当TSP1与钙结合时有一个构象变化(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。3型重复在所有TSP分子中是高保守的。根据COMP中存在3型重复和对TSP1的研究，推定COMP与钙结合并在有或无钙的情况下呈现不同构象。然而，在存在EDTA情况下最初纯化的COMP不与钙结合，并不能示出由于钙的功能所致的明显构象差异(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。
如实施例1所示，全长人COMP序列被克隆，并且所得全长序列被克隆入哺乳动物表达载体中，并转染至人胚胎肾细胞中。分离并扩增稳定转染子的集落。当用全长人COMP cDNA转染人胚肾细胞时，它们能加工和分泌hCOMP(图1)。
另外，如实施例2所示，COMP是一种钙结合蛋白。根据COMP中存在3型重复和对TSP1的研究，推定COMP与钙结合。然而，最初在EDTA中纯化的COMP不与钙结合，并不能由于钙功能而示出明显的构象差异(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。在此，直接钙结合，旋转投影电子显微镜(EM)及限制性胰蛋白酶消化用于显示，COMP是一种钙结合蛋白，并在不同钙浓度下显示不同构象。
hCOMP的旋转投影EM图(图2)示出重组hCOMP是五聚体。在存在钙的情况下，hCOMP具有一紧凑外观，使其难以分解5个亚单位。在存在EDTA的情况下，hCOMP采取伸展的构象。这些结果推测，在饱合钙的情况下纯化的COMP，当钙与分子螯合时构象发生变化。这个观测结果不同于以前发表的关于COMP在EDTA中纯化的报道(Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。然而，在此观测的构象变化与先前关于TSP1，TSP3和TSP4的发现及在COMP上存在高度同源的3型钙结合重复序列是一致的(Lawler等，1982；Qabar等，1995；Lawler等，1995；Oldberg等，1992；Newton等，1994)。
为进一步示出hCOMP是钙结合蛋白，在各种钙浓度下进行hCOMP的限制性胰蛋白酶消化。在低钙浓度下，hCOMP易于被胰蛋白酶酶解为2个小片段，27kDa和36kDa(图3)。当钙浓度升高时，hCOMP被消化为中度等大小条带，50kDa和55kDa。当钙浓度更高时，开始出现62kDa和67kDa的条带。67kDa的条带在钙浓度在毫摩尔范围内成为主要的条带。这些结果表明hCOMP依赖于钙浓度对胰蛋白酶消化有不同敏感性，且推测存在与3型钙结合重复相关的构象差异。
钙与COMP的直接结合用45CaCl2通过平衡透析测定。简而言之，将TSP1和COMP在Slide-A-Lyzer透析装置(Pierce，Rockford，IL)中对含有0.3mM CaCl2和10μCi/ml45CaCl2的透析缓冲液透析。在透析结束时，取10μl蛋白质样本和透析缓冲液进行闪烁计数和蛋白质测定计算结合的钙离子数。在0.3mM游离钙浓度，每个TSP1亚单位结合10±2个钙离子(4个数据点的平均值±SD)。这与先前报道相一致，即据报道11-12个钙离子与每个TSP1亚单位结合(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。在相同条件下，每个COMP亚单位结合11±1个钙离子。这是首次示出COMP与钙离子结合，且此结果与COMP及其它TSP家族成员中存在高度同源3型钙结合重复序列相一致。
另外，如实施例3所示，COMP是一种糖胺聚糖(GAG)结合蛋白，其最大结合依赖于其钙充满构象。为探查hCOMP除了缺失NH2端肝素结合功能域之外，是否是GAG结合蛋白，及3型钙结合重复序列的构象是否影响hCOMP的功能，在存在钙或EDTA的情况下，测试hCOMP与软骨中发现的常见GAGs的相互作用。
亲和共电泳(ACE)用于确定hCOMP与肝素及其它GAGs包括软骨中硫酸软骨素的结合。这些分析结果示于表1。单位是nM，且在报道有标准偏差情况下，代表两次测定结果的平均值。当数据比给定值高时，表明在任何蛋白质浓度均观测不到结合。
表1hCOMP与糖胺聚糖的结合
COMP与低分子量的肝素结合。这与我们观测的hCOMP与肝素-琼脂糖凝胶结合相一致。尽管与肝素的结合可提示COMP中存在有功能的GAG-结合位点，但肝素是HS的高硫酸盐形式，只在肥大细胞中产生，因而不能真正代表大多数组织中的GAG。为更好查明GAG和蛋白聚糖在COMP功能中的潜在作用，用ACE在存在钙的情况下，测试硫酸肝素，硫酸角质素和3种硫酸软骨素(6-硫酸软骨素，C6S；4-硫酸软骨素，C4S；和硫酸皮肤素，DS)与hCOMP的结合(表1)。数据证明hCOMP与三种硫酸软骨素的结合亲和性较高，而与HS的结合较弱(1.2μM)。hCOMP不结合硫酸角质素。
为进一步确定钙结合3型重复的构象是否对GAG结合是至关重要的，在存在EDTA时测试hCOMP与肝素和C6S的结合。这些结果表明钙的消耗降低hCOMP与GAGs的结合。而通过EDTA处理，肝素结合只降低3～5倍，C6S结合似乎被此处理破坏，因此推测构象依赖于3型重复和/或C端结构域中的CS结合位点。这表明COMP需要在其钙充满构象中才可与具有硫酸软骨素侧链的软骨细胞蛋白聚糖糖明显结合。
