专利名称：趋化因子受体调制剂,制备和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及趋化因子受体调制剂，其制备方法和用途。
相关申请本申请是美国专利申请登记号No.60/217683(2000年7月12日申请)的部分持续申请，No.60/217683在这里引作参考。
背景技术：
趋化因子是白细胞运输和各种其它生物过程中涉及的小蛋白质。大多数趋化因子是定位的并且通过诱导趋化性而增加炎症，并且不同类型炎症细胞的细胞激活一般存在于炎症部位。一些趋化因子具有除趋化性之外的性质，例如诱导杀伤细胞的增殖和激活，调制造血母细胞类型的生长，在炎症症状，血管生成和肿瘤生长时将造血母细胞运输入和运输出骨髓(参见，例如，Baggiolini等，Ann.Rev.Immunology(1997)15675-705；Zlotnik等，Critical Rev.Immunology(1999)19(1)1-4；Wang等，J Immunological Methods(1998)220(1-2)1-17；和Moser等，Intl.Rev.Immunology(1998)16(3-4)323-344)。
很多趋化因子的氨基酸序列，结构和功能是公知的。趋化因子具有大约8-10 kDa的分子量，并且在蛋白质水平上表现出彼此大约20-50％的序列同源性。并且这些蛋白质还具有共同的三级结构。所有的趋化因子具有一定数目的在分子内二硫键形成中涉及的保守的半胱氨酸残基，它们被用来鉴定趋化因子并且将趋化因子分类。例如，具有由单个氨基酸分开的头两个半胱氨酸残基的趋化因子被称为″C-X-C″趋化因子(也称为″α″趋化因子)。具有相邻的头两个半胱氨酸残基的趋化因子被称为″CC″趋化因子(也称为″β″趋化因子)。″C″趋化因子与其它趋化因子的不同之处在于没有半胱氨酸残基(也称为″γ″趋化因子)。C趋化因子表现出与CC趋化因子的一些成员相类似，但是没有第一和第三半胱氨酸残基，而第一和第三半胱氨酸残基是CC和CXC趋化因子的特征。具有由三个氨基酸分开的头两个半胱氨酸残基的趋化因子小组成员被称为″CXXXC ″趋化因子(也称为″CX3C″或″δ″趋化因子)。还有趋化因子亚组。例如，已知包含另外两个保守的半胱氨酸残基的CC趋化因子，有时术语″C6-β″趋化因子用于该亚组。迄今为止鉴定的大多数趋化因子是CC和CXC趋化因子类的成员。
趋化因子的生物学活性是受体介导的。这包括趋化因子特异性受体还有具有与属于CC趋化因子或CXC趋化因子族的几种不同的趋化因子结合的重叠配体特异性的受体。例如，CC趋化因子SDF-1α对于CXCR4受体是特异性的，而CXC趋化因子RANTES结合CCR1，CCR3和CCR5受体。另一个例子是趋化因子Eotaxin，其是CCR3(也称为CKR3)受体的配体(参见，例如Cyster，J.G.，Science(1999)2862098-2102；Ponath等，J.Experimental Medicine(1996)183(6)2437-2448；Ponath等，J.Clinical Investigation(1996)97(3)604-12；和Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Communications(1997)231(2)365-368)。
重要的疾病路径，例如哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，癌症，病毒引起的疾病，粉瘤/动脉粥样硬化，类风湿性关节炎和器官移植排异中涉及趋化因子。但是，和很多趋化因子以及它们用作治疗物的潜在的用途相关的一般问题涉及它们促进或恶化炎症反应和感染的固有的性质。归根结蒂，进行过很多趋化因子的修饰试图产生相应的野生型趋化因子的拮抗剂。经典的有代表性的例子是RANTES的情况。在某些情况下，野生型RANTES能增强炎症和HIV感染(Gordon等，RVirol.(1999)73684-694；Czaplewski等，J Biol.Chem.(1999)27416077-16084)。相反，在RANTES多肽链的26位(E26A)和66位(E66S)的取代作用将分子转化为它的非炎症版本，并且提高了它与其对于HIV的受体的竞争能力(Appay等，J.Biol.Chem.(1999)274(39)27505-27512)。此外，进行RANTES的N-末端修饰，产生能阻断HIV-1感染的拮抗剂，包括N-末端截短[RANTES 9-68]，加入甲硫氨酸(″Met-RANTES″)，氨基氧戊烷(″AOP-RANTES″)，或者壬酰基(″NNY-RANTES″)(Arenzana-Seisdedos，等.，Nature(1996)383400；Mack，等，J Exp.Med.(1998)1871215-1224；Proudfoot，等.，J Biol.Chem.(1996)2712599-2603；Wells，等，WO 96/17935；Simmons，等，Science(1997)276276-279；Offord等，WO 99/11666；和Mosier等，J Virology(1999)73(5)3544-3550)。
在某些情况下，这样的进展提高了拮抗剂-相关效力，但是制备趋化因子受体调制剂的挑战之一是在改进其它药物性质例如药物动力学的同时提高药效。也期望制备趋化因子的潜在的拮抗剂和相应的趋化因子受体调制剂化合物的一般策略和方法，和它们在制备用于预防和/或治疗疾病的药物的用途。本发明满足这些和其它需要。
发明概述本发明涉及抑制相应的天然存在的趋化因子的作用的氨基-末端(“N-末端”)和羧基-末端(“C-末端”)修饰的趋化因子受体调制剂。本发明的N-末端趋化因子受体调制剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物的趋化因子多肽链。本发明的C-末端趋化因子受体调制剂包括在其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链。本发明的N-和C-末端趋化因子受体调制剂还可以包括在N-和C-末端两者一起进行的修饰。也提供了制备和应用趋化因子受体调制剂的方法。本发明的显著之处在于提供了制备是相应的天然存在的野生型趋化因子或者它们的受体的潜在的抑制剂的化合物的一般途经。
详细地，本发明涉及包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物的趋化因子多肽链。
本发明特别涉及这样的趋化因子受体调制剂的实施方案，其中趋化因子多肽链包括与天然存在的野生型趋化因子的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列(例如CC趋化因子，CXC趋化因子等)。
本发明进一步涉及这样的趋化因子受体调制剂的实施方案，其中N-末端包括是趋化因子多肽链的第一个形成二硫键的半胱氨酸的N-末端的趋化因子多肽链的氨基酸。
本发明进一步涉及这样的趋化因子受体调制剂的实施方案，其中所述脂肪链是包括5-26个碳原子的烃链，和/或其中氨基酸衍生物具有式-(N-CnR-CO)-，其中n是1-22，R是氢原子，烷基或芳基，并且其中N和Cn，N和R，或者Cn和R能形成环结构。
本发明进一步涉及趋化因子受体调制剂，包括在其C-末端修饰有脂肪链(特别是其中包括5-22个碳原子的脂肪链)或多元环，特别是其中脂肪链或多元环是脂质的趋化因子多肽链。
本发明进一步涉及趋化因子受体调制剂，包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链。
此外，本发明涉及含有趋化因子受体调制剂的药物组合物，其中趋化因子受体调制剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物的趋化因子多肽链，或者其药学可接受盐。
此外，本发明涉及含有趋化因子受体调制剂的药物组合物，其中趋化因子受体调制剂包括在其C-末端修饰有脂肪链或者多元环的趋化因子多肽链，或者其药学可接受盐。
此外，本发明涉及含有趋化因子受体调制剂的药物组合物，其中趋化因子受体调制剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链，或者其药学可接受盐。
本发明还涉及治疗通过用趋化因子受体调制剂治疗而减轻的哺乳动物(包括人)的疾病状态(特别是其中所述疾病状态是炎症疾病，或者其中所述疾病状态是由HIV感染引起的或者与HIV感染相关)的方法，该方法包括对需要这样治疗的哺乳动物施用治疗有效量的趋化因子受体调制剂，其中所述趋化因子受体调制剂包括下面的趋化因子多肽链(A)在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，(B)在其C-末端修饰有脂肪链或多元环，或者(C)在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环。
图1是四类天然存在的趋化因子和保守的半胱氨酸型定义的它们相应的N-末端，N-环和C-末端区的一般结构示意图，其中“C”是半胱氨酸的一字母代码，“X”代表除半胱氨酸之外的任何氨基酸。
图2A-2E描述各种趋化因子多肽链的天然存在的氨基酸序列的例子，包括这些趋化因子的相应的N-末端，N-环和C-末端区。使用的是20种遗传编码的氨基酸的标准一字母氨基酸代码。
优选实施方案说明本发明涉及N-和C-末端趋化因子受体调制剂。如这里使用的，术语“趋化因子受体调制剂”意指根据合适的趋化因子生物测试所测定的调制或抑制天然存在的趋化因子的活性的多肽，或衍生的多肽。合适的抑制剂可以通过拮抗它们所结合的趋化因子受体的一种或多种性质而起作用(例如抑制病毒感染，引起受体下调，引起受体内在化)，从而“拮抗”受体循环回细胞表面的正常周期。在其它生物响应的背景中，这样的调制剂能够作为受体的激动剂起作用，例如诱导钙通量，引发趋化性等。因此，本发明的趋化因子受体调制剂能够作为拮抗剂起作用(包括拮抗作用)，但是也可以作为激动剂起作用，或者是这两者的混合。优选的是表现出至少一种拮抗性质的趋化因子受体调制剂，所述拮抗性质就是拮抗它们结合的趋化因子受体的一种或多种生物学性质的能力(例如阻断或部分阻断(1)病毒感染，(2)趋化性，(3)受体循环等)。这样的趋化因子受体调制剂可以通过结合(或者捕获)，但是不激活趋化因子受体而起作用，或者可以通过其它方式介导它们的作用。
本发明的N-末端趋化因子受体调节剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物的趋化因子多肽链。所述N-末端趋化因子受体调节剂从N-末端向C-末端方向阅读时具有下式J1-X1-Z1-CHEMOKINE，其中J1是脂肪链；X1是包括趋化因子多肽链N-末端氨基酸序列的0个或多个氨基酸的间隔基团；Z1是氨基酸衍生物；CHEMOKINE是趋化因子多肽链残留的氨基酸序列；短线(″-″)代表一个共价键。设计化合物时考虑多肽链的N-末端区的总长。因此，根据疏水性脂肪链的长度和氨基酸衍生物的位置，N-末端拮抗剂可以包括相对于相应的天然存在的趋化因子多肽链的一处或多处取代，插入或缺失。
本发明的C-末端趋化因子受体调节剂包括在其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链。这些化合物从N-末端向C-末端方向阅读时具有下式CHEMOKINE-X2-J2，其中X2是包括趋化因子多肽链C-末端氨基酸序列的0个或多个氨基酸的间隔基团；J2是脂肪链或多元环；CHEMOKINE是趋化因子多肽链残留的氨基酸序列；短线(″-″)代表一个共价键。可以对趋化因子的C-末端区进行取代修饰，包括一个或多个氨基酸或者其它化学部分的插入，缺失或添加，与相应的野生型分子相比延长多肽链的C-末端，以及加入荧光标记和生物相容性聚合物，以及偶联其它的化合物例如小的有机分子，肽，蛋白质等等。
本发明的N-末端和C-末端趋化因子受体调节剂可以包括在其N-和C-末端两个区的修饰作用，具体指定为N-/C-末端趋化因子受体调节剂。这些化合物具有下式J1-X1-Z1-CHEMOKINE-X2-J2，其中J1，XI，Z1，CHEMOKINE，X2，J2和″-″如上所述。这些化合物根据给定的最终的用途以协同方式合并了N-和C-末端修饰的优点。
″趋化因子多肽链″意指与天然存在的野生型趋化因子的多肽链基本上同源的多肽链。″N-末端氨基酸序列″意指是邻接的并且是天然存在的趋化因子多肽链的第一个形成二硫键半胱氨酸的N-末端的趋化因子多肽链的氨基酸序列。″C-末端氨基酸序列″意指是邻接的并且是天然存在的趋化因子多肽链的最后一个形成二硫键半胱氨酸的C-末端的趋化因子多肽链的氨基酸序列。构成本发明趋化因子受体调制剂基础的趋化因子多肽链，N-末端氨基酸序列，C-末端氨基酸序列，第一个和最后一个形成二硫键的半胱氨酸容易从天然存在的趋化因子相应的氨基酸序列，以及通过与相同类的其它趋化因子特异性模拟，例如与已知的C，CC，CXC和CXXXC趋化因子的氨基酸序列相比较，而推导出。
例如，下面是已知的天然存在的趋化因子的例子，其中很多有不同的名称，因此出现几次6Ckine，9E3，ATAC，ABCD-1，ACT-2，ALP，AMAC-1，AMCF-1，AMCF-2，AIF，ANAP，Angie，β-R1，β-血小板球蛋白，BCA-1，BLC，blr-1配体，BRAK，C10，CCF18，Ck-β-6，Ck-β-8，Ck-β-8-1，Ck-β-10，Ck-β-11，cCAF，CEF-4，CINC，C7，CKA-3，CRG-2，CRG-10，CTAP-3，DC-CK1，ELC，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-1，Exodus-2，ECIP-1，ENA-78，EDNAP，ENAP，FIC，FDNCF，FINAP，Fractalkine，G26，GDCF，GOS-19-1，GOS19-2，GOS-19-3，GCF，GCP-2，GCP-2-类，GR01，GR02，GR03，GRO-α，GRO-β，GRO-γ，H400，HC-11，HC-14，HC-21，HCC-1，HCC-2，HCC-3，HCC-4 H174，肝素中和蛋白，Humig，I-309，ILINCK，I-TAC，Ifi10，IL8，IP-9，IP-10，IRH，JE，KC，Lymphotactin，L2G25B，LAG-1，LARC，LCC-1，LD78-α，LD78-β，LD78-γ，LDCF，LEC，Lkn-1，LMC，LAI，LCF，LA-PF4，LDGF，LDNAP，LIF，LIX，LUCT，Lungkine，LYNAP，Manchester抑制剂，MARC，MCAF，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MCP-5，MDC，MIP-1-α，MIP-1-β，MIP-1-δ，MIP-1-γ，MIP-3，MIP-3-α，MIP-3-β，MIP-4，MIP-5，Monotactin-1，MPIF-1，MPIF-2，MRP-1，MRP-2，M119，MDNAP，MDNCF，巨核细胞刺激因子，MGSA，Mig，MIP-2，mob-1，MOC，MONAP，NC28，NCC-1，NCC-2，NCC-3，NCC-4 N51，NAF，NAP-1，NAP-2，NAP-3，NAP-4，NAP S，NCF，NCP，Neurotactin，制癌蛋白A，P16，P500，PARC，pAT464，pAT744，PBP，PBP-样，PBSF，PF4，PF4-样，PF4-ALT，PF4V1，PLF，PPBP，RANTES，SCM-1-α，SCI，SCY A26，SLC，SMC-CF，ST38，STCP-1，SDF-1-α，SDF-1-β，TARC，TCA-3，TCA-4，TDCF，TECK，TSG-8，TY5，TCF，TLSF-α，TLSF-β，TPAR-1，TSG-1。
