专利名称：1,2－二酰基－3－(6－脱氧－6－磺酸基－α－D－吡喃型葡萄糖苷基)－sn－甘油脂的制 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法。
背景技术：
艾滋病(AIDs)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的全身免疫缺陷性疾病，为全球最危险的传染病之一。自1981年发现首例患者至今，全球感染者已接近4000万，且每天仍以16000新感染者的速度递增，约90％新感染者出现在发展中国家，亚洲占新感染者的42％。艾滋病患者全身免疫功能低下，易患各种并发症而死亡。目前，美国食品及药物管理局(FDA)批准上市的抗艾滋病药物仅有十几个，主要是逆转录酶抑制剂，易出现耐药性，几个药物联合应用虽能延缓耐药性的出现，但依然存在毒副作用大、价格昂贵的缺点，不能有效控制艾滋病的迅速蔓延。研究发现，海藻中1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂是HIV的很强的抑制剂，其作用机理是干扰病毒和细胞的吸附、抑制病毒逆转录酶活性、抑制合胞体形成。目前，1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的提取和分离，主要是从微藻如蓝绿藻中提取，采用硅胶柱多次分离的方法；原料来源有限而且制备方法不适于大量提取和分离。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单、原材料便宜、适于大规模生产1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是按如下步骤操作1.海藻总脂的提取用有机溶剂浸提粉碎的海藻，提取液中加入0.3～1％的氯化钾溶液分层，将有机相减压蒸干，得到海藻总脂；2.二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-cellulose)经酸碱预处理后，用甲醇、氯仿清洗，用乙酸处理，悬浮在甲醇中装柱；3. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的制备取所述海藻总脂溶于3∶2至1∶1体积比的氯仿-甲醇混合溶剂，加到层析柱柱床表面，继续用所述混合溶剂洗脱掉杂质，再用体积比为12∶8∶(0.5～1.5)的CHCl3∶CH3OH∶NH3·H2O混合溶剂洗脱，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品；4. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的纯化1)将所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品溶于用1∶1体积比配制的氯仿-甲醇中，加入0.3～1％ KCl溶液，其最后氯仿-甲醇-水的比例为1∶1∶(0.5～1)，离心分层，弃掉水相，除去乙酸铵；2)按每克粗品50g～100g硅胶的比例，称取100～200目硅胶，在100～120℃下活化1.5～3小时，冷却后悬浮在冷丙酮中装柱，将所述纯化后的1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品按0.3～1.0g/ml溶于甲醇中上柱，用冷丙酮洗脱，将丙酮洗脱液减压蒸干后得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的纯品；所述海藻总脂的提取，具体为将粉碎后的海藻，加入1～4倍体积的氯仿∶甲醇混合溶剂，氯仿∶甲醇体积比为1∶1，进行溶剂提取，减压蒸干滤液，然后再加入2～3倍蒸干物体积的氯仿-甲醇混合溶剂，氯仿∶甲醇体积比为1∶1，进行溶解，再加0.3～1％的KCl溶液，最后的氯仿∶甲醇∶水体积比例为1∶1∶0.5～1，静置分层，弃去水相和不溶物，将有机相减压蒸干，得到海藻总脂；所述二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱，具体为按每分离1g总脂需2.0～5g二乙基氨基乙基纤维素计，称取二乙基氨基乙基纤维素，先后分别用1M HCl、1M NaOH浸泡1.5～3小时，再分别用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的甲醇-氯仿混合液清洗，抽滤至干，悬浮在冰乙酸中5～12小时后将乙酸抽滤掉，并用甲醇清洗二乙基氨基乙基纤维素，至除去冰乙酸；然后悬浮在甲醇中装柱；新柱装成后，先用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的氯仿清洗，然后再用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的、体积比3∶2的氯仿-甲醇混合溶剂平衡交换柱；所述氯仿可以用正己烷代替，甲醇可以用乙醇代替；所述二乙基氨基乙基纤维素可以用二乙基氨基乙基葡聚糖代替；所述海藻原料为石莼、松节藻、马尾藻、扁江蓠；所述海藻原料为海藻干品或新鲜海藻；所述海藻为新鲜海藻时，海藻总脂的提取先将海藻冷冻干燥，再粉碎。
