干细胞增强材料的制作方法

专利名称：干细胞增强材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及具备增强人类含动物干细胞机能的干细胞增强材料。
作为体性干细胞一种的造血干细胞是血液的干细胞，在维持造血机能上是最重要的物质。这种造血是由骨髓进行，另外，在胎生期，进行造血的器官随胎生月龄的增加而发生变化，还已知在出生前骨髓发挥造血作用。骨髓造血，最初生成造血干细胞，其后，该造血干细胞增殖、分化成红血球和白血球供给体内。所以，作为骨髓造血作用的造血干细胞的生成通常正常地进行，而且是维持人和家畜等其它动物健康不可缺少的。
一方面，受大量放射线照射和受抗癌剂施用，不会因这些急性病症死亡，但是其副作用使骨髓的造血机能，即造血干细胞的生成机能受到损坏而降低，其结果使红血球和白血球等造成的血球的生成降低，造成死亡。
这种血球的生产机能损坏发生时，实现了由癌治疗造成癌细胞的减少或消灭，与由血液不足造成生命的死亡没有关系。换言之，如果正常维持骨髓的造干血细胞，发挥癌治疗效果，是可以战胜癌症的，但是目前这是不可能的。
而且，为了提高癌症治疗等的治疗效果，也希望开发骨髓干细胞的增强材料。
再者，为了使健康体的体力增强，提高抵抗力，也要求开发骨髓干细胞增强材料。
另外，如果除造血干细胞外其它的体性干细胞也能够增强的话，可以进行各种疾病的预防或治疗。例如，如果神经干细胞可以增强，就可以实施阿尔察默病的预防或治疗；如果骨髓干细胞可以增强，就可以实施骨质疏松病等的预防或治疗；如果肝脏干细胞可以增强，就可以实施肝脏疾病的预防或治；如果肾脏干细胞可以增强，就可以实施肾脏疾病的预防或治疗。
再者，如果胚性干细胞可以增强，可以促进胚性干细胞的细胞分化。在该胚性干细胞中，预先含作为信号传达物质的斯坦脱(STAT)3，仍然维持胚性干细胞不分化，随着该STAT3与女性荷尔蒙容易反应，胚性干细胞开始增殖。所以，研究它莫西分(tamoxifen)那样选择性的雌激素受容体调节剂(SERMs)代替女性的荷尔蒙。但是，SERMs的作用机理不十分清楚，有毒性等的副作用，希望SERMs对人具有有效机能性。按此观点，期待异黄酮甙元具有SERMs作用机能的有效性。
本发明的第二目的是提供可以不阻碍细胞增殖因子作用的酶的酶活性，保持雌激素那样的作用，使用异黄酮甙元可增强干细胞的干细胞增强材料。
本发明者进行深入研究，发现对大白鼠照射放射线，在异黄酮甙元和谷类用曲菌发酵使蛋白质分解的生成物再加水分解时，当该生成物中含乳酸菌和/或向上述生成物添加乳酸菌增殖促进生成物，上述两方面经口摄取时，其后移植健康大白鼠的骨髓，发现脾脏的机能大大恢复，这些异黄酮甙元或谷类由曲菌发酵使蛋白质分解的生成物再添加水分解时，当该生成物中含乳酸菌和/或向上述的生成物添加乳酸菌增殖促进生成物的体内吸收，可以增强骨髓造血干细胞，从而完成了本发明。
再者，根据本发明人的深入研究，发现当异黄酮甙元和谷类由曲菌发酵使蛋白质分解的生成物再添加水分解时，当该生成物中含乳酸菌和/或向上述的生成物添加乳酸菌增殖促进生成物，无论如何由于含有异黄酮甙元的一种即大豆甙元的作用(雌激素样的作用)，一次能够增强干细胞，从而完成了本发明。
说明该干细胞的作用，按照本发明制备的异黄酮甙元增强的干细胞具有自己复制、分化增殖的性质，该细胞增殖与酪氨酸激酶等的增殖因子作用的酶有关。但是，由于异黄酮甙元的一种即染料木黄酮有阻碍该酪氨酸激酶活性的作用，因此不可能期待用染料木黄酮增殖干细胞。为此，按照本发明制备的异黄酮甙元，特别是在用溶剂提取浓缩的异黄酮甙元的组分中，由于大量含有大豆甙元，染料木黄酮的含量少，所以，推测含有大量的大豆甙元的雌激素的作用主要机能是增强干细胞。
更详细地说，胚性干细胞不但存在体性干细胞信号传达物质，而且特别可分出重要承担细胞分化的STAT3。考虑STAT3的活性化有维持干细胞未分化状态的作用，但是，在STAT3与雌激素受容体(ER)的配位体结合领域和融合蛋白质(STAT3ER)的情况下，形成未分化的菌落，更引起分化增殖。所以，认为按照本发明制备的异黄酮甙元的一种即大豆甙元对雌激素的作用，与ER的结合，是STAT3ER所起的作用，可以增强骨髓干细胞。据此，按照本发明制备的异黄酮甙元也可以增强STAT3作信号传达物质的胚性干细胞。
这样制备的本发明的干细胞增强材料，其特征是有具备干细胞增强作用的异黄酮甙元。该干细胞是形成各脏器或形成各组织来源的含造血干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞的体性干细胞或胚性干细胞。该异黄酮甙元增强干细胞的作用，可列举出不阻碍细胞增殖因子作用的酶活性的雌激素作用。
按照本发明的具有具备增强干细胞作用的异黄酮甙元的干细胞增强材料在体内被吸收，可以增强体性干细胞。
再者，本发明的含有具备增强干细胞作用的异黄酮甙元的干细胞增强材料，当具有另外的胚性干细胞的信号传达物质作用时，可以增强该胚性干细胞。