另外，如实施例4所示，COMP是一种在钙充满形式中与人软骨细胞具有最大粘着性的粘着蛋白。先前的研究已报道软骨细胞根本不粘附COMP(Sommarin等，1989；Oldberg等，1992)，或者只在非常高的COMP浓度下才能观测到明显的附着(DiCesare等，1994)。COMP支持细胞附着的能力在短时附着分析中确定，以及确定3型构象是否对其粘着性有影响。
用一种软骨细胞衍生的细胞系TCla测试COMP是否是一种粘着蛋白。在单层细胞和在藻酸盐中培养系中均生长的细胞用于此分析。
就在单层细胞中生长的Tcla细胞而言，钙充满构象中hCOMP支持细胞以剂量依赖方式附着(图4)。在蛋白质包被浓度为5μg/ml和更高时，细胞也在蛋白质包被的孔上铺展。在包被前用EDTA处理hCOMP，未观测到对附着的明显作用(图4)。根据先前报道，TSP1和TSP2的还原有助于曝露RGD序列，该序列可能隐蔽在3型钙结合重复中复杂的胞内二硫键的内部(Sun等，1992；Chen等，1994)。鉴于所有TSPs中的3型重复的高度同源及hCOMP中存在RGD序列，对hCOMP进行测试。确实，在包被之后hCOMP的还原提高了其粘着性，尤其在低COMP包被浓度(图4)。细胞附着并铺展于以1μg/ml包被的二硫苏糖醇处理的COMP上。为鉴别细胞附着于COMP上的区域，对在大肠杆菌中表达和纯化的三种不同融合蛋白的粘着活性进行测试。融合蛋白质是通过从含有插入物的pGEX载体(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)表达而产生的，这些融合蛋白包含日本血吸虫的谷胱甘肽S-转移酶和COMP2型重复区(Leu 88-Arg 268)，或COMP的3型重复区(Arg 268-Ile 517)或COMP和COOH末端区。TCla细胞未能示出与任何这些重组融合蛋白有明显附着。然而，当在包被之后3型重复融合蛋白被还原时，细胞能附着并在平板上良好铺展。RGD肽有效地抑制TCla细胞对hCOMP的附着。此数据表明COMP是一种粘着蛋白，且3型重复可能通过RGD序列部分负责此粘着活性。
当软骨细胞在单层细胞中培养时，它们随着时间推移而去分化，且丧失一些软骨细胞的特点(van der Mark等，1997)。在单层细胞中延长培养之后，软骨细胞从产生II型胶原和丰富的蛋白聚糖的分化表型转换为产生I型胶原和少量蛋白聚糖的去分化的成纤维细胞表型。此去分化的过程可通过将软骨细胞在悬浮液例如在藻酸盐培养系统中培养而逆转(Robbins和Goldring，1998；Goldring，1998；Hauselmann等，1994；Bonaventure等，1994)。为解决这个问题，用藻酸盐系统再分化TCla细胞，并测试hCOMP对这些再分化细胞附着的支持作用。钙充满形式的野生型hCOMP在藻酸盐珠中培养7-10天后，也能支持TCla细胞的附着(图5)。在包被之前钙的螫合使附着水平降低大约50％(图5)。这些数据提示hCOMP的钙充满的野生型构象是支持在藻酸盐系统中培养的分化的TCla细胞最大附着所需的。此发现还解释了先前对COMP粘着活性研究的争论。当COMP以钙耗竭的构象纯化时，它的粘着活性对分离自分化阶段的组织的软骨细胞而言是低的(Sommarin等，1989；Oldberg等1992；DiCesare等，1994)。
当COMP以钙充满形式中纯化与先前报道的在EDTA中纯化相对比时，COMP示出不同的表现(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992DiCesare等，1994)。这些结果表明钙结合对保持COMP的正确结构构象是至关重要的，该构象反过来又对其功能是至关重要的，包括其最佳GAG结合性及其支持细胞附着的能力。
另外，如实施例5所示，COMP是软骨细胞迁移的促动因子。人costochondral软骨细胞被用于测试COMP在促进软骨细胞迁移中是否起作用。将不同浓度的COMP以及TSP1和Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)包被在转孔迁移分析孔的膜下面。将如在附着分析中制备的软骨细胞加样于孔中。在37C进行迁移4小时。存留在孔内的未迁移细胞用棉签除去。迁移至膜下的细胞用CyQuant试剂盒定量。
数据(图6)示出COMP是一种软骨细胞迁移的良好化学引诱剂。包被在膜下的，低如10mg/ml浓度的COMP即可促进软骨细胞迁移至其附近。 TSP1也促进软骨细胞迁移。然而，在10mg/ml的相同浓度下，COMP似乎是比TSP1更强的化学引诱物。Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)实际上是一种胶原，与先前报道相一致，也促进软骨细胞迁移(Shimizu，M.，K.Minakuchi，S.Kaji和J.Koga，“软骨细胞迁移至纤连蛋白，I型胶原和II型胶原，”细胞结构与功能，22309-315(1997))。
