专利名称：用作erk抑制剂的吡唑组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于药物化学领域，并涉及属于蛋白激酶抑制剂、尤其是ERK抑制剂的吡唑化合物，含有这类化合物的组合物及其使用方法。这类化合物可用于治疗能通过蛋白激酶抑制剂减轻的癌和其他疾病状态。
背景技术：
哺乳动物促分裂原活化蛋白(MAP)1激酶是介导胞内信号转导途径的丝氨酸/苏氨酸激酶(Cobb和Goldsmith，1995年，《生物化学杂志》270，14843；Davis，1995年，《Mol.Reprod.Dev.》42，459)。MAP激酶族的成员共享序列相似性和保守结构域，并包括ERK(胞外信号调节激酶)、JNK(Jun N端激酶)和p38激酶。JNK和p38激酶响应促炎细胞因子TNF-α和白介素-1并通过细胞应力诸如热震、高摩尔渗透压浓度、紫外线照射、脂多糖类和蛋白合成抑制剂而活化(Derijard等，1994年，《细胞》76，1025；Han等，1994年，《科学》265，808；Raingeaud等，1995年，《生物化学杂志》270，7420；Shapiro和Dinarello，1990年，《美国国家科学院院报》92年，12230)。与此对照，ERK通过促分裂原和生长因子活化(Bokemeyer等，1996年，《国际肾脏学》49，1187)。
ERK2是一种广泛分布的蛋白激酶，当Thr183和Tyr185被上游MAP激酶MEK1磷酸化时，它达到最大活性(Anderson等，1990年，《自然》343，651；Crews等，1992年，《科学》258，478)。一旦活化，ERK2就磷酸化许多调节蛋白，包括蛋白激酶Rsk90(Bjorbaek等，1995年，《生物化学杂志》270，18848)和MAPKAP2(Rouse等，1994年，《细胞》78，1027)，以及转录因子诸如ATF2(Raingeaud等，1996年，《分子与细胞生物学》16，1247)、ElK-1(Raingeaud等，1996年)、c-Fos(Chen等，1993年，《美国国家科学院院报》90，10952)和c-Myc(Oliver等，1995年，《实验生物学与实验医学会会志》210，162)。ERK2还是依赖于Ras/Raf的途径的下游目标(Moodie等，1993年，《科学》260，1685)，并可帮助从这些潜在的致癌蛋白交接信号。ERK2已显示在乳癌细胞的阴性生长对照中起作用(Frey和Mulder，1997年，《癌症研究》57，628)，并且还报道了ERK2在人乳癌中的过度表达(Sivaraman等，1997年，《临床检查杂志》99，1478)。活化ERK2还牵涉到内皮素刺激的气道平滑肌细胞的增殖，提示了这种激酶在哮喘中的作用(Whelchel等，1997年，《美国呼吸细胞与分子生物学杂志》16，589)。
JNK族的(MAP)1激酶已涉及在介导对多种疾病的细胞反应中起作用，所述疾病包括癌(《致癌基因》1996年，13，135-42)、肝病(《肝脏学》1998年，28，1022-30)、心血管疾病(《循环系研究》1998年，83，167-78；《循环》1998年，971731-7；《生物化学杂志》1997年，272，28050-6；《循环系研究》1996年，79，162-73；《循环系研究》1996年，78，947-53；《临床检查杂志》1996年，97，508-14)，和免疫学疾病(《免疫学杂志》1999年，162，3176-87；《欧洲免疫学杂志》1998年，28，3867-77；《实验医学杂志》1997年，186，941-53；《欧洲免疫学杂志》1996年，26，989-94，等等)。
Aurora2是和人的癌症诸如结肠癌、乳癌和其他固体肿瘤有牵连的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。这种激酶据信与调节细胞周期的蛋白磷酸化事件有关。具体地说，Aurora2可在控制有丝分裂期间染色体的精确分离中起作用。细胞周期的错误调节可导致细胞增殖和其他异常。在人的结肠癌组织中，已发现了过度表达的Aurora2蛋白。参见Bischoff等，《欧洲分子生物学组织杂志》1998年，17，3052-3065；Schiumacher等，《细胞生物学杂志》1998年，143，1635-1646；Kimura等，《生物化学杂志》1997年，272，13766-13771。
糖原合酶激酶-3(GSK-3)是由各自由不同基因编码的α和β同种型构成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶〔Coghlan等，《化学与生物学》7，793-803(2000)；Kim和Kimmel，遗传学发展流行观点》10，508-514(2000)〕。GSK-3和多种疾病包括糖尿病、早老性痴呆、CNS疾病诸如躁狂抑郁性疾病和神经变性疾病、以及心肌突出肥大等有牵连〔WO99/65897；WO00/38675；和Haq等，《细胞生物学杂志》(2000)151，117〕。这些疾病可由其中GSK-3起作用的某些细胞信号途径的异常动作引起或导致这种异常。
KDR是也结合VEGF(血管内皮生长因子)的酪氨酸激酶受体(Neufeld等，1999年，《美国实验生物学会联合会会志》13，9)。VEGF与KDR受体的结合导致血管生成，这是毛细管从先存在的血管的萌芽。在引起肿瘤血管生成并允许癌性细胞迅速生长的各种癌中发现了高浓度的VEGF。因此，抑制VEGF活性是抑制肿瘤生长的一个手段，据显示这可以通过抑制KDR受体酪氨酸激酶实现。
AKT，也称作蛋白激酶B，是在促进各式各样的细胞类型的存活中起重要作用的丝氨酸/苏氨酸激酶〔Khwaja，A.，《自然》，33-34页(1990)〕。据Zang等人显示，人卵巢癌细胞显示出抬高浓度的AKT-1和AKT-2。抑制AKT导致这些人卵巢癌细胞的编程性细胞死亡，证明AKT可能是卵巢癌治疗〔Zang，Q.Y.等，《致癌基因》，19(2000)〕和其他增殖性疾病的重要目标。AKT途径也和运动神经元存活和神经再生有牵连〔Kazuhiko，N.等，《神经科学杂志》，20(2000)〕。
对于尚未得到满足的开发蛋白激酶抑制剂的医学需要有很高的需求，尤其是对于可用于治疗与ERK活化有关的各种疾病的ERK抑制剂，特别是考虑到对于这些疾病中的大多数来说目前可获得的、相当不够的治疗选择。
因此，仍然非常需要开发蛋白激酶的强抑制剂，包括ERK抑制剂，它们可用于治疗与蛋白激酶活化有关的各种疾病。
发明的描述现已发现本发明化合物及其组合物是有效的蛋白激酶抑制剂，尤其是ERK的抑制剂。这些化合物具有通式I 或其药学上可接受的衍生物，其中R1选自R、卤素、N(R8)2、OR、NRCOR、NRCON(R8)2、CON(R8)2、SO2R、NRSO2R或SO2N(R8)2；T选自价键或连接基；R各自独立地选自氢或具有1至6个碳的可选取代的脂族基；R2选自氢、CN、卤素、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环基、具有1至6个碳的可选取代的无环脂族链基、或具有4至10个碳的可选取代的环脂族基；R3选自R、OH、OR、N(R8)2、卤素或CN；Q是价键、J、或可选取代的C1-6亚烷基链，其中该亚烷基链的最多两个非相邻碳各自可选地并独立地被J取代；J选自-C(＝O)-、-CO2-、-C(O)C(O)-、-NRCONR8-、-N(R)N(R8)-、-C(＝O)NR8-、-NRC(＝O)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R)O-、-ON(R8)-、-OC(＝O)N(R8)-、-N(R)COO-、-SO2N(R8)-、-N(R)SO2-或-N(R8)-；R4选自-R8、-R5、-NH2、-NHR5、-N(R5)2或-NR5(CH2)yN(R5)2；R5各自独立地选自R6、R7、-(CH2)yCH(R6)(R7)、-(CH2)yR6、-(CH2)yCH(R6)2、-(CH2)yCH(R7)2或-(CH2)yR7；y是0-6；R6各自是可选取代的基团，独立地选自脂族基、芳基、芳烷基、芳烷氧基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、杂环基、杂环基烷基或杂环基烷氧基；R7各自独立地选自可选取代的羟基烷基、烷氧基烷基、芳氧基烷基或烷氧基羰基；R8各自独立地选自R，或者同一氮上的两个R8与氮一起可选地构成具有1至3个杂原子的4至8元饱和或不饱和杂环；并且各个可取代的环氮可选地被R、NR2、COR、CO2(C1-C6可选取代的烷基)、SO2(C1-C6可选取代的烷基)、CONR2和SO2NR2取代。