下面，具体说明造血干细胞，含有具备干细胞增强作用的异黄酮甙元的干细胞增强材料在体内吸收，可增强骨髓造血干细胞。
即，在该异黄酮甙元中含有能够增强骨髓造血干细胞机能的雌激素作用那样的大豆甙元。因此，异黄酮甙元在体内被吸收时，大豆甙元与雌激素按相同的作用与造血干细胞的ER结合，起STAT3ER的作用，增强了骨髓的造血作用，造血干细胞增殖，分化成红血球和白血球向体内供给合适量血球等成分的血液。
据此，本发明的干细胞增强原材料经口摄取或点滴在体内被吸收时，可以使作为骨髓的造血作用的造血干细胞的生成正常地进行，向体内供给有合适量的血球等的成分的血液，例如，可以防止受大量放射线照射，受癌治疗法的放射线照射，受投予的抗癌剂的情况下引起的骨髓造血机能降低，可以期待降低的造血机能大大恢复。据此，由于本发明的干细胞增强材料经口摄取或点滴等在体内被吸收，没有副作用的实施癌治疗，可以期待可能战胜癌症。
再者，本发明的干细胞增强材料经口摄取或点滴在体内被吸收时，增强骨髓的造血干细胞，发挥向体内供给有合适量的血球等成分的血液的机能，进行预防各种疾病，可期待维持健康。
另外，本发明的异黄酮甙元在体内被吸收时，该造血干细胞以外其它的体性干细胞也同样的被增强。
再者，在胚性干细胞中，相对作为其信号传达物质的大豆甙元STAT3，以和雌激素同样的作用与ER结合，形成ER配位体结合领域和STAT3ER，形成未分化的菌落，而且可以进行分化增殖。
来自谷物的原材料能够保有异黄酮甙元这样的作用。而作为来自谷物原材料优选豆类，异黄酮甙元优选用曲菌使豆类发酵，用曲菌酶加水分解豆类成分制成。再者，这样得到的异黄酮甙元优选用溶剂提取浓缩。这种情况下的异黄酮甙元含大豆甙元至少70重量％。
这样制备的本发明的干细胞增强材料，用曲菌使豆类发酵制曲处理后，将其进行加水分解处理，大豆粕中的蛋白质和/或糖质完全分解成含大量异黄酮甙元的生成物，可以达到含前述骨髓造血干细胞的体性干细胞和胚性干细胞增强作用的更好效果。
再者，本发明的干细胞增强材料，其特征是用曲菌使豆类发酵，让蛋白质分解的生成物再加水分解，该生成物中含乳酸菌和/或向上述生成物中添加乳酸菌增殖促进生成物(下文，<称曲菌大豆发酵培养物>)。
这种曲菌大豆培养物，与前述的异黄酮甙元同样，具有增强含骨髓造血干细胞的体性干细胞和胚性干细胞的机能，也发挥同样优良的作用。
图2表示实施例1中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等，在放射线照射后脾脏重量变化图。
图3表示在实施例1中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等每100克体重放射线照射后脾脏重量变化图。
图4表示实施例1中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等用放射线照射后骨髓移植后脾菌落形成数图。
图5表示在实施例1中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的体重变化图。
图6表示实施例2中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的每10克体重放射线照射后脾脏重量变化图。
图7表示实施例2中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等用放射线照射后骨髓移植后脾茵落形成数图。
图8表示实施例2中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的每10克体重放射线照射后睾丸重量变化图。
图9表示在实施例2中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的体重变化图。


图10表示在实施例3中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等每10克体重放射线照射后脾脏重量变化图。
图11表示实施例3中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等用放射线照射后骨髓移植后脾菌落形成数图。
图12表示实施例3中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的每10克体重放射线照射后睾丸重量变化图。
图13表示在实施例3中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的体重变化图。
图14表示实施例4中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的每10克体重放射线照射后脾脏重量变化图。
图15表示实施例4中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等用放射线照射后骨髓移植后脾菌落形成数图。