本发明具有如下优点1.产品纯度高，无毒、副作用。本发明提供的1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备工艺是国内外首次建立的制备方法，采用本发明制备的产品1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂不仅能够抑制病毒进入细胞，并可抑制病毒逆转录酶活性，是一作用于多环节的抗艾滋病活性物质。本发明的产品与目前使用的抗艾滋病药物相比，作用位点多，效果好，不易出现抗药性；另外，该产品来自于海藻，属于纯天然，没有毒副作用；其获得的1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂纯度达到97％以上。
2.原料来源广泛、价格便宜。我国有丰富的海藻资源，其中大型海藻具有生物量大，采集方便等特点，由于本发明以大型海洋藻类为原料，所以所采用的原料丰富，便于研究开发；另外，本发明采用的化学试剂主要是氯仿、甲醇和丙酮等常见试剂，易得、而且价格亦便宜；还有，本发明采用的分离材料主要是硅胶和二乙基氨基乙基纤维素；硅胶价格便宜，易得，而二乙基氨基乙基纤维素可以再生后，多次重复使用。
3.工艺简单，适于大规模生产。本发明制备工艺可以大大减少制备流程中有机溶剂的用量，提取分离工艺简单，采用本发明工艺可以大量制备1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂，对我国的海洋生物技术产业和海洋药物产业的发展具有促进作用，能够产生巨大的经济效益和社会效益。
图1为本发明一个实施例红外光谱图。
图2为本发明一个实施例核磁共振氢谱图。
图3为本发明一个实施例核磁共振碳谱图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例11.海藻总脂的提取取1公斤新鲜的石莼，冷冻干燥后粉碎，加氯仿∶甲醇(1∶1)1L浸泡24小时，过滤，滤渣再用氯仿∶甲醇(1∶1)1L二次浸泡10小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发器减压蒸干，然后溶于氯仿-甲醇(1∶1)200mL，并加入0.88％的KCl溶液，最终氯仿∶甲醇∶水的比例为1∶1∶0.9，静置分层，除去杂质，将有机相减压蒸干，得到15.5克海藻总脂；2.二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱称取15g二乙基氨基乙基纤维素，先后分别用1M HCl、1M NaOH浸泡1.5小时，再分别用2倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的甲醇和氯仿清洗，用布氏漏斗抽滤至干，悬浮在冰乙酸中10小时后将乙酸抽滤掉，并用甲醇清洗二乙基氨基乙基纤维素，至除去冰乙酸；向层析柱中加入约1/3高度的甲醇，在搅拌下，将悬浮在甲醇中的二乙基氨基乙基纤维素倾入柱中，待底面上沉积1～2cm的柱床后，打开柱的出口，随着甲醇的流出，上面不断加悬浮液，二乙基氨基乙基纤维素颗粒便连续缓慢沉降，最后在柱床表面盖一片滤纸；新柱装成后，先用2倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的氯仿洗，然后再用3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的、体积比3∶2的氯仿-甲醇混合溶剂平衡交换柱；3. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的制备称取所述海藻总脂6.624g溶于10ml氯仿-甲醇混合溶剂(氯仿与甲醇的体积比为3∶2)上样，用50ml混合所述溶剂洗脱杂质，再用100mlCHCl3∶CH3OH∶NH3·H2O(12∶8∶1.5v/v/v)洗脱，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品1.595g；4. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的纯化1)将1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品溶于10ml 1∶1氯仿-甲醇中，加入9ml 0.88％ KCl溶液，离心分层，弃去水相，除去乙酸铵，有机相减压蒸干，得到第一步纯化的粗品；2)将100～200目硅胶在110℃下活化2小时，冷却后悬浮在冷丙酮中装柱，称取1.520g所述纯化的粗品，按0.34g/ml溶于5ml甲醇上硅胶柱(14cm×1.5cm)，用150ml温度为4℃冷丙酮洗脱，将洗脱液减压蒸干，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂纯品0.595g。