除非另有说明，否则本文中将采用以下定义。另外，取代基或变量的组合只有产生稳定的化合物时才是允许的。
本文中所用的术语“脂族”是指完全饱和或含有1个或多个不饱和单元的直链、支链或环C1-C12烃。例如，合适的脂族基包括取代或未取代的直链、支链或环烷基、烯基、炔基及其混合物，诸如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基或(环烷基)烯基。单独使用或作为较大基团的一部分的术语“烷基”和“烷氧基”指的是含有1至12个碳原子的直链和支链。单独使用或作为较大基团的一部分的术语“烯基”和“炔基”将包括含有2至12个碳原子的直链和支链。术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”是指根据具体情况被1个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。术语“卤素”是指F、Cl、Br或I。术语“杂原子”是指N、O或S，并且将包括任何氧化形式的氮和硫，以及季铵化形式的任何碱性氮。
单独使用或作为较大基团的一部分如在“芳烷基”中所用的术语“芳基”指的是具有5至14个成员的芳环基，诸如苯基、苄基、1-萘基、2-萘基、1-蒽基和2-蒽基，以及杂环芳基或杂芳基诸如2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噁二唑基、5-噁二唑基、2-噁唑基、4-噁唑基、5-噁唑基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、3-哒嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、5-四唑基、2-三唑基、5-三唑基、2-噻吩基或3-噻吩基。术语“芳环”也指被可选地取代的环。
芳基还包括稠合多环芳环系统，其中碳环芳环或杂芳基环与一个或多个其他环稠合。实例包括四氢萘基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基，等等。如本文中所用的，在术语“芳基”的范围内还包括这样的基团其中一个或多个碳环芳环和/或杂芳基环与环烷基或非芳族杂环稠合，例如2，3-二氢化茚基或四氢苯并吡喃基。
非芳族杂环是其中一个或多个环碳在环中被杂原子诸如氮、氧或硫取代的非芳族碳环。环可以是5、6、7或8元环和/或与另一个环、诸如环烷基或芳环稠合。实例包括3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮、2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉基、3-吗啉基、4-吗啉基、2-硫代吗啉基、3-硫代吗啉基、4-硫代吗啉基、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、4-噻唑烷基、diazolonyl、N-取代diazolonyl、1-苯并[c]吡咯酮基、苯并噁烷、苯并三唑-1-基、苯并吡咯烷、苯并哌啶、苯并氧杂环戊烷基、苯并硫杂环戊烷基和benzothiane。术语“杂环”，无论是饱和的还是不饱和的，也指被可选取代的环。
芳基(碳环和杂环)或芳烷基，诸如苄基或苯乙基，可含有一个或多个取代基。芳基的不饱和碳原子上的适宜取代基的实例包括卤素、-R、-OR、-SR、被护OH(诸如酰氧基)、苯基(Ph)、取代Ph、-OPh、取代-OPh、-NO2、-CN、-N(R)2、-NRN(R)2、-NRCON(R)2、-NRCOR、-NRCO2(脂族的)、-CO2R、-COR、-C(O)C(O)R、-CON(R)2、-CONRN(R)2、-S(O)2R、-SON(R)2、-S(O)(脂族的)、-SO2N(R)2或-NRS(O)2R，其中R各自独立地选自氢、脂族基或取代脂族基。
脂族基或非芳族杂环可以含有一个或多个取代基。脂族基或非芳族杂环的饱和碳上的适宜取代基的实例包括上文中对不饱和碳列出的那些以及下列这些＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、＝N-、OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2(脂族的)、＝NNHSO2(脂族的)或＝NR，其中R各自独立地选自氢、脂族基或取代脂族基。
术语“亚烷基链”指的是可选取代的直链或支链碳链，它可以是完全饱和的或者具有一个或多个不饱和单元。可选取代基是如上文中对脂族基所述的。Q的C1-6亚烷基链的可选取代基包括上文中对脂族基所述的那些。
芳族或非芳族杂环上的可取代的氮可以是可选取代的。氮上的适宜取代基包括R、COR、N(R)2、CON(R)2、CONRN(R)2、S(O)2R和CO2R，其中R独立地选自氢、可选取代的芳基或脂族基。
术语“连接基”是指连接两部分化合物的有机部分。连接基一般由原子诸如氧或硫、单元诸如-NH-或-CH2-、或原子链诸如亚烷基链组成。连接基的分子质量一般在约14至200范围内。连接基的实例包括饱和或不饱和C1-6亚烷基链，它是可选取代的，并且其中该链的最多两个饱和碳可选地被-C(＝O)-、-CONH-、-CONHNH-、-CO2-、-NHCO2-、-O-、-NHCONH-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)NH-、-NHNH-、-NHCO-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-SO2NH-或NHSO2-取代。
对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的某些化合物可以互变异构形式存在，所有这类互变异构形式的化合物都在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文中描述的结构还意味着包括该结构的所有立体化学形式，即每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体和非对映体的混合物也在本发明的范围内。除非另有说明，否则本文中描述的结构还意味着包括仅在存在一个或多个同位素富原子方面有所不同的化合物。例如，具有现在的结构但氢被氘或氚取代、或者碳被富集13C或14C的碳取代的化合物也在本发明范围内。本发明的一个实施方案涉及式II化合物 其中R1、R2、R3、R4、T和Q如上所述。
本发明的优选实施方案涉及式II-A化合物 其中T、R2和R4如上所述，而R1和R3各自为氢。
优选的化合物包括具有一项或多项、首选全部下列特征的那些(a)Q是-CO-、-CO2-或-CONH-；(b)T是价键；(c)R1是氢或NHR；(d)R2是可选取代的芳环，更优选可选取代的苯环；(c)R3是氢；(e)R4选自R5、-NHR5、-N(R5)2、-NR5R6、-NHCHR5R6、或-NHCH2R5；和/或(f)R5是可选取代的基团，选自芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环基烷基、(CH2)yR6、(CH2)yR7、或(CH2)yCH(R6)(R7)。
