专利名称：皂甙化合物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及皂甙化合物，特别是植物中提取的总皂甙化合物的用途。具体地，本发明涉及皂甙化合物在制备治疗与中枢神经胆碱能N受体(胆碱样，nicotinic acetylcholine receptor)有关的疾病的药物中的应用。本发明还涉及包括所述皂甙化合物的药物组合物。
背景技术：
N受体，又称烟碱样乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor)，是中枢和外周胆碱能神经系统的一种受体，这一系统中的另一受体是M受体，又称毒菌碱样乙酰胆碱受体(muscarinic acetylcholine receptor)。烟碱即尼古丁(Nicotine)对N受体有特异的亲和性，而毒菌碱(Muscarine)对M受体有特异的亲和性。尼古丁是N受体的激动剂，N受体与其结合后被激活，产生受体的生物功能。近年来的基础医学研究证明，中枢胆碱能神经系统，尤其是N受体，在大脑功能上起着重要的作用，最为重要的是其在学习，记忆，识别，注意力和个人行为表现上的作用。此外，N受体也参与调节大脑皮层的血流量。上述内容例如描述在Paterson，D.和A.Nordlberg，Neuronal nicotinicreceptors in the human brain，Prog Neurobiol 61(1)75-111(2000)中。
由中枢神经系统病变引起的疾病有很多种。具体地，中枢神经系统疾病主要是指各种神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)，精神分裂症(schizophrenia)、抑郁症(depression)，以及中枢性药物依赖如对尼古丁或酒精的依赖等。
神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)，即老年性痴呆，路易小体病(Lewy body disease或Dementia with Lewy bodies)，血管性痴呆(vascular dementia)，帕金森氏病(Parkinson disease)，图雷特氏(Tourette)综合症。这类中枢神经退行性疾病的共同点是病因不清。虽然近年来的研究结果发现老龄，基因突变，蛋白质代谢紊乱，免疫系统调节紊乱，脑外伤，脑炎症(inflammation)，中毒，甚至受教育水准和生活习惯(如吸烟，酗酒等)等因素都与这些疾病的发病有关。但是，对每一种疾病来讲，没有一个单一困素可以成为明确的病因。
精神分裂症和抑郁症是两种病因不清和临床表现都很复杂的中枢神经系统疾病，但不属于神经退行性疾病。
中枢性药物依赖是指对成瘾性药物或物质的依赖，如对吗啡，可卡因等的依赖。吸烟成瘾是由于对尼古丁的依赖。
上述各种疾病中以阿尔茨海默病即老年性痴呆最为人们重视。其原因是老年性痴呆的发病率排在这些疾病的首位。随着我国国民生活水平和医疗条件的不断提高，人均寿命也将延长，我国正面临老龄化社会的问题。由此产生的后果是患老年性痴呆病的人数大量增加，我国将成为世界上老年性痴呆病患病人数最多的国家。如没有有效的预防和治疗措施，将给家庭和社会带来极大的负担。
然而，由于还没有彻底搞清这些疾病的病因，在临床治疗上还不存在针对其中任何一种疾病的特效药物。
一个十分值得注意的现象是阿尔茨海默病和帕金森氏病患者中吸烟者的临床症状要比非吸烟者明显为轻，而90％的精神分裂症患者是重度吸烟者。如让他们停止吸烟，他们的临床症状会明显加重。这一现象可能说明吸烟是这些病人采取的自我疗法，即通过吸烟获取尼古丁，进而刺激N受体的自我疗法。从病因学，病理学，实验药理学和实验治疗学获得的研究结果证实前面所述的这些疾病无一例外的与中枢胆碱能神经系统的病变，特别是N受体的病变，有密切关系。