为了详细说明，而不是为了限制，图2A-2D描述了上面列出的野生型趋化因子多肽链和它们相应的N-末端，N-环和C-末端氨基酸序列中的一些的例子。如图所示，另外的趋化因子多肽链是已知的并且能够从很多不同的来源获得，包括公众可进入的数据库，例如(JohnsHopkins University，Maryland USA)，Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratory & Rutgers University，NewJersey USA)，Entrez(National Institutes of Health，MarylandUSA)，NRL 3D(Pittsburgh Supercomputing Center，CarnegieMellon University，Pennsylvania USA)，CATH(University CollegeLondon，London，UK)，NIH Gopher Server(NIH，Maryl and USA)，ProLink(Boston University，Massachusetts USA)，The NucleicAcid Database(Rutgers University，New Jersey USA)，Genebank(National Library of Medicine，Maryland USA)，Expasy(SwissInstitute of Bioinformatics，Geneva Switzerland)，等。还有，通过根据现有技术已知的标准技术，包括数据库和相关的实现该目的工具，通过同源性和模式匹配能够鉴定新的趋化因子，例如从不同的基因和蛋白质测序程序得到的那些。
在本发明的一个实施方案中，涉及进化技术，例如噬菌体展示或者模块改组，可以用来产生具有提高的受体特异性的趋化因子。HIV的治疗和预防(美国专利6,214,540；DeVico等)中描述过利用噬菌体展示对趋化因子衍生物或类似物测定它们结合趋化因子受体的能力。噬菌体展示技术也曾被用来检测或鉴定CXC趋化因子受体3(CXCR3)(美国专利6,140,064，Loetscher等)的受体蛋白质的配体，抑制剂或启动子，它们的特征在于选择性结合具有诱导细胞应答能力的一种或多种趋化因子(美国专利6,184,358，Loetscher等)。在分子的标记和筛选中(美国专利6,180,336，Osbourn等)，在特异性抗原的结合分子的标记和接下来的纯化中(参见例如，WO92/01047)，以及在预防和治疗HIV感染和免疫疾病的肽组合物的检测中(美国专利6,090,388，Wang)都描述过噬菌体展示的应用。
也描述过涉及G蛋白-偶联受体的噬菌体展示方法(参见例如，Doorbar，J.等，″利用噬菌体展示分离凝血酶受体的肽拮抗剂″，J.Mol.Biol.，244361-9(1994))，在N-环区有定向进化的优选的区(Konigs，C，″噬菌体展示随机肽库的2单克隆抗体筛选揭示趋化因子受体CCR5的mimotopes受体的三级结构和HIV-1 gp120的N-末端结合位点的推断″，Eur.J.Immunol.2000年4月；30(4)1162-71；Sidhu，S.S.等，″噬菌体上大蛋白质的高拷贝展示用于功能筛选″，JMol Biol 2000年2月18日；296(2)487-95；Fielding，A.K.等，″超融合剂gibbon猿ape白血病包膜糖蛋白配体展示对细胞毒素基因的定向，″Hum Gene Ther 2000年4月10日；11(6)817-26)，N-环和C-末端之间的区，和C-末端(Cain，S.A.等，″从全分子随机诱变的C5a库筛选新的配体″，Protein Eng 2001年3月；14(3)189-93；Heller，T.等，″从噬菌体文库筛选在免疫综合疾病和局部缺血/再灌注损伤中减弱炎症反应的C5a受体拮抗剂″，J.Immunol.1999年6月15日；163(2)985-94；Chang，C.等，″利用组合肽库解剖LXXLL核受体辅助激活剂相互作用主题α和β雌激素受体的肽拮抗剂的发现″，Mol Cell Biol 1999年12月；19(12)8226-39)。
合适的疏水性脂肪链J1和J2包括但不限于长度是5(C5)至22(C22)个碳原子的疏水性脂肪链。所述链可以是不饱和的和/或没有支链的，或者可以具有不同的饱和度和/或支化度。脂肪链具有通式Cn(Rm)-，其中Cn碳原子数，Rm是选自氢原子，烷基，酰基，芳香基团或者它们的组合的取代基的数目，并且n和m可以是相同或不同的。基团J1和J2通过任何合适的共价键连接X1，X2或者连接趋化因子多肽链。合适的共价键的例子包括但不限于酰胺键，酮，醛，酯，醚，硫醚，硫代酸酯，thiozolidne，肟，oxizolidine，席夫碱和席夫碱型键(例如酰肼)。非限制性地，这样的键包括-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C(O)NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C(O)-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；
-NH-(CH2)-C(O)-；-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-NH-(CH2)xNH-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-NH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-NH(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-NH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)x]yC(O)-；-NH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-ONH-C(O)-；-ONH-(CH2)-C(O)-；-ONH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-NHC(O)-；-ONH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)x-NH-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-ONH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-ONH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-NH-C(O)；-OCH2-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-OCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C-(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-O-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)x-NH-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-CH＝CH-(CH2)[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-SCH2-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-C(O)-；-S-C(O)NH-(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-NH-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)(CH2)-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-S-C(O)N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-S-C(O)-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-NHC(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-NH-[(CH2)x-NH]yC(O)-；-C3H6SN-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NHC(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6SN-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-
-C3H6ON-C-；-C3H6ON-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-C3H6ON-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-NH-(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-NH-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-NH[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-S-C(O)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-(CH2)-[NH-(CH2)]-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NHC(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)x-NH-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[(CH2)x-NH]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-CH2-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-NH-(CH2)x-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)x]y-C(O)-；-C3H6ON-N(CH3)-(CH2)-[NH-(CH2)]y-C(O)-；-O-C(O)-；-C(O)-，或者一个共价键，其中x和y是2，3，4或更大，并且可以是相同或不同的。
适合键合体系的化学是公知的并且可以用于该目的(参见，例如，″蛋白质共轭和交联化学″，S.S.Wong，编著，CRC Press，Inc.(1993)；生物缀合化学透视，Claude F.Modres，编著，ACS(1993))。
除了J1和J2连接XI，X2或趋化因子多肽链之外，可以选择使用的键合体系来调节目标分子的物理-化学和/或生物学性质，前提是得到的分子保留其拮抗剂性质。例如，通过插入在有关通过利用不同的长度、刚性、电荷和/或偏光力的键合体系调节半寿期等或者调节效力、特异性等方面与另一种相比的一种类型的条件下更稳定(或更不稳定)的键合体系能够实现该目的。连接烃链和趋化因子多肽链的键合单元本质上可以不同，前提是J1和/或J2的总长度和空间占有最优选接近天然存在的趋化因子。
在优选的实施方案中，脂肪链J1是长度为5(C5)至10(C10)个碳原子的烃链，而脂肪链J2是长度为12(C12)至20(C20)个碳原子的脂质。J1 C5-C10烃链包括但不限于-C5H11，-C5H9，-C5H7，-C5H5，-C5H3，-C6H13，-C6H11，-C6H9，-C6H7，-C6H5，-C6H3，-C7H15，-C7H13，-C7H11，-C7H9，-C7H7，-C7H5，-C7H3，-C8H17，-C8H15，-C8H13，-C8H11，-C8H9，-C8H7，-C8H5，-C8H3，-C9H19，-C9H17，-C9H15，-C9H13，-C9H11，-C9H9，-C9H7，-C9H5，-C9H3，-C10H21，-C10H19，-C10H17，-C10H15，-C10H13，-C10H13，-C10H11，-C10H9，-C10H7，-C10H5，和-C10H3。
合适的J2脂质包括但不限于脂肪酸衍生的脂质和多元环甾族化合物衍生的脂质。所述脂肪酸包括但不限于饱和的和不饱和的脂肪酸。饱和脂肪酸的例子是月桂酸(C12)，十四烷基酸(C14)，棕榈酸(C16)，硬脂酸(C18)，和花生酸(C20)。不饱和脂肪酸的例子包括油酸(C18)，亚油酸(C18)，亚麻酸(C18)，桐酸(C18)，和花生四烯酸(C20)。所述多元环包括但不限于醛甾酮，胆甾烷醇，胆固醇，胆酸，粪甾醇，皮质甾酮，可的松，脱氢胆甾醇，链甾醇，毛地黄皂甙配基，麦角甾醇，雌二醇，羟基皮质甾酮，7-胆甾烷醇，强的松，孕烯醇酮，孕甾酮，睾酮，酵母甾醇，等等。脂肪酸通常通过酸部分连接趋化因子多肽链，从而得到酰基-连接部分，但是也可以使用其它键。连接烃链和趋化因子多肽链的键合单元本质上可以不同，前提是N-末端区的总长度和空间占有接近天然存在的趋化因子。从这点上看发现C-末端区更灵活，这样可以比N-末端区更大程度改变总长度和空间占有。