1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的纯度为97.3％。
产率0.5951.520×1.595×1.9056.624×0.2257×100%=79.56%]]>其中0.2257为每克石莼总脂含该化合物0.2257mmol；1.905为每克纯化合物含1.905mmol；其红外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱分别参见图1～3。
实施例21.海藻总脂的提取取0.3公斤松节藻干品，粉碎后加正己烷-乙醇混合溶剂(1∶1体积比)1L浸泡24小时，过滤，滤渣再用正己烷-乙醇(1∶1)混合溶剂1L二次浸泡10小时，过滤，合并滤液，用旋转蒸发器减压蒸干，然后溶于正己烷∶乙醇(1∶1)100mL，并加入0.4％的KCl溶液，最终正己烷∶乙醇∶水的比例为1∶1∶0.6，静置分层，除去杂质，将有机相减压蒸干，得到4.5克海藻总脂；2.二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱称取15g二乙基氨基乙基葡聚糖，先后分别用1M HCl、1M NaOH浸泡3小时，再分别用3倍于二乙基氨基乙基葡聚糖体积的乙醇和正己烷清洗，用布氏漏斗抽滤至干，悬浮在冰乙酸中8小时后将乙酸抽滤掉，并用乙醇清洗二乙基氨基乙基葡聚糖，至除去冰乙酸；向层析柱中加入约1/3高度的乙醇，在搅拌下，将悬浮在乙醇中的二乙基氨基乙基葡聚糖倾入柱中，待底面上沉积1～2cm的柱床后，打开柱的出口，随着乙醇的流出，上面不断加悬浮液，二乙基氨基乙基葡聚糖颗粒便连续缓慢沉降，最后在柱床表面盖一片滤纸；新柱装成后，先用3倍于二乙基氨基乙基葡聚糖体积的氯仿洗，然后再用3倍于二乙基氨基乙基葡聚糖体积的、体积比3∶2的氯仿-乙醇混合溶剂平衡交换柱；3. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的制备称取所述海藻总脂4.5g溶于10ml氯仿-乙醇混合溶剂(氯仿与乙醇的体积比为3∶2)上样，用50ml混合所述溶剂洗脱杂质，再用100mlCHCl3∶C2H5OH∶NH3·H2O(12∶8∶0.5v/v/v)洗脱，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品1.36g；4. 1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的纯化1)将1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品溶于10ml 1∶1正己烷-乙醇中，加入0.4％ KCl溶液，正己烷-乙醇-水的比例为1∶1∶0.6，离心分层，弃去水相，除去乙酸铵，有机相减压蒸干，得到第一步纯化的粗品；2)将100～200目硅胶在120℃下活化3小时，冷却后悬浮在冷丙酮中装柱，1.520g所述纯化的粗品，按约0.3g/ml溶于5ml乙醇上硅胶柱(14cm×1.5cm)，用150ml冷丙酮洗脱，冷丙酮温度为5℃，将洗脱液减压蒸干，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂纯品0.505g。
1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的纯度为98.3％。
产率0.505×1.9054.50×0.2826×100%=75.60%]]>其中0.2826为每克松节藻总脂含该化合物0.2826mmol；1.905为每克纯化合物为1.905mmol。
本发明所述海藻原料还可为石莼海藻干品，新鲜松节藻，亦为马尾藻、扁江蓠的干品或鲜品。
权利要求