R2苯基的取代基的实例包括卤素、硝基、烷氧基和氨基。
当R4为R5时，优选的R5基的实例包括吡咯烷-1-基、吗啉-1-基、哌啶-1-基和哌嗪-1-基，其中各个基团是可选取代的。当R4是-NHR5或-N(R5)2时，优选的R5基还包括(CH2)yR6、(CH2)yR7和(CH2)yCH(R6)(R7)。优选的R6和R7的实例包括吡啶-3-基、吡啶-4-基、咪唑基、呋喃-2-基、四氢呋喃-2-基、环己基、苯基、-CH2OH、-(CH2)2OH和异丙基，其中各个基团是可选取代的。其中R1和R3各自为氢的式II的例举性结构列在下表1中。表1.化合物II
本发明的另一个优选实施方案涉及式II-B化合物
其中T、R、R2和R4如上所述。
优选的II-B化合物包括具有一项或多项、首选全部下列特征的那些(a)T是价键；(b)R3是氢；和/或(c)R2是可选取代的芳环，更优选可选取代的苯环。
其中R3为H的式II-B的例举性结构列在下表2中。
表2.化合物II-B
本发明化合物一般可以用本领域技术人员已知的制备类似化合物的方法加以制备，如通用方案I和II以及下文中所示的合成实施例所说明的。
方案I 试剂和条件(a)PhCH2COCl，AlCl3，CH2Cl2，2小时，室温(b)DMF，24小时，室温(c)(Me2N)2-Ot-Bu，THF，24小时，室温(d)H2NNH2，EtOH，12小时，回流上述方案I显示了用于制备R2为可选取代的苯基时的本发明化合物的一般合成途径。在步骤(a)中，可选取代的苯甲酰氯在二氯甲烷和三氯化铝中与化合物1化合形成化合物2。苯环上的各种取代基都可经受该反应。合适的R2基的实例包括但不限于上文表1中列出的那些。
在DMF中用胺3处理化合物2而形成酰胺4。当胺3为伯胺时，该反应在室温下进行。当胺3为仲胺时，该反应在50℃下加热以使反应完全并得到酰胺4。
在步骤(c)，通过在室温下用(Me2N)2-Ot-Bu处理酰胺4而形成烯胺5。另一方面，在步骤(c)形成烯胺5的反应也可以通过使用二甲基甲酰胺-二甲基乙缩醛(DMF-DMA)实现。使用DMF-DMA的反应需要抬高的温度以得到烯胺5，而使用(Me2N)2-OtBu则有在室温下进行反应以更高纯度得到烯胺5的优点。
在步骤(d)，通过在抬高的温度下用水合肼处理烯胺5而形成吡唑化合物6。如表1中所例举的、用该方法合成的式II化合物通过制备HPLC(逆相，10→90％MeCN的水溶液，15分钟)分离。用于生产这些化合物的具体条件陈述在实施例中。
方案II 试剂和条件(a)3-Cl-PhCH2COCl，AlCl3，CH2Cl2，2小时，室温(b)DMF，24小时，室温(c)NBS，CCl4，回流(d)iPrOH，回流(e)甲酸，回流，2小时。
上述方案II显示了可用于制备式II-B化合物的一般合成方法，以化合物II-B-16为例。该方法是从Jira，T.等在《Pharmazie》第401-406页(1994)中公开的方法改良的。式II-B化合物也可以用与下列文献中公开的类似方法制备Woller，J.等，《Pharmazie》第937-940页(1996)；Rychmans，T.等，《四面体》第1729-1734页(1997)；和Tupper，D.E.等，《合成》第337-341页(1997)。
按照另一个实施方案，本发明提供了抑制生物学样品中激酶活性的方法。该方法包括使所述生物学样品与本发明化合物接触的步骤。
本文中所用的术语“生物学样品”包括细胞培养物或其提取物；从哺乳动物得到的活组织检查物质或其提取物；以及血液、唾液、小便、粪便、精液、眼泪、或其他体液或其提取物。术语“生物学样品”还包括活有机体，在这种情况下，“使本发明化合物与生物学样品接触”与术语“对哺乳动物给药所述化合物(或包含所述化合物的组合物)”是同义的。
本发明的另一个方面涉及哺乳动物的可通过用蛋白激酶抑制剂治疗而减轻的疾病状态的治疗方法，该方法包括对需要这种治疗的哺乳动物给药治疗有效量的式I化合物 或其药学上可接受的衍生物，其中R1选自R、卤素、N(R8)2、OR、NRCOR、NRCON(R8)2、CON(R8)2、SO2R、NRSO2R或SO2N(R8)2；T选自价键或连接基；R各自独立地选自氢或具有1至6个碳的可选取代的脂族基；R2选自氢、CN、卤素、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环基、具有1至6个碳的可选取代的无环脂族链基、或具有4至10个碳的可选取代的环脂族基；R3选自R、OH、OR、N(R8)2、卤素或CN；Q是价键、J、或可选取代的C1-6亚烷基链，其中该亚烷基链的最多两个非相邻碳各自可选地并独立地被J取代；J选自-C(＝O)-、-CO2-、-C(O)C(O)-、-NRCONR8-、-N(R)N(R8)-、-C(＝O)NR8-、-NRC(＝O)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R)O-、-ON(R8)-、-OC(＝O)N(R8)-、-N(R)COO-、-SO2N(R8)-、-N(R)SO2-或-N(R8)-；R4选自-R8、-R5、-NH2、-NHR5、-N(R5)2或-NR5(CH2)yN(R5)2；R5各自独立地选自R6、R7、-(CH2)yCH(R6)(R7)、-(CH2)yR6、-(CH2)yCH(R6)2、-(CH2)yCH(R7)2或-(CH2)yR7；y是0-6；R6各自是可选取代的基团，独立地选自脂族基、芳基、芳烷基、芳烷氧基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、杂环基、杂环基烷基或杂环基烷氧基；R7各自独立地选自可选取代的脂族基、羟基烷基、烷氧基烷基、芳氧基烷基或烷氧基羰基；R8各自独立地选自R，或者同一氮上的两个R8与氮一起可选地构成具有1至3个杂原子的4至8元饱和或不饱和杂环；并且各个可取代的环氮可选地被R、NR2、COR、CO2(C1-C6可选取代的烷基)、SO2(C1-C6可选取代的烷基)、CONR2和SO2NR2取代。
一个实施方案包括给药式II化合物。优选实施方案包括给药式II-A化合物，首选表1中所列的化合物。另一个优选实施方案包括给药式II-B化合物，更优选表2中所列的化合物。下面描述用于这类方法的药物组合物。
本发明方法尤其可用于治疗能通过使用ERK、JAK、JNK、Aurora、GSK、KDR或AKT的抑制剂来减轻的疾病状态。除非另有说明，否则本文中所用的术语“ERK”、“JAK”、“JNK”、“Aurora”、“GSK”、“KDR”和“AKT”指的是各个酶的所有同种型，包括但不限于ERK1、ERK2、ERK3、ERK4、ERK5、ERK6、ERK7、JAK1、JAK2、JAK3、JAK4、JNK1、JNK2、JNK3、Auroral、Aurora2、GSK3-α、GSK3-β、KDR、AKT-1、AKT-2和AKT-3。
化合物作为蛋白激酶抑制剂、例如作为ERK抑制剂的活性可以在体外、在体内或在细胞系中进行测定。用ERK为例，体外测定包括测定活化ERK的激酶活性或ATP酶活性的抑制情况。另一项体外测定法定量测定抑制剂结合ERK的能力，并可通过在结合前对抑制剂进行放射性标记、分离抑制剂/ERK复合物和测定放射性标记结合的量来测量，或者通过进行竞争实验来测量，其中新的抑制剂与结合到已知放射性配体上的ERK一起培养。根据要抑制的ERK类型或同种型，可以使用任何类型或同种型的ERK。
根据酶测定法的测定，本发明化合物是ERK的强抑制剂。这些化合物还在细胞增殖测定中显示能抑制ERK。用于酶测定和细胞增殖测定的具体条件陈述在下文中的实施例中。
根据酶测定法的测定，本发明化合物还是JNK、Aurora、GSK、KDR和AKT的抑制剂。用于该测定的具体条件陈述在下文中的实施例中。不受理论的束缚，本发明化合物还预期能抑制其他蛋白激酶。