在另一个优选的实施方案中，本发明的趋化因子衍生物中包括J1和J2成分时，J1和J2包括C5至C20饱和或不饱和酰基链，例如壬酰基，壬烯酰基，氨基氧戊烷，十二酰基，十四酰基，棕榈酸根，月桂酰基，棕榈酰基，二十烷酰基，油酰基，或二十四烷酰基。例如，J1取代基可以是壬酰基或氨基氧戊烷，J2取代基可以是饱和或不饱和脂肪酸，优选C12-C20脂肪酸，或者多元环甾族化合物脂质例如胆甾醇。
根据脂肪链的性质和长度，本发明的趋化因子受体调制剂可以包括加给多肽链特别是在C-末端的另外的氨基酸或其它部分，提供对于脂肪部分的间隔基团和/或分开的连接位点。
″氨基酸衍生物″意指除20种遗传编码天然存在的氨基酸之外的氨基酸或类氨基酸化合物。特别地。氨基酸衍生物Z1不是20种遗传编码天然存在的氨基酸之一，而是具有式-(N-CnR-CO)-，其中Cn是1-22个碳原子，R是氢原子，烷基或者芳香基团，并且其中N和Cn，N和R，或Cn和R能够形成环结构。还有，在其还原形式中，根据氨基酸衍生物的性质，N，Cn和R各自可以具有一个或多个氢原子。烷基部分可以是被取代的或不被取代的，其可以是线性的，支链的或者环的，并且可以包括一个或多个杂原子。氨基酸衍生物可以从头制备或者从商业来源购得(参见，例如，Calbiochem-Novabiochem AG，Switzerland；Advanced Chemtech，Louisville，KY，USA；LancasterSynthesis，Inc.，Windham，NH，USA；Bachem California，Inc.，Torrance，CA，USA；Genzyme Corp.，Cambridge，MA，USA)。氨基酸衍生物的例子包括但不限于，氨基异丁酸(Aib)，羟基脯氨酸(Hyp)，1，2，3，4-四氢异喹啉-3-COOH(Tic)，二氢吲哚-2-羧酸(indol)，4-二氟-脯氨酸(P(4，4DiF))，L-噻唑烷-4-羧酸(Thz)，L-高脯氨酸(HoP)，3，4-脱氢-脯氨酸(ΔPro)，3，4-二羟基苯丙氨酸(F(3，4-DiOH))，pBzl，-3，4-二羟基苯丙氨酸(F(3，4DiOH，pBzl))，二苯甲酮(p-Bz)，环己基丙氨酸(Cha)，3-(2-萘基)丙氨酸(βNal)，环己基甘氨酸(Chg)，和苯丙氨酸(Phg)。
关于X1，CHEMOKINE和X2，这些成分的氨基酸序列基本上与天然存在的野生型分子同源。术语″基本上同源″当在这里使用时，包括与给定序列至少具有40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％(优选95-99％)序列同源性的氨基酸序列。该术语包括但不限于相对于给定序列有1至20个，1至10个或者1至5个单个氨基酸缺失，插入或取代的氨基酸序列，前提是得到的多肽作为相应的天然存在的趋化因子的拮抗剂起作用。
例如，本领域公知某些氨基酸可以被其它氨基酸置换而多肽的性质基本上没有改变，包括但不限于氨基酸的保守型取代。这样的可能性在本发明的范围内。还应该注意能经常进行基本上没有改变多肽的性质的氨基酸的缺失或插入。本发明包括这样的缺失或插入(其可以是例如至多是相应的天然存在的趋化因子的特异拮抗剂序列的长度的10，20或50％)。此外，可以使趋化因子进行实质性修饰，包括混合和匹配不同的趋化因子多肽片段，产生另外的多样性，例如WO 99/11655中描述的模块′交叉′合成方法，这篇文献在这里全文引作参考。
除了在N-和/或C-末端改变之外，本发明的趋化因子受体调制剂还可以包括在多肽链中，即在上式CHEMOKINE代表的多肽链中，一个或多个氨基酸取代，插入或缺失。在优选的实施方案中，在趋化因子的N-环中进行改变，提高它对目标受体的特异性/选择性。用这种方法，本发明的趋化因子受体调制剂的N-环可以阻断特异性受体，同时减小对其可能的其它共同受体的拮抗剂作用。″N-环″意指与给定趋化因子多肽链的N-末端区的第一个保守半胱氨酸模式邻接的/C-末端的20-26个氨基酸序列区(参见，图1和2)。例如，以趋化因子多肽链的N-末端至C-末端方向阅读时，CC趋化因子的N-环是位于与第一和第二个保守的半胱氨酸氨基酸之间和与它们邻接/C-末端和与第三个保守的半胱氨酸氨基酸邻接/N-末端的氨基酸区。
本发明的趋化因子受体调制剂还可以包括可检测标记，例如荧光团，和在特异的选择的位点导入的其它取代基，其将分子转化为膜的探针和与趋化因子作用相关的细胞生物学作用，病毒抑制作用等，以及用于监测药物动力学等。可检测标记优选与趋化因子受体调制剂的C-末端区连接。可检测标记可以在趋化因子多肽链的合成期间或合成之后插入。作为一个例子，在链组装期间，可检测标记可以插入到连接前的肽片段中，例如，在去除其它保护基团并且从树脂释放标记的肽之前，使荧光团与树脂结合的肽上的没有保护的反应基团连接是方便的。包括可检测标记的氨基酸衍生物和用来将它们插入到肽或多肽序列中所使用的化学合成技术是公知的，并且可以用于该目的。用这种方法，可以对得到的趋化因子多肽链产物进行设计，使在选择的具体位置之前包含一个或多个可检测标记物。或者，可以对反应基团加上可检测标记物，优选化学选择性反应基团，例如酮基或醛基，它们使得连接之前的多肽片段或者甚至连接之后的多肽链的给定氨基酸上存在位点特异性连接。
适合该目的的可检测标记物包括光敏基团，和发色团，包括荧光团和其它染料，或者半抗原，例如生物素。这样的标记物可以从很多不同的商业途经获得(参见，例如，Molecular Probes，Oregon USA；Sigma and affiliates，St.Louis MO，USA；等)。对于在树脂上标记，荧光素，曙红，俄勒冈绿，若丹明绿，对甲氨基酚绿，四甲基若丹明，若丹明红，德克萨斯红，香豆素和NBD荧光团，dabcyl发色团和生物素对于氟化氢(HF)来说都是适当稳定的，并且对于大多数其它酸来说也都是适当稳定的，因此对于通过固相合成插入是合适的(Peled，等，Biochemistry(1994)337211；Ben-Efraim，等，Biochemistry(1994)336966)。除香豆素之外，这些荧光团对于用来将利用Fmoc化学过程合成的肽去保护的试剂也是稳定的(Strahilevitz，等，Biochemistry(1994)3310951)。也可以使用ε-dabcyl-L-赖氨酸的t-Boc和α-Fmoc衍生物在多肽序列的选择位点插入dabcyl发色团。dabcyl发色团具有很宽的可视吸收，并且可以用作淬火基团。通过使用dabcyl琥珀酰亚胺酯也可以在N-末端插入dabcyl基团(Maggiora，等，J Med Chem(1992)353727)。EDANS是FRET实验中对于与dabcyl淬灭剂配对的常用荧光团。通过使用5-((2-(t-Boc)-γ-谷氨酰氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸可以在肽的自动合成期间方便地引入这样的荧光团(Maggiora，等，J Med Chem.(1992)353727)。在化学合成期间可以使用α-(t-Boc)-ε-丹磺酰-L-赖氨酸将丹磺酰荧光团插入到多肽中(Gauthier，等，Arch Biochem.Biophys.(1993)306304)。和使用EDANS一样，这种荧光团的荧光与dabcyl的吸收重叠。使用t-Boc-保护的生物胞素的衍生物(Geahlen，等，Anal.Biochem.(1992)20268)，或者其它已知的生物素化衍生物例如NHS-生物素等能够实现肽的定位生物素化作用。外消旋二苯甲酮苯丙氨酸类似物也可以在其t-Boc或Fmoc保护作用之后插入到肽中(Jiang，等，Intl.J Peptide Prot.Res.(1995)45106)。非对映异构体的拆分可以通过产物的HPLC纯化完成；没有保护的二苯甲酮也可以通过本领域标准技术拆分。用于肟偶联的携带酮基的氨基酸，氮杂/羟基色氨酸，生物素化赖氨酸和D-氨基酸也属于可以用于树脂标记的氨基酸的其它例子。认识到通过根据本领域标准技术的常规合成能够制备用于自动肽合成的其它保护的氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的趋化因子受体调制剂可以包括与其结合的药物(参见，例如，WO 00/04926)。
还提供了制备本发明趋化因子受体调制剂的方法，该方法包括(i)合成包括具有与天然存在的趋化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽链的天然存在的趋化因子的类似物，其中所述多肽链在N-末端，N-环和C-末端的一处或多处修饰有选自脂肪链和氨基酸衍生物的部分；和(ii)与相应的天然存在的趋化因子相比对趋化因子类似物筛选拮抗剂活性。
特别地，制备N-末端趋化因子受体调制剂的方法包括(i)合成包括具有与天然存在的趋化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽链的天然存在的趋化因子的类似物，其中所述多肽链在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物；和(ii)与相应的天然存在的趋化因子相比对趋化因子类似物筛选拮抗剂活性。制备C-末端趋化因子受体调制剂的方法包括(i)合成包括具有与天然存在的趋化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽链的天然存在的趋化因子的类似物，其中所述多肽链在其C-末端修饰有脂肪链或多元环；和(ii)与相应的天然存在的趋化因子相比对趋化因子类似物筛选拮抗剂活性。制备N-/C-末端趋化因子受体调制剂的方法包括(i)合成包括具有与天然存在的趋化因子基本上同源的氨基酸序列的多肽链的天然存在的趋化因子的类似物，其中所述多肽链在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且在其C-末端修饰有脂肪链或多元环；和(ii)与相应的天然存在的趋化因子相比对趋化因子类似物筛选其拮抗剂活性。
本发明的趋化因子受体调制剂的合成是通过化学合成(即，没有核糖体的合成)，或者生物合成(即，有核糖体的合成)和化学合成的结合来实现的。对于化学合成，趋化因子受体调制剂可以通过一步一步链组装或片段缩合技术整个制备，例如利用Fmoc和tBoc途经的固相或液相肽合成，或者通过链组装整个制备的肽片段的化学连接，或者链组装和生物合成的组合。这样的一步一步链组装或片段缩合和连接技术是本领域公知的(参见，例如，Kent，S.B.H.，Ann.Rev.Biochem.(1988)57957-989；Dawson等，Methods Enzymol.(1997)28734-45；Muir等，Methods Enzymol.(1997)289266-298；Wilken等，Current Opinion In Biotechnology(1998)9412-426；Ingenito等，J Amer.Chem.Soc.(1999)121(49)11369-11374；和Muir等，Chemistry & Biology(1999)6R247-R256)。
对于化学连接，具有N-末端官能团的第一肽片段与具有C-末端官能团的第二肽片段连接，C-末端官能团与N-末端官能团反应，在它们之间生成共价键。根据选择的官能团，连接反应产生在连接位点有正常酰胺键或非正常共价键的产物。用于化学连接的第一或第二肽片段一般利用一步一步链组装或片段缩合来制备。特别地，当通过肽片段的连接制备趋化因子受体调制剂时，就想要的用于连接的化学选择性反应化学来说，制备包含合适的携带的化学选择性反应基团的片段。这些化学过程包括但不限于正常化学连接(Dawson，等，Science(1994)266776-779；Kent，等，WO 96/34878)，延长的一般化学连接(Kent，等，WO 98/28434)，形成肟的化学连接(Rose，等，J Amer，Chem.Soc.(1994)11630-33)，形成硫代酸酯的连接(Schnolzer，等，Science(1992)256221-225)，形成硫醚的连接(Englebretsen，等，Tet，Letts.(1995)36(48)8871-8874)，形成腙的连接(Gaertner，等，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，和形成四氢噻唑的连接和形成噁唑烷的连接(Zhang，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，等，WO 95/00846)。
选择给定连接化学过程的反应条件，保持连接成分的期望的相互作用。例如，可以改变pH和温度，肽和成分的水溶性，肽的比例，各种肽的水含量和组成，使连接最优化。可以进一步利用添加或逐出溶解肽的试剂至不同的程度，来控制期望的连接反应的特异性和速度。通过测定期望的化学选择性反应产物与一种或多种内对照和/或外对照的比较，容易确定反应条件。
化学合成的优选方法使用了正常化学连接，这公开于Kent等，WO96/34878，和公开于Offord等，WO 99/11666中的在N-和/或C-末端进行化学修饰制备蛋白质的方法，这些文献的公开内容在此引作参考。一般情况下，包含C-末端硫代酸酯的第一肽与带有具有没有氧化的巯基侧链的N-末端半胱氨酸的第二肽反应。N-末端半胱氨酸的氧化的巯基侧链在催化量的硫醇的存在下与C-末端硫代酸酯缩合，所述硫醇优选是苄基硫醇，苯硫酚，2-硝基苯硫酚，2-硫代苯甲酸，2-硫代吡啶，等。通过对-氨基硫代酸酯键连接第一和第二肽来制备中间体肽，其重排产生包括通过酰胺键连接的第一和第二肽的肽产物。
对于化学和生物合成的结合，通过化学合成制备一个肽片段，同时应用重组技术制备另一个，然后利用化学连接来连接片段，产生全长产品。例如，可以使用intein表达系统开发′intein′蛋白质剪接元件的可诱导自身裂解活性，来产生C-末端硫代酸酯肽片段。特别地，intein在硫醇例如DTT，b-巯基乙醇或半胱氨酸的存在下经历了自身裂解，产生带有C-末端硫代酸酯的肽片段(参见，例如，Muir等，Chemistry & Biology(1999)6R247-R256；Chong等，Gene(1997)192277-281；Chong等，Nucl.Acids Res.(1998)265109-5115；Evans等，Protein Science(1998)72256-2264；和Cotton等，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。然后可以利用这种带有C-末端硫代酸酯的肽片段连接带有N-末端硫代酸酯反应官能团的第二个肽，例如带有用于正常化学连接的N-末端半胱氨酸的肽片段。
