专利名称：抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于医学生物工程领域，特别涉及到基因工程抗体领域，是抗体工程的最前沿，即全人源化基因工程抗体方面的研究结果。
抗体工程是当代生物医学的前沿技术，运用免疫学，分子生物学，生物化学，药理学，生物物理学，生物工程及医学等多学科的理论方法，研究抗体的结构和功能。其宗旨在于设计构建新型抗体，应用与临床检验和治疗。
乙型肝炎是一种流行广、难治愈的传染性疾病。目前，全球有3亿乙型肝炎病毒携带者，不完全统计认为中国有3000万慢性乙型肝炎患者。乙型肝炎不仅导致肝硬化，而且是肝癌的原因病毒。病毒性乙型肝炎的临床治疗仅停留在免疫增强剂，没有确切的疗效。近1-2年出现了动物源性单克隆抗体，用于临床治疗乙型肝炎。但是因为物种差异，其具有很强的免疫原性，不仅疗效甚微，更易于引起免疫损伤，严重者导致死亡。既往文献报导，针对乙型肝炎病毒的人-鼠嵌合抗体、移植抗体均已获得，在一定程度上减少了抗体的鼠源性成分。目前这一领域的研究热点集中于全人源化基因工程抗体，以期最大限度去除鼠源性成分，满足临床治疗要求。作为抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的人源Fab抗体也已经获得。但是，乙型肝炎病毒表面抗原具有多种变异，就一种抗原获得的抗体难以有效中和所有病毒亚型，也使其未来的临床应用受到很大限制。而乙型肝炎病毒表面抗原的组分之一，preS1抗原，相对保守的多。而且，临床资料证实，抗preS1抗体的出现与乙型肝炎的临床治愈密切相关。所以，全人源化抗preS1的基因工程抗体的开发具有非常重要的意义。作为基因工程抗体的一种，单链抗体(ScFv)是将抗体重链和轻链的V区通过连接肽连接成的重组蛋白。它的优点在于它是一种分子量最小的活性抗体片段仅为原抗体分子量的1/6。它可以迅速渗透包括肿瘤的各种组织，体内清除速度快，并适于进一步分子改造。而且，它不含有Fc段，能够更特异地结合靶器官。因此，本发明以获得全人源化抗preS1的单链抗体(ScFv)为目的。
本发明的目的是获得全人源化抗preS1的单链抗体(ScFv)，解决动物源性抗体容易引起免疫损伤的问题，同时实现一种抗体拮抗多种病毒亚型。为将来临床治疗乙型肝炎提供可行性的抗体药物。该抗体基因可以与质粒DNA一起稳定、无限复制，以其低成本使未来广泛应用成为可能。
实现本发明的技术方案是选择健康供者60人，每人取外周血2ml，以淋巴细胞分离液提取淋巴细胞，与乙型肝炎病毒preS1抗原共培养，体外致敏后，提取总RNA，经过RT-PCR，以人抗体基因特异引物，PCR扩增人抗体的轻链，重链可变区。再通过Linker基因连接轻链和重链基因，组装成单链抗体基因。利用噬菌体展示技术，将得到的单链抗体基因插入噬粒载体，转化大肠杆菌，构建人源免疫单链抗体库。用乙型肝炎病毒preS1抗原对该抗体库进行固相淘选，获得抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源化单链抗体。
本发明的效果和益处是本发明所陈述的抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源化单链抗体，对人体没有物种差异，不会导致免疫损伤。而且特异性更好，与靶器官的结合率高。在将来的临床治疗中，将发挥现有的抗乙型肝炎病毒的抗体性药物所达不到的效果。
以下是抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源单链抗体基因的核苷酸序列。下划线依次为抗体重链的CDR1、CDR2、CDR3区，和抗体轻链的CDR1、CDR2、CDR3区。CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCCCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACATTCTGGTCAGCTGTGGCCGTGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCACTTCTGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCGTCTGCATCTGCCTTGCTGGCAGCCTCGATCAAGCTCACCTGCACCCTAAGCAGTGAGCACAGCACCTACACCATCGAATGGTATCAACAGAGACCAGGGAGGTCCCCCCAGTATATAATGAAGGTTAAGAGTGATGGCAGCCACAGCAAGGGGGACGGGATCCCCGATCGCTTCATGGGCTCCAGTTCTGGGGCTGACCGCTACCTCACCTTCTCCAACCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGAGTATCACTGTGGAGAGAGCCACACGATTGATGGCCAAGTCGTA以下用最佳实施例对本发明作详细说明实施例1-5为人源抗前S1单链抗体ZG1的筛选方法；实施例6-7为人源抗前S1单链抗体ZG1的功能鉴定；实施例8为人源抗preS1单链抗体ZG1的基因特征。
实施例1淋巴细胞的体外致敏选择健康供者60人，每人取外周血2ml，以淋巴细胞分离液提取淋巴细胞。经细胞计数，共得到2.5×108白细胞。与preS1(100μg/ml)在含10％人AB型血清、1％PHA的RPMI1640中共培养5天，镜下可见分裂相。离心收集淋巴细胞，计数显示增殖1倍，为5×108细胞，作为免疫抗体库的原料。
实施例2人源单链抗体基因片段的扩增将致敏的淋巴细胞以TRIZOL REGENT(Gibico)提取RNA。首先以反转录试剂盒合成cDNA第一链。之后以半套式PCR扩增抗体基因可变区基因片段。首先以一组特异性IgG、κ、λ链引物PCR扩增重链(VH+CH1)、轻链(VL+CL)基因片段，约为700bp。PCR条件为94℃1分钟，(98℃10秒，52℃30秒，72℃30秒)×35循环。引物如下引物 碱基序列HZ5′IGGGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGHZ5′II GGGGCCCAGCCGGCCCAGGTCACCTTGARGGAGTCTGGHZ5′III GGGGCCCAGCCGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCYGGHZ5′IV GGGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGSAGTCGGGHZ5′VGGGGCCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGHZ3′GACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGGLκ5′I GACATCCAGATGACCCAGTCLκ5′II GATATTGTGATGACTCAGTCLκ5′III GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCLκ3′ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCLλ5′I CAGTCTGTSBTGACKCAGCCRCCLλ5′II TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCCLλ5′III MASGYTRTRCTGACTCARSMMCMLλ3′TGAAGATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTHZ5′I～HZ5′IV为重链5’端引物。HZ5′I与VH的1、7族同源，HZ5′II与VH的2、6族同源，HZ5′III、HZ5′IV、HZ5′V，分别与VH的3-5亚族同源。HZ3’G为重链3’端引物，与μ链的铰链区同源。Lκ3’I、Lκ3’II、Lκ3’III为κ链5’端引物，分别与Vκ的1-3亚族同源，Lκ3’为κ链3’端引物；Lλ5′I、Lλ5′II、Lλ5′III为λ链5’端引物，与Vλ的1-7亚族同源，Lλ3′为λ链3’端引物。下划线为SfiI的酶切位点。
再以可变区的特异性引物PCR扩增VH，Vκ、Vλ。PCR条件为94℃1分钟，(98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒)×35循环。所获得的DNA片段(330bp左右)经胶纯化后回收并电泳定量。引物如下JH TGAGGAGACGGTGACCAKKGTBCCJκ1GGGCGGCCGCACGTTTGATWTCCACYTTGGTCCCJκ2GGGCGGCCGCACGTTTRATCTCCAGYYKKGTCCCJλ GGGCGGCCGCACCTARRACGGTSAGCTKGGTJH为VH3’端引物，Jκ1、Jκ2为Vκ3’端引物，Jλ为Vλ3’端引物。下划线为NOTI的酶切位点。