图16表示在实施例4中摄取本发明的干细胞增强材料的大白鼠等的体重变化图。
本发明的干细胞增强材料是含有造血干细胞增强材料的体性干细胞和胚性干细胞的增强干细胞的材料，其特征是含有异黄酮甙元和/或曲菌大豆发酵培养物。具体地说，是含有具备增强干细胞作用的异黄酮甙元和/或曲菌大豆发酵培养物的固体状(包括粉状、粒状等一切形状)或液体状材料，可用作食物或药物。
一方面，异黄酮甙元，不论由哪种原料制备的异黄酮甙元，优选谷类作为原料得到的谷物原材料。另外，谷类作为原材料，特别是用曲菌使豆类发酵，其后加水分解，用曲菌酶分解的豆类成分制成。而且优选按上述的加水分解生成的原材料，再用溶剂提取浓缩，制成异黄酮甙元。
这样制成的具有本发明的异黄酮甙元的干细胞增强材料，在规定的期间内经投予或点滴在体内连续地吸收后，可以增强含骨髓造血干细胞的体性干细胞。
再者，有具备本发明干细胞增强作用的异黄酮甙元的干细胞增强材料与胚性干细胞信号传达物质作用，可以增强该胚性干细胞。
下面，根据图1说明增强含有异黄酮甙元的本发明的造血干细胞增强材料的体性干细胞和胚性干细胞的干细胞增强材料用曲菌发酵制备的情况。
图1的实线部分，示出了按照本发明从豆类的一种即大豆粕制备干图1的实线部分，示出了按照本发明从豆类的一种即大豆粕制备干细胞增强材料的制备方法的一个实施方案，同一图的虚线部分更进一步示出了本发明的曲菌大豆发酵培养物的制备方法的实施方案。
按图1的实线部分示出的方法说明制备本发明干细胞增强材料的情况。首先蒸煮大豆粕，与不进行蒸煮的情况相比，曲菌容易增殖。另外，根据制造的目的等，这种大豆粕的蒸煮和其蒸煮后的制曲处理可以以间歇方式分批进行，或者，蒸煮与其后的制曲处理可以连续方式连续地进行，优选用制曲装置连续地进行。
而且，这种蒸煮结束后大豆粕一旦冷却，大豆粕中的水分量使曲菌增殖的可能量为例如约36重量％。
调整大豆粕的水分量，因而本发明的干细胞增强原材料按如下方法制备。
即，蒸煮结束后的大豆粕单体在不死灭曲菌的温度40℃以下温度冷却时，按规定的重量比接种曲菌种曲，将两者混合均匀。
此后，由于接种的种曲的增殖作用，在制曲装置内混合物的温度上升，控制混合物的物品温度，一旦低于约32℃，放置曲菌使大豆粕发酵，即进行制曲处理直到温度上升到约38℃，同时伴随增殖的曲菌的成长生成物紧密成块状。此后，在进行制曲的制曲装置内，旋转搅拌紧密结块的生成物，使其分散开，在内部进行通气，均匀地供给空气，控制物品温度下降到33-35℃为止，进一步通气的同时进行制曲处理。在该过程中要确实防止曲菌的死灭，曲菌增殖可以充分进行。此后，根据制曲装置内生成物的结块情况，进行必要次数的旋转搅拌，并继续通气。
用于制曲的曲菌，是从古代的日本独特的发酵食品或在发酵(テンペ)中使用的曲菌，使用作为食品安全的宇佐美氏曲霉、川地曲霉、泡盛曲霉、沙都(サイトイ)曲霉、米曲霉、黑曲霉等的曲霉属和根霉属的曲菌。
这种发酵的时间，根据所使用的曲菌的种类，至少24小时以上，曲菌充分增殖，使大豆中的蛋白质和/或糖质按规定量分解，发酵时间充分。
在本实施方案中，对制曲处理的生成物中的蛋白质和/或糖质更进一步进行加水分解。其中含糖质是含寡糖类等的糖类或淀粉等。
这样制曲处理后加水分解的基质仍然保持薄片状。即，在本实施方案中，制曲结束后的生成物，例如，加水使其水分量为50重量％，加热30-45℃，保温同时保持规定的时间，通过制曲处理进行加水分解生成物内的蛋白质和/或糖质。由于加水分解的这样的蛋白质和/或糖质，大量生成具有增强骨髓造血干细胞的机能的异黄酮甙元。
下面，说明含本发明造血干细胞增强材料的增强体性干细胞和胚性干细胞的干细胞增强材料的具体实例。
使用米曲霉作上述那样的曲菌，按照本发明生成的干细胞增强材料，发酵大豆粕，使其良好地分解为异黄酮化合物。即，未处理的大豆粕中，因为糖甙即大豆黄甙和金雀异黄甙与甙元即大豆甙元和染料木黄酮相比非常多，所以，按照本发明生成的发酵大豆粕中，糖甙即大豆黄甙和金雀异黄甙分解非常少，分解生成的甙元即大豆甙元和染料木黄酮非常多。即，通风调节无处理的大豆粕的温度为35℃，进行48小时的制曲，加水使水分含量为约50％，在45℃温度24小时以上用曲菌酶加水分解大豆成分或曲菌成分，大豆粕中的异黄酮化合物含量列如表1，大量得到异黄酮化合物的甙元体即大豆甙元或染料木黄酮。
表1

(单位毫克/100克)下面，就大豆胚牙进行说明，预先蒸煮后的大豆胚牙加水使水分含量为约37％后，蒸煮、杀菌、冷却后，大豆胚牙和曲菌按配合比例，400公斤大豆胚牙配8×107个/克的曲菌胞子200克调整种曲(精白米调整)，混合。更进一步，在32℃温度冷却后，制曲开始，直到物品温度为40℃不通风，但是，在40℃时开始通风，抑制温度上升。从开始约17小时后开始进行搅拌(第一工序)。冷却大豆胚牙，搅拌后物品温度为35℃左右开始通风，控制温度。接着，在约8小时后，进行2次搅拌(第二工序)，冷却。控制物品温度为35℃左右再通风，在约16小时后，与前回同样的进行3次的搅拌(最后工序)。此后，通风使物品温度在约38℃，控制温度，从开始48小时后，制曲结束。制曲结束后，边搅拌边调节水含量达50％，加热使物品温度达约50℃后，用曲菌酶加水分解大豆胚牙中的异黄酮化合物48小时以上，直到其中的大部分异黄酮化合物分解成为甙元体。表2列出了按本发明处理的大豆胚牙的异黄酮化合物大量得到主体为甙元体的大豆甙元。