在链装配期间，链装配之后或者期间及之后，可以插入脂肪链和氨基酸衍生物。对于在链装配期间插入，在逐步式或片段缩合，和/或连接链装配过程中插入氨基酸衍生物和/或具有与其连接的脂肪链的氨基酸。这些氨基酸可以以逐步的方式加给肽合成期间延长着的肽链，加给目的在于连接的装配的肽片段，或者在某些情况下，通过从聚合物载体上裂解，能够提供结合的N-或C-末端修饰，通过裂解产物得到期望的脂肪链。对于后链装配，在链装配期间(保护的或没有保护的形式)插入氨基酸或者其带有反应官能团的衍生物，然后以其没有保护的反应形式使用连接期望的部分，即，在后肽合成连接反应中。在变性线性肽链上，或者在多肽链折叠之后，可以进行后链装配连接。在优选的实施方案中，在肽合成中在感兴趣的氨基酸位点加上氨基酸衍生物，而在肽合成之后通过连接反应加上N-，C-和/或N-/C-末端脂肪链。根据期望的共价键，可以利用多种连接化学过程中的任何一种(参见，例如，Plaue，S等，Biologicals.(1990)18(3)147-57；Wade，J.D.等，Australas Biotechnol.(1993)3(6)332-6；Doscher，M.S.，Methods Enzymol.(1977)47578617；Hancock，D.C.等，Mol Biotechnol.(1995)4(1)73-86；Albericio，F.等，Methods Enzymol.(1997)289313-36)，以及连接化学过程。根据本领域标准技术能够实现本发明趋化因子受体调节剂的折叠。参见，例如，WO 99/11655；WO 99/11666；Dawson等，MethodsEnzymol.(1997)28734-45)。
对于对趋化因子化合物筛选拮抗剂活性，以特征在于趋化因子配体与其相应的受体直接或间接结合的测试为基础，通过体外或体内，检测化合物。趋化因子受体和它们的相应的野生型趋化因子的例子包括CXXXCR1(Fractalkine)；XCR1(SCM-1)；CXCR2(GRO，LIX，MIP-2)；CXCR3(MIG，IP-10)；CXCR4(SDF-1)；CXCR5(BLC)；CCR1(MIP-1α，RANTES，MCP-3)；CCR2(MCP-1，MCP-3，MCP-5)；CCR3(Eotaxin，RNATES，MIP-1α)；CCR4(MDC，TARC)；CCR5(RANTES，MIP-1α，MIP-1β；CCR6(MIP3α)；CCR7(SLC，MIP-3β)；CCR8(TCA-3)；和CCR9(TECK)。这些系统的体内和体外测试是公知的，并且容易获得，或者能够从头制备。参见，例如，US 5,652,133；US5,834,419；WO 97/44054；WO 00/04926；和WO 00/0492。例如，一般使用表达一种或多种趋化因子受体的天然的，转化的，和/或转基因细胞系监测当暴露给趋化因子受体调制剂例如本发明的化合物时趋化因子诱导的趋化性的效果或者对该作用的抑制。也可以使用动物模型，例如，监测与本发明的趋化因子受体调制剂处理相关的反应曲线，或者表征这些化合物的药物动力学和药效性能。为了表征作为病毒感染抑制剂的本发明的化合物，可以应用使用靶细胞系和膜细胞系的膜-介导的细胞融合测试对本发明的趋化因子受体调制剂筛选它们预防HIV感染的能力。当然，也可以使用没有细胞的病毒感染测试用于该目的。
作为一个例子，一般对于评价趋化性的拮抗作用，可以使用外周血白细胞，例如根据已知的单细胞纯化方法从正常供者分离的那些，T淋巴细胞和嗜中性白细胞。可以构建一组表达C，CC，CXXXC和CXC趋化因子受体的试验细胞，并且在接触本发明的各种化合物的系列稀释物之后进行评价。天然的趋化因子可以用作对照物。例如，用编码不同的趋化因子受体的表达盒转染的一组细胞适合该目的。例如，可以使用转化体表达CXCR4/融合/LESTR，CCR3，CCR5，CXC4(这样的细胞可以从各种商业来源和/或科研途经获得或者能够根据标准方法制备；参见，例如，Risau，等.，Nature 387671-674(1997)；Angiololo，等，Annals NY Acad.Sci.(1996)795158-167；Friedlander，等，Science(1995)8701500-1502)，能够筛选趋化因子的拮抗剂，例如RANTES，SDF-1α或SDF-1β和MIP。结果可以表示为趋化性指数(″CI″)，代表刺激物对对照介质诱导的细胞迁移中折叠的增加，并且测定统计学意义。
也可以进行受体结合测试，例如评价竞争抑制作用对受体再循环作用(参见，Signoret，N.等，″HIV辅助受体CCR5的胞吞作用和再循环″，J Cell Biol.2000 151(6)1281-94；Signoret，N.等，″趋化因子受体胞吞作用和再循环的分析″，Methods Mol Biol.2000；138197-207；Pelchen-Matthews，A.等，″趋化因子受体运输和病毒复制″，Immunol Rev.1999年4月；16833-49；Daugherty，B.L.等，″放射性标记趋化因子结合测试″，Methods Mol Biol.2000；138129-34；Mack，M.等，″趋化因子受体的下调和再循环″，MethodsMol Biol.2000；138191-5；所有这些在此引作参考)。这种方法是公知的，并且一般根据标准方法在递增浓度的未标记天然趋化因子的存在下使用标记的趋化因子受体调制剂。当然，标记可以在一个配体或两个配体上。在这种类型的测试中，可以例如使用计算机程序例如LIGAND(P.Munson，Division of Computer Research andTechnology，NIH，Bethesda，MD)分析结合数据，并且与天然白细胞或一组表达靶趋化因子受体的受体转染细胞，使用“一点”和“两点”模型进行Scatchard作图分析。然后利用下面的计算式计算没有标记的配体对结合的竞争速度％抑制作用＝1-(在没有标记的趋化因子存在下结合/在只有介质存在下结合×100。
为了对化合物筛选它们预防或减轻病毒感染和疾病的能力，可以对一组暴露给各种病毒株和对照物稳定表达每一种合适的受体的细胞筛选化合物。例如，可以使用表达CCR3，CCR5，CXC4或CXCR4受体的U87/CD4细胞筛选M-回归，T-回归和双重回归HIV株的感染。可以以相对于趋化因子受体调制剂和对照浓度感染百分比评价病毒感染的抑制作用。参见，例如.，McKnight，等，Virology(1994)2018-18)；和Mosier，等，Science(1993)260689-692；Simmons，等，Science(1997)276276-279；Wu，等，J.Exp.Med.(1997)185168-169；和Trkola，等，Nature(1996)384184-186)。钙迁移测定是用于筛选受体结合的拮抗剂的另一个实施例，例如鉴定对于嗜中性白细胞和嗜酸性细胞是趋化性的天然趋化因子的拮抗剂(Jose，等.，J.Exp.Med 179881-887(1994))。作为另一个例子，通过小鸡尿囊绒膜(CAM)测试可以评价本发明的化合物的生血管活性(Oikawa，等，Cancer Lett，(1991)5957-66)。
本发明的趋化因子受体拮抗剂具有很多用途，包括用作研究工具，诊断和用作治疗物。特别地，发现本发明的趋化因子受体拮抗剂具有有价值的药理学性质，已经证明有效阻断与在各种疾病中涉及的相应的野生型分子相关的炎症作用，所述各种疾病包括哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，粉瘤/动脉粥样硬化，器官移植排异，和类风湿性关节炎。因此，它们用于治疗哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，粉瘤/动脉粥样硬化，器官移植排异，和类风湿性关节炎。例如，几种本发明的趋化因子受体拮抗剂例如RANTES和SDF-1α或SDF-1β拮抗剂也被证明抑制HIV-1感染，并且拮抗剂(例如，vMIP-II)可以用于相同的目的。因此，本发明的RANTES，或SDF-1α或SDF-1β拮抗剂和本发明的vMIP-II类似物用于抑制哺乳动物HIV-1。通过下面实施例中描述的方法测定化合物用于抗HIV-1用途的潜力。通过本领域技术人员公知的方法测定化合物抗炎效果的潜力。此外，要明白本发明的趋化因子受体调制剂可以单独使用，或者相互组合使用，以及与在治疗一种给定疾病中有协同作用的其它非趋化因子药物组合使用。
举例来说，不是限制性的，下面是详细说明这些分子制备趋化因子受体调制剂的一般用途的野生型趋化因子分子和它们相关的生物学性能的一些具体例子。例如，SCM-1是脾中表达的C-趋化因子。其本质上与CC和CXC-趋化因子有关，主要差别在于它只具有这些蛋白质中保守的四个半胱氨酸的第二个和第四个(Yoshida等，FEBS Letters(1995)360(2)155-159)；Yoshida等，J.Biol.Chem.(1998)273(26)16551-16554)。对于人，有两种高度同源的蛋白质，SDF-1α或SDF-1β，其差别在于两个氨基酸取代基。发现SCM-1与鼠淋巴细胞特异性趋化因子lymphotactin大约60％相同。因此SCM-1和lymphotactin可以代表人和鼠C-趋化因子或γ-趋化因子的原型。两种SCM-1分子特异性诱导基因工程处理表达孤独受体GPR5的鼠L1.2细胞中的迁移，GPR5主要在胎盘中表达，在各种人组织中在脾和胸腺中弱表达。因此，发现SCM-1的拮抗剂在阻断GPR4的正常功能中的用途。
作为另一个实施例，Fractalkine的可溶形式，一种76个氨基酸CXXXC-趋化因子，是T-细胞和单核细胞的有效化学引诱物，但是对嗜中性白细胞则不是。用TNF或IL1刺激之后Fractalkine大大增加。对于Fractalkine的人受体指定为CX3CR1。该受体介导Fractalkine的粘着和迁移功能。该人受体在嗜中性白细胞，单核细胞，T-淋巴细胞，和几种实体器官包括脑中表达。已经证明该受体与CD4一起作为来自HIV-1初级分离物的膜蛋白的辅助受体发挥功能。细胞-细胞融合测试证明Fractalkine有效地并且特异性地抑制融合。(参见，例如，Bazan等，Nature(1997)385(6617)640-644；Combadiere等，J.Biol.Chem.(1998)273(37)23799-23804；Rossi等，Genomics(1998)47(2)163-170；和Faure等，Science(2000)2872274-2277)。因此表明发现Fractalkine的拮抗剂在涉及TNF或IL1途经的各种关节炎疾病例如关节炎的治疗中的用途，还发现作为HIV感染阻断剂的用途。
Eotaxin是另外一个例子。该蛋白质长度是74个氨基酸，并且由于其特征性半胱氨酸模式而分类为CC-趋化因子。在用作变应性炎症模型的豚鼠的支气管肺泡中发现它，并且涉及与哮喘相关的疾病。Eotaxin诱导皮肤中1-2 pM剂量的大量的嗜酸性细胞累积，而不明显影响嗜中性白细胞的累积。Eotaxin是豚鼠和人嗜酸性细胞的体外有效刺激剂。该因子表现出与豚鼠嗜酸性细胞上的RANTES共享一个结合位点。Eotaxin对正常人嗜酸性细胞诱导钙流通响应，但是对嗜中性白细胞或单核细胞则不是这样。通过用其它CC-趋化因子预处理嗜酸性细胞不能将该响应脱敏。在嗜碱细胞中，Eotaxin诱导比RANTES高水平的趋化性响应，但是其对于组胺释放或白三烯C4产生只有边缘作用。其在B-细胞淋巴瘤细胞的趋化性中也可以起作用。Eotaxin的主要受体是CCR3(参见，例如，Bartels等，Biochem.Biophys.Res.Comme(1996)225(3)1045-51)；Jose等，J Exp.Med.(1994)179881-887)；Ponath等，J.Clin.Investigation(1996)97(3)604-612)；Ponath等，J.Exp.Med.(1996)183(6)2437-2448)；Yamada等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1997)231(2)365-368)。因此，Eotaxin的拮抗剂可以用作哮喘和其它嗜酸性细胞相关的变应性疾病的潜在的调制剂。
RANTES是令人特别感兴趣的拮抗剂的靶趋化因子的另一个例子。它是在从炎症，器官排异到HIV感染范围很多疾病中涉及的一种CC-趋化因子。TNF-α和IL1-α诱导RANTES的合成，但是TGF-β，IFN-γ和IL6则不诱导。培养物中循环T-细胞和T-细胞克隆产生RANTES，而迄今为止试验的任何T-细胞系则不产生。T-淋巴细胞的刺激作用之后抑制RANTES的表达。对于T-细胞，人嗜酸性细胞和嗜碱细胞，RANTES是趋化性的，并且在将白血球补充到炎症部位中起着积极作用。RANTES也激活嗜酸性细胞释放例如嗜酸性阳离子蛋白质。它改变嗜酸性细胞的密度并且使得它们hypodense，认为这代表一般细胞激活的状态并且常常与象哮喘和变应性鼻炎这样的疾病相关。RANTES也是氧化代谢的潜在的嗜酸性细胞-特异性激活剂。RANTES提高单核细胞对内皮细胞的粘着性。它选择性支持表达细胞表面标记CD4和UCHL1的单核细胞和T-淋巴细胞的迁移。认为这些细胞预先刺激具有记忆T-功能的辅助T-细胞。RANTES激活来自某些选择嗜碱细胞供体的人嗜碱细胞并且引起组胺的释放。另一方面，RANTES也能抑制几种细胞因子包括最有效的组胺诱发剂MCAF之一诱导的组胺从嗜碱细胞的释放。
最近证明RANTES具有除趋化性之外的生物学活性。它能诱导已知为类似于IL2激活的细胞的CHAK(C-C-趋化因子激活杀伤细胞)的杀伤细胞的增殖和激活。人滑液成纤维细胞表达RANTES，并且RANTES可以参与正在发生的类风湿性关节炎的炎症过程。在人单核细胞白血病细胞系THP-1上已经鉴定了RANTES的高亲和性受体(大约700个结合位点/细胞；Kd＝700皮摩尔)，其在趋化性和钙迁移测试中响应RANTES。通过与MCAF(单核细胞趋化性和激活因子)或者MIP-1-α(巨噬细胞炎性蛋白质)预先温育，THP-1细胞对RANTES的趋化性响应得到大大抑制。RANTES对单核细胞的结合受到MCAF和MIP-1-α的竞争。RANTES的受体是CCR1，CCR3和CCR5。RANTES的拮抗剂的临床应用和意义是多方面的。例如，天然RANTES的抗体能够显著抑制与实验血管系膜增殖性肾炎相关的细胞渗透。另外，天然RANTES表现出在经受与肾移植排异相关的细胞排斥的人肾同种移植中高效表达(Pattison等，Lancet(1994)343(8891)209-11(1994)。已经证明RANTES的化学修饰形式(氨基氧戊烷-RANTES或AOP-RANTES；和正-壬酰基RANTES或NNY RANTES)作为趋化因子的CCR-5受体的拮抗剂起作用，并且具有抑制HIV-1感染的能力。因此，根据本发明的RANTES的N-，C-和N-/C-末端修饰的类似物拮抗剂作为象哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，器官移植，粉瘤/动脉粥样硬化和类风湿性关节炎这样的疾病的治疗中的抗炎药物是有用的。