此数据与COMP支持软骨细胞附着的数据提示，COMP是包含在用于软骨修复的人工基质中的一个良好候选物。人工基质中的COMP可作为软骨细胞迁移至基质的良好化学引诱物，并作为良好的附着因子。另外，通过结合的维生素D3，其代谢物或视黄酸，COMP可有助于进一步启动软骨细胞分化，并产生正确类型的胞外基质。
本发明所述的研究结果提供了一些关于COMP结构和功能的重要观察。与最初方法纯化的COMP相比，本发明揭示的重组表达和纯化的hCOMP有一些令人惊喜的优点。这是首次如果按比率扩大培养，人COMP可以不限量地纯化。在此新的纯化方案中，在各个步骤中均保持钙的存在，以维持钙依赖性结构。此方案基于如下事实，即在生物合成期间及在胞外环境中，COMP应存在于毫摩尔水平的钙环境中。到目前为止，大多数广泛应用的COMP由于它们的可得性，是纯化自牛软骨或鼠纤维肉瘤的。然而，牛或鼠的物质不能用于人体，因为它们能潜在地引起免疫应答。也有报道纯化自人软骨的人COMP(DiCesare等，1995；Neidhart等，1997)，然而，人体物质的来源是有限的。另外，所报道的COMP纯化方法也对其应用有一定限制性。有两种已公布的纯化COMP的方法，最早的方法是用含有盐酸胍和EDTA的溶液提取(Hedbom等，1992)，这使蛋白质变性。另一种方法是以“天然”状态纯化COMP，然而此方法利用EDTA提取，EDTA处理从COMP中螫合钙和/或其它二价阳离子，并使COMP处于钙耗竭状态。有数据示出此构象变化可能是不可逆的，因为这样纯化的COMP在含有钙的EM下不能折成紧凑的钙充满状态。已报道在含有EDTA的情况下纯化的COMP与本发明所述在钙充满状态下纯化的COMP相比，不能进行一些功能，例如，COMP不能与肝素-琼脂糖凝胶结合，且对COMP能否支持软骨细胞附着是有争论的。如本发明所述实施例所示，钙充满状态对于COMP的最大GAG结合活性及最大细胞粘着活性是至关重要的。
1、纯化的COMP本发明包括纯化的软骨寡聚基质蛋白(COMP)，如人COMP(hCOMP)，如通过在含有钙的情况下表达和/或纯化hCOMP而制备的hCOMP，本发明还包括在钙存在下纯化COMP(如hCOMP)的方法。COMP可在高钙浓度环境中纯化，例如钙的浓度在毫摩尔范围(水平)，如至少300μm(0.3毫摩尔)。本文所用“钙充满条件”是指钙浓度至少为0.3毫摩尔。在一实施方案中，hCOMP克隆可被导入例如能表达和分泌hCOMP的细胞中；在例如适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养此细胞；并在含有钙的情况下纯化hCOMP。hCOMP克隆可通过克隆全长hCOMP而产生。本领域技术人员熟知重组技术，例如参见Ausubel，F.N.等，分子生物学的通用方案，Greene出版协会，和JohnWiley&Sons，Inc.(1998)。将蛋白质如hCOMP导入细胞的方法包括但非限于转染，转化和电穿孔。本领域也已熟知适于表达的条件。细胞可在钙充满的培养基中培养。hCOMP可在毫摩尔水平的溶液中表达和/或纯化(例如钙的浓度至少为300μM)。能表达COMP的细胞包括软骨，肌腱和韧带细胞，和人胚肾细胞，或用例如COMP DNA(编码COMP的DNA)转染的其它细胞。
本发明还涵盖了在不同钙浓度中纯化的COMP。这种COMP可被胰蛋白酶不同酶解。在一实施方案中，由此方法产生的hCOMP，当被胰蛋白酶酶解时，被消化为50kDa或55kDa的条带。在另一实施方案中，当被胰蛋白酶酶解时，纯化的hCOMP被消化为62kDa或67kDa的条带。
本发明还涵盖了COMP(如人COMP，如通过本发明的方法纯化的hCOMP)的片段，突变体及其它衍生物和类似物，本发明还包括生产和使用这种片段，突变体和其它衍生物和类似物的方法。在一实施方案中，这种衍生物包括COMP尤其钙充满构象的COMP的结合位点(如钙结合位点)。本文所用的“钙充满构象”指已在钙充满条件下纯化的COMP的形式。本发明还包括包含COMP和/或COMP衍生物的组合物。
2、抗COMP抗体及ELISA试剂盒本发明还涵盖了在含有钙的情况下纯化的COMP(包括hCOMP)的抗体，例如在本发明方法下纯化的hCOMP的抗体。此抗COMP抗体可以是单克隆或多克隆的，它们可以是嵌合的。它们可以是特异于COMP衍生物如COMP片段或突变体的抗体。它们可以是与降解的COMP(包括COMP片段)结合而不与未降解的COMP结合的抗体。或者，它们可结合未降解的(完整全长)COMP，但不结合降解的COMP。本领域熟知生产抗体的方法。在一实施方案中，抗体是纯化的hCOMP的抗体，hCOMP是通过将hCOMP克隆导入能表达和分泌hCOMP的细胞中，在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养基中培养该细胞，并在含有钙的情况下纯化hCOMP而制备。在一实施方案中，抗体是在钙充满情况下例如钙的浓度在毫摩尔范围(水平)，如至少300μM(或0.3毫摩尔)中纯化的hCOMP的抗体。本发明还包括本文所述的抗体的片段。如本文所用，“抗体”可指任一种类型的抗体，如具有一定特异性和亲和性的单克隆抗体，或在抗血清中的多克隆抗体制备物，或一种分析中的多个抗体，即术语“抗体”包含多种含义。