本发明的蛋白激酶抑制剂或其可药用盐可以配制成用于对动物或人给药的药物组合物。包含足以可检测地抑制蛋白激酶活性量的蛋白激酶抑制剂和药学上可接受的载体的、能有效地治疗或预防蛋白激酶介导的疾病的这些药物组合物是本发明的另一个实施方案。本文中所用的术语“可检测地抑制”是指含有所述抑制剂的样品和只含有蛋白激酶的样品间活性的可测量的变化。
本文中所用的术语“ERK介导的疾病”是指其中已知ERK起作用的任何疾病状态或其他有害病况。这类疾病非限制性地包括癌、中风、糖尿病、肝肿大、心血管疾病包括心肥大、早老性痴呆、囊纤维变性、病毒疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、牛皮癣、变应性疾病包括哮喘、炎症、神经病学疾病和与激素有关的疾病。术语“癌”包括但不限于下列癌乳癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道癌、肾癌、骨髓疾病、淋巴样疾病、何杰金氏病、毛细胞、口腔前庭和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、咽癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和中枢神经系统癌，以及白血病。
本发明化合物还可用作相关激酶的抑制剂。术语“相关激酶”指的是具有与连接ERK结合位点的那些残基类似的残基的蛋白激酶。不希望受到理论的束缚，申请人推测这种抑制活性是由ERK和相关激酶的活性位点之间的紧密的结构相似性导致的。ERK序列与其他激酶的对齐可以从普通的软件程序诸如可从Genetics ComputerGroup购得的“bestfit”程序产生。这种程序使用Smith和Waterman在《应用数学进展》2；482(1981)中描述的局部同源性算法。
利用上述标准蛋白质序列对齐软件确定，受本发明化合物抑制的相关激酶将含有与ERK残基相对应的残基I31、E33、G34、A35、Y36、G37、M38、V39、A52、K54、R67、T68、E71、L75、I84、I86、I103、Q105、D106、L107、M108、E109、D111、K114、D149、K151、S153、N154、L156、C166和D167，相似性得分为80％或更高。相似性得分可以使用标准氨基酸置换表确定，诸如由Dayhoff(Dayhoff，M.O.等，《蛋白质序列和结构图谱》，1979年)和Blosom-Henikoff(Blosom-Henikoff，S和Henikoff，J.D.，PNAS，1992，8910915-10919)描述的那些。术语“相关激酶”还包括含有与下列ERK残基的相似性得分为80％或更高的残基的那些I31、G37、A52、I103、E109和N154。
本发明化合物还可用作JAK族激酶的抑制剂。不希望受到理论的束缚，申请人推测这种抑制活性是由于如上述标准方法确定的ERK和JAK的活性位点之间的紧密的结构相似性导致的。
从用ERK结合抑制剂进行的内部X射线晶体结构实验来看，ERK活性部位中的三个氨基酸残基构成了与这些类型的抑制剂的关键氢键键合作用。这三个氨基酸残基是M108、D106和Q105。此氨基酸编号对应于Swiss-Prot资料库中的登记号#P28482。Swiss-Prot资料库是由瑞士日内瓦的欧洲生物信息学协会(EBI)发布的国际蛋白质序列资料库。该资料库可以在www.ebi.ac.uk/swissprot上找到。
M108和D106的主链原子以及伴随的相互作用是所有激酶共有的。M108提供氢键供体和受体，D106通过其主链CO提供氢键受体。能与活性部位中的一个或多个这些氢键键合基团形成氢键的抑制剂预期将与酶结合，并因此显示出抑制作用。
通过检查从上述软件程序获得的对齐数据，确定Q105谷氨酰胺残基和包括ERK和JAK的激酶子集有关。Q105提供关键的氢键接受侧链CO。模型化实验显示，对于ERK和JAK，Ht环的氢键供体在Q105残基远处的氢键键合部位中。由于这些类似的活化-位点相互作用，本发明的ERK抑制剂也抑制JAK。因此，这些化合物可用于治疗JAK介导的疾病。
本文中所用的术语“JAK介导的疾病”是指其中已知JAK起作用的任何疾病状态或其他有害病况。这类疾病非限制性地包括变应性疾病诸如哮喘和特应性皮炎、自身免疫疾病诸如SLE狼疮和牛皮癣、以及与器官移植有关的疾病。
本发明化合物还可用作JNK族激酶的抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗JNK介导的疾病。本文中所用的术语“JNK介导的疾病”是指其中已知JNK起作用的任何疾病状态或其他有害病况。这类疾病非限制性地包括驱动编程性细胞死亡的神经变性疾病诸如早老性痴呆、帕金森氏病、ALS(肌萎缩性侧索硬化)、癫痫和癫痫发作、杭廷顿氏舞蹈病、外伤性脑损伤、以及缺血性和出血性中风、心脏病、免疫缺陷疾病、炎性疾病、变应性疾病、自身免疫疾病、破坏性骨疾病诸如骨质疏松症、增殖性疾病、传染病、病毒疾病、涉及细胞死亡的疾病和增生包括中风、心脏病发作和器官氧不足中的再充满/局部缺血、凝血酶诱导的血小板聚集、慢性骨髓性白血病(CML)、类风湿性关节炎、哮喘、骨关节炎、局部缺血、癌、肝脏疾病包括肝局部缺血、心脏病诸如心肌梗死和充血性心力衰竭、牵涉T细胞活化的病理性免疫疾病和神经变性疾病。
本发明化合物还可用作Aurora抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗Aurora介导的疾病。本文中所用的术语“Aurora介导的疾病”是指其中已知Aurora起作用的任何疾病状态或其他有害病况。这类疾病非限制性地包括癌。术语“癌”包括但不限于下列癌结肠癌和卵巢癌。
本发明化合物还可用作GSK族激酶的抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗GSK介导的疾病。本文中所用的术语“GSK介导的疾病”是指其中已知GSK起作用的任何疾病状态或其他有害病况。这类疾病非限制性地包括糖尿病、早老性痴呆、神经变性疾病和CNS疾病诸如躁狂抑郁性疾病和精神分裂症。
本发明化合物还可用作KDR族激酶的抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗KDR介导的疾病。本文中所用的术语“KDR介导的疾病”是指其中已知KDR起作用的任何疾病状态或其他有害病况。KDR介导的疾病或病况包括但不限于癌诸如脑癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、乳癌、卡波济氏肉瘤和白血病；子宫内膜异位，良性前列腺增生；血管疾病诸如再狭窄和动脉粥样硬化；自身免疫疾病诸如类风湿性关节炎和牛皮癣；眼病诸如增殖性或血管生成性视网膜病和黄斑变性；和炎性疾病诸如接触性皮炎、哮喘和迟发性过敏反应。
本发明化合物还可用作AKT族激酶的抑制剂。因此，这些化合物可用于治疗AKT介导的疾病。本文中所用的术语“AKT介导的疾病”是指其中已知AKT起作用的任何疾病状态或其他有害病况。AKT介导的疾病或病况包括但不限于增殖性疾病、癌和神经变性疾病。
除了本发明的化合物以外，本发明化合物的药学上可接受的衍生物或药物前体也可以用于组合物中来治疗或预防上述疾病。
“药学上可接受的衍生物或药物前体”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐或其他衍生物，一旦对接受者给药，它们就能直接或间接提供本发明化合物或其抑制性活性代谢物或残余物。特别有利的衍生物或药物前体是当这类化合物对哺乳动物给药时能提高本发明化合物的生物利用度(例如通过使口服给药的化合物更容易地吸收到血液中)或能增强母化合物向与母物质有关的生物学房室(例如脑或淋巴系统)的释放的那些。