具体地，对于阿尔茨海默病而言，阿尔茨海默病人脑内胆碱能神经系统受损是这一疾病的一突出神经病理变化，表现为胆碱乙酰化酶(cholineacetyltransferase)的活性下降，由M受体介导的神经元内信号传递系统失调等。其中最突出的是N受体的变化。N受体的变化集中在与学习，记忆，识别和个人行为表现有密切相关的脑区，如前皮层，侧皮层，海马等。阿尔茨海默病人脑内N受体的基因表达下降(mRNA的量下降)，受体亚单位蛋白质的合成降低，标记配体的结合位点明显减少，受体介导离子的生理功能受阻。由于胆碱能系统尤其是N受体在上述大脑功能上的重要的作用，阿尔茨海默病的临床症状被认为主要是由脑内胆碱能系统退行性病变引起的。动物实验和人自愿受试者实验表明尼古丁本身能明显地改善阿尔茨海默型痴呆的临床症状。例如可参见Newhouse.，P.A.，Kelton，M.，Nicotinic systems in centralnervous systems diseasedegenerative disorders and beyond，Pharm Acta Helv74(2000)91-101和Nordberg，A.PET studies and cholinergic therapy inAlzheimer’s disease.Rev Neurol(Paris)155(Suppl 4)S53-63(1999)。因此，可以相信有效提升N受体的药物能够治疗阿尔茨海默症。
此外，下述疾病也与N受体有关，相信通过提升N受体能够治疗或改善与N受体有关的这些疾病。
路易小体病是一种痴呆，仅次于阿尔茨海默痴呆的最常见的痴呆症。在这类病人大脑的不同区域内N受体有明显的下降，例如可参见Perry E.，et al.Nicotinic receptor subtypes in human brain ageing，Alzheimer and Lewy bodydiseases，Eur J Pharmacol 393(2000)215-222。
血管性痴呆虽然没有实验数据证明血管性痴呆病人脑内N受体有明显的变化，但由于N受体参与调节皮层血流量，N受体仍然是发展新的治疗药物的重要靶受体。例如可参见Martin-Ruiz C et al.，Nicotinic receptors indementia of Alzheimer，Lewy body and vascular types，Acta Neurol Scand Suppl2000；17634-41。
就注意力不足/多动症(Attention Deficit/Hyperactivity Disorder，ADHD)而言，由于患此类疾病的成人患者的吸烟率很高，因此提示与N受体特异性结合的尼古丁类药物对这一疾病具有潜在的治疗作用。最近的急性双盲尼古丁临床试验证明尼古丁本身在治疗这一病症上的积极作用。
虽然帕金森氏病的病理和病因与阿尔茨海默病不同，但与阿尔茨海默病类同的是这些病人脑内的N受体有明显的下降。而且，最新的临床实验结果表明尼古丁能明显改善包括运动和识别功能在内的多种临床症状，例如参考Belluardo，N.，Mudo，G.，Blum，M.，Fuxe，K.，Central nicotinic receptors，neurotrophic factors and neuroprotection，Behav Brain Res 113(2000)21-34中所述的内容。
精神分裂症患者的吸烟比例高达90％。动物实验证明P50反应(对音频刺激反应的实验)与海马区低亲和力N受体的α7亚型功能不全有关。基因学研究证明第15对染色体上的α7 N受体调节区域的改变可能是精神分裂症的一个特征。最新的研究结果也表明在精神分裂症病人的脑内α7N受体的蛋臼含量明显将低，例如可参见Guan，Z.Z.，X.Zhang，K.Blennow，and A.Nordberg.Decreased Protein Level of Nicotinic Receptor alpha7 Subunit in theFrontal Cortex from Schizophrenic Brain，Neuroreport 10(8)1779-82(1999)。
