专利名称：丙型肝炎病毒第一高变区抗原及其融合抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及一系列具有高交叉反应性的丙型肝炎病毒第一高变区抗原及含多个不同第一高变区的融合抗原。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV)基因是1989年首次克隆成功，自此掀起了研究HCV的热潮(Choo QL.et al.Isolation of a cDNA clone derived from blood-bornenon-A，non-B viral hepatitis genome，Science，1989；244359-362)。HCV病毒为单链RNA病毒，全长约9500个碱基，编码一个约为3000个氨基酸残基的多蛋白前体，继而在宿主及病毒基因编码蛋白酶的作用下，加工成C、E1、E2、NS2-5等多种成熟蛋白。HCV整个基因组具有很高的变异性，其中位于E2区N端的27个氨基酸变异性最大，通常称为第一高变区(HVR1)，由于HVR1是目前已知丙型肝炎病毒中唯一的中和性抗原表位(Farci P.etalPrevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees after antibody-mediated invitro neutralization.Proc Natl Acad Sci USA，1994；9615394-15399)，其抗体的水平与病情有关(Zibert.A etal Antibodies in Human Sera Specific toHypervariable Region 1 of Hepatitis C Virus Can Block Viral Attachment，Virology，1995；203653-661)，所以HVR1抗体可能和疾病转归关系密切。利用RT-PCR等方法将HVR1的基因克隆表达后可用于HVR1抗体水平检测，但该方法程序复杂，并且只能检测单株病毒的抗体。这样，至今仍然没有简单而有效的检测HVR1抗体的手段，亟需具有极高交叉反应性的HVR1抗原，通过ELISA对病人的HVR1抗体进行检测。
丙型肝炎病毒是一种危害性极大的病毒，慢性化比率高达70％，其中有50％的病人发展为肝硬化和肝细胞癌，目前对丙型肝炎的治疗方法主要是干扰素或干扰素与病毒唑合并使用，价格昂贵，副作用大，疗效差(Fried MW andHoofnagle JH.Therapy of hepatitis C，Semin Liver Dis，1995；1582-91)。所以丙型肝炎疫苗的研制倍受关注。但也由于丙型肝炎病毒的中和性表位位于变异性最大的HVR1，这给HCV疫苗的研制带来很大困难，成功的关键在于获得高免疫交叉反应的高变区抗原。最近有不少研究证明HVR1仍具有一定的交叉免疫反应性，并初步筛选到这样一些HVR1(Puntoriero G et al.Towards asolution for hepatitis C virus hypervariabilitymimotopes of the hypervariableregion 1 can induce antibodies cross-reacting with a large number of viral variants，J.EMBO，1998；173521-3533)。但我们认为通过一条HVR1引起的交叉性毕竟是有限的，我们设想如果能将几个具有高交叉免疫反应性的HVR1片段用基因重组的方法连到一起，可能会获得可与绝大多数病人血清发生免疫反应的多肽，可为疫苗研究提供真正有效的免疫原。
本发明的目的是提供一系列具有高交叉反应性的单片段的重组HVR1抗原。
本发明的另一个目的是提供一个高交叉反应性的含多个HVR1的融合抗原。
发明内容
为实现上述目的，本发明的发明人从大量文献报道(国内与国外)不同的HVR1序列中，筛选出可能具有高交叉反应性的HVR1，合成基因重组表达，并实验验证其交叉反应性，它们的氨基酸序列为STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQKSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK
DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQKGTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQNTTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQNETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQNNTYVTGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQNTTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQNDTTVTGGQAARTTQSFTSLFPPGPSQK或QTTTTGGSASHAVSSLTGLFSPGSKQN。