本发明化合物的药学上可接受的药物前体非限制性地包括酯、氨基酸酯、磷酸酯、金属盐和磺酸酯。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括从药学上可接受的无机和有机酸和碱衍生的那些。适宜的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天门冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、酸式硫酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、月桂基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡糖庚酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、palmoate、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其他酸，诸如草酸，尽管自身不是药学上可接受的，但可以在得到本发明化合物和它们的药学上可接受的酸加成盐中作为中间体用于盐的制备。
从适宜的碱衍生的盐包括碱金属(例如钠和钾)盐、碱土金属(例如镁)盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。本发明还预想了本文中公开的化合物的任何碱性含氮基团的季铵化。季铵化可得到水或水溶或分散的产物。
可以用于这些药物组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白诸如人血清白蛋白、缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本发明组合物可以口服给药、胃肠外给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、经鼻给药、经颊给药、鞘内给药或经由植入贮器给药。本文中所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、损害内和颅内注射或滴注技术。优选组合物口服、腹膜内或静脉内给药。
本发明组合物的无菌注射用形式可以是含水或油质的悬浮液。这些悬浮液可以按照本领域中的已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行配制。无菌注射用制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射用溶液或悬浮液，例如用1，3-丁二醇制成溶液。在可接受的赋形剂和溶剂中可以采用的是水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油常常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的不挥发油包括合成的一-或二-甘油酯。脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于注射用制剂，天然的药学上可接受的油也可以，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化变型。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或常用于配制药学上可接受的剂型包括乳剂和悬浮液的类似分散剂。为了制剂的目的，还可以使用其他常用表面活性剂诸如吐温类、司盘类和其他乳化剂或常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型的生物利用度增强剂。
本发明的药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊剂、片剂、含水悬浮液或溶液。就用于口服的片剂而言，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂诸如硬脂酸镁。对于以胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥玉米淀粉。当需要口服含水悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如果需要，还可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
另一方面，本发明的药物组合物可以直肠给药用的栓剂形式给药。这些可以通过将药剂与适宜的在室温下为固体但在直肠温度下为液体并因此将在直肠中熔化而释放出药物的非刺激性赋形剂混合加以制备。这类物质包括椰子油、蜂蜡和聚乙二醇。
本发明的药物组合物还可以局部给药，尤其是当治疗目标包括通过局部应用就可容易地进入的区域或器官时，包括眼睛、皮肤或下肠道的疾病。合适的局部制剂可针对各种区域或器官容易地制备。
对于下肠道的局部应用可以用直肠栓剂制剂(参见上文)完成，或者用适宜的灌肠剂制剂完成。也可使用局部透皮贴片。
对于局部应用，药物组合物可以配制成合适的含有悬浮或溶于一种或多种载体中的活性成分的软膏剂。用于本发明化合物的局部给药的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。另一方面，药物组合物可以配制成合适的含有悬浮或溶于一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的洗液或膏霜。适宜的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇一硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。
对于眼科应用，药物组合物可以配制成在等渗的pH调节好的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选配制成在等渗的pH调节好的无菌盐水中的溶液，加或不加防腐剂诸如氯苄烷铵。另一方面，对于眼科应用，药物组合物可以配制成软膏剂诸如在凡士林中的。
本发明的药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入给药。这类组合物按照药物制剂领域中众所周知的技术制备，并可制备成在盐水中的溶液，使用苯甲醇或其他适宜的防腐剂、增强生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、和/或其他常规增溶剂或分散剂。
可以与载体物质结合生产单一剂型的本发明的蛋白激酶抑制剂的量将根据所治疗的主体、特定的给药方式变化。优选应配制组合物使得可以对接受这些组合物的病人给药剂量在约0.01-100mg/kg体重/天之间的抑制剂。
还应当理解对于任何特定病人的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、以及主治医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。抑制剂的量还将取决于组合物中的特定化合物。
本发明的激酶抑制剂或其药物组合物还可以掺入到用于涂敷可植入医学装置诸如假体、人工瓣膜、血管移植物、斯滕特氏固定模和导管的组合物中。例如，血管斯滕特氏固定模已用于克服再狭窄(损伤后血管壁的再狭窄)。但是，使用斯滕特氏固定模或其他可植入装置的病人有形成凝血块或血小板活化的危险。这些不希望的作用可以通过用包含激酶抑制剂的组合物预先涂敷装置来防止或缓和。适宜的涂层和可植入包衣装置的一般制备记载在美国专利5,099,562；5,886,026和5,304,121中。涂层一般是生物相容性聚合材料诸如水凝胶聚合物、聚甲基二硅氧烷、聚己内酯、聚乙二醇、聚乳酸、乙烯基乙酸乙烯酯、及其混合物。涂层可以可选地进一步用适宜的氟聚硅氧烷、多糖、聚乙二醇、磷脂或其结合物的表层涂层覆盖，以便赋予组合物能可控释放的特性。用本发明的激酶抑制剂涂敷的可植入装置是本发明的另一个实施方案。