此外，关于图雷特氏综和症，不只一项临床实验证明尼古丁，通过透皮尼古丁贴片，能够明显降低颜面痉挛。
据统计，抑郁症患者的吸烟率达46％。一项临床实验的结果显示抑郁症重症思者在接受4天尼古丁皮肤贴剂后，其临床症状明显改善。
中枢性药物依赖酒精成痛者多数是重度吸烟者。实验证明酒精可以明显降低N受体在细胞上的表达。酗酒者脑内的N受体的量也明显低于非酗酒者。与之相反的是吸烟者脑内的N受体数量明显高于非吸烟者。
因此，相信通过提升与尼古丁特异性结合的N受体能够有治疗或改善上述疾病的积极作用。
综上所述，发展影响或改善胆中枢碱能神经系统功能，特别是能够提升N受体的药物对于预防和治疗这些疾病具有明显意义。在本领域中，通过直接或间接刺激胆碱能受体而恢复胆碱能系统神经传递的功能，而提供影响胆碱能系统的药物。具体地，直接刺激胆碱能受体的药物是受体的激动剂，间接刺激胆碱能受体的药物是胆碱脂酶抑制剂。
为治疗上述疾病，特别是阿尔茨海默型痴呆，临床上主要采用胆碱脂酶抑制剂。胆碱脂酶抑制剂的作用机理是通过抑制胆碱脂酶，降低此酶对乙酰胆碱的水解而提升乙酰胆碱的水平，在高水平乙酰胆碱的刺激下，受损的胆碱能神经系统的功能，包括N受体的功能，得以改善或恢复。例如参考Giacobini，E.，Cholinergic Foundations of Alzheimer’s Disease Therapy，J.Physiol Paris 92(1998)283-287中内容所述。
由于N受体在大脑生理功能上的重要作用以及上述各疾病与N受体病变的密切关系，加之与N受体特异性结合的尼古丁本身对这些常见的中枢神经系统疾病的明显临床作用，近年来以N受体为靶体药物的研发受到越来越广泛的重视。但是，由于尼古丁本身具有很强的外周副作用，其本身不能成为临床用药。
目前，国际上在发展预防和治疗阿尔茨海默型痴呆症药物的另外几个主要方向是抗体治疗，特殊酶(beta-secretase等)的抑制剂，抗衰老化合物(雌激素等)。对于除阿尔茨海默型痴呆症外的在本发明中列出的其他疾病来讲，大量研究结果提示影响N受体的药物对这些疾病具有潜在的预防和治疗意义。
但是，使用胆碱脂酶抑制剂或受体激动剂所面临的问题是由于被刺激的受体是“残留”的或“病变”的受体，因此这些药物对疾病的治疗效果往往是“基线依赖性”的(base line dependent)，即药物疗效和药物毒性与脑内胆碱能神经系统的病变程度有关。这给临床选择药物剂量和控制副作用上带来了一定的困难。
因此，希望得到能够增加功能性胆碱能受体表达而副作用低的药物。
发明内容
本发明的发明人意外地发现了皂甙化合物具有增加功能性胆碱能N受体数量，同时副作用低的作用，能够用于制备治疗与中枢胆碱能N受体有关的疾病的药物。
本发明的目的是提供一种皂甙化合物在治疗与中枢神经胆碱能N受体有关的疾病中的应用。所述皂甙化合物能够是从植物中提取的总皂甙化合物，包括甾体和三萜皂甙，也可以是通过合成而得到的皂甙化合物。
本发明的另一个目的是提供包含所述皂甙化合物和药用载体的药物组合物，用于治疗与中枢神经胆碱能N受体有关的疾病。
具体地，本发明的发明人最新研究结果表明，从一些中草药中如远志(Polygala tenuifolia)，三七(Panax notoginseng)，牛膝(Achyranthes bidentata)，穿山龙(Achyranthes bidentata)，知母(Anemarrhena asphodeloides)等提取的总皂甙能明显地提升胆碱能N受体的结合位点，提升幅度在50％到300％之间，但不影响M受体的结合位点。发明人还发现这些总皂甙不抑制N受体与其特异性激动剂的结合，因此它们上调N受体的机制是与尼古丁上调N受体的机制不同的。