用基因重组的方法将其中的两个或两个以上的序列连接在一起，可获得具有更高交叉反应的重组HVR1融合抗原，优选的是将以下四个HVR1基因用连接臂连接后，表达的重组融合抗原STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSGGGSSGGGSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKGGGSSGGGSSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQKGGGSSGGGSETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN本发明可通过以下技术方案得以实现。
利用Goldkey计算机软件(军事医学科学院编写，有市售)精选了12条代表性HVR1抗原序列，合成基因后，分别重组表达，然后用ELASA确定其与血清的交叉反应性，并从中选择交叉反应性高的HVR1序列用于组合连接。
因为HVR1基因片段只有81个碱基，不是很长，故抗原基因的合成采用化学合成法。化学合成基因较PCR法可省去提取模板基因的操作，方便快速。更主要也只有用化学合成才可以根据需要获得相应序列的基因，同时也可选择在大肠杆菌的偏性密码子合成HVR1基因，有利于在E.coli中获得高效的表达，这是PCR法不能达到的。选用化学合成法，根据抗原表位的肽序列，和大肠杆菌中高表达的偏性密码子，推断出核苷酸序列加以合成。化学法合成基因一次能合成的长度有限，一股不超过60个碱基。对HVR1的基因可先合成两条3’端有一段互补重叠的基因片段，将二者退火后用聚合酶延伸，获得正负双链DNA基因。
为了便于基因间的相互连接，并在连接后可获得较好的抗原活性，在抗原表位间需有一连接臂，我们在表位的上下游分别加上G-G-G-S和S-G-G-G，所以在合成基因时应加上相应的基因。最后为了便于基因克隆到表达载体，还合成了两条和连接臂相配的通用引物，引入两个酶切位点Xho I和Xba I，以适合表达载体pBVIL1(参见中国专利申请表达载体pBVIL1及其构建方法和用途，申请号00100695.9)。
合成基因的两端已引入酶切位点Xho I和Xba I，所以各基因片段均可方便地用双酶切法插入载体pBVIL1中，构建相应的表达质粒。构建的表达质粒需用PCR法鉴定，以证明各基因片段已获正确地插入。
各单片段HVR1抗原表达质粒，转化E.coli HB101后，通过热诱导培养，取全菌液进行SDS-PAGE鉴定，证明各表达质粒均已获得了高效的表达，再经离子交换柱及凝胶过滤纯化，均可获得电泳纯的单片段的HVR1抗原纯品。用ELASA检测单个片段与HCV病人血清的交叉反应性，选出其中相对高交叉反应性的HVR1抗原序列，用于下一步的连接。
多HVR1融合抗原表达质粒是在各HVR1抗原表达质粒的基础上构建而成的。把其中一个含HVR1-1#基因的质粒作为载体；另一含有基因HVR1-2#的质粒作为模板，用含有Spe I的通用引物及含有BamH I的原IL-1基因3’端引物，扩增出含有HVR1-2#和部分IL-1的基因片段，插入用Xho I和Xba I双切的HVR1-1#基因的后面，获得含有HVR1-1#和HVR1-2#两个基因的质粒。由于新质粒中，HVR1-1#和HVR1-2#基因间的连接是由互补酶Xba I和Spe I之间的相连，连接后酶切位点不复存在，因此，新质粒又可作为新的载体，与另一含有HVR1-n#基因质粒的扩增基因片段连接。重复三次，可获得质粒pBVIL1/HVR1-1#+2#+4#+8#。转化、诱导、表达后，获得纯化的HVR1四片段融合抗原。
实验结果证明，本发明的不同的HVR1抗原均有一定的交叉性，多HVR1融合抗原的交叉性更有本质的提高，与随机HCV病人血清的交叉反应率高达到90/91，显著高于目前文献上60-75％交叉率的报道(Watanabe K et al.Thehypervariable Region 1 Protein of Hepatitis C Virus Broadly Reactive with Sera ofPatients with Chronic Hepatitis C Has a Similar Amino Acid Sequence with theConsensus Sequence，Virology，1999；264153-158)，是真正意义的高交叉反应的HVR1融合抗原。
附图简要说明
图1为HVR1抗原间连接及多表位抗原表达质粒构建示意2为HVR1四次连接中获得的转化菌SDS-PAGE示意3为高交叉反应性HVR1抗原序列具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细地描述，该实施例是用于解释、而不以任何方式限制本发明。
实施例1.12条代表抗原表位的选择我们通过Goldkey软件对国内123条HVR1序列进行分析，根据氨基酸出现频率的高低得到了HVR1的共同序列1#，并按各序列之间相似度的不同挑选了6条HVR1序列作为代表(序列2#～7#)，序列8#、9#为国外发表序列，10～12#为文献报道认为可能具有高交叉反应的HVR1序列。