按照另一个实施方案，本发明提供了治疗或预防ERK、JAK、JNK、Aurora、GSK、KDR或AKT介导的病况或疾病状态的方法，它包括对病人给药上述一种药物组合物的步骤。本文中所用的术语“病人”是指哺乳动物，优选人。
优选该方法用于治疗或预防选自下列成员的病况或疾病状态癌诸如乳癌、结肠癌、前列腺癌、皮肤癌、胰腺癌、脑癌、生殖泌尿道癌、淋巴系统癌、胃癌、喉癌和肺癌包括肺腺癌和小细胞肺癌、中风、糖尿病、肝肿大、心肥大、心血管疾病、早老性痴呆、囊纤维变性、和病毒疾病，或者任何上述具体疾病或紊乱。
根据要治疗或预防的特定病况或疾病状态，通常给药用于治疗或预防该病况的其他治疗剂可以与本发明的抑制剂一起给药。例如，化疗剂或其他抗增殖剂可以与本发明的抑制剂结合来治疗增殖性疾病和癌。已知化疗剂的实例包括但不限于阿霉素、地塞米松、长春新碱、环磷酰胺、氟尿嘧啶、托泊替堪、紫杉醇、干扰素和铂衍生物。
还可以与本发明的抑制剂结合给药的药剂的其他实例非限制性地包括抗炎剂诸如皮质类固醇、TNF阻滞剂、IL-1RA、硫唑嘌呤、环磷酰胺和柳氮磺胺吡啶；免疫调节剂和免疫抑制剂诸如环孢菌素、藤霉素、雷怕霉素、霉酚酸莫非替克、干扰素、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤和柳氮磺胺吡啶；神经营养因子诸如乙酰胆碱酯酶抑制剂、MAO抑制剂、干扰素、抗惊厥剂、离子通道阻滞剂、利鲁唑和抗帕金森氏病药剂；用于治疗心血管疾病的药剂诸如β阻滞剂、ACE抑制剂、利尿剂、硝酸盐、钙通道阻滞剂和他汀类；用于治疗肝脏疾病的药剂诸如皮质类固醇、考来烯胺、干扰素和抗病毒剂；用于治疗血液疾病的药剂诸如皮质类固醇、抗白血病药和生长因子；用于治疗糖尿病的药剂诸如胰岛素、胰岛素类似物、α葡萄糖甙酶抑制剂、双胍类和胰岛素敏化剂；以及用于治疗免疫缺陷疾病的药剂诸如γ球蛋白。
这些附加药剂可以作为多剂方案的一部分与含有抑制剂的组合物分开给药。另一方面，这些药剂可以是单一剂型的一部分，与抑制剂一起混合在单一组合物中。
为了能更全面地理解本发明，给出下列实施例。应当理解这些实施例只是为了说明的目的，而不解释为以任何方式对本发明的限制。实施例实施例1 2，2，2-三氯-1-(4-苯基乙酰基-1H-吡咯-2-基)-乙酮(1)在一个干燥烧瓶中，苯基乙酰氯(1当量)与2-三氯乙酰基吡咯(1当量)在最小量的二氯甲烷(DCM)中化合。在室温下，向所得溶液中加入三氯化铝(1当量)。2小时后，将该反应混合物直接加到硅胶柱上。用在己烷中的10％乙酸乙酯至50％乙酸乙酯梯度洗脱，得到化合物1，收率60％。1H NMR(CDCl3)δ4.0(s，2H)，7.1-7.35(m，7H)，9.7(brs，NH)。使用方法B进行的HPLC(如下文中实施例5所述)提供了4.9分钟的保留时间。LC/MS(M+1)330.2，(M-1)328.1。实施例2 4-苯基乙酰基-1H-吡咯-2-羧酸苄基酰胺(2)在室温下，向化合物1(1当量)的DMF溶液中加入苄胺(1.2当量)。24小时后，蒸除溶剂，粗产物2不经纯化就使用。使用方法B进行的HPLC(如下文中实施例5所述)提供了3.8分钟的保留时间。FIA/MS(M+1)319.3，(M-1)317.2。实施例3 4-(3-二甲氨基-2-苯基-丙烯酰基)-1H-吡咯-2-羧酸苄基酰胺(3)在室温下，向化合物2(1当量)的THF溶液中加入(Me2N)2CHOt-Bu(3当量)。24小时后，蒸除溶剂，粗产物3不经纯化就使用。1H NMR(CDCl3)δ4.4(s，2H)，4.8(s，NH)，6.8-7.4(m，13H)。实施例4 4-(4-苯基-1H-吡唑-3-基)-1H-吡咯-2-羧酸苄基酰胺(II-5)在室温下，向化合物3(1当量)的乙醇溶液中加入水合肼(3当量)并将所得混合物加热回流。12小时后，蒸除溶剂，粗产物用制备HPLC(逆相；10→90％MeCN的水溶液；15分钟)纯化，得到所需化合物II-5。LC/MS(M+1)343.3，(M-1)341.2。
实施例5利用基本上与上述实施例1-4中所述的和方案I说明的类似方法，我们已制备了其他式II化合物。这些化合物的特性资料总结在下表3中，包括LC/MS，HPLC和1H NMR数据。
对于HPLC方法指定为“A”的化合物，采用以下方法水∶MeCN，0.1％TFA(95∶5→0∶100)梯度洗脱22分钟，在1mL/分钟和214nm下进行。对于HPLC方法指定为“B”的化合物，采用以下方法水∶MeCN，0.1％TFA(90∶10→0∶100)梯度洗脱8分钟，在1mL/分钟和214nm下进行。方法A和B各自使用大小为3.0×150mm的YMC ODS-AQ 55 120A柱。术语“Tret(分钟)”指的是使用指定HPLC方法得到的化合物的保留时间，以分钟计。
合适时，1H NMR数据也总结在下表3中，其中“Y”表示可以获得1H NMR数据并且该数据与结构一致。化合物编号对应于表1中所列的化合物编号。表3.选定化合物的特性资料
实施例6ERK抑制测定通过分光光度偶联酶测定法(Fox等(1998)《蛋白质科学》7，2249)测定化合物对ERK2的抑制。在该测定中，固定浓度的活化ERK2(10mM)与在DMSO(2.5％)中的不同浓度的化合物一起在30℃下在含有10mM MgCl2、2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、200μM NADH、150μg/mL丙酮酸激酶、50μg/mL乳酸脱氢酶和200μM erktide肽的0.1M HPEPS缓冲液，pH7.5中培养10分钟。监测在340nm下的吸光度的下降率。从该数据作为抑制剂浓度的函数来评估IC50。
表4显示了在ERK2抑制测定中选定的本发明化合物的活性结果。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“A”的活性的化合物提供1微摩尔以下的Ki值；具有指定为“B”的活性的化合物提供1至5微摩尔之间的Ki值；具有指定为“C”的活性的化合物提供大于5微摩尔的Ki值。表4.选定化合物的ERK2抑制活性
实施例7ERK抑制细胞增殖测定利用细胞增殖测定法测定化合物对ERK2的抑制。在该测定中，完全培养基通过向RPMI 1640培养基(JRH Biosciences)中加入10％胎牛血清和青霉素/链霉素溶液来制备。将结肠癌细胞(HT-29细胞系)加入到96孔平板的84个孔中，种植密度为10,000细胞/孔/150μL。通过在37℃下培养2小时使细胞附着到平板上。用完全培养基制备测试化合物的溶液，通过系列稀释得到以下浓度20μM、6.7μM、2.2μM、0.74μM、0.25μM和0.08μM。将测试化合物溶液(50μL)加入到含有细胞的72个孔中。向其余的12个含有细胞的孔中仅加入完全培养基(200μL)构成对照组，以测量最大增殖。向剩余的12个空白孔中加入完全培养基构成载体对照组，以测量背景底数。平板在37℃下培养3天。将3H-胸苷储备溶液(1mCi/mL，NewEngland Nuclear，Boston，MA)用RPMI培养基稀释到20μCi/mL，然后将20μL该溶液加入到各个孔中。平板在37℃下再培养8小时，然后收获并使用液体闪烁计数器分析3H-胸苷摄取。
在结肠细胞增殖测定中抑制ERK并具有小于10μM的IC50的选定的本发明化合物包括II-43、II-48和II-45。
实施例8JAK抑制测定化合物对JAK的抑制可以利用G.R.Brown等在《Bioorg.Med.Chem.Lett.》2000年，第10卷，575-579页中描述的方法用以下方式测定。向先前在4℃下用Poly(Glu，Ala，Tyr)6∶3∶1涂敷然后用磷酸缓冲盐水0.05％和吐温(PBST)洗涤的Maxisorb平板中加入2μM ATP、5mM MgCl2和化合物的DMSO溶液。反应用JAK酶开始，平板在30℃下培养60分钟。然后这些平板用PBST洗涤，加入100μLHRP缀合4G10抗体，该平板在30℃下培养90分钟。平板再次用PBST洗涤，加入100μL TMB溶液，然后这些平板在30℃下再培养30分钟。加入硫酸(100μL，1M)终止反应，平板在450nM下读数，得到光学密度用于分析确定IC50值。