趋化因子SDF-1α和β的拮抗剂是另外的例子，它们属于CXC类趋化因子。SDF-1β的不同之处在于在C-末端具有四个另外的氨基酸。这些趋化因子与它们的非人相应物92％以上相同。除了血细胞之外SDF-1被普遍表达。SDF-1对淋巴细胞和单核细胞起作用，但是体外对嗜中性白细胞不起作用，并且体内是单核细胞的高效化学引诱剂。其还诱导淋巴细胞内胞内肌动蛋白聚合作用。SDF-1体外体内作为人造血母细胞的化学引诱剂，产生混合类型的并且更原始类型的母细胞。SDF-1还表现出在心室隔膜的形成中涉及。CD34+细胞的趋化性加强了对SDF-1和IL-3组合的响应。SDF还被证明诱导这些细胞中细胞质钙的暂短增加。SDF-1的主要受体是CXCR4，它还作为HIV1的主要T-淋巴细胞辅助受体发挥功能。参见，例如.，Aiuti等，J.Exp.Med.(1997)185(1)111-120(1997)；Bleul等，J Exp.Med.(1996)184(3)1101-1109(1996)；Bleul等，Nature(1996)382(6594)829-833；D′Apuzzo等，European J.Immunol.(1997)27(7)1788-1793；Nagasawa等，Nature(1996)382635-638)；Oberlin等，Nature(1996)382(6594)833-835。例如，本发明的SDF-1拮抗剂作为象哮喘，变应性鼻炎，特应性皮炎，器官移植，粉瘤/动脉粥样硬化和类风湿性关节炎这样的疾病的治疗中的抗炎药物是有用的。此外，本发明的SDF-1拮抗剂可以单独使用或者与其它化合物例如本发明的RANTES拮抗剂类似物结合使用，用于阻断就原炎症细胞的募集和/或激活来说SDF-1，RANTES，MIP-1α，和/或MIP-1β在哺乳动物中的作用，或者治疗或阻断HIV-1感染。
因此，本发明的另一方面涉及通过施用治疗有效量的包括本发明的趋化因子受体调制剂的化合物或者其药学可接受盐对需要的哺乳动物治疗的药物组合物和方法。″药学可接受盐″意指保留本发明多肽的生物学效力和性质而且没有生物学或其它方面不期望的性质的盐。盐可以从酸或碱衍生。酸加成盐衍生自无机酸，如盐酸，氢溴酸，硫酸(得到硫酸盐和硫酸氢盐)，硝酸，磷酸等，和有机酸，如乙酸，丙酸，乙醇酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，酒石酸，柠檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，水杨酸，对甲苯磺酸等。碱加成盐可以衍生自无机碱，包括钠，钾，锂，铵，钙，镁盐等。衍生自有机碱的盐包括从下面的化合物形成的那些伯胺，仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺，和环胺包括异丙基胺，三甲基胺，二乙基胺，三乙基胺，三丙基胺，乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，氨丁三醇，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，普鲁卡因，羟基胺，胆碱，甜菜碱，乙二胺，葡萄糖胺，N-烷基葡萄糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶等。优选的有机碱是异丙基胺，二乙胺，乙醇胺，哌啶，氨丁三醇和胆碱。
这里使用的术语″治疗″包括哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，包括(i)预防受试者疾病发生，所述疾病可能预先已经存在但是还没有诊断患有该疾病；(ii)抑制该疾病，即阻止其发展；或者(iii)减轻疾病，即使得该疾病消退。
这里使用的术语″通过用趋化因子受体调制剂治疗而预防或减轻的哺乳动物疾病状态″意在包括本领域一般公知的一般情况下用趋化因子受体调制剂有用治疗的所有的疾病状态，和发现通过用本发明具体化合物治疗有用地防止或减轻的那些疾病状态。为了详细说明而非限制性地，这些包括哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，病毒疾病，粉瘤/动脉粥样硬化，类风湿性关节炎和器官移植排异。
这里使用的术语″治疗有效量″指当对需要的哺乳动物施用时足以例如作为消炎药物，抗哮喘药物，免疫抑制药物，或者抑制哺乳动物病毒感染的抗自身免疫疾病药物有效治疗(如上定义)的本发明趋化因子受体调制剂的量。构成″治疗有效量″的该量取决于趋化因子衍生物，症状或疾病及其严重程度，要治疗的哺乳动物，其体重，年龄等，但是本领域技术人员根据经验和本说明书的公开可以按常规确定。这里使用的术语″q.s.″指加入足以实现所述功能，例如使得溶液达到期望的体积(例如，100mL)的量。
以治疗有效剂量施用本发明的趋化因子受体调制剂和它们的药学可接受盐，即活性成分，所述治疗有效剂量即如上所述当对相应的哺乳动物施用时足以有效治疗的量。这里描述的趋化因子受体调制剂的施用可以通过对于有着相似用途的药物来说任何可接受的施用方式。这里使用的术语″本发明的趋化因子受体调制剂″，″本发明的多肽的[药学可接受盐]″和″活性成分″互换使用。
制剂中趋化因子受体调制剂的含量可以在本领域技术人员使用的全部范围内改变，例如，占总制剂的从大约0.01％重量(％w)至大约99.99％w的趋化因子受体调制剂和大约0.01％w至99.99％w赋形剂。更典型地，趋化因子受体调制剂以大约0.5％w至大约80％w的水平存在。
本发明趋化因子受体调制剂对人剂量水平进行了优化，一般来说，日剂量是每千克体重每天大约0.05至25mg，最优选是每千克体重每天大约0.01至10mg。因此，对体重70kg的人施用，剂量范围是每天大约0.07mg至3.5g，优选每天大约3.5mg至1.75g，最优选每天大约0.7mg至0.7g。施用的拮抗剂的量当然取决于受试者和预防或减轻所针对的疾病状态，疾病的性质或严重程度，施药方式和时间表，以及开处方的医师的判断。这样的使用优化完全在本领域技术人员范围之内。
可以通过任何可接受的全身或局部途经施药，例如，通过肠胃外，口服(特别是婴儿制剂)，静脉内，鼻内，支气管吸入(即，气雾剂制剂)，透皮或局部途经，以固体形式，半固体形式或液体形式或气雾剂剂量形式，象，例如，片剂，丸剂，胶囊，粉末，液体，溶液，乳状液，注射液，悬浮液，栓剂，气雾剂等。本发明的趋化因子受体调制剂也可以以缓释或控制释放剂量形式给药，包括贮存式注射液，渗透泵，丸剂，透皮贴(包括电转运)，等等，用于以预定速度延时施用多肽，优选以适合单次给药的精确剂量的单位剂量形式。组合物含有常规药物载体或赋形剂和本发明的趋化因子受体调制剂，此外，可以含有其它药用物质，药物，载体，佐药等。载体可以选自各种油类，包括石油，动物油，植物油或合成油，例如，花生油，豆油，矿物油，芝麻油，等。水，盐水，葡萄糖水溶液，和二醇类是优选的液体载体，特别是对于可注射溶液来说。合适的药学载体包括淀粉，纤维素，滑石粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸镁，硬脂酸钠，一硬脂酸甘油酯，氯化钠，干燥脱脂奶粉，甘油，丙二醇，水，乙醇，等。其它合适的药学载体和它们的制剂描述于E.W.Martin著的″Remington′s Pharmaceutical Sciences″。
如果期望，要施用的药物还可以含有少量没有毒性的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂等，例如，乙酸钠，一月桂酸脱水山梨糖酯，三乙醇胺油酸酯等。
尽管活性成分中的很多是必需的，可以利用口服使用常规日剂量给药方案送递本发明的趋化因子受体调制剂，可以根据期望的预防程度或折磨减轻的程度调整给药方案。对于这样的口服给药，通过掺入通常使用的赋形剂例如药物级甘露糖醇，乳糖，淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，croscarmellose sodium，葡萄糖，明胶，蔗糖，碳酸镁等，制备药学可接受的无毒组合物。这样的组合物的形式是溶液，悬浮液，可分散片剂，丸剂，胶囊，粉末剂，缓释制剂等。口服制剂特别适合肠胃失调的治疗。通过利用改善全身循环吸收的赋形剂能够调节一般全身目的的口服生物利用度，例如含有乙酰化氨基酸的制剂。参见，例如，US 5,935,601和US5,629,020。
组合物可以采取胶囊，丸剂或片剂形式，因此组合物可以含有活性成分，稀释剂例如乳糖，蔗糖，磷酸二钙，等；崩解剂，例如croscarmellose sodium，淀粉或者其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；和粘合剂，例如淀粉，聚乙烯吡咯烷酮，阿拉伯胶，明胶，纤维素及其衍生物，等。
液体药学可施用的组合物可以例如通过将本发明的趋化因子受体调制剂(大约0.5％至大约20％)和任意的药学佐药溶解，分散等在载体中来制备，所述载体是例如水，盐水，葡萄糖水溶液，甘油，甘醇，乙醇，防腐剂等，从而形成溶液或悬浮液。如果期望，要施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，例如湿润剂，悬浮剂，乳化剂，或者增溶剂，pH缓冲剂等，例如，乙酸钠，柠檬酸钠，环糊精衍生物，聚氧乙烯，一月桂酸或硬脂酸脱水山梨糖醇酯等。制备这样的剂量形式的操作方法是已知的，或者对于本领域技术人员是显而易见的；例如，参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pennsylvania。在任何情况下，要施用的组合物或制剂还含有定量的活性成分，其量足以预防或减轻接受治疗的受试者的症状。对于对婴儿口服施用，优选液体制剂(例如糖浆或悬浮液)。
对于在例如碳酸异丙烯酯，植物油或甘油三酯中含有液体，溶液或悬浮液的固体剂量形式，优选制成明胶胶囊。对于液体剂量形式，例如在聚乙二醇中的溶液，可以用足够量的药学可接受液体载体例如水稀释，容易计量给药。
或者，通过将活性成分溶解于或分散于植物油，甘醇，甘油三酯，二醇异丙烯酯(例如碳酸异丙烯酯)等中，并且将这些溶液或悬浮液在硬或软明胶壳中制成胶囊，可以制备液体或半固体口服制剂。
在使用本发明的趋化因子受体调制剂治疗上述症状中，优选肠胃外施用这里描述的活性成分。肠胃外给药一般特征在于注射，或者皮下，或者肌内或者静脉内，并且包括真皮内或腹膜内注射以及胸骨内注射或者输液技术。可注射液可以制备成常规形式，或者是液体溶液或者是悬浮液，适合在注射之前制成溶液或悬浮液的固体形式，作为乳状液或者生物相容性聚合物基础的微球体(例如，脂质体，聚乙二醇衍生物，聚(D，C)交酯等)。合适的赋形剂是例如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，另外，如果期望，要施用的药物组合物还可以含有少量没有毒性的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，增溶剂，蛋白质载体等，例如，乙酸钠，聚氧乙烯，一月桂酸脱水山梨糖酯，三乙醇胺油酸酯，环糊精，血清白蛋白等。
本发明的趋化因子受体调制剂可以肠胃外施用，例如通过将这样的分子溶解于合适的溶剂(例如水或盐水)或者掺入到脂质体制剂中然后分散到可接受的输液用液体中。本发明多肽的典型的日剂量可以通过一次输注给药，或者通过以固定时间间隔的一系列输注给药。对于肠胃外给药，特别适合的有水可溶形式的活性成分水溶液，例如水可溶性盐形式，或者含有增粘物质的含水注射用悬浮液，所述增粘物质例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖，和，如果期望，稳定剂。活性成分，任选地和赋形剂一起，也可以是冻干物形式，并且可以在肠胃外施用之前通过加入合适的溶剂而制备成溶液。
最近发明的肠胃外给药的方法使用了缓慢释放或缓释体系的埋入法，使得保持恒定水平的剂量。参见，例如，US 3,710,795，US5,714,166和US 5,041,292，这里引作参考。
这样的肠胃外用组合物中含有的活性成分百分比高度依赖于其具体性质，以及多肽的活性和受试者的需要。但是，可以使用溶液中活性成分是0.01％至10％的百分比，如果组合物是接着稀释至上述百分比的固体，则更高。优选地，在溶液中组合物含有0.02-8％的活性成分。
施用本发明的趋化因子受体调制剂的另一种方法是利用大丸剂注射和连续输液。当治疗性处理是针对HIV-1感染的预防时，这是特别优选的。
气雾剂给药是直接对呼吸道送递本发明的趋化因子受体调制剂的有效方法。该方法的一些优点是1)它避开了酶促降解作用，肠胃道不好的吸收作用，或者由于肝脏第一次通过作用使得治疗物质的损耗；2)施用除此之外由于它们的分子大小，电荷或者对肺外位点的亲和力而不能到达呼吸道中的目标点的活性成分；3)它提供了通过肺的肺泡快速吸收到体内；和4)避免其它器官系统接触活性成分，在接触可能引起不期望的副作用的情况下这是重要的。因为这些原因，气雾剂给药特别适合治疗哮喘，肺部局部感染，和肺和呼吸道的其它疾病或症状。
有三种类型的药物吸入装置，雾化器吸入器，计量剂量吸入器和干粉吸入器。雾化器吸入器产生高速空气流，其使得趋化因子衍生物(配制成液体形式)象雾一样喷出，雾载着药物进入患者呼吸道。计量剂量吸入器一般具有装有压缩气体的配方，并且在开动时，通过压缩气体放出计量量的多肽，这样提供施用一组量的药物的可靠方法。干粉吸入器施用能够通过仪器在呼吸时分散在呼吸气流中的自由流动的粉末形式的多肽。为了获得自由流动粉末，趋化因子与赋形剂例如乳糖一起配制。计量趋化因子衍生物保存在胶囊形式中，并且每次开动都分配给患者。所有上述方法都可以用于施用本发明。
以脂质体为基础的药物制剂也适合本发明的趋化因子受体调制剂。例如，参见，US 5,631,018，US 5,723,147，和5,766,627。相信脂质体的优点与药物的脂质体包埋得到的组织分布和药物动力学参数的有利变化相关，并且可以由本领域技术人员对本发明的多肽应用。也可以利用用于注射或口服施用的控制释放脂质体液体药物制剂。
对于通过栓剂的全身给药，传统的粘合剂和载体包括例如聚乙二醇或甘油三酯，例如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。这样的栓剂可以从含有大约0.5w/w％至大约10w/w％；优选大约1w/w％至大约2w/w％范围的活性成分的混合物形成。