表2

单位毫克/100克另外，在本实施方案中，使用溶剂进一步提取浓缩加水分解得到的生成物，表3列出得到异黄酮甙元为30重量％以上的浓缩物。这种情况下的异黄酮甙元含有约70重量％大豆甙元。
表3本发明原材料的组成

这样制备的本实施方案的干细胞增强材料，经制曲处理和其后的加水处理，完全分解大豆粕中的蛋白质和糖质，得到了大量含异黄酮甙元的生成物。
这种异黄酮苷元具有可增强骨髓造血干细胞机能等的增强体性干细胞的机能，在体内被吸收时，例如，增强骨髓的造血作用，增殖造血干细胞，分化成红血球和白血球，向体内供给合适量的血球等成分的血液。
因此，本发明的干细胞增强材料经口摄取或点滴等在体内被吸收时，正常地进行生成作为骨髓造血作用的造血干细胞，向体内供给合适量的血球等成分的血液，例如，防止受大量放射线照射、受癌治疗法的放射线照射和受抗癌剂投予时引起的骨髓造血机能降低，可期望降低的造血机能大大地恢复。因此，本发明的干细胞增强材料经口摄取或点滴等在体内被吸收，实施癌治疗时没有副作用，可期待战胜癌症。
另外，本发明的干细胞增强材料经口摄取或点滴等在体内被吸收，增强骨髓造血干细胞，发挥向体内供给合适量的血球等成分的血液，进行预防各种病症，可期待维持健康。特别是在原子能设备中工作的人员，或受X光线等的放射线照射的人员，摄取本发明的干细胞增强材料，可以得到维持健康的效果。
因此，这样制成的本发明的含有异黄酮甙元的干细胞增强材料，经口摄取或点滴，在规定的期间内持续在体内被吸收，可增强含骨髓造血干细胞的体性干细胞。
另外，有具备本发明的干细胞增强作用的异黄酮甙元的干细胞增强材料，对胚性干细胞的信号传达物质作用，可增强该胚性干细胞。
下面，说明图1虚线所示部分的本发明干细胞增强材料即曲菌大豆发酵培养物的制备方法。
这种曲菌大豆发酵培养物与上述异黄酮甙元的制备方法的不同之处在于，豆类用曲菌发酵使蛋白质分解的生成物进一步加水分解时，在该生成物中含的乳酸菌和/或向上述生成物添加乳酸菌增殖促进生成物，加水分解时也使用乳酸菌。
在这个实施方案中，相对制曲处理生成的生成物，在加水分解工序中，曲菌和乳酸菌共存促进增殖生成曲菌大豆发酵培养物。
使用这种乳酸菌的方法有两种。
说明使用乳酸菌的一种方法的实施方案，即加水分解直到乳酸菌的菌数为108cfu/g以上，保持必要的时间制备生成物。其它的与上述实施方案同样的进行。在这样的实施方案中，利用制曲处理生成物中天然含有的乳酸菌进行。而且，在本实施方案中，利用提供纤维板(プロバイオテックス)，乳酸菌和曲菌和原料即豆类生成物在同一基质上共存共荣一起活泼增殖。
在本实施方案中，作为曲菌用豆浆用曲菌的米曲霉，按本发明制备方法制备的从发酵大豆粕分离的乳酸菌，进行表4中试验项目的试验，进行乳酸菌的鉴别。
表4分离菌a的性状试验项目 试验结果形态球菌*1格拉姆染色性+*1胞子-*1运动性 -*1对氧的态度 通性嫌气性*1过氧化氢酶 -*1生成乳酸L(+)*1葡萄糖生成的气体-*110℃下的生育+45℃下的生育+50℃下的生育+6.5％氯化钠下的生育 +在pH9.6时的生育 +在40％胆汁存在下的生育 +黄色素的生成-溶血性(羊血液) α溶血精氨酸二水解酶 +马尿酸加水分解 +预栗树皮甙加水分解 +在0.1％甲叉ブル一ミルク生育+酸的生成D-木糖 -L-鼠李糖 +*2*3蔗糖 +乳糖 +蜜二糖 +棉籽糖 +*2松三糖 -甘油糖 -*2*3核糖醇 -山梨糖醇 +*2甘露糖醇 +L-阿戊糖 +菌体内DNA的GC含量(摩尔％)*440*1表示前报(试验报告书第5980212-001号)的结果。
*2表示非典型性状*3表示屎肠球菌JCM 5804T(基准菌株)和分离菌a同样的反应。
*4表示用HPLC法。
从表4所示的性质分离的乳酸菌，与肠球菌属(Enterococcus)的屎肠球菌(Enterococcus faecium)相同。这种乳酸菌确认是称为肠球菌的消化管道内的常在菌。
本实施例中的上述发酵时间和加水分解时间及加水分解温度应根据豆类的种类、状态、特性、分量；曲菌的种类、状态、特性、分量；乳酸菌的种类、状态、特性、分量；生成物即干细胞增强材料的种类、特性等调整。
下面，根据图1的虚线部分说明生成曲菌大豆发酵培养物时使用乳酸菌的其它方法的实施方案。
在本实施方案中，加水分解时把乳酸菌添加在曲菌处理的生成物中。
该乳酸菌与上述实施方案的相同，是肠球菌属，特别是屎肠球菌。