实验用的总皂甙分别含不同量的三萜皂甙和甾体皂甙。三萜皂甙和甾体皂甙有很多异构体，每一组份含异构体不少于20个。异构体的分子量在1000Da左右。
由于N受体与学习，记忆和识别功能以及情绪有着密切的关系，加之上述中枢神经系统疾病在很大程度上与N受体的变化有关，故这些植物皂甙成分可以应用在预防与治疗这类疾病中。
本发明中还涉及用于预防和治疗中枢神经系统疾病的药物组合物，其中包括由植物中提取的能够特异性升高中枢样胆碱能N受体的三萜或甾体总皂甙，或者也能够使用其中一种或一种以上具有所述化学结构或其异构体的皂甙化合物与通用药物载体组成的药物组合物。
本发明不排除具有上述植物皂甙结构或经过化学合成而获得具有同样结构的皂甙化合物能够改善或治疗中枢胆碱能系统功能，特别是具有提升中枢样胆碱能N受体的药物组合物能够用于治疗本发明中所述的疾病。
由植物中提取或合成得到的皂甙化合物在药物组合物中的剂量能够根据具体疾病种类和病情而进行合理选择，这里不作限制。
用于临床治疗的药物的剂型和添加剂及给药方式根据临床效果和方便患者的常规使用方式而进行设计，这里不作限制。
具体实施例方式
本发明中使用的皂甙化合物能够是植物中提取的总皂甙化合物。其中总皂甙指的是由一种植物中提取的所有的皂甙化合物。
这些皂甙化合物能够采用文献，例如《常用中药成分与药理手册》中(黄泰康主编，中国医学科技出版社，1994年4月第1版，北京)所述的方法提取获得。
具体地，可以通过包括下列步骤的方法得到植物皂甙化合物1，用水将植物浸透，沸水中煮数小时，取上清浓缩。
2，将以上所得的浓缩物再用水溶解后，经搅拌后沉淀。不溶于水的疏水性物质将沉淀，含水溶性分子的上清回收，并再次浓缩。
3，浓缩后的水溶性提取物用醇处理数次，洗去杂质和盐份，部分纯化的水溶性物质冰冻干燥后用于进一步纯化。
4，上述冰干的物质经过不同种类的柱层析方法进一步分离出包括各种不同皂甙的总皂甙组份。
5，分离出的总皂甙成分用Gilson高压液相色谱仪-Fimigan AQA质谱仪进行了进一步分析。具体操作步骤是，干燥后的样品溶于水(2mg/ml)，取30微升经自动进样器注入Merck Chromatith Performance RP-18e层析柱(4.6x100mm)，流速1.5ml/分，10％-80％已氰梯度洗脱，结果用Unipoint Lc/MSInterface Window软件处理。结果进一步证实上述样品中的组份或主要是三萜或甾体皂甙。
实施例以下是本发明例举本发明技术方案的非限定性实例。这些实施例进一步描述和说明了本发明范围内的实施方案。应该理解的是，本文中给出的实施例仅用于说明的目的，并不是用来限定本发明，在不背离本发明精神和范围的条件下，本领域普通技术人员可对其进行各种改变，这是本领域普通技术人员所认可的。
实施例1由远志，三七，穿山龙，知母，西洋参，牛膝，续断，黄芪中提取的总皂甙对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的N受体的影响。
1，SH-SY5Y细胞在含7.5％的小牛血清的DMEM培养液中培养。细胞培养箱的条件是37℃和5％CO2。
2，药物处理在细胞培养开始的第一天进行。药物用细胞培养液溶解(100mg/10ml)后用0.2μm的无菌滤膜过滤除菌。
3，细胞在药物存在的条件下培养4-5天后收取用于制备膜匀浆。
4，[3H]Epibatidine(N受体特异性配体，比活48Ci/mmol，终浓度3nM)结合实验在SH-SY5Y细胞膜匀浆上进行，使用Tris-HCl，pH7.4缓冲液，25℃，3小时孵温。然后用GF/C滤膜分离出结合部分。GF/C滤膜上的放射活性用液体闪烁计数仪测定。非特异性结合由0.1mM的(-)nicotine决定。