本发明还涵盖了ELISA试剂盒，其包含纯化的hCOMP和/或这种hCOMP的抗体，该hCOMP是通过将hCOMP克隆导入能表达和分泌hCOMP的细胞，在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养该细胞，并在含有钙的情况下纯化hCOMP而制备的。
3、COMP在破坏性关节疾病中作为标记的应用在一实施方案中，COMP在破坏性关节疾病中用作标记。骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)的关节通常引起患者疼痛和伤残。在这些炎性和机械性关节疾病中，软骨基质进入负平衡，导致关节软骨的进行性破坏及不同程度的骨破坏。OA是一种从初始的关节损害发展为进一步破坏的慢性过程。OA的临床诊断是基于关节疼痛的病史和放射线检查。通常在诊断阶段，组织已经被破坏且病人需要手术。近年来，针对RA的进攻性早期药物治疗希望可以阻止或延缓疾病进展并改善最终结果。这种进攻性早期治疗只保证疾病是否已具有严重预后。因而，简便的及非侵害的及可靠的检测亚临床状态的关节炎及确定疾病进展结果的方法将是非常有意义的。
有人体滑液(SF)和血清中，已有报道在膝关节损伤后COMP量增加。在早期OA中，在血清及SF中已经观测到COMP水平升高(Neidhart等，1997；Petersson等，1998a；Petersson等；1998b)。在具有临床膝关节疼痛的病人体内，COMP水平升高与随后的对OA的放射线检测相关，而COMP水平在随后对正常人进行放射线检测则无变化(Pertersson等，1998a，Pertersson等，1998b)。在损伤性膝关节中，一些产生抗COMP自身抗体的患者发生损伤后骨关节炎的危险性增加(Kuhne等，1998)。在具有侵害性RA及随后产生进一步大关节损坏的早期RA患者中，COMP水平也提高(Saxne等，1993；Forslind等，1992；Wollheim等，1997)。随后，随着RA的进展，COMP水平降低。然而在SF中，较高百分率的RA患者(84％)和其它炎症性关节炎的患者(60％)示出COMP高度降解(Neidhart等，1997)。简而言之，血清中COMP浓度增加可作为早期OA和RA的有效预测标记。另外COMP在SF中降解增加这一指标则可用作RA和其它炎症性关节疾病的标记。
本领域熟知本发明所述分析的标准技术(参见Ausebel，前述)。例如，可使用相同或相似于1997年8月8日申请的专利申请WO98/07095中所述方法。
现已经示出血清中的COMP水平与SF中COMP水平正相关。血清可无损害地及轻微痛觉地易于自病人获取，且血清中COMP水平通过竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)而易于测定。迄今为止，还未研制出一种诊断试剂盒，可能是由于hCOMP及其抗体的来源有限。使用本发明纯化COMP的方法，在含有钙优选在钙充满条件下可纯化大量的COMP。也可包括这种hCOMP的抗体。使用本发明纯化的COMP的竞争性ELISA可在例如96孔微量滴定板或适合蛋白附着的其它基质中进行。此ELISA分析和试剂盒中使用人COMP比使用纯化自其它动物来源的COMP优选，因为已示出使用牛COMP的ELISA产生不精确的测定结果(Neidhart等，1997)。在ELISA分析中，平板可用1μg/ml纯化的hCOMP包被。平板上过量的结合位点可例如用牛血清白蛋白封闭。患者的血清可连续稀释，并与标准的即已知数量的纯化的hCOMP及特异抗COMP抗体一起，在4℃保温过夜。然后将此溶液加入平板并在室温培养1小时。冲洗之后，可向孔中加入酶缀合的二级抗体，并如标准ELISA分析进行分析。患者血清中的COMP浓度可源自标准曲线和稀释倍数的线性范围。在此分析中，优选单克隆抗体用作初级抗体。然而，也可使用多克隆抗体。多克隆抗COMP抗体已经研制出(Hecht等，1998)，单克隆抗COMP抗体正在研制。使用本发明所提供的技术可为ELISA提供来源无限制的纯化的重组hCOMP。
标准ELISA分析可用于检测损伤性膝关节外伤的患者是否出现抗COMP抗体，从而指导诊断与治疗。在此分析中，hCOMP包被在96孔微量滴定板上，连续稀释的患者血清用于检测抗COMP自身抗体的存在与否。在此分析中，hCOMP比其它动物来源的COMP具有更大优势，因为自身抗体可识别只存在于人COMP的表位，因而使用hCOMP更灵敏和精确。
免疫印迹可用于检测SF中COMP是否降解。简而言之，SF中蛋白质可例如通过乙醇沉淀，将此沉淀物在含有不具有还原剂的SDS电泳缓冲液的溶液中重悬浮。蛋白质可例如在SDS中在3-15％聚丙烯酰胺凝胶上分离，并经电泳转移至一片硝基纤维素纸上。通过标准免疫印迹方法，使用识别未降解的和降解的COMP的多克隆抗COMP抗体或单克隆抗体，对COMP进行检测。对条带的相对强度进行扫描并计算降解条带的百分比。在此，纯化的hCOMP和商购的分子量标准物可用于鉴别COMP的完整及降解形式。