在生成物中加入这样的乳酸菌进行制曲处理开始加水分解工序，在加水分解工序中，制曲处理增殖的曲菌和乳酸菌在同一基质上即在前述的生成物上共存共生，乳酸菌由生成物供给营养促进增殖，在生成物中曲菌和乳酸菌一起培养。特别是，在制曲处理生成物中生成维生素B类，由于生成的乳酸菌也易吸收营养价值高的成分，所以维生素B类作为营养源促进了乳酸菌的增殖。而且，在本实施方案的生成物内，用曲菌酶加水分解各种成分，由于相当于用消化酶分解大豆粕，消化物和未消化物是分离的状态。用曲菌酶加水分解的分解物(消化物)被人或家畜摄取并直接吸收，而常在肠内不被吸收的未分解物成为有用的乳酸菌的营养源，增加人或家畜有用的短链脂肪酸的生成。
但是，上述的生成物是可活泼增殖的乳酸菌的培养基，在人或家畜的肠内增殖的该乳酸菌是可以将含在上述生成物中的酶未分解物的生成物作为营养源的。而且，最终生成曲菌和有用的微生物是在同一基质的生成物中被培养的，利用提供的纤维板，保有乳酸菌增殖促进机能的豆类作原料可以生成干细胞增强材料。
这样制备的本实施方案的干细胞增强材料与上述实施方案的异黄酮甙元相同，同样能够发挥含优良的骨髓造血干细胞的体性干细胞和胚性干细胞的增强干细胞机能。
下面，说明本发明的实施例。
实施例1在本实施例中，为了确认增强骨髓造血干细胞机能进行实验，对大白鼠实施放射线照射和骨髓移植，用鼠脾菌落法测定。
试验方法1.育成健康各区体重一致的试样雌性大白鼠(雌ICR)(8周龄)
2.准备大白鼠的投予物，普通食物、相对该普通食物的异黄酮甙元的浓缩材料及作为曲菌大豆发酵培养物的原料的豆类，实施制曲处理，在对生成的生成物在加水分解工序中，得到曲菌和乳酸菌共存共生的促进增殖的生成物的混合饵料。
3.比较区1和2与试验区1和2各5只大白鼠，如表5所示，比较区1和2投予普通食物，试验区1按体重投予在普通食物中添加异黄酮甙元比例为30毫克/公斤的饵料，试验区2投予普通食物中添加1重量％的上述曲菌大豆发酵培养物的饵料，各饲育三周。
表5

※表中(毫克/公斤)是每公斤体重的投予量。
4.放射线照射在三周饲育后，对比较区2、试验区1和试验区2的大白鼠全身照射一次，照射剂量为8GY。
5.骨髓移植放射线照射24小时后，对全区的大白鼠进行骨髓移植。此时，供体是切取同类的大白鼠的大腿骨，在净化台上切短大腿骨的两端，其中的一端，试验员用1毫升的注射器一次将含10％抗霉菌素的RPMI Medium1640培养基注入骨髓腔中。调整骨髓细胞数为105/毫升，从尾静脉注射0.5毫升，供体大白鼠用2GY放射线全身照射，用在普通食物中添加1重量％的前述曲菌大豆发酵培养物饵料饲育4周。
6.脾脏的测定骨髓移植7日后目视测定体重，屠杀全部大白鼠，取出脾脏，测定脾脏的重量和脾菌落形成数。
7.体重测定目视测定全部大白鼠在骨髓移植前和移植7日后的体重。
试验结果1.放射线照射后的脾脏重量变化示于图2，每100克体重的放射线照射后的脾脏重量变化示于图3，在放射线照射后和骨髓移植后的脾菌落形成数示于图4。
2.体重测定结果示于图5。
图2至图4示出了关于脾脏的试验结果，参见比较区1没有受放射线照射的大白鼠，并与比较区2及试验区1和试验区2进行比较，没有摄取本发明干细胞增强材料的比较区2脾脏的重量没有增加，而且，由于脾菌落形成数量少，骨髓的造血机能大大降低。根据该比较区2的结果，受8GY照射量的强放射线照射，在只摄取普通食物的大白鼠中，接受骨髓移植，没有发挥什么效果，大约是脾菌落数极低抑制造成的。
因此，在摄取本发明的干细胞增强材料的试验区1和2中，脾脏的重量增加很多，而且由于脾菌落数也非常高，大大提高了增强骨髓的造血干细胞的机能。
即，在体内吸收了含有本发明的异黄酮甙元和曲菌大豆发酵培养物的干细胞增强材料，即使受8GY照射量的放射线照射，只摄取普通食物的比较区2的大白鼠也不相同，发挥了接受骨髓移植的效果，脾菌落数的形成数也增加非常多。所以，在体内吸收含有本发明的异黄酮甙元和曲菌大豆发酵培养物的干细胞增强材料，由于放射线照射而降低的骨髓造血机能可以大大恢复。因此，当受照射量为6GY、4GY等弱放射线照射时，在体内吸收含有本发明的异黄酮甙元和曲菌大豆发酵培养物的干细胞增强材料，即使不进行骨髓移植，也和实施骨髓移植的情况相同，可以期待脾菌落形成数增多，由放射线照射降低的骨髓造血机能可以大大恢复。
由于这种造血机能实质性地恢复，可知本发明的干细胞增强材料有增强骨髓造血干细胞的机能。
而且，在体内吸收异黄酮甙元和曲菌大豆发酵培养物的干细胞增强材料，能够增强骨髓的造血干细胞，增殖的造血干细胞，分化成红血球和白血球，向体内供给合适量的血球等成分的血液。
因此，经口摄取或点滴在体内被吸收本发明的干细胞增强材料，使作为骨髓造血作用的造血干细胞的生成正常地进行，向体内供给合适量的血液，例如，可以防止受大量放射线的照射、受癌症治疗法的放射线照射、受抗癌剂的投予时引起的骨髓造血机能的降低，可以期待降低的造血机能大大恢复。所以，经口摄取或点滴在体内被吸收的本发明干细胞增强材料，进行癌症治疗时没有副作用发生，可以期等战胜癌症。