5，结果如表一所示。其中远志，三七，穿山龙，知母总皂甙具有明显提升N受体[3H]epibatidine结合位点的作用。
表一植物总皂甙处理对SH-SY5Y细胞膜N受体[3H]epibatidine结合位点的影响对照组 处理组[3H]Epibatidine结合位点 [3H]Epibatidine结合位点(fmol/mg蛋白)(fmol/mg蛋白)远志总皂甙20mg/L 158.1±3.6287.1±8.4100mg/L 66.5±3.6 179.4±8.3三七总皂甙10mg/L 158.1±3.6 258.1±12.7穿山龙总皂甙10mg/L 158.1±3.6 262.4.1±8.7100mg/L158.1±3.6 268.8±10.1知母总皂甙100mg/L44.0±1.1112.0±7.5西洋参总皂甙100mg/L44.0±1.154.4±2.3牛膝总皂甙100mg/L66.5±3.688.1±4.4续断总皂甙100mg/L66.5±3.679.1±6.9黄芪总皂甙100mg/L66.5±3.658.8±3.4实施例2由远志，三七，穿山龙，知母，西洋参，牛膝，续断，黄芪中提取的总皂甙对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的M受体的影响。
1，SH-SY5Y细胞在含7.5％的小牛血清的DMEM培养液中培养。细胞培养箱的条件是37℃和5％CO2。
2，药物处理在细胞培养开始的第一天进行。药物用细胞培养液溶解(100mg/10ml)后用0.2μm的无菌滤膜过滤除菌。
3，细胞在药物存在的条件下培养4-5天后收取后制备膜匀浆。
4，[3H]QNB(M受体特异性配体，比活48Ci/mmol，终浓度1nM)结合实验在SH-SY5Y细胞膜匀浆上进行，使用Tris-HCl，pH7.4缓冲液，25℃，1.5小时孵温。然后用GF/C滤膜分离出结合部分。GF/C滤膜上的放射活性用液体闪烁计数仪测定。非特异性结合由0.1mM的阿托品(atropine)确定。
5，结果如表二所示。这些皂甙无明显提升M受体[3H]QNB结合位点的作用。
表二植物总皂甙处理对SH-SY5Y细胞膜M受体[3H]QNB结合位点的影响对照组 处理组[3H]QNB结合位点 [3H]QNB结合位点(fmol/mg蛋白) (fmol/mg蛋白)远志总皂甙20mg/L384.8±3.2 367.2±31.8100mg/L 321.1±26.4 162.6±2.6三七总皂甙10mg/L384.8±3.2 379.5±9.1穿山龙总皂甙10mg/L384.8±3.2 481.5±15.0100mg/L 384.8±3.2 361.5±14.7知母总皂甙100mg/L 219.4±9.7 262.0±11.3西洋参总皂甙100mg/L 219.4±9.7 202.7±6.2牛膝总皂甙100mg/L 321.1±26.4 299.0±11.7续断总皂甙100mg/L 321.1±26.4 320.0±8.7黄芪总皂甙100mg/L 321.1±26.4 355.9±23.1实施例3由远志，三七，穿山龙，知母，西洋参，牛膝，续断，黄芪中提取的总皂甙竞争抑制[3H]epibatidine对大鼠大脑匀浆制备N受体的特异性结合。
1，匀浆制备由去除小脑的大鼠脑获得。
2，[3H]epibatidine/总皂甙受体结合实验条件[3H]epibatidine终浓度0.5nM，使用Tris-HCl，pH7.4缓冲液，25℃，3小时孵温。然后用GF/C滤膜分离出结合部分。GF/C滤膜上的放射活性用液体闪烁计数仪测定。非特异性结合由0.1mM的(-)烟碱决定。
3，结果如表三所示。这些皂甙不竞争抑制[3H]epibatidine对大鼠大脑匀浆制备N受体的特异性结合，指示它们不与N受体的激动剂结合位点结合。