4、COMP在软骨修复中的应用在软骨修复领域，已尝试进行软骨细胞和间充质干细胞的移植，及人工基质的移植，或组合这二种方法。然而，结果都是不令人满意的，尤其远期效果。据信修复的组织应具有相同或相似的透明软骨的组成和结构，以经得起时间与使用的考验。因此，修复的组织的组织学性质是鉴定修复步骤是否适当及结果是否较好的一个重要因素。在透明软骨中，主要成分是II型胶原和大量聚集的蛋白聚糖的聚集蛋白聚糖。在长期跟踪中，许多软骨修复步骤的主要问题是修复的组织是含有I型胶原而不是II型胶原，且与透明软骨相比具有较少蛋白聚糖的纤维软骨。纤维性修复在一段时间之后趋于退化。先前的研究已经示出软骨细胞产生这些蛋白质的能力依赖于细胞的分化状态。COMP在解决这个问题中可起重要作用。
维生素D3和视黄酸已示出在软骨和骨的形态形成和修复中是重要因素。视黄酸具有影响肢形成和刺激负重生长的软骨细胞中基质钙化和胶原合成。维生素D3及其二种主要活性代谢产物1，25-二羟基维生素D3[1，25(OH)2D3]，和24R，25-二羟基维生素D3[24R，25(OH)2D3]发现是正常软骨细胞发育和分化所必需的。此代谢物促进间充质细胞分化为软骨细胞以及软骨细胞分化接近形态上肥大的表型。l，25(OH2)D3尤其刺激II型胶原的转录及提高肢芽间充质细胞中软骨形态发生。视黄酸的调节功能已部分归因于骨形态形成蛋白-7水平的刺激，其接着刺激软骨细胞的成熟(Grimsrnd等)，维生素D3代谢物的作用是通过调节包含cAMP和蛋白激酶C的胞内信号途径而进行的(Schwartz等，1998a；Schwartz等，1998b)。
维生素D3代谢物及视黄酸在水溶液中基本是不溶的，且需要载体蛋白转运并在生理条件下贮存。最近已报道COMP是天然发生的结合蛋白(Guo等，1998)，因此，COMP可作为这些信号分子的贮存和输送蛋白。
除了视黄酸和维生素D3的代谢物，COMP还示出也与胶原结合(Rosenberg等，1998)。根据我们的研究，与软骨细胞中发现的不同GAG结合的COMP是一种去分化的和分化的软骨细胞的粘着蛋白，并可作为软骨细胞迁移的化学引诱物。本发明的实施例表明COMP的钙充满构象是其发挥最大GAG结合和支持细胞附着活性的关键。COMP的这些性质使其成为软骨修复的一个理想候选物。
COMP可用于软骨修复的各种步骤中，可作为软骨细胞或间充质细胞的促动因子(如化学引诱剂)和粘着因子，也可作为分化因子(与视黄酸或维生素D3代谢物结合)。
例如，自身软骨细胞移植已成为膝关节软骨全部损伤的普及外科治疗方法。此方法有一定预期效果，但远期效果有一定问题(Koh等，1998；Brittberg等，1990；Brittberg等，1994)。此方法包括分离病人的软骨细胞，体外扩展软骨细胞，并将培养的软骨细胞注入缺损部位，用取自近关节的中段胚骨骨膜瓣缝合覆盖。此方法利用在单层细胞中体外培养的软骨细胞。如以前报道所述，在单层细胞培养中，随着培养时间延长，软骨细胞趋于去分化。去分化的软骨细胞从II型胶原表达表型转换为I型胶原表达，并产生较少的聚集蛋白聚糖，类似成纤维细胞表型。
例如，COMP，如本发明所述纯化的hCOMP可用于移植软骨发生细胞的方法中，包括在存在COMP下培养细胞。本文所用的“软骨发生细胞”是指能产生软骨的细胞，包括软骨细胞和间充质细胞。软骨发生细胞可以是自身的。本文所用的“自身的”是指细胞是取自将要移植入内的相同个体的。COMP可与分化剂结合。分化剂可以是维生素D3或维生素D3代谢物或视黄酸。细胞可分离自个体，例如动物如哺乳动物，例如人(如病人)。hCOMP可介导细胞吸附(如扩展的软骨细胞)，并为细胞输送分化剂及释放分化剂。细胞可以在用与分化剂结合的hCOMP包被的组织培养平板上培养。细胞例如软骨细胞和间充质细胞可以与结合分化剂的hCOMP一起注入缺损部位，从而有助于维持软骨细胞分化和刺激II型胶原和其它软骨成分在缺损部位产生。细胞可在hCOMP存在下培养(hCOMP可与分化剂结合)。hCOMP可通过本发明所述方法纯化。本发明还涵盖了用这些方法生产用于自身移植的软骨细胞，及通过这些方法生产的软骨细胞。在一实施方案中，软骨细胞可以在用与维生素D3代谢物结合的hCOMP包被的组织培养平板上培养。在此，COMP作为附着因子并也可提供分化因子。扩展的软骨细胞也与结合维生素D3代谢物的COMP一起注入缺损部位。这也应有助于在缺损部位维持软骨细胞分化和刺激II型胶原产生。人COMP比其它动物来源COMP优选，从而避免了潜在的宿主免疫应答这一问题。
另一项研究是针对研制软骨修复的人工基质。人工基质可用于在缺损部位输送和稳定细胞及试剂的方法中，且在一些情况中，这些基质还可使得或刺激宿主细胞向内生长和基质形成以及新细胞和基质与宿主组织的结合(Buckwalte和Mankin，1998；Silver和Glasgold，1995；Newman，1998)。人工基质包括各种生物学及非生物学物质，包括处理的软骨和骨基质，胶原，胶原和透明质酸，纤维蛋白凝胶，碳纤维，多孔聚乳酸，等。不同的基质已由不同的实验室研制，且每一种都有其优点与缺点。评价移植物的关键是其可提供一个多孔结构，细胞可迁移至其中，贴附并生长，以及其促进并保持所移植的细胞的分化的软骨细胞表型，且其在体内不引起炎症和毒性。在人工基质中，在修复和再生关节软骨中也可使用可刺激软骨细胞生长和分化的生长因子，包括类胰岛素生长因子，成纤维细胞生长因子，和转化生长因子。然而，它们对除了软骨之外其它组织的多重作用，及对它们的体内作用的有限了解，使得研究者对它们在临床中的应用很谨慎。现在还未有关于移植物中使用COMP的报道，因为至今对COMP的了解有限。