1#STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK2#STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK3#ITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQK4#STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK5#DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQK6#GTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQN7#TTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQN
8# NTYVTGGSAAHTTSRfTSLFSPGPQQN9# ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN10#TTTTTGGVQGHTTRGLVRLFSLGSKQN11#DTTVTGGQAARTTQSFTSLFPPGPSQK12#DTTVTGGQAARTTQSFTSLFTPGPSQK其中，1#为我国的共同序列，2#～7#为我国的HVR1序列，并按其与1#同源性的高低排列，8#、9#为国外发表序列，10#～12#为国外交叉性较高的HVR1序列，主要用来做与1～9#HVR1的交叉性的比较。
实施例2.HVR1#～12#抗原的克隆与表达1、含HVR1单片段抗原表达质粒的构建1.1合成基因片段的设计与合成根据各合成基因的需要，设计了如下提到的基因片段。基因片段序列设计后均委托上海生工生物技术服务有限公司合成。1#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCGAACCACCCGAGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGAGGGAACAGGGAGGTGAAGGACTGGGTGGT2#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCACTCCCTGCGAGGCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCAGGGGAGAACAGGCCGGTCAGGGAGGATACAGC3#FGGTGGTGGATCTATCACCCGAGTAACCGGCGGCGTACAGGGCCACTCCCTGCGATCCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCCAGGGAGAACAGTCGTACCAGGCCTCGGGTGGT4#FGGTGGTGGATCTTCCACCCACGTAACCGGC GCTGTACAGGGCCGATCCCTGCAGTCCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGGGATTTGCCAGGGGAGAAGATGGAGGTCAGGCCGAAAGCAGC5#FGGTGGTGGATCTGACACCCACGTAACCGGCGGCGCTGCTGCTCGAGGCGCTTCCGGCCTGRACCTCCACCACTGTTCTGCTGAGGGCCAGGGGAGAACAGGGAGGTGAATCGGGAGGTGGT6#FGGTGGTGGATCTGGCACCTACGTAACCGGCGGCGCTACCGCTCACACCGCTTCCGGCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGTTTAGCGCCAGGAGCGAACAGTTTGGTGAAGGAGGAGGTAGC7#FGGTGGTGGATCTACCACCCACGTAACCGCTGGCACCGCTGCTCACGCTACCTCCTCCTTCRACCTCCACCACTGTTCTGTTTGGAGCCGGTGGTGAACAGGGAAGCGAAGCCGGAAGCGGT8#FGGTGGTGGATCTGAAACCCACACCTCCGGCGGCTCCGTAGCTCGAGCTGCTTTCGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGGGACAGGAAGGAGGTGAAGGACTGCAGGGA9#FGGTGGTGGATCTAACACCTACGTAACCGGCGGCTCCGCTGCTCACACCACCTCCCGATTCRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCGGAGGTGAACAGGTTAGCCAGGCCGGAAGCGCC10#FGGTGGTGGATCTACCACCACCACCACCGGCGGCGTACAGGGCCACACCACCCGAGGCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCAGGGGTGAACAGGGAGGTCAGGGATCGCAGGGA11#FGGTGGTGGATCTCAGACCACCACCACCGGCGGCTCCGCTTCCCACGCTGTATCCTCCCTGRACCTCCACCACTTTTCTGAGCAGGGCCGGAGGTGAACAGGGAGGTCAGGCCTCGCAGGGA12#FGGTGGTGGATCTGACAC