实施例3单链抗体基因的组装首先合成linker模板5’CTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGC TCT GGC GGT AGT GCA CAG3’再以6组引物PCR扩增。PCR条件94℃1分钟，(98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒)×35循环。引物如下。
引物碱基序列LJH CMMYGGWCACCGTCTCYTCATCGAGTGGTGGAGGCGGLVκ1 GACTGGGTCATCTGATGTCGTGCACTACCGCCAGAGCLVκ2 GACTGAGTCATCACAATATCGTGCACTACCGCCAGAGCLVκ3 GACTGCGTCAACACAATTTCGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ1 CTGMGTCAVSACAGAGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ2 GACTCAGTCGWGTMTGTGCACTACCGCCAGAGCLVλ3 YTGAGTCAGYAYARCGTGCACTACCGCCAGAGCLJH为5’端引物，其余为3’端引物。下划线部分与Linker模板同源，未划线部分分别与VH、Vκ、Vλ同源。
重叠延伸法连接重链、轻链和Linker。取等摩尔重链、轻链DNA，分别和5条linker DNA互为模板，PCR连接，条件94℃1分钟，(98℃10秒，60℃1分钟，72℃1分钟)×10循环。再分别以相应的重链5’端、轻链3’端引物进行扩增。PCR条件94℃1分钟，(98℃10秒，55℃1分钟，72℃30秒)×30循环。电泳检测得到重链-linker-轻链(ScFv)的DNA特异带，≈700bp。胶纯化后回收并定量。
实施例4噬菌体抗体库的构建将单链抗体DNA片段用SfiI和NotI内切酶酶切，用DNA Ligation Kit(TaKaRa公司)连接载体pCANTAB5E与ScFv片段。ScFv(500ng)+pCANTAB5E(500ng)+Solution I(10μl)，16℃过夜连接。连接液经乙醇沉淀，70％乙醇洗沉淀2次以彻底去除盐离子。取预冷的电击杯，加入100μl感受态细胞，2μl去除盐离子的ScFv-pCANTAB5E片段，置于冰上1min。将电击仪设置成25mF，25kV，200ohms。擦干电击杯外壁，插入电击仓，电击1次。重复50次。然后立即加入1ml 2YT-G培养基，将细胞洗出。将转化后的E.coli TG1 37℃ 250rpm摇床培养1h，全部涂TYE-AG平板(含100μg/ml的氨苄和1％葡萄糖的TYE)，37℃过夜。第2天刮取全部克隆，用含30％glycerol的2YT-AG，-70℃保存。经测定，抗体库容量为7×108。
实施例5抗体库的淘选将抗体库以1∶10000比例接种于2YT-AG培养基(含氨苄100μg/ml，葡萄糖2％)，培养至OD600约为0.5。取适量用于M13KO7超感染。(Moi＝10)。离心弃上清，以10ml 2YT-AK培养基(含氨苄100μg/ml，卡那霉素25μg/ml)重悬沉淀并37℃摇床过夜培养。取适量离心去除沉淀，向上清加入1/5体积PEG沉淀噬菌体。与4倍体积的2％MPBS(2％体积脱脂奶粉的PBS)共孵育20分钟后，加入预先以100μg/ml PreS1包被并以2％MPBS封闭的免疫试管。37℃，2小时后倾空试管，以0.5％tween20-PBS洗20次(倒入再立即倒出)，PBS洗20次后，加入10ml对数生长期的E.coli TG1，37℃静置暗养1小时。取100μl菌液，用2YT培养基级数稀释，铺SOB-AG平板，30℃培养过夜，测定容量，以监测次级库有无富集。其余-70℃保存于含15％甘油的2YT培养基。
此淘选过程重复5次。对每一轮淘选后的库容量测定显示，第1轮淘选后得到6×104次级库，第2轮后得到8×105，第3轮后得到5×106，第4轮后得到6×106，第5轮后得到5×106次级库。该结果显示了富集性淘选的过程，初步说明淘选有效。