本发明包括用于软骨修复的移植物。本文所用的“移植物”是指一种组合物，其可被移植入个体中。“修复”是指改善或部分或全部恢复至未受损状态。
在一优选的实施方案中，胶原凝胶如I型胶原和II型胶原用于基质中。研究表明II型胶原比I型胶原具有更好的维持软骨细胞表型和基质合成的作用(Nehrer等，1997)。在一实施方案中，将与分化剂如维生素D3或其代谢物或视黄酸结合的COMP，加入作为移植物的II型胶原凝胶中。凝胶中也可包括蛋白聚糖包括硫酸软骨来。血液或骨髓中的间充质干细胞可代替软骨细胞，因为它们相对易于获取。在此移植中，鉴于hCOMP的GAG和胶原结合活性及其五聚体结构，hCOMP可作为胶原纤维和蛋白聚糖之间的桥粱以更好地掺入基质。COMP还可作为移植的软骨细胞或间充质干细胞的粘着物。在基质中不包括细胞的情况下，COMP可作为促动剂，促使细胞进入基质。由于维生素D3可在COMP置入基质之前与其结合，因此COMP还作为输送和缓释此分化剂的手段，从而有助于保持和促进软骨细胞或间充质细胞成熟与分化，产生在软骨未遭受损伤、无病理变化或其它损害的个体内发现的软骨基质类型。这种软骨在此称作天然发生的未损伤的软骨(即“正常”软骨)。
实施例1人重组COMP(hCOMP)的表达与纯化将编码全长人COMP的DNA(Newton等，1994)克隆入pcDNA3.1+载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将所得克隆用Lipotectin试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)转染至人胚肾细胞(293细胞)中。在G418的选择下分离稳定转染物的单一集落并扩展。细胞在加入10％胎牛血清(FBS)的Dulbeceo’s修改的Eagle’s培养基(DME)(Life Technologies)中生长直至接近铺满。然后将细胞用DME冲洗2次，并在加入2mML-谷氨酰胺的DME中生长48小时。收集条件培养基进行纯化。为纯化hCOMP，将条件培养基加样于肝素-琼脂糖凝胶层析柱中，并用含有≥2mM CaCl2的Tris缓冲盐水充分冲洗。然后通过高盐溶液从层析柱洗脱结合物，高盐溶液是在含有2mM CaCl2的10mMTris，pH7.5中溶液缓冲的，浓度高于0.5M的NaCl溶液。或者，将条件培养基通过30％硫酸铵在4℃沉淀过夜。将沉淀物重悬浮于含有2mMCacl2的TBS中，并加样于在含有2mM CaCl2的TBS中的10-20％线性蔗糖梯度上，并通过在BeckmanSW 41 Ti转子中以38,000rpm离心20-24小时而分离。集合含有COMP的部分。将该部分在-80℃贮存直至进一步使用。
当人胚肾293细胞用全长人COMP cDNA转染时，它们能加工和分泌hCOMP(图1)。此分泌和纯化的hCOMP是五聚体。未转染的293细胞通过用抗COMP的多克隆抗体F8(Hecht等，1998)免疫印迹鉴定，其不能合成任何内源性COMP。此纯化的蛋白质与人软骨和肌腱的COMP在SDS-PAGE中一起迁移。
实施例2 COMP作为钙结合蛋白的分析根据COMP存在3型重复序列及对TSP1的研究，COMP推定为与钙结合。然而，最初在EDTA存在下纯化的COMP不与钙结合，且不能由于钙的功能而示出明显的构象差异(Rosenberg等，1998；Hauser等，1995；Morgelin等，1992；DiCesare等，1994)。直接钙结合，旋转投影电子显微镜(EM)和限制性胰蛋白酶消化用于显示COMP是钙结合蛋白，并在不同钙浓度下呈现不同构象。
将在含有2mM CaCl2的Tris缓冲盐水中的纯化的COMP用70％甘油，0.15M乙酸铵和0.2mM CaCl2稀释。将未用CaCl2制备的等价的蛋白质样品在与70％甘油和0.15M乙酸铵混合之前，调节到含5mM EDTA。然后将样品喷涂至新鲜切割的云母片上并用铂旋转投影。hCOMP的旋转投影EM图象(图2)示出重组hCOMP是五聚体。在存在钙下，hCOMP具有紧凑的结构使其难以分解为五个亚单位。在EDTA下，hCOMP采取一延伸的构象。从链间二硫键至C-球末端的hCOMP的未校正臂长，在钙存在下是19.9±2.6nm，在EDTA存在下是30.4±3.3nm(各为20次测量的平均值±标准偏差)。这些结果提示在钙充满状态下纯化的hCOMP，当钙被从分子中螯合时，hCOMP将经历构象变化。
在各种钙浓度下进行hCOMP的限制性胰蛋白酶消化。在hCOMP的消化中观测到分子量为27，36，50，55，62和67kDa的6个胰蛋白酶消化的片段。在低钙浓度下(在1-25μM范围)，hCOMP易于被胰蛋白酶消化为27kDa和36kDa的两个小片段(图3)。纯化的重组COMP用含有2mM或0.5mMCaCl2的Tris缓冲盐水透析。将EDTA加入16μg每种蛋白质中以使最终游离Ca2+浓度为μM级。在0℃以酶底物为1∶100的比率进行胰蛋白酶消化20小时。加入还原SDS样品缓冲液终止消化，并通过SDS-PAGE分离多肽。当钙浓度提高至50-100μM时，hCOMP被消化为50kDa和55kDa的中等条带。当钙浓度高于150μM时，随着钙深度的增加，hCOMP开始出现62kDa和67kDa的条带。此67kDa的条带成为在毫摩尔钙浓度下的主要条带。此条带不存在于影响其钙结合活性的COMP突变体中。