实施例9JNK抑制测定用以下方式使用分光光度偶联酶测定法就化合物抑制JNK的能力对化合物进行筛选。向含有0.1M HPEPS缓冲液(pH7.5)、10mMMgCl2、2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、200μM NADH、150μg/mL丙酮酸激酶、50μg/mL乳酸脱氢酶和200μM EGF受体肽(具有序列KRELVEPLTPSGEAPNQALLR)的测定储备缓冲溶液中加入化合物的不同浓度的DMSO溶液和固定浓度(10nM)的活化JNK。所得混合物在30℃下培养10分钟，然后通过加入10μM ATP引发反应。在30℃下在340nM下的吸光度的下降作为时间的函数加以监测，使所得数据与竞争性抑制动力学模型相配合来确定Ki。
表5显示了在JNK抑制测定中选定的本发明化合物的活性结果。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“A”的活性的化合物提供1微摩尔以下的Ki值；具有指定为“B”的活性的化合物提供1至5微摩尔之间的Ki值；具有指定为“C”的活性的化合物提供大于5微摩尔的Ki值。
表5.选定化合物的JNK抑制活性
实施例10Aurora抑制测定用以下方式使用标准偶联酶测定法就化合物抑制Aurora的能力对化合物进行筛选。向含有0.1M HPEPS，pH7.5、10mM MgCl2、25mMNaCl、2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、300μM NADH、30μg/mL丙酮酸激酶、10μg/mL乳酸脱氢酶、40μM ATP和800μM肽(LRRASLG，AmericanPeptide，Sunnyvale，CA)的测定储备缓冲溶液中加入30μM化合物的DMSO溶液，所得混合物在30℃下培养10分钟。通过加入10μL70nM Aurora和1mM DTT引发反应。在30℃下使用BioRad Ultramark平板读数器(Hercules，CA)在5分钟读数时间里监测340nM下的吸光度而得到反应率。从该数据作为抑制浓度的函数来确定IC50。
表6显示了在Aurora2抑制测定中选定的本发明化合物的活性结果。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“A”的活性的化合物提供5微摩尔以下的IC50值；具有指定为“B”的活性的化合物提供5至10微摩尔之间的IC50值；具有指定为“C”的活性的化合物提供大于10微摩尔的IC50值。
表6.选定化合物的Aurora2抑制活性
实施例11GSK-3抑制测定用以下方式使用标准偶联酶测定法(Fox等(1998)《蛋白质科学》7，2249)就化合物抑制糖原合成酶激酶3(GSK-3)的能力对化合物进行筛选。向含有0.1M HPEPS，pH7.5、10mM MgCl2、25mM NaCl、2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、300μM NADH、1mM DTT、30μg/mL丙酮酸激酶、10μg/mL乳酸脱氢酶、300μM肽(HSSPHQp-SEDEEE，AmericanPeptide，Sunnyvale，CA)和60nM GSK-3的测定储备缓冲溶液中加入30μM化合物的DMSO溶液，所得混合物在30℃下培养5分钟。通过加入10μL ATP引发反应。在30℃下使用Molecular Devices平板读数器(Sunnyvale，CA)在5分钟读数时间里监测340nM下的吸光度而得到反应率。从该数据作为抑制浓度的函数来确定IC50。
表7显示了在GSK-3抑制测定中选定的本发明化合物的活性结果。化合物编号对应于表1中的化合物编号。具有指定为“A”的活性的化合物提供10微摩尔以下的IC50值；具有指定为“B”的活性的化合物提供10至20微摩尔之间的IC50值；具有指定为“C”的活性的化合物提供大于20微摩尔的IC50值。
表7.选定化合物的GSK-3抑制活性
实施例12KDR抑制测定使用标准偶联酶测定法(Fox等，《蛋白质科学》，(1998)7，2249)就化合物抑制KDR的能力对化合物进行筛选。测定在200mMHPEPS，pH7.5、10mM MgCl2、25mM NaCl、1mM DTT和1.5％DMSO的混合物中进行。测定中的终底物浓度为300μM ATP(SigmaChemicals)和10μM聚E4Y(Sigma)。测定在37℃和30nM KDR下进行。偶联酶系统各成分的终浓度为2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、200μM NADH、30μg/mL丙酮酸激酶和10μg/mL乳酸脱氢酶。
制备含有上列所有试剂但不含ATP和测试化合物的测定储备缓冲溶液。将177μL该储备溶液置于96孔平板中，接着加入3μl含有测试化合物(化合物终浓度为30μM)的2mM DMSO储备液。平板在37℃下预培养约10分钟，反应通过加入20μl ATP(终浓度300μM)引发。使用Molecular Devices平板读数器(Sunnyvale，CA)在5分钟读数时间里在37℃下得到反应率。对与含有测定混合物和DMSO但不含测试化合物的标准孔相比显示大于50％抑制的化合物进行滴定，以确定IC50值。
在上述测定中在2μM浓度下抑制KDR并具有大于40％的抑制百分数的选定的本发明化合物包括II-43、II-48、II-304和II-305。
实施例13AKT抑制测定使用标准偶联酶测定法(Fox等，《蛋白质科学》，(1998)7，2249)就化合物抑制AKT的能力对化合物进行筛选。测定在100mMHPEPS，pH7.5、10mM MgCl2、25mM NaCl、1mM DTT和1.5％DMSO的混合物中进行。测定中的终底物浓度为170μM ATP(SigmaChemicals)和200μM肽(RPRAATF，American Peptide，Sunnyvale，CA)。测定在37℃和45nM AKT下进行。偶联酶系统各成分的终浓度为2.5mM磷酸烯醇丙酮酸、300μM NADH、30μg/mL丙酮酸激酶和10μg/mL乳酸脱氢酶。
制备含有上列所有试剂但不含AKT、DTT和测试化合物的测定储备缓冲溶液。将56μL该储备溶液置于384孔平板中，接着加入1μl含有测试化合物(化合物终浓度为30μM)的2mM DMSO储备液。平板在30℃下预培养约10分钟，反应通过加入10μl酶(终浓度45nM)和1mM DTT引发。使用BioRad Ultramark平板读数器(Hercules，CA)在5分钟读数时间里在30℃下得到反应率。对与含有测定混合物和DMSO但不含测试化合物的标准孔相比显示大于50％抑制的化合物进行滴定，以确定IC50值。
抑制AKT的选定的本发明化合物包括II-89、II-94和II-305。
虽然我们已描述了本发明的许多实施方案，但很明显，我们的基本实施例可以加以改变得到使用本发明化合物和方法的其他实施方案。因此，应当领会本发明的范围将由所附的权利要求书而不是已利用实施例进行表述的具体实施方案确定。
权利要求