表三植物总皂甙竞争抑制[3H]epibatidine对大鼠大脑匀浆制备N受体的特异性结合[3H]Epibatidine特异性结合的百分数对照100±1.4远志总皂甙10mg/L 99.7±4.9100mg/L 99.4±1.9三七总皂甙10mg/L 105.5±2.3100mg/L 97.6±1.8穿山龙总皂甙10mg/L 99.1±2.2100mg/L 103.5±5.5知母总皂甙10mg/L 98.7±3.3100mg/L 96.8±1.0西洋参总皂甙10mg/L 97.7±4.9100mg/L 99.4±4.9牛膝总皂甙10mg/L 102.6±3.2100mg/L 101.2±3.8续断总皂甙10mg/L 94.7±0.6100mg/L 101.7±4.9黄芪总皂甙10mg/L 97.6±1.8100mg/L 94.7±2.8
通过上述实施例，本领域的普通技术人员能够清楚地明白，本发明中由远志总皂甙、三七总皂甙、穿山龙总皂甙和/或知母总皂甙能够显著地提高N受体的表达而很少或不影响M受体的表达，故它们对N受体的作用是特异性的。由于这些皂甙不抑制特异性激动剂与N受体的结合，说明它们与受体的激动剂结合的位点没有结合。
相比之下，尼古丁上调N受体机制是由于尼古丁与N受体的激动剂结合位点结合造成N受体脱敏，脱敏了的受体生物转换周期变长，结果是N受体的数量升高。
本发明的这些植物皂甙化合物不与N受体的激动剂结合位点结合的意义在于由植物皂甙上调的N受体是非脱敏的受体，因此保持了其完整的生物学功能。
具有上述功能的植物皂甙，或经有机合成而获得的皂甙化合物在临床治疗学方面的意义是恢复或补充中枢神经系统内受损的N受体，进而达到预防和治疗与中枢神经系统内N受体有关的疾病的效果。
而且，上述疾病对尼古丁类药物的治疗反应往往是“基线性”的。而由植物皂甙引起的N受体的上调改变或者在一定程度上恢复N受体神经传递的功能，这意味着病理“基线”向好的方向转化，由此而产生的结果是提高其它直接或间接刺激N受体药物的疗效，从而提供了皂甙化合物在制备治疗与中枢神经胆碱能有关的疾病中的新应用。
权利要求
1.皂甙化合物在制备与中枢胆碱能N受体有关的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中所述皂甙化合物为能够从植物中提取得到的总皂甙化合物，所述植物包括远志、三七、穿山龙和知母。
3.根据权利要求1或2的应用，其中所述药物可以用于治疗中枢神经系统疾病，包括神经退行性疾病、精神分裂症、抑郁症以及中枢性药物依赖症的疾病。
4.根据权利要求1-3中任一项的应用，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、路易小体病、血管性痴呆、帕金森氏病、图雷特氏综合症。
5.一种用于治疗与中枢胆碱能N受体有关的疾病的药物组合物，所述组合物包括一种或一种以上的皂甙化合物和药用载体。
6.根据权利要求5的药物组合物，其中所述皂甙化合物为从植物中提取得到的总皂甙化合物。
7.根据权利要求5或6的药物组合物，其中所述皂甙化合物是从包括远志、三七、穿山龙和知母的植物中提取得到的。
全文摘要
本发明提供了皂甙化合物,特别是从植物中得到的总皂甙化合物的应用。特别地,这些皂甙化合物能够特异性提升中枢样胆碱能N受体(烟碱样受体,nicotinic acetylcholine receptor),不与N受体的激动剂结合位点结合,而且不影响胆碱能M受体(毒菌碱样受体,muscarinic acetylcholine receptor),因此可用于治疗与中枢胆碱能N受体有关的中枢神经系统疾病以及精神分裂症、抑郁症和中枢性药物依赖。本发明还提供了治疗与中枢样胆碱能N受体有关的疾病的药物组合物。
文档编号C07J9/00GK1422861SQ0114257
公开日2003年6月11日 申请日期2001年12月3日 优先权日2001年12月3日
发明者张晓 申请人:张晓