如上所述，以及进一步如下面的具体实施例详细说明的，发现本发明的趋化因子受体调制剂作为天然存在的趋化因子的拮抗剂的用途。特别地，发现具有作为拮抗剂的提高的效力的本发明的趋化因子受体调制剂在分析和治疗各种病态例如哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，器官移植排异，病毒性疾病，粉瘤/动脉粥样硬化，类风湿性关节炎和器官移植排异的用途。在设计和筛选它们的同类受体的小分子拮抗剂中也可以使用本发明的趋化因子受体调制剂。例如，对结构差异进行工程处理得到本发明的化合物有利于设计、筛选更合理方案和更好的小分子化合物用作治疗涉及趋化因子受体的天然活性的疾病的药物的协调。
实施例给出下面的制备和实施例使得本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。这些实施例不应该被认为是本发明范围的限制，而只是详细说明和代表性例子。
缩写DIEA二异丙基乙胺DMF N，N-二甲基甲酰胺DNP 2，4-二硝基苯基GuHCl 盐酸胍HBTUO-(H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-uronium六氟磷酸盐HF 氟化氢TFA 三氟乙酸Aib 氨基异丁酸Hyp 羟基脯氨酸Tic 1，2，3，4-四氢异喹唑啉-3-COOHIndol 二氢吲哚-2-羧酸P(4，4DiF) 4-二氟-脯氨酸Thz L-噻唑烷-4-羧酸Hop L-高脯氨酸Δpro 3，4-去氢-脯氨酸
F(3，4-DiOH) 3，4二羟基苯基丙氨酸F(3，4-DiOH，pBzl)) pBzl，-3，4二羟基苯基丙氨酸p-Bz 二苯甲酮Cha 环己基丙氨酸BNal 3-(2-萘基)-丙氨酸Chg 环己基-甘氨酸Phg 苯基甘氨酸HoF 高苯丙氨酸F(F)5五氟苯丙氨酸TBuA 叔丁基丙氨酸F(4-Me) 4-甲基苯丙氨酸TL 叔亮氨酸CycP 1-氨基-1-环戊烷羧酸CycH 1-氨基-1-环己烷羧酸Nle 正亮氨酸氨基氧戊烷-RANTE(2-68) AOP-RANTES正-壬酰基-RANTES(2-68) NNY-RANTES实施例1本发明趋化因子受体调制剂的一般合成方法通过固相肽合成制备趋化因子受体调制剂的肽。在来自AppliedBiosystems的常规修饰的430A肽合成仪上进行固相合成，对于一步一步Boc化学链延伸，利用原位中和/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸盐活化方法(Schnolzer，等，Int.J.Peptide Protein Res.(1992)40180-193)。在产生硫代酯的树脂上合成N-末端肽片段。在所研究的位置之前的残基(从C至N末端延长)和操作延长的肽在0.03mmol规模上接触之后裂解树脂。每一次合成循环由用纯TFA处理1-2分钟去除Nα-Boc，1分钟DMF流动冲洗，与1.0mmol预先活化的Boc-氨基酸在过量DIEA存在下偶联10-至20-分钟和第二次DMF流动冲洗组成。在过量DIEA(3mmol)存在下用1mmol HBTU(0.5M，DMF)将Nα-Boc-氨基酸(1.1mmol)预先活化3分钟。每一次人工偶联步骤之后，用水合茚三酮分析评价残留的自由胺(Sarin，等，Anal.Biochem.(1981)117147-157)。在标准-O-CH2苯基乙酰甲基树脂上合成包括氨基酸的C-末端片段。链组装完全之后，将肽去保护并且通过用5％ p-甲酚作为清除剂用无水HF在0℃下处理1小时而从树脂上裂解下来。在所有的情况下，咪唑侧链DNP保护基团残留在His残基上，因为DNP-去除过程与C-末端硫代酯基团不相容。但是在连接反应中硫醇会将DNP逐渐去除，得到去保护His。裂解之后用冰冷却的二乙醚沉淀出两种肽，溶解于含水乙腈中并且冻干。通过使用线性梯度的缓冲液A(H2O/0.1％三氟乙酸)中的缓冲液B(乙腈/10％ H2O/0.1％三氟乙酸)，用来自Waters的C18-柱子通过RP-HPLC来纯化肽，并且在214nm下进行UV检测。使用Platform II仪器(Micromass，Manchester，England)通过电雾化质谱分析样品。利用正常化学连接将肽用于连接产生全长趋化因子多肽链(Dawson，等，Science(1994)266776-779)；Wilken，等，Chem.Biol.(1999)643-51；和Camarero，等.，CurrentProtocols in Protein Science(1999)18.4.1-18.4.21)。根据标准技术在Cys-SH/(Cys-S)2存在下完成多肽链的折叠(Wilken等，Chem.Biol.(1999)643-51)。
实施例2NNY-RANTES，AOP-RANTES，和SDF-1的N-，C-和N-/C-末端类似物的合成和在实施例1中一样制备RANTES(1-68)和SDF-1β(1-72)的类似物，这里加以描述制备CC和CXC趋化因子拮抗剂的一般方法。特别地，N-末端，C-末端和N-/C-末端修饰的RANTES类似物以对趋化因子化合物CH3-(CH2)7-C(O)-RANTES(2-68)，也称作正-壬酰基-RANTES(2-68)或″NNY-RANTES″，和趋化因子化合物CH3-(CH2)4-O-N＝CH-CO-RANTES(2-68)，也称作氨基氧戊烷RANTES或″AOP-RANTES″的修饰为基础。用于该目的的NNY-RANTES，AOP-RANTES和另外的RANTES衍生物分子描述于WO 99/11666，该专利文献在此引作参考。利用和对RANTES类似物相同基础设计方法构建SDF-1的N-，C-和N/C-末端类似物。
对于给出目标趋化因子的N-末端修饰，例如对RANTES的NNY和AOP修饰，如上所述和如WO 99/11666和Wilken等，Chem.Biol.(1999)64351中所述，使用用于连接产生补充的N-末端修饰(例如.，NNY或AOP)的N-末端肽片段树脂上加工，接着裂解/去保护，纯化，并且在正常化学连接中使用没有保护的N-末端修饰的肽α-硫酯连接C-末端肽片段，生成全长产物，来制备化学变体。根据实施例1所述，合成肽，并且在肽合成期间插入氨基酸取代基，包括氨基酸衍生物。利用和实施例1一样的正常化学连接产生线性产物，其中对于RANTES类似物，连接是在Lys31-Cys32位点进行的，对于SDF-1类似物，在Asn33-Cys34位点进行。将等摩尔量的肽片段(2-2.5mM)溶解于6MGuHCl，100mM磷酸盐，pH7.5，1％苄硫醇，和3％苯硫酚。反应通常进行过夜。和上文对于肽片段所述一样纯化和分析得到的多肽产物。对于产生折叠的蛋白质，将纯化的NNY-RANTES类似物的多肽链(大约0.5-1mg/mL)溶解于含有8mM半胱氨酸，1mM胱氨酸和10mM甲硫氨酸的2M GuHCl，100mM Tris，pH8.0中。轻柔搅拌过夜，如上所述通过RP-HPLC来纯化蛋白质溶液。在SDF-1类似物的情况下使用其它折叠条件室温下在空气存在下在0.5mg/mL于1M GuHCl，0.1M Tris，pH8.5下氧化SDF-1和Met0-SDF-1。搅拌过夜之后完成折叠。在相同缓冲液中在2M GuHCl存在下氧化SOP-，己酰基-和NNY SDF-1。
对于脂肪酸与给定折叠蛋白质的化学偶联，包括两个基本步骤。首先，用氨基氧基基团将脂肪酸官能化。其次，在认为对趋化因子活性无关紧要的蛋白质的羧基-末端区特异性引入反应羰基。为此目的，利用C-末端Lys(Ser)Gly序列延伸来合成目的在于C-末端脂肪酸修饰的趋化因子类似物。这样，例如，合成在C-末端包含Lys(Ser)Gly序列延伸的NNY-RANTES(2-68)。通过对折叠蛋白质的NaIO4处理产生反应性羰基，这样使得脂肪酸部分通过稳定的肟键定点连接。
对于脂肪酸官能化，在0.5ml的DMF/DCM混合物(1∶1，v∶v)中用等摩尔量的DCC和HOAt活化0.2mmol脂肪酸(十六烷酸酯，油酸酯，花生四烯酸酯，胆酸酯)，并且加给0.25mmolBoc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的0.5ml DMF溶液，并且用N-乙基吗啉将表观pH调节至pH.8.0。对于胆甾醇衍生物，将0.2mmol氯甲酸胆甾醇酯溶解于0.5ml DCM，并且加给0.25mmol Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2的乙醇化溶液，并且用三乙胺将表观pH调节至pH9.0。保温过夜之后，真空下去除挥发物质，并且通过急骤层析或者通过在C4柱上进行制备HPLC分离产物。通过TFA处理去除Boc基团并且通过ESI-MS验证产物。
对于蛋白质氧化，将目标蛋白质(2mg/mL)溶解于含有6M氯化胍的0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.5，并且加入甲硫氨酸，使得清除剂比蛋白质过量100-倍摩尔。然后加入10-倍过量的高碘酸钠，并且避光下将溶液温育10分钟。通过加入比高碘酸盐1000-倍摩尔过量的乙二醇终止反应，并且在室温下进一步温育溶液15分钟。然后该溶液对0.1％乙酸透析，最后冻干。例如，ESI-MS几乎定量证明C-末端侧链丝氨酸的氧化作用，其中在AOP-RANTES-K(S)G情况下获得8141.1±0.7Da的质量，相应于减少31Da，生成乙醛酰衍生物，没有观察到相应于起始物质量的峰。
在0.1％十二烷基肌氨酸钠，20mM甲硫氨酸和比蛋白质20-倍过量的官能化脂肪酸存在下，在0.1M乙酸钠缓冲液，pH5.3中实现脂肪酸与趋化因子的偶联。在37℃下搅拌16-20小时之后，应用反相HPLC纯化脂肪酸的氨基氧基和趋化因子醛之间形成肟键的偶联物，并且通过ESI-MS表征产物。对于所有的类似物，通过分析HPLC几乎可以定量控制氨基氧基官能化脂肪酸与氧化的蛋白质的偶联。
实施例3NNY-和AOP-RANTES的N-末端类似物对于N-末端RANTES衍生物，对头8个氨基酸残基具有下面的序列-PYSSDTTP-的相应于NNY-RANTES(2-68)或AOP-RANTES(2-68)的头8个氨基酸残基的氨基酸N-末端区中的一个或多个进行修饰。这些相应于图2A-2E给出的68个氨基酸残基野生型RANTES多肽链(即，RANTES(1-68))的氨基酸残基2-9，因为NNY-RANTES(2-68)中的正-壬酰基取代基和AOP-RANTES(2-68)中的氨基氧基戊烷置换了天然存在的RANTES(1-68)的第一个残基(Ser)。例如，下面通式化合物″NNYP2X-RANTES(3-68)″代表氨基酸位置2处NNY-RANTES(2-68)中的取代，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的位置2处取代脯氨酸(P)的氨基酸，并且RANTES(3-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余66个氨基酸，以N-至C-末端方向阅读。举另外一个例子，通式化合物″NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)″代表氨基酸位置3处NNY-RANTES(268)中的取代，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的位置3处取代酪氨酸(Y)的氨基酸，并且RANTES(4-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余65个氨基酸，以N-至C-末端方向阅读。对于多取代的NNY-RANTES类似物，通式化合物″NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)″代表在NNY-RANTES(2-68)中在氨基酸位置2，3和9处三处取代的下面的化合物结构式的例子，其中NNY是正-壬酰基，X是在NNY-RANTES(2-68)的2位取代脯氨酸(P)，在3位取代酪氨酸(Y)，在9位取代脯氨酸(P)的相同或不同的氨基酸，SSDTT相应于NNY-RANTES(2-68)的氨基酸4-8，并且RANTES(10-68)代表NNY-RANTES(2-68)的其余59个氨基酸，以N-至C-末端方向阅读。下面是制备的NNY-P2X-RANTES(3-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-P2Aib-RANTES(3-68) 1NNY-P2Hyp-RANTES(3-68) 2NNY-P2Tic-RANTES(3-68) 3NNY-P2Indol-RANTES(3-68) 4NNY-P2P(4，4DiF)-RANTES(3-68) 5NNY-P2Thz-RANTES(3-68) 6NNY-P2HoP-RANTES(3-68) 7NNY-P2ΔPro-RANTES(3-68) 8NNY-P2A-RANTES(3-68) 9下面是制备的NNY-P-Y3X-RANTES(4-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-P-Y3P-RANTES(4-68) 10NNY-P-Y3A-RANTES(4-68) 11NNY-P-Y3L-RANTES(4-68) 12NNY-P-Y3V-RANTES(4-68) 13NNY-P-Y3F(3，4-DiOH)-RANTES(4-68) 14NNY-P-Y3F(3，4-DiOH，pBzl)-RANTES(4-68)15NNY-P-Y3pBz-RANTES(4-68) 16NNY-P-Y3Cha-RANTES(4-68) 17NNY-P-Y3β Nal-RANTES(4-68)18NNY-P-Y3Chg-RNATES(4-68) 19NNY-P-Y3Phg-RANTES(4-68) 20
NNY-P-Y3Hof-RANTES(4-68)21NNY P-Y3F(F)5-RANTES(4-68) 22NNY-P-Y3tbuA-RANTES(4-68) 23NNY-P-Y3F(4-Me)-RANTES(4-68)24NNY-P-Y3tL-RANTES(4-68) 25NNY-P-Y3CycP-RANTES(4-68) 26NNY-P-Y3CycH-RANTES(4-68) 27NNY-P-Y3Nle-RANTES(4-68)28下面是制备的NNY-PY-S4X-RANTES(5-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-PY-S4A-RANTES(5-68) 29NNY-PY-S4tbuA-RANTES(5-68) 30下面是制备的NNY-PYS-S5X-RANTES(6-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-PYS-S5tbuA-RANTES(6-68) 31下面是制备的NNY-PYSS-D6X-RANTES(7-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-PYSS-D6tbuA-RANTES(7-68)32下面是制备的NNY-PYSSD-T7X-RANTES(8-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-PYSSD-T7tbuA-RANTES(8-68) 33下面是制备的NNY-PYSSDT-T8X-RANTES(9-68)类似物的例子。