而且，经口或点滴在体内被吸收的本发明干细胞增强材料，增强骨髓的造血机能，发挥向体内供给有合适量血球等成分的血液的机能，进行预防各种疾病，可期待维持身体健康。
实施例2在本实施例中，为确认雄性受试物增强骨髓造血干细胞的机能，增强生殖细胞的干细胞的机能与异黄酮甙元的投予量的依存性，进行试验，对大白鼠进行放射线照射和骨髓移植，用鼠脾菌落法测定。
试验方法1.育成健康各区体重一致的试样雄性大白鼠(雄ICR)(6周龄)。比较区3、4和5及试验区4各饲育10只大白鼠，试验区3饲育5只大白鼠。
2.准备大白鼠的投予物，有普通食物、普通食物这的异黄酮甙元的浓缩原材料或选择的雌激素受容体调节剂(SERMs)，即混合比它莫西分毒性低的诱导体toremifen制成的混合饵料。
3.如表6所示，比较区3和4各投予普通食物，试验区3按体重投予在普通食物这添加异黄酮甙元浓缩材料比例为30毫克/公斤的饵料，试验区4按体重投予在普通食物中添加异黄酮甙元浓缩材料的比例为100毫克/公斤饵料，比较区5按体重投予在普通食物中添加トレミフェン(toremifen)的比例为30毫克/公斤的饵料，各个饲育。
表6

※表中(毫克/公斤)表示每公斤体重的投予量。
4.放射线照射3周饲育后，比较区4和5及试验区3和4的大白鼠用8GY照射量全身只照射一次。
5.骨髓移植放射线照射24小时后，对全区的大白鼠进行骨髓移植。此时，供体是切取同类的大白鼠的大腿骨，在净化台上切短大腿骨的两端，其中的一端，试验员用1毫升的注射器一次将含10％抗霉菌素的RPMI Medium1640培养基注入骨髓腔中。调整骨髓细胞数为105/毫升，从尾静脉注射0.5毫升，供体大白鼠用2GY放射线全身照射，用在普通食物中添加1重量％的前述曲菌大豆发酵培养物饵料饲育3周。
6.脾脏和睾丸的测定骨髓移植7日后目视测定体重后，大白鼠全部屠杀，取出脾脏，测定脾脏的重量和脾菌落形成数，同时取出睾丸，测定睾丸的重量。
7.体重测定目视测定全部大白鼠在骨髓移植前和移植7日后的体重。
试验结果1.每10克体重放射线照射后的脾脏重量变化示于图6，用放射线照射后骨髓移植后的脾菌落形成数示于图7。
2.每10克体重放射线照射后的睾丸重量变化示于图8。
3.体重测定结果示于图9。
图6和图7示出了关于雄性大白鼠脾脏的试验结果，比较区3没有受放射线照射的雄性大白鼠，与比较区4和5及试验区3和试验区4进行比较，相对比较3区，其它各区中脾脏的重量同样降低，但是，在这些区中，比较区5相对于其它区显示出脾脏的重量低一些。脾菌落的形成数，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对于体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区4比比较区4、5和试验区3显著的高。相对于比较区3的其它各区中，睾丸的重量相同的降低，但是，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对于体重，按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区4比比较区4、5和试验区3睾丸的重量明显高。相对于比较区3，比较区4、5和试验区3、4的体重变化不大，但是，比较区5与其它区相比，体重显著降低。
根据这些试验结果，一方面，在受试雄性大白鼠中，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对于体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区4中，脾菌落形成数和睾丸重量比其它区显著地增加，而另一方面，相对于体重按30毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区3中，没有得到相对比较例的有效的增强结果。因此，对雄性大白鼠，为了发挥本发明干细胞增强原材料的干细胞增强作用，对摄取量有容量依存性，即摄取容量多时干细胞的作用状况增强。而且，摄取足够容量的本发明干细胞增强材料，确实发挥了与实施例1雌性大白鼠同样的肝细胞增强作用。
另外，在比较区5中，脾脏重量和体重比其它的比较区4和试验区3和4的低。因此，认为比较区5投予的toremifen和异黄酮甙元有同等的干细胞增强作用，但是，毒性比异黄酮甙元强得多。所以，本发明的干细胞增强材料的异黄酮甙元按相当于体重100毫克/公斤投予，抑制体重的毒性比toremifen小，异黄酮甙元有效地增强干细胞。即异黄酮甙元摄取量多，增强干细胞的作用高，而且在安全性方面也有效。
而且，在本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区4比其它的比较区4、5和试验区3睾丸重量非常显著地增加，本发明干细胞增强材料这的异黄酮甙元有来自睾丸和雌性卵巢生殖器的精子和卵子的生殖细胞的干细胞增强作用。