CACCGTAACCGGCGGCCAGGCTGCTCGAACCACCCAGTCCTTCRACCTCCACCACTTTTCTGGGAAGGGCCAGGGGTGAACAGGGAGGTCAGGCCTCGGGTGGT通用引物F1GCCTCGAGGGTGGTGGATCT通用引物R1GCTCTAGAACCTCCACCACT通用引物F2GCACTAGTGGTGGTGGATCT通用引物R2GCGGATCCTTAGGAAGACACAAA1.2 PCR法获得HVR1#～12#基因HVR1#～12#的基因合成方法，除所用合成基因片段不同外，均用两步PCR合成法第一步在PCR扩增管中，依次加入H2O 41μl，10×PCR Buffer 5μl，分别加入各自基因的合成的一对基因片段(20pmol/μl)R、F各1μl，10mmol/L 4dNTP 1μl，2U/μl的Taq DNA聚合酶1μl，混匀，1000rpm离心30秒，然后放入PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 2400)中扩增。PCR反应条件为94℃ 1分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分，5个循环。
第二步以第一步的PCR产物为模板进行扩增。即在PCR扩增管中，依次加入H2O 40μl，10×PCR Buffer 5μl，20pmol/μl通用引物R1、F1各1μl，1/10的第一步PCR产物1μl，10mmol/L 4dNTP 1μl，2U/μl的TaqDNA聚合酶1μl，混匀，1000rpm离心30秒，然后放入PCR扩增仪中扩增。PCR反应条件为94℃ 3分钟后，94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟。
PCR产物纯化用上海华舜生物工程有限公司生产的“小量PCR产物纯化”试剂盒进行纯化，即于PCR产物中加入PB 0.25ml，全量移入吸附柱，然后按说明书方法进行清洗和洗脱，然后电泳鉴定。
1.3表达质粒的构建1.3.1 PCR产物及表达载体pBVIL1双酶切取以上纯化的PCR产物及pBVIL1表达载体各30ul分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(H)4ul、Xba I(10u/ul)和Xho I(12u/ul)各1ul，加灭菌蒸馏水至40ul，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收PCR产物及载体pBVIL1经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.3.2连接于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1ul、10×T4 DNA Ligase buffer 1ul、T4 DNA Ligase(12u/ul)1ul，加灭菌蒸馏水至10ul，置16℃过夜。
1.3.3转化在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，42℃水浴摇床中诱导培养4h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，作进一步鉴定。
1.3.4质粒提取及鉴定取上述SDS-PAGE鉴定证明目的基因获得高表达的菌株，按《分子克隆》(科学出版社，第二版)方法提取质粒。以质粒为模板，用各基因的F1引物和通用引R2进行PCR扩增(方法同上述第二步)，然后用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
2.抗原的表达与纯化2.1表达菌株的培养取-70℃保存的表达菌株20ul接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，立即将培养瓶转到42℃水浴摇床中，诱导培养4小时。将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0 TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，12000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0 TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃，12000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化将上述溶解的包涵体溶液过Q-Sepharose FF阴离子交换柱，用平衡液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇)清洗后，用不同浓度的NaCl(用平衡液配制)洗脱，收集各洗脱峰，经SDS-PAGE鉴定，收集0.05mol/L NaCl洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。