化合物序号NNY-PYSSDT-T8tBuA-RANTES(9-68) 34下面是制备的NNY PYSSDTT-P9X-RANTES类似物的例子。
化合物序号
NNY-PYSSDTT-P9Hyp-RANTES(10-68)35NNY-PYSSDTT-P9Aib-RANTES(10-68)36NNY-PYSSDTT-P9ΔPro-RANTES(10-68) 37NNY-PYSSDTT-P9Thz-RANTES(10-68)38下面是制备的二取代类似物NNY-P2X-Y3X-RANTES(4-68)，和三取代类似物NNY P2X-Y3X-SSDTT-P9X-RANTES(10-68)的例子。
化合物序号NNY-P2Hyp-Y3tButA-RANTES(4-68) 39NNY-P2Thz-Y3tButA-RANTES(4-68) 40NNY-P2Hyp-Y3Chg-RANTES(4-68) 41NNY-P2Thz-Y3Chg-RANTES(4-68) 42NNY-P2Thz-Y3Chg-SSDTT-P9Aib-RANTES(10-68) 43实施例4NNY-RANTES的N-末端，N-环类似物下面的化合物是为了详细说明另外的NNY取代的-RANTES类似物，其中修饰N-环(RANTES的残基12-20)以提高对CCR5的效力而不影响通过CCR1和CCR3的信号传导。
对于N-末端，N-环RANTES类似物，对NNY-RANTES(2-68)进行N-末端修饰，其中N-环相应于氨基酸12-20。RANTES的N-环具有氨基酸序列-FAYIARPLP-(SEQ ID NO.2)。例如，NNY-RANTES(2-68)中氨基酸位置12处的取代具有化合物通式″NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68)″，其中NNY是正-壬酰基，PYSSDTTPCC相应于RANTES(1-68)的氨基酸2-11，F12pBz指氨基酸衍生物在RANTES(1-68)的位置12处取代苯丙氨酸(F)，并且RANTES(13-68)代表RANTES(1-68)的其余氨基酸残基13-68，自N-向C-末端方向阅读。
化合物序号NNY-PYSSDTTPCC-F12pBz-RANTES(13-68) 44NNY-PYSSDTTPCC-F12Y-RANTES(13-68) 45NNY-PYSSDTTPCC-F12F(4-Me)-RANTES(13-68) 46NNY-PYSSDTTPCC-F12(4-F)-RANTES(13-68) 47NNY-PYSSDTTPCCF-A13R-RANTES(14-68)48
NNY-PYSSDTTPCCF-A13S-RANTES(14-68) 49NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14F-RANTES(15-68) 50NNY-PYSSDTTPCCFA-Y14Cha-RANTES(15-68) 51NNY-PYSSDTTPCCFAY-I15tBuA-RANTES(16-68) 52NNY-PYSSDTTPCCFAY-I1SS-RANTES(16-68)53NNY-PYSSDTTPCCFAYI-A16S-RANTES(17-68) 54NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17A-RANTES(18-68) 55NNY-PYSSDTTPCCFAYA-R17H-RANTES(18-68) 56NNY-PYSSDTTPCCFAYAR-P18Thz-RANTES(19-68)57NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19I-RANTES(20-68) 58NNY-PYSSDTTPCCFAYARP-L19Cha-RANTES(20-68) 59NNY-PYSSDTTPCCFAYARPL-P20Thz-RANTES(21-68) 60实施例5NNY-RANTES的N-末端RANTES类似物下面的实施例是为了详细说明另外的NNY-取代的-RANTES类似物，其中在NNY取代基处使用不同的疏水性脂肪链。
化合物序号CH2＝CH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-RANTES(2-68) 61Nle-Met-RANTES(1-68) 62化合物序号十二烷酰基-RANTES(3-68) 63月桂酰基-Hyp-RANTES(3-68)64化合物序号十四酰基-RANTES(4-68)65十二酰基-Hyp-RANTES(4-68)66实施例6NNY和AOP-RANTES的C-末端和N/C-末端类似物制备带有丝氨酸残基酰化的Lys的ε氨基的具有Lys-Gly C-末端延伸的AOP-和NNY-RANTES。高碘酸盐氧化丝氨酸延伸之后，这些衍生物偶联包括荧光团(FITC，NBD，Cy-5和BODIPY-F1)或者脂质的氨基氧酰基官能化化合物。已经证明保留了它们的生物学活性并且导入象CH3-(CH2)14-CONH-(CH2)2-NHCO-CH2-O-NH2这样的脂肪部分的这些C-末端标记的趋化因子提高趋化因子的效力。为了发现最有效的化合物，通过偶联Boc-AoA-NH-(CH2)2-NH2，接着Boc去除月桂酸根，棕榈酸根，油酸根，花生酸根，胆酸根，和氯甲酸胆甾醇酯，用氨基氧基将不同的脂肪酸和脂质官能化。这些衍生物的一种或多种偶联氧化的NNY-RANTES-K(S)G或AOP-RANTES-K(S)G，其中AOP类似物举例如下化合物序号AOP-RANTES-K(月桂酰基)-G 67其中″(月桂酰基)″是乙醛酰＝AoA-乙二胺月桂酸酯的缩写，依此类推AOP-RANTES-K(棕榈酰)-G 68AOP-RANTES-K(二十烷酰)-G 69AOP-RANTES-K(油酰)-G 70AOP-RANTES-K(胆酰)-G 71AOP-RANTES-K(胆甾醇基)-G 72也通过其它策略制备脂质部分的化学变体。通过使脂肪酸与Fmoc-去保护的Boc-肽-Lys-Gly-树脂连接，然后裂解，纯化并且用于化学连接，产生全长多肽，通过C-末端片段树脂上合成，合成了这样的化合物。
在设计这些化合物中，使用脂质偶联有两个主要的原因。首先，现在有越来越多的证据证明RANTES化合物的抗HIV-1抑制活性与下调受体的能力有关。这意味着，一旦内在化，正常情况下在早期核内体中与受体的再循环相关的配体-受体复合体也应该与浆膜或者某些胞质脂肪酸结合蛋白相互作用。因此，简单通过相互作用，配体的脂质修饰可以将复合体定向具体的胞内亚区，从而延迟受体的再循环。几篇与胞内蛋白运输有关的最新文章支持这样的观点酰化作用是提高蛋白质对去污剂抗性膜的亲合力的共同机理，并且可能是没有跨膜的蛋白质的主要定向机理(参见，例如，Melkonian等，J Biol.Chem.(1999)2743910-3917；Zlatkine等，J.Cell Sci.(1997)110673-679；Zhan等，Cancer Immunol.Immunother.(1998)4655-60)。其次，也可以进行修饰来改变化合物的药物动力学性质。几篇最近的文章支持该概念(参见，例如，Honeycutt等，Pharm.Res.(1996)131373-1377；Kurtzhals等，J.Pharm.Sci.(1997)861365-1368；Marlcussen等，Diabetologia(1996)39281-288)。
如下面实施例中证明的，活性的提高是令人惊奇和出人意料的，因为修饰是要改变药物动力学。所预期的结果是活性降低而又希望药物动力学改进是不能给出可接受的折中方案的。
实施例7SDF-1的N-末端类似物制备下面的N-末端SDF-1(1-72)衍生物来详细说明制备CXC趋化因子受体调制剂的一般方法。举例来说，修饰SDF-1的N-末端，产生N-末端带有脂肪链的化合物。根据上文对于RANTES化合物所描述的，制备在N-末端区还包括氨基酸衍生物，和/或在C-末端区有脂肪链的化合物。特别地，制备合适的N-末端取代基并且检测，具体来说包括但不限于Lys，Met-Lys，己酰基-Lys，CH3-(CH2)7-C(O)和CH3-(CH2)4-O-NH-乙醛酰。下面的化合物是一些制备的SDF-1类似物的例子。
化合物序号Lys-SDF-1(2-72) 73Met-Lys-SDF-1(2-72) 74己酰基-Lys-SDF-1(2-72)75NNY-SDF-1(2-72) 76AOP-乙醛酰-SDF-1(2-72)77实施例8筛选分析利用HIV-基础测试表征针对发现RANTES和SDF-1用途的该特定指征的阻断功能，对实施例3-7中制备的几种RANTES和SDF类似物和其它化合物筛选拮抗剂活性。一般来说，化合物通过筛选它们抑制HIV膜-介导的细胞融合的能力的初步筛选。接着对这些化合物中最有希望的化合物测定它们抑制靶细胞系无细胞病毒感染的能力。选择这些测试，因为根据在SCID小鼠模型中测得细胞融合测试和体外无细胞病毒感染测试是体内潜力的有用指征(Mosier等，J.Virol.(1999)733544-3550)。此外，因为发现NNY-RANTES相对于AOP-RANTES的抗病毒效力的提高是由于除对于CCR5亲合力提高之外的因素，对化合物评价在细胞融合测试中的活性，而不是对于CCR5的亲合力。
实施例9膜-介导的细胞融合测试使用经工程处理使病毒膜蛋白与携带CD4和CCR5并且包含报道基因受体系统的细胞融合的细胞测定给定一组实施例3-7的化合物抑制CCR5-依赖性细胞融合的能力。基本上根据Simmons等(Science(1997)276276-279)所述，使用细胞系HeLa-PSL和HeLa-Env-ADA，进行CCR5-回归线病毒膜-介导的细胞融合测试，所述两种细胞系均由M.Alizon(巴黎)实验室友情提供。简要地说，将HeLa-PSL细胞接种于96-孔板中(每孔100微升104个细胞)。24小时之后去除培养基并且对每孔加入含有104HeLa-Env-ADA细胞加趋化因子(200微升终体积)。又过24小时之后，用PBS将细胞清洗一次并且溶解于室温的50微升PBS/0.5％ NP-40中15分钟。通过加入50微升2XCPRG底物(16mM氯代苯酚红-p-D-吡喃半乳糖苷；120mM Na2HPO4，80mMNaH2PO4，20mM KCl，20mM MgSO4，和10mM β-巯基乙醇)，接着在室温下避光温育1-2小时，对溶胞产物测定对p-半乳糖苷酶的活性。然后在Labsystems微量板读数器上读取575nm下的吸收度。根据这些数值，计算各抑制剂浓度下抑制百分率[100×(OD(试验)-OD(负对照))/OD(正对照)-OD(负对照))]。从融合抑制百分率对抑制剂浓度的图可以计算各化合物的IC50值。
有统计学意义的是，被测化合物中的大多数表现出相对于野生型RANTES更大的效力。下面的表1给出了选择的RANTES拮抗剂类似物的结果。
表1细胞融合筛选N-末端修饰的NNY-RANTES化合物序号平均相对效力19 723 740 442 2NNY-RANTES(对照) 18-25N-环修饰的NNY-RANTES化合物序号平均相对效力5415571558135914NNY-RANTES(对照) 18-25C-末端修饰的AOP-RANTES化合物序号平均相对效力6845AOP-RANTES(对照)100在表1中，对于平均相对效力，融合测定中IC50的绝对值根据不同天数进行的实验而不同，但是活性的排列次序保持不变。为了将结果规格化，各项实验中使用AOP-RANTES作为对照物。这样，相对于AOP-RANTES表示各项实验中的IC50，AOP-RANTES给出100的任意值。尽管试验的化合物中大多数表现出相对于野生型RANTES更大的效力，但是某些化合物例如序号是19，23，40和42的化合物的效力是即使是系列中最低稀释度下仍然获得大于50％的抑制作用。
实施例10无细胞病毒感染测试以和膜-介导的细胞融合测试相同的方法进行无细胞病毒感染测试，除了在这种情况下用肝R5-回归线病毒代替膜细胞系。HEK293-CCR5细胞(7，T.Schwartz，Copenhagen友情提供)接种于24孔板(1.2×105细胞/孔well)。温育过夜之后，使用12pM[125I]MIP-1-α(Amersham)加0.5ml的结合缓冲液(50mM HEPES，pH7.4，补加了1mM CaCl2，5mM MgCl2，和0.5％(w/v)牛血清白蛋白)中不同量的未标记配体，在4℃下对全部细胞进行竞争结合3小时。温育之后，在补加有0.5M NaCl的冰冷却结合缓冲液中将细胞快速洗涤四次。细胞溶解于1毫升的3M乙酸，8M脲和2％NP-40中。使用贝克曼γ4000闪烁计数器对溶解材料计数1分钟。测定两次，并且应用Prism软件从相吻合的单相浓度抑制曲线得出IC50值。表2说明了超过序号是19和23的化合物初步筛选所示的NNY-RANTES的效力的提高。
表2对于从无细胞病毒感染测试筛选化合物的体外感染数据
实施例11与抗-CCR5和抗-CXCR4化合物结合治疗下面的实施例详细说明使用抗-CCR5(例如.，NNY-RANTES)和抗-CXCR4(例如，SDF-1拮抗剂或AMD 3100)结合用于阻断HIV感染，并且阻断HIV的R5毒株向X4毒株潜在的转化的保护作用。使用SCID小鼠模型用于该目的。特别地，根据Mosier，Adv.Immunol.(1996)6379-125；Picchio，等，J Virol.(1997)717124-7127；Picchio，等，J.Virol.(1998)722002-2009；和Offord等，WO 99/11666中描述的方法，对SCID小鼠测定NNY-RANTES和AMD 3100(小有机分子抗-X4试剂)的保护作用，重新注入人外周血白细胞，并且用HIV-1攻击。根据表X施用NNY-RANTES，以200mg/ml溶液使用AMD 3100。用R5 HIV病毒攻击，除了单独使用AMD 3100族。在结合治疗中发现没有避开突变体，实验自始至终，所有的适当接受处理的小鼠没有病毒。这表明本发明的N-，C-和N-/C-末端RANTES衍生物可以与抗-X4毒株化合物例如AMD 3100或SDF-1拮抗剂结合使用，例如这里描述的那些，用于阻断哺乳动物HIV感染。
本说明书中提到的所有的出版物和专利申请在这里引作参考，其引用程度就好象各出版物或专利申请具体地并且各个指明地引作参考一样。