实施例3在本实施例中，为了确认在雄性供体的增强骨髓造血干细胞的机能、增强生殖细胞的干细胞的机能和异黄酮甙元投予量的依存性，对雄性大白鼠进行放射线照射试验。
试验方法1.育成健康各区体重一致的受试的雄性大白鼠(雄ICR)(6周龄)。比较区6和7及试验区5和6分别饲育10只大白鼠。
2.大白鼠的投予物，准备普通食物、该普通食物与异黄酮甙元浓缩物的混合饵料。
3.如表7所示，比较区6和7投予普通食物，试验区5投予添加相对于体重按30毫克/公斤比例的异黄酮甙元的浓缩原材料的普通食物，试验区6投予添加相对于体重按100毫克/公斤比例的异黄酮甙元的浓缩原材料的普通食物，分别饲育。
表7

※表中(毫克/公斤)表示每公斤体重的投予量。
4.放射线照射对比较区7和试验区5及6各区的大白鼠，饲育开始时，用2GY照射量一次全身照射，饲育3周时间。
5.脾脏的测定在三周饲育后测定体重，屠杀全部大白鼠，取出脾脏，测定脾脏的重量和脾菌落形成数，同时取出睾丸，测定睾丸的重量。
6.体重测定在饲育前和三周饲育后，测定全部大白鼠的体重。
试验结果1.图10示出了每10克体重放射线照射后脾脏重量的变化，图11示出了放射线照射后骨髓移植后的脾菌落形成数。
2.图12示出每10克体重放射线照射后睾丸重量的变化。
3.图13示出了体重的测定结果。
图10和图11示出了雄性大白鼠脾脏的试验结果，参见比较区6没有受放射线照射的雄性大白鼠与比较区7和试验区5和6的比较，相对于比较区6的其它各区中，脾脏的重量一样降低，而在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区6比比较区7和试验区5显著高。在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重，按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区6比比较区7和试验区5脾菌落形成数显著高，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按30毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区5比比较区7脾菌落形成数没有明显升高。睾丸重量相对比较区6其它各区一样的降低，而在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例经口投予异黄酮甙元的试验区6比比较区7和试验区5睾丸的重量升高。相对比较区6，比较区7和试验区5和6体重低一些。
根据这些试验结果，在受试的供体雄性大白鼠中，一方面，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区6中，脾菌落形成数和睾丸重量比其它的有显著地增加，但是，另一方面，相对于体重按30毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区5中，虽然比试验区6低，但是相对于比较区7得到了增强的结果。所以，在受试的供体雄性大白鼠中，为了发挥本发明干细胞增强材料的干细胞增强作用，对摄取容量有依存性，即摄取容量多，干细胞状况作用大。而且，摄取足够容量的本发明干细胞增强材料，确实发挥了与实施例1的雌性大白鼠同样的干细胞增强作用。
另外，在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区6睾丸重量显示了比比较区7和试验区5高的倾向，本发明的干细胞增强材料中的异黄酮甙元具有来自睾丸和卵巢生殖器的精子与卵子的生殖细胞的干细胞增强作用。
根据实施例2和3，在受试体和供体中，一同摄取本发明的干细胞增强材料即异黄酮甙元，由干细胞的增强作用体内的干细胞受到增强，从供体得到骨髓移植的受试体可以发挥高的移植效果，供体可提供移植效果高的骨髓等。
试验方法1.育成健康各区体重一致的受试雌性大白鼠(雌ICR)(6周龄)。在每区饲育5只大白鼠。
2.准备大白鼠投予物，普通食物，在该普通食物中添加异黄酮甙元的浓缩材料或作为异黄酮甙元的单体的染料木黄酮或具有最强雌激素作用的17β雌二醇的混合饵料。
3.如表8所示，比较区8、9和10投予普通食物，试验区7相对体重按100毫克/公斤比例投予添加异黄酮甙元浓缩材料的普通食物，试验区8相对体重按30毫克/公斤比例投予添加异黄酮甙元浓缩原材料的普通食物，试验区9相对体重按30毫克/公斤比例投予添加异黄酮单体的普通食物，比较区11相对体重按10微克/公斤比例投予添加17β雌二醇的普通食物，分别饲育。
表8

※表中(毫克/公斤)微克/公斤)表示每公斤体重的投予量。
4.放射线照射饲育3周后，除8区外，对比较区9、10、11和试验区7、8、9的大白鼠用8GY照射量进行一次全身照射。