3.单片段HVR1抗原活性鉴定将纯化的单片段抗原及，用pH7.2的磷酸盐缓冲液稀释到2.0ug/ml，包被ELISA测定板，经封闭后，对中国红十字会北京血站提供的15份HCV阳性血清，进行了测定。结果如表1所示。
实施例3.选出与我国HCV感染株具有高交叉反应性的HVR1根据表1实验结果，我们选出4条具有高交叉反应性的HVR1多肽序列1#、2#、4#、8#。该4条HVR1多肽的综合交叉性能覆盖其他的HVR1多肽。
实施例4.用分子重组的方法进行4条HVR1的连接含HVR1#基因的质粒作为载体；另一含有基因HVR2#的质粒作为模板，用含有Spe I的通用引物F2及含有BamH I的原IL-1基因3’端通用引物R2，扩增出含有HVR2#和部分IL-1的基因片段，插入用Xho I和Xba I双切的HVR1#基因的后面，获得含有HVR1#和HVR2#两个基因的质粒(图1)。由于新质粒中，HVR1#和HVR2#基因间的连接是由互补酶Xba I和Spe I之间的相连，连接后酶切位点不复存在，因此，新质粒又可作为新的载体，与而另一含有HVR1基因的质粒增连接，重复上述过程，再经3轮循环可获得含四片段HVR1的质粒。图2可明显看出HVR1序列逐个连接上，并获得很好的表达。
实施例5四片段HVR1融合抗原的获得及高交叉性的测定对含有四片段表达菌种的操作按实施例2中的2抗原的纯化与表达，即可获得电泳纯的四片段HVR1融合抗原(L4HVR1)。经ELISA连接后的抗原交叉性有了本质的提高，能与所有的15份HCV阳性血清发生交叉反应。为了更进一步鉴定四片段HVR1融合抗原在HCV阳性血清中的检出率，我们用302医院92份HCV阳性血清(经华美公司试剂盒确定)进行检测(结果见表2)检出率高达90/91份，充分说明HVR1四片段融合抗原多肽是高交叉反应的，该抗原的序列如图3所示。表112条代表HVR1多肽抗原与15份阳性血清交叉性(黑体代表阳性)
表2.HVR1四片段融合抗原多肽(L4HVR1)活性鉴定OD 检出份数 ％ 累计％＞2.0 56 61.5 61.51.5～2.0 14 15.4 76.91.0～1.5 13 14.3 91.20.5～1.0 66.6 97.80.371 11.1 980.065 11.权利要求
1.有高交叉反应性的丙型肝炎病毒第一高变区抗原，其氨基酸序列为STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK，STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK，ITRVTGGVQGHSLRSLTSLFTPGPAQK，STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK，DTHVTGGAAARGASGLANLFTSGPAQK，GTYVTGGATAHTASGFASLFTTGSKQN，TTHVTAGTAAHATSSFTKLFAPGAKQN，ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN，或NTYVTGGSAAHTTSRFTSLFSPGPQQN。
2.含多个丙型肝炎病毒第一高变区的融合抗原，其特征在于所说的丙型肝炎病毒第一高变区选自权利要求1中的两种或两种以上序列。
3.权利要求2所述的融合抗原，其特征在于所说的丙型肝炎病毒第一高变区选自权利要求1中的四种序列。
4.权利要求3所述的融合抗原，其特征在于所说的四种丙型肝炎病毒第一高变区序列为STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQK，STHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQK，STHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQK，和ETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN。
5.权利要求4所述的融合抗原，其特征在于所说的四种丙型肝炎病毒第一高变区序列融合后的序列为STHVTGGVQGRTTRGLTSLFTPGPSQKSGGGSSGGGSTHVTGGVQGHSLRGLTSLFTSGPAQKSGGGSSGGGSTHVTGAVQGRSLQSFTSFLSPGPSQKSGGGSSGGGSETHTSGGSVARAAFGLTSIFSPGKSQN
全文摘要
本发明从已报道的不同的HVR1序列中筛选出12条可能具有高交叉反应的HVR1序列，进行了重组表达。经实验验证，从中选择了4条交叉反应性高的HVR1序列，用于进一步组合连接。连接后的融合抗原较单片段HVR1抗原的交叉反应性有显著提高，在丙型肝炎患者中的检出率高达90/91，是目前已知交叉反应性最广HVR1抗原。由于HVR1含有丙型肝炎病毒中唯一的中和性抗原表位，因此本发明可用于检测丙型肝炎患者体内的中和性抗体及制备丙型肝炎疫苗。
文档编号C07K14/085GK1408723SQ01141879
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月18日 优先权日2001年9月18日
发明者凌世淦, 宋晓国, 张贺秋, 修冰水 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所