COMP与钙的直接结合用45CaCl2通过平衡透析而测定。简而言之，将TSP1和COMP在Slide-A-Lyzer透析装置(Pierce，Rockford，IL)中，用含有0.3mM CaCl2和10mCi/ml45CaCl2的透析液透析。在透析结束时，取10ml蛋白质样品和透析液进行闪烁计数和蛋白质测定。计算钙离子结合数。在0.3mM游离钙浓度下，每个TSP1亚单位结合10±2个钙离子(4组数据的平均值±SD)。这与前述报道中11-12个钙离子与每个TSP1亚单位结合相一致(Lawler和Simons，1983；Misenheimer和Mosher，1995)。在相同条件下，每个COMP亚单位结合11±1个钙离子。这是第一次显示出COMP结合钙离子，且此结果与在COMP及其它TSP家族成员中存在高度同源的3型钙结合重复序列相一致。
实施例3COMP作为糖胺聚糖(GAG)结合蛋白的分析为探查hCOMP尽管缺失NH2端肝素结合功能域是否仍可以是GAG结合蛋白，及3型钙结合重复序列的构象是否影响hCOMP功能，我们在钙或EDTA存在下测试了hCOMP与软骨中发现的常见GAGs的相互作用。
用亲和共电泳(ACE)(San Antonio等，1993)确定hCOMP与肝素及其它商购的衍生自组织来源的GAGs，包括来自软骨的硫酸软骨素的结合，并测定Kd值。这些分析结果示于表1。COMP结合低分子量的肝素，Kd为89nM。这与我们所观测到的hCOMP与肝素-琼脂糖凝胶结合相一致。尽管与肝素结合可提示COMP中存在有功能的GAG结合位点，但肝素是高度硫酸化的HS，只在肥大细胞中产生，因而不能真正代表大多数组织中的GAG。为更好地确定GAGs和蛋白聚糖在COMP功能中的作用，用ACE测试硫酸肝素，硫酸角质素和三种硫酸软骨素(软骨素-6-硫酸，C6S；软骨素-4-硫酸，C4S；硫酸皮肤素，DS)在含有2mM钙的情况下与hCOMP的结合情况(表1)。数据表明hCOMP与三种硫酸软骨素亲和结合，Kd在328-583nM范围，而与HS结合较弱(1.2μM)。hCOMP不与硫酸皮肤素结合。
为进一步确定钙结合3型重复序列的构象是否是与GAG结合的关键，测试hCOMP在存在5mMEDTA时与肝素和C6S的结合情况。这些结构表明钙的耗竭降低了hCOMP与GAG的结合。尽管通过EDTA处理，与肝素结合只下降3-5倍，但与C6S结合被此处理破坏。
实施例4COMP作为粘着蛋白的分析一种软骨细胞衍生的细胞系，TCla用于测试COMP是否是粘着蛋白。在单层细胞和藻酸盐培养系统中生长的细胞用于此分析。
为制备进行附着分析的在单层细胞中生长的细胞，将生长在10cm组织培养平板中的细胞用HEPES缓冲盐水(HBS)冲洗2次，并在37℃用1ml在HBS中的0.1mg/mlTPCK处理的胰蛋白酶(Worthington，Lakewood，NJ)处理5分钟。胰蛋白酶消化用2ml在含有1mMCaCl2的HBS(HBS/C)中的0.5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma)终止。将细胞从平板上冲洗下成为单细胞悬浮液，沉降并用胰蛋白酶抑制剂溶液冲洗2次。接下来，将细胞以终浓度为2-2.5×105个细胞/ml重悬浮于含有1％热灭活的小牛血清白蛋白的HBS/C(HI-BSA)中，用于附着分析。
用一种藻酸盐培养系统再分化软骨细胞(Robbins和Goldring，1998；Goldring，1998；Hauselmann等，1994；Bonaventure等，1994)。简而言之，将单层细胞中培养的细胞用胰蛋白酶消化并用磷酸盐缓冲盐水冲洗。将细胞以终浓度为4×106个细胞/ml重悬浮于在0.15M NaCl中的1.2％Keltone，LVCR藻酸盐溶液(Monsanto，St.Louis，MO)中。然后将此细胞悬浮液穿经一个22号针注入102mMCaCl2中。在胶凝作用之后10分钟，用0.15MNaCl冲洗珠，并在含有10％FBS和25μg/ml抗坏血酸盐的1∶1DME/F-12中培养。为制备进行附着分析的在藻酸盐培养系统中培养的细胞，将7-10天藻酸盐珠培养物用55mM柠檬酸盐/0.15MNaCl，pH6.0溶液溶解(Robbins和Goldring，1998)。释放的细胞用PBS冲洗1次并用HBS/C冲洗1次，之后以终浓度为2-2.5×105个细胞/ml将细胞重悬浮于含有1％BSA的HBS/C中。
Immulon II 96孔平板(DYNEX，Cantilly，VA)用在HBS/C或含有5mM EDTA的HBS(HBS/E)中的各种浓度的COMP，在4℃包被过夜。然后将此平板在37℃分别用在HBS/C或HBS/E中的1％HI-BSA封闭30分钟。封闭之后，一些用在HBS/E中的蛋白质包被的孔用在HBS/E中的20mM二硫苏糖醇(DTT)在22℃还原30分钟。将孔用HBS/C冲洗4次，之后在每孔中加入100μl细胞，并在37℃培养2小时。在培养结束时，在相差显微镜的观测后，将平板用HBS/C冲洗3次。贴附于每孔的细胞数量用CyQuant试剂盒(MolecularProbes，Eugene，OR)确定。