1.式I化合物 或其药学上可接受的衍生物或药物前体，其中R1选自R、卤素、N(R8)2、OR、NRCOR、NRCON(R8)2、CON(R8)2、SO2R、NRSO2R或SO2N(R8)2；T选自价键或连接基；R各自独立地选自氢或具有1至6个碳的可选取代的脂族基；R2选自氢、CN、卤素、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环基、具有1至6个碳的可选取代的无环脂族链基、或具有4至10个碳的可选取代的环脂族基；R3选自R、OH、OR、N(R8)2、卤素或CN；Q是价键、J、或可选取代的C1-6亚烷基链，其中该亚烷基链的最多两个非相邻碳各自可选地并独立地被J取代；J选自-C(＝O)-、-CO2-、-C(O)C(O)-、-NRCONR8-、-N(R)N(R8)-、-C(＝O)NR8-、-NRC(＝O)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R)O-、-ON(R8)-、-OC(＝O)N(R8)-、-N(R)COO-、-SO2N(R8)-、-N(R)SO2-或-N(R8)-；R4选自-R8、-R5、-NH2、-NHR5、-N(R5)2或-NR5(CH2)yN(R5)2；R5各自独立地选自R6、R7、-(CH2)yCH(R6)(R7)、-(CH2)yR6、-(CH2)yCH(R6)2、-(CH2)yCH(R7)2或-(CH2)yR7；y是0-6；R6各自是可选取代的基团，独立地选自脂族基、芳基、芳烷基、芳烷氧基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、杂环基、杂环基烷基或杂环基烷氧基；R7各自独立地选自可选取代的脂族基、羟基烷基、烷氧基烷基、芳氧基烷基或烷氧基羰基；R8各自独立地选自R，或者同一氮上的两个R8与氮一起可选地构成具有1至3个杂原子的4至8元饱和或不饱和杂环；并且各个可取代的环氮可选地被R、NR2、COR、CO2(C1-C6可选取代的烷基)、SO2(C1-C6可选取代的烷基)、CONR2和SO2NR2取代；条件是当R1和R3各自为氢和当TR2是附着在吡唑环4位上的未取代苯环时QR4不是CON(CH3)2。
2.具有结构式II的按照权利要求1的化合物 或其药学上可接受的衍生物或药物前体。
3.具有一项或多项以下特征的按照权利要求2的化合物(a)Q是-CO-、-CO2-或-CONH-；(b)T是价键；(c)R1是氢或NHR；(d)R2是可选取代的芳环；(c)R3是氢；(e)R4选自R5、-NHR5、-N(R5)2、-NR5R6、-NHCHR5R6、或-NHCH2R5；或(f)R5是可选取代的基团，选自芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环基烷基、(CH2)yR6、(CH2)yR7、或(CH2)yCH(R6)(R7)。
4.具有式II-A的按照权利要求3的化合物 或其药学上可接受的衍生物或药物前体。
5.具有以下特征的按照权利要求4的化合物(a)T是价键；(b)R2是可选取代的芳环；(c)R4选自R5、-NHR5、-N(R5)2、-NR5R6、-NHCHR5R6、或-NHCH2R5；和(d)R5是可选取代的基团，选自芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环基烷基、(CH2)yR6、(CH2)yR7、或(CH2)yCH(R6)(R7)。
6.按照权利要求1的化合物，其中所述化合物选自表1中列出的那些，所述化合物不是编号1化合物。
7.具有式II-B的按照权利要求1的化合物 或其药学上可接受的衍生物或药物前体。
8.按照权利要求7的化合物，其中所述化合物具有一项或多项以下特征(a)T是价键；(b)R2是可选取代的芳环；(c)R4选自R5、-NHR5、-N(R5)2、-NR5R5、-NHCHR5R6、或-NHCH2R5；或(d)R5是可选取代的基团，选自芳基、芳烷基、杂芳基、杂芳烷基、杂环基、杂环基烷基、(CH2)yR6、(CH2)yR7、或(CH2)yCH(R6)(R7)。
9.按照权利要求1的化合物，其中所述化合物选自表2中列出的那些。
10.包含足以可检测地抑制蛋白激酶活性量的权利要求1-9任一项所述的化合物和药学上可接受的载体的组合物，所述蛋白激酶选自ERK、JAK、JNK、Aurora、GSK、KDR、AKT或与此相关的蛋白激酶中的一个或多个。
11.按照权利要求10的组合物，其中所述化合物以药学上可接受的方式配制成用于对病人给药。
12.按照权利要求11的组合物，它进一步包含或者作为与所述化合物一起的多剂形式的一部分或者作为分离的剂型的治疗剂。
13.抑制生物学样品中蛋白激酶活性的方法，其中所述蛋白激酶选自ERK、JAK、JNK、Aurora、GSK、KDR、AKT或与此相关的蛋白激酶，该方法包括使所述样品与按照权利要求1-9任一项的化合物接触的步骤。
14.治疗病人的蛋白激酶介导的疾病状态的方法，其中所述蛋白激酶选自ERK、JAK、JNK、Aurora、KDR、AKT或与此相关的蛋白激酶中的一个或多个，该方法包括对所述病人给药按照权利要求11的组合物的步骤。
15.按照权利要求14的方法，还包括另外的对所述病人给药或者作为与所述化合物一起的多剂形式的一部分或者作为分离的剂型的治疗剂的步骤。
16.治疗病人的疾病状态的方法，其中所述疾病状态选自癌、中风、糖尿病、肝肿大、心血管疾病、早老性痴呆、囊纤维变性、病毒疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、牛皮癣、变应性疾病、炎症、神经病学疾病、与激素相关的疾病、与器官移植有关的疾病、免疫缺陷疾病、破坏性骨疾病、增殖性疾病、传染病、涉及细胞死亡的疾病、凝血酶诱导的血小板聚集、慢性骨髓性白血病(CML)、肝脏疾病、牵涉T细胞活化的病理性免疫疾病或CNS疾病，该方法包括对所述病人给药按照权利要求10的组合物的步骤。
17.按照权利要求16的方法，其中疾病状态是癌。
18.按照权利要求17的方法，其中疾病状态是选自下列种类的癌乳癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、生殖泌尿道癌、食道癌、喉癌、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、胃癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、肺癌、表皮样癌、大细胞癌、小细胞癌、肺腺癌、骨癌、结肠癌、腺瘤、胰腺癌、腺癌、甲状腺癌、滤泡癌、未分化癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌和胆道癌、肾癌、骨髓疾病、淋巴样疾病、何杰金氏病、毛细胞、口腔前庭和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、咽癌、小肠癌、结肠-直肠癌、大肠癌、直肠癌、脑癌和中枢神经系统癌，或白血病。
19.按照权利要求17或18的方法，还包括另外的对所述病人给药或者作为与所述化合物一起的多剂形式的一部分或者作为分离的剂型的化学治疗剂的步骤。
20.按照权利要求16的方法，其中疾病状态是心血管疾病。
21.按照权利要求20的方法，其中疾病状态是选自再狭窄、心肥大、动脉粥样硬化、心肌梗死或充血性心力衰竭的心血管疾病。
22.按照权利要求20或21的方法，还包括另外的对所述病人给药或者作为与所述化合物一起的多剂形式的一部分或者作为分离的剂型的用于治疗心血管疾病的治疗剂的步骤。
23.一种用于涂敷可植入装置的组合物，它包含按照权利要求1的化合物和适于涂敷所述可植入装置的载体。
24.一种用按照权利要求23的组合物包衣的可植入装置。
全文摘要
本发明公开了用作蛋白激酶抑制剂的式(I)化合物,其中R
文档编号C07D231/38GK1362953SQ01800374
公开日2002年8月7日 申请日期2001年2月5日 优先权日2000年2月5日
发明者J·格林, J·曹, M·黑尔, C·贝克尔, F·玛尔泰斯, J·珍尼特卡, M·穆里肯, G·比米斯, X·谢, J·斯特劳布, Q·唐, R·马歇尔 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司