5.骨髓移植放射线照射24小时后，除比较区8和9外，对比较区10、11和试验区7、8和9进行骨髓移植。这种情况下，切取供体同类大白鼠的大腿骨，在净化台上切短大腿骨的两端，从其中的一端，试验员用1毫升的注射器一次将含10％抗霉菌素的RPMI Medium 1640培养基注入骨髓腔中。调整骨髓细胞数为105/毫升，从尾静脉注射0.5毫升，供体大白鼠用2GY放射线全身照射，用在普通食物中添加1重量％的前述曲菌大豆发酵培养物饵料饲育3周。
6.脾脏的测定骨髓移植10日后，屠杀全部大白鼠，取出脾脏，测定脾脏的重量和脾菌落形成数。
7.体重测定饲育开始时、1周后、2周后、骨髓移植前、移植5日目、7日、和10日，目视测定全部大白鼠的体重。
试验结果1.图14示出了每10克体重放射线照射后脾脏重量的变化，图15示出了放射线照射后骨髓移植后的脾胃菌落形成数。
2.图16示出了体重的测定结果。
根据图14和图15示出的雄性大白鼠脾脏的试验结果，参见比较区8没有受放射线照射的雄性大白鼠与比较区9、10和11及试验区7、8和9的比较，相对比较区8其它各区中脾脏的重量一样降低，而其中的比较区9、10和11显示出了比试验区7、8和9低的值。一方面，受放射线照射的试验区7、8和9比比较区9和10脾脏重量显著升高，其中在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重按100毫克/公斤比例投予异黄酮甙元的试验区7相对试验区8和9脾脏重量显著升高。脾菌落形成数，试验区7、8和9比受放射线照射后移植的比较区10和11脾脏重量显著升高，其中在投予了本发明的干细胞增强材料中，相对体重对按100毫克/公斤比例和30毫克/公斤比例投予添加异黄酮甙元的试验区7和8、对按30毫克/公斤比例投予添加作为异黄酮单体的染料木黄酮的试验区9显著升高。放射线照射7日后目视测定休重，比较区9、10和11显示减少的倾向，试验区7和8显示没有变化的倾向，试验区9显示增加的倾向。
根据这些试验结果，在受试体的大白鼠中，投予了本发明的干细胞增强材料中的异黄酮甙元混合物和单体的试验区7、8和9中，受放射线照射移植后，脾脏重量和脾菌落数比比较区10和11有明显地增强。而且，在投予本发明干细胞增强材料的试验区7、8和9中，投予异黄酮甙元混合物的试验区7和8比投予异黄酮甙元单体的试验区9明显升高，而且，在投予本发明增强朱材料的试验区7和8中，异黄酮甙元混合物投予量多的试验区7与投予少的试验区8相比没有明显升高。因此，在雌性大白鼠的受试体中，为了发挥本发明干细胞增强材料的干细胞增强作用，对异黄酮甙元存在容量有依存性，即摄取的容量多，干细胞的状况作用大。而且，表3示出了异黄酮甙元的混合物比作为单体的染料木黄酮发挥了更强的干细胞增强作用。特别是，由于表3所示的异黄酮甙元的混合物比作为单体的染料木黄酮的制造成本低，所以成本是非常有优势的。另外，具有最强雌激素作用的17β雌二醇显著地抑制体重的增加，至今不认为增加脾菌落形成数。在本试验中，对异黄酮甙元设定投予量小于1/1000，不能确认干细胞增强，但是有体重抑制等副作用的问题。
另外，本发明的上述实施方案和实施例并不是限制本发明，可以进行必要的变更。本明的干细胞增强材料经口投予或点滴，在体内吸收良好。
权利要求
1.干细胞增强材料，其特征是有具备增强干细胞作用的异黄酮甙元。
2.按权利要求1所述的干细胞增强材料，其特征是干细胞是由含造血干细胞、神经干细胞、骨髓干细胞等的各个脏器形成或组织形成的根源的干细胞而形成的体性干细胞或胚性干细胞。
3.按权利要求1或2所述的干细胞增强材料，其特征上述异黄酮甙元是保有不阻害在细胞增殖因子中起作用的酶的酶活性的雌激素的作用。
4.按权利要求1-3中任一项所述的干细胞增强材料，其特征是异黄酮甙元是来自谷类的原材料。
5.按权利要求4所述的干细胞增强材料，其特征是来自谷类的原料是谷类经曲菌发酵分解蛋白质，其后加水分解而生成的生成物。
6.按权利要求5所述的干细胞增强材料，其特征是谷类是豆类。
7.按权利要求5或6所述的干细胞增强材料，其特征是异黄酮甙元是将加水分解生成的材料进一步浓缩生成的生成物。
8.按权利7所述的提高性机能的干细胞增强材料，其特征是异黄酮甙元含有至少70重量％的大豆甙元。
9.干细胞增强材料，其特征是豆类经曲菌发酵分解蛋白质的生成物进一步加水分解时，该生成物中含促进增殖的乳酸菌和/或向上述的生成物中添加促进增殖的乳酸菌的生成物。
全文摘要
本发明涉及肥胖抑制材料,该材料经口摄取或点滴等在体内被吸收,能增强体性干细胞,特别是能增强骨髓造血干细胞或形成胚性干细胞的干细胞。本发明提供的增强干细胞的干细胞增强材料含有异黄酮甙元,后者具有不阻害在细胞增殖中起作用的酶的酶活性的雌激素作用。本发明的干细胞增强材料是从前完全没有的。本发明的基本特征是由于含有增强干细胞作用的异黄酮甙元,从而得到了上述的有优良作用的干细胞增强材料。
文档编号C07D311/36GK1383380SQ01801908
公开日2002年12月4日 申请日期2001年7月18日 优先权日2000年7月18日
发明者武部实, 潘伟军 申请人:尼基摩株式会社