1.一种1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于按如下步骤操作1)海藻总脂的提取用有机溶剂浸提粉碎的海藻，提取液中加入0.3～1％的氯化钾溶液分层，将有机相减压蒸干，得到海藻总脂；2)二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱二乙基氨基乙基纤维素经酸碱预处理后，用甲醇、氯仿清洗，用乙酸处理，悬浮在甲醇中装柱；3)1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的制备取所述海藻总脂溶于3∶2至1∶1体积比的氯仿-甲醇混合溶剂，加到层析柱柱床表面，继续用所述混合溶剂洗脱掉杂质，再用体积比为12∶8∶(0.5～1.5)的CHCl3∶CH3OH∶NH3·H2O混合溶剂洗脱，得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品；4)1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品的纯化(1)将所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品溶于用1∶1体积比配制的氯仿-甲醇中，加入0.3～1％KCl溶液，其最后氯仿-甲醇-水的比例为1∶1∶0.5～1，离心分层，弃掉水相，除去乙酸铵；(2)按每克粗品50g～100g硅胶的比例，称取100～200目硅胶，在100～120℃下活化1.5～3小时，冷却后悬浮在冷丙酮中装柱，将所述纯化后的1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂粗品按0.3～1.0g/ml溶于甲醇中上柱，用冷丙酮洗脱，将丙酮洗脱液减压蒸干后得到1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的纯品。
2.按照权利要求1所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述海藻总脂的提取，具体为将粉碎后的海藻，加入1～4倍体积的氯仿∶甲醇混合溶剂，氯仿∶甲醇体积比为1∶1，进行溶剂提取，减压蒸干滤液，然后再加入2～3倍蒸干物体积的氯仿-甲醇混合溶剂，氯仿∶甲醇体积比为1∶1，进行溶解，再加0.3～1％的KCl溶液，最后的氯仿∶甲醇∶水体积比例为1∶1∶0.5～1，静置分层，弃去水相和不溶物，将有机相减压蒸干，得到海藻总脂。
3.按照权利要求1所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述二乙基氨基乙基纤维素的预处理与装柱，具体为按每分离1g总脂需2.0～5g二乙基氨基乙基纤维素计，称取二乙基氨基乙基纤维素，先后分别用1M HCl、1MNaOH浸泡1.5～3小时，再分别用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的甲醇-氯仿混合液清洗，抽滤至干，悬浮在冰乙酸中5～12小时后将乙酸抽滤掉，并用甲醇清洗二乙基氨基乙基纤维素，至除去冰乙酸；然后悬浮在甲醇中装柱；新柱装成后，先用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的氯仿清洗，然后再用2～3倍于二乙基氨基乙基纤维素体积的、体积比3∶2的氯仿-甲醇混合溶剂平衡交换柱。
4.按照权利要求1、2或3所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述氯仿可以用正己烷代替，甲醇可以用乙醇代替。
5.按照权利要求1或3所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述二乙基氨基乙基纤维素可以用二乙基氨基乙基葡聚糖代替。
6.按照权利要求1或2所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述海藻原料为石莼、松节藻、马尾藻、扁江蓠。
7.按照权利要求6所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述海藻原料为海藻干品或新鲜海藻。
8.按照权利要求1或2所述1，2-二酰基-3-(6-脱氧-6-磺酸基-α-D-吡喃型葡萄糖苷基)-sn-甘油脂的制备方法，其特征在于所述海藻为新鲜海藻时，海藻总脂的提取先将海藻冷冻干燥，再粉碎。
全文摘要
一种1，2－二酰基－3－(6－脱氧－6－磺酸基－α－D－吡喃型葡萄糖苷基)－sn－甘油脂的制备方法，步骤1)用有机溶剂浸提粉碎海藻，滤液中加入氯化钾水溶液分层，将有机相减压蒸干，得海藻总脂；2)二乙基氨基乙基纤维素经酸碱预处理后用甲醇、氯仿清洗，乙酸处理，悬浮在甲醇中装柱；3)将海藻总脂溶于氯仿－甲醇(C－M)混合溶剂上柱，用C－M混合溶剂除杂质，再用CHCl
文档编号C07H17/04GK1408718SQ01128229
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月29日 优先权日2001年9月29日
发明者范晓, 韩丽君, 李宪璀, 娄清香 申请人:中国科学院海洋研究所