就生长于单层细胞中的TCIa细胞而言，钙充满构象的hCOMP以依赖剂量方式支持细胞附着(图4)。在5μg/ml或更高的蛋白质包被浓度，细胞也铺布于蛋白质包被的孔上。在包被前用EDTA处理hCOMP对吸附没有明显的影响(图4)。在包被后还原hCOMP提高其粘着活性，尤其在低COMP包被浓度(图4)。细胞附着并铺布于以1μg/ml包被的二硫苏糖醇处理的COMP上。为鉴别COMP上细胞所附着的区域，测试了融合蛋白的粘着活性，融合蛋白是通过表达具有插入序列的pGEX载体(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala)而产生的，如此融合蛋白包含日本血吸虫的谷胱甘肽-S-转移酶和COMP的2型重复区(Leu 88-Arg 268)或COMP的3型重复区(Arg 268-Ile 517)或COMP的COOH末端区(Asp 518-Ala 957)。TCla细包未显示出与任何这些重组融合蛋白有明显附着。然而，当3型重复融合蛋白在包被之后被还原时，细胞能附着并良好地铺布于平板上(图4，未示出)。RGD肽有效地抑制TCla细胞对hCOMP的附着。
采用再分化TCla细胞的藻酸盐系统，并如在单层细胞中相同方式测试hCOMP支持这些再分化的细胞附着作用。钙充满形式下的野生型hCOMP在藻酸盐珠中培养7-10天后也能支持TCla细胞的附着(图5)。包被前钙的螯合使附着水平降低大约50％(图5)。当COMP在钙耗竭构象中纯化时，其粘着活性就分离自分化状态组织的软骨细胞而言是低的(Sommarin等，1989；Oldberg等，1992；Dicesare等，1994)。
实施例5 COMP作为软骨细胞迁移的化学引诱物的分析人关节软骨细胞用于测试COMP在促进软骨细胞迁移中是否起作用。将COMP以及TSP1和Vitrogen(Cohesion，Palo Alto，CA)在不同浓度，在转孔迁移分析孔(Costar，Camuridge，MA)的膜下面包被。将如附着分析中制备的软骨细胞加样于孔中。在37℃进行迁移分析4小时。用棉签拭去未迁移的残留在孔内的细胞。迁移至膜下的细胞用CyQuant试剂盒(Molecular Probes)定量。
数据(图6)表明COMP是软骨细胞迁移的良好化学引诱物。以低至10μg/ml包被在膜背侧的COMP即促进软骨细胞向其迁移。TSP1也促进软骨细胞迁移，但是在10μg/ml的相同浓度，COMP看起来是比TSP1更强的化学引诱物。基本上是胶原的Vitrogen(Cohesion；Palo Alto，CA)也促进软骨细胞迁移。
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权利要求
1.纯化的hCOMP，其通过如下方法制备a)将编码hCOMP的DNA导入细胞中，从而产生表达hCOMP的细胞；b)将该细胞在适于表达hCOMP的条件下，在培养基中培养，从而产生表达的hCOMP；及c)在钙存在下纯化hCOMP。
2.权利要求1纯化的hCOMP，其中hCOMP是在钙充满条件下纯化的。
3.权利要求1纯化的hCOMP，其中b)步骤中的细胞是在钙充满培养基中培养的。
4.权利要求1纯化的hCOMP，其中hCOMP是在钙浓度为至少300μM的溶液中纯化的或者表达及纯化的。
5.一种纯化hCOMP的方法，包括a)获得编码全长hCOMP的DNA；b)将DNA导入细胞中，从而产生表达hCOMP的细胞；c)将该细胞在适于表达hCOMP的条件下，在培养基中培养，从而产生表达的hCOMP；及d)在钙存在下纯化hCOMP。
6.权利要求5的方法，其中hCOMP是在钙充满条件下纯化的。
7.权利要求5的方法，其中hCOMP是在钙浓度为至少300μM的溶液中纯化的或者表达及纯化的。
8.抗权利要求1的hCOMP或由权利要求6的方法纯化的hCOMP的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
9.包含选自如下一组的一种物质的ELISA试剂盒，所述的组为(a)权利要求1的hCOMP；(b)抗权利要求1的hCOMP的至少一种抗体；(c) 由权利要求5的方法产生的hCOMP；(d)抗由权利要求5的方法产生的hCOMP的至少一种抗体。
10.权利要求1的hCOMP在制备用于修复软骨缺损区软骨的植入物中的应用。
全文摘要
本发明涉及纯化的软骨寡聚基质蛋白(COMP)如人COMP(hCOMP),包括通过在钙存在下(例如在钙充满条件下)纯化的hCOMP。本发明还涉及在钙存在条件下纯化COMP的方法,抗纯化的hCOMP的抗体,以及包含纯化的hCOMP的ELISA试剂盒。本发明纯化的hCOMP可用于制备软骨修复用的植入物。
文档编号C07K14/435GK1340548SQ0112264
公开日2002年3月20日 申请日期2001年6月29日 优先权日2000年6月29日
发明者陈晖 , 约翰·W·劳勒 申请人:陈晖 , 约翰·W·劳勒