实施例6多克隆酶连免疫吸附实验(ELISA)对每一轮淘选后的抗体库进行多克隆ELISA检测。10μg/ml PreS1 4℃过夜包被96孔酶标板。PBS洗板3次，3％BSA-PBS 37℃封闭2小时。PBS洗板3次。取每一轮淘选后保存的噬菌体10μl，溶于200μl 3％BSA-PBS，加入酶标板，室温孵育2小时。以0.05％tween20-PBS洗板5次，加入1∶10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗M13噬菌体抗体，室温放置60分钟，0.05％tween20-PBS洗板5次，加入ABTS显色底物，室温放置20-60分钟。每孔加入50μl1M硫酸终止反应后酶标仪读数。结果显示，酶标仪测定的OD600值从第1轮淘选后的0.23递增至第5轮后的0.88。进一步说明淘选到了抗preS1的单链抗体。
实施例7竞争ELISA检测抗体片段的亲和力于第5轮淘选后取ELISA鉴定的阳性克隆，植入E.coli HB2151，37℃摇床30分钟后，于SOBAG-N平板化线培养至可见单克隆。取单克隆植入5ml2YT-AG，30℃摇床培养过夜。室温1500g离心20分钟，弃上清。以50ml2YT-AI重悬沉淀，30℃摇床6小时。室温1500g离心20分钟，上清即含可溶性单链抗体片段。同上包被及封闭96孔酶标板。取上述含可溶性抗体片段的上清液与级数稀释5次的PreS1过夜共孵育达到平衡后，加入包被并封闭好的96孔酶标板。同上方法进行ELISA检测。竞争ELISA结果显示该抗体的亲和常数为10-6M-10-7M，该抗体命名为ZG1。
实施例8人源抗乙型肝炎病毒preSI抗原的单链抗体的基因序列分析对ZG1进行序列测定(TAKARA大连公司)，结果经DNAPLOT软件分析显示，其重链属于人抗体重链第4亚族，轻链属于人抗体λ链第4亚族。
权利要求
1.一种抗乙肝病毒preS1抗原的人源单链抗体，其特征在于a)抗体基因的序列为该抗体特有的，决定了该抗体特异性识别乙肝病毒preS1抗原的特征，基因序列如下CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTAGTAACTGGTGGAGTTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCTATCATAGTGGGAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACAAGTCCAAGAACCAGTTCCCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGACATTCTGGTCAGCTGTGGCCGTGTTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGCACTTCTGCCTGTGCTGACTCAGCCCCCGTCTGCATCTGCCTTGCTGGGAGCCTCGATCAAGCTCACCTGCACCCTAAGCAGTGAGCACAGCACCTACACCATCGAATGGTATCAACAGAGACCAGGGAGGTCCCCCCAGTATATAATGAAGGTTAAGAGTGATGGCAGCCACAGCAAGGGGGACGGGATCCCCGATCGCTTCATGGGCTCCAGTTCTGGGGCTGACCGCTACCTCACCTTCTCCAACCTCCAGTCTGACGATGAGGCTGAGTATCACTGTGGAGAGAGCCACACGATTGATGGCCAAGTCGTAb)通过体外致敏的方法获得preS1抗原免疫的人淋巴细胞，以此为原料构建了人源preS1抗原免疫的单链抗体库，c)该抗体来自preS1抗原对人源免疫单链抗体库的固相淘选。
全文摘要
本发明属于医学生物工程领域,特别涉及到基因工程抗体领域。本发明是从免疫人源单链抗体库经过固相淘选获得的抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源单链抗体(ScFv),其特征在于此重组抗体是由其基因轻链和重链的可变区中的特异序列决定,具有识别乙型肝炎病毒preS1抗原的的功能。可以用于临床治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病。
文档编号C07K16/18GK1335324SQ0112797
公开日2002年2月13日 申请日期2001年7月24日 优先权日2001年7月24日
发明者安利佳, 张志超, 胡学军 申请人:大连理工大学