现在完全描述了本发明，对本领域技术人员来说，不脱离后面的权利要求书的精神或范围对其进行很多变化和修饰是显而易见的。
序列表<110>Gryphon Sciences<120>趋化因子受体调制剂，制备和用途<130>03504.271<140><141><150>60/217,683<151>2000-07-12<160>28<170>专利版本2.1<210>1<211>92<212>PRT<213>人<400>1Gly Ser Glu Val Ser Asp Lys Arg Thr Cys Val Ser Leu Thr Thr Gln1 5 10 15Arg Leu Pro Val Ser Arg Ile Lys Thr Tyr Thr Ile Thr Glu Gly Ser20 25 30Leu Arg Ala Val Ile Phe Ile Thr Lys Arg Gly Leu Lys Val Cys Ala35 40 45Asp Pro Gln Ala Thr Trp Val Arg Asp Val Val Arg Ser Met Asp Arg50 55 60Lys Ser Asn Thr Arg Asn Asn Met Ile Gln Thr Lys Pro Thr Gly Thr65 70 75 80Gln Gln Ser Thr Asn Thr Ala Val Thr Leu Thr Gly85 90<210>2<211>68<212>PRT<213>人<400>2Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala1 5 10 15Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln35 40 45Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser50 55 60Leu Glu Met Ser65<210>3<211>74<212>PRT<213>人<400>3Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg1 5 10 15Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly20 25 30Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp35 40 45Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr50 55 60Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys Pro65 70<210>4<211>73<212>PRT<213>人<400>4Lys Ser Met Gln Val Pro Phe Ser Arg Cys Cys Phe Ser Phe Ala Glu1 5 10 15Gln Glu Ile Pro Leu Arg Ala Ile Leu Cys Tyr Arg Asn Thr Ser Ser20 25 30Ile Cys Ser Asn Glu Gly Leu Ile Phe Lys Leu Lys Arg Gly Lys Glu35 40 45Ala Cys Ala Leu Asp Thr Val Gly Trp Val Gln Arg His Arg Lys Met50 55 60Leu Arg His Cys Pro Ser Lys Arg Lys65 70<210>5<211>76<212>PRT<213>人<400>5Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr1 5 10 15Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met50 55 60Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr65 70 75<210>6<211>76<212>PRT<213>人<400>6Gln Pro Val Gly Ile Asn Thr Ser Thr Thr Cys Cys Tyr Arg Phe Ile1 5 10 15Asn Lys Lys Ile Pro Lys Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Arg Arg Thr Thr20 25 30Ser Ser His Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Lys Thr Lys Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Thr Gln Lys Trp Val Gln Asp Phe Met50 55 60Lys His Leu Asp Lys Lys Thr Gln Thr Pro Lys Leu65 70 75<210>7<211>82<212>PRT<213>人<400>7Gly Pro Asp Ala Val Ser Thr Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Val Val1 5 10 15Lys Gln Lys Ile His Val Arg Lys Leu Lys Ser Tyr Arg Arg Ile Thr20 25 30Ser Ser Gln Cys Pro Arg Glu Ala Val Ile Phe Arg Thr Ile Leu Asp35 40 45Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Glu Lys Trp Val Lys Asn Ser Ile50 55 60Asn His Leu Asp Lys Thr Ser Gln Thr Phe Ile Leu Glu Pro Ser Cys65 70 75 80Leu Gly<210>8<211>70<212>PRT<213>人<400>8Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr Phe Glu Thr Ser20 25 30Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Arg Ser Arg35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser50 55 60Asp Leu Glu Leu Ser Ala65 70<210>9<211>69<212>PRT<213>人<400>9Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr1 5 10 15Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser20 25 30Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys35 40 45Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr50 55 60Asp Leu Glu Leu Asn65<210>10<211>70<212>PRT<213>人<400>10Ala Ser Asn Phe Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His1 5 10 15Pro Lys Phe Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys20 25 30Asp Ile Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys35 40 45Ala Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser50 55 60Lys Lys Val Lys Asn Met65 70<210>11<211>77<212>PRT<213>人<400>11Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro1 5 10 15Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp20 25 30Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln35 40 45Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg50 55 60Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg Ser Ser65 70 75<210>12<211>74<212>PRT<213>人<400>12Gly Asp Thr Leu Gly Ala Ser Trp His Arg Pro Asp Lys Cys Cys Leu1 5 10 15Gly Tyr Gln Lys Arg Pro Leu Pro Gln Val Leu Leu Ser Ser Trp Tyr20 25 30Pro Thr Ser Gln Leu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys35 40 45Arg Gly Arg Gln Val Cys Ala Asp Lys Ser Lys Asp Trp Val Lys Lys50 55 60Leu Met Gln Gln Leu Pro Val Thr Ala Arg65 70<210>13<211>99<212>PRT<213>人<400>13Arg Val Thr Lys Asp Ala Glu Thr Glu Phe Met Met Ser Lys Leu Pro1 5 10 15Leu Glu Asn Pro Val Leu Leu Asp Arg Phe His Ala Thr Ser Ala Asp20 25 30Cys Cys Ile Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ile Pro Cys Ser Leu Leu Glu35 40 45Ser Tyr Phe Glu Thr Asn Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe50 55 60Leu Thr Lys Lys Gly Arg Arg Phe Cys Ala Asn Pro Ser Asp Lys Gln65 70 75 80Val Gln Val Cys Met Arg Met Leu Lys Leu Asp Thr Arg 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His Arg Leu35 40 45Phe Cys Ala Asp Pro Lys Glu Gln Trp Val Lys Asp Ala Met Gln His50 55 60Leu Asp Arg Gln Ala Ala Ala Leu Thr Arg Asn Gly65 70 7权利要求
1.一种包括在其N-末端修饰有脂肪链和一种或多种氨基酸衍生物的趋化因子多肽链的趋化因子受体调制剂。
2.权利要求1的趋化因子受体调制剂，其中所述趋化因子多肽链包括与天然存在的野生型趋化因子的氨基酸序列基本上同源的氨基酸序列。
3.权利要求2的趋化因子受体调制剂，其中所述天然存在的野生型趋化因子是CC趋化因子。
4.权利要求2的趋化因子受体调制剂，其中所述天然存在的野生型趋化因子是CXC趋化因子。
5.权利要求1的趋化因子受体调制剂，其中所述N-末端包括是所述趋化因子多肽链的第一个二硫键形成半胱氨酸的N-末端的所述趋化因子多肽链的氨基酸。
6.权利要求1的趋化因子受体调制剂，其中所述脂肪链是包括5-26个碳原子的烃链。
7.权利要求1的趋化因子受体调制剂，其中所述氨基酸衍生物具有式-(N-CnR-CO)-，其中n是1-22，R是氢原子，烷基或芳基，并且其中N和Cn，N和R，或者Cn和R能形成环结构。
8.一种包括在其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链的趋化因子受体调制剂。
9.权利要求8的趋化因子受体调制剂，其中所述脂肪链包括5-22个碳原子。
10.权利要求9的趋化因子受体调制剂，其中所述脂肪链或多元环是脂质。
12.一种包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链的趋化因子受体调制剂。
13.一种含有趋化因子受体调制剂或者其药学可接受盐的药物组合物，其中所述趋化因子受体调制剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物的趋化因子多肽链。
14.权利要求13的药物组合物，其中所述组合物是与一种或多种药学可接受赋形剂相混合的。
15.一种含有趋化因子受体调制剂或者其药学可接受盐的药物组合物，其中所述趋化因子受体调制剂包括在其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链。
16.一种包括权利要求15的趋化因子受体调制剂或者其药学可接受盐的药物组合物。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述组合物是与一种或多种药学可接受赋形剂相混合的。
18.一种含有趋化因子受体调制剂或者其药学可接受盐的药物组合物，其中所述趋化因子受体调制剂包括在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环的趋化因子多肽链。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述组合物是与一种或多种药学可接受赋形剂相混合的。
20.一种治疗通过用趋化因子受体调制剂治疗而减轻的哺乳动物疾病症状的方法，该方法包括对需要这样治疗的哺乳动物施用治疗有效量的趋化因子受体调制剂，其中所述趋化因子受体调制剂包括下面的趋化因子多肽链(A)在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，(B)在其C-末端修饰有脂肪链或多元环，或者(C)在其N-末端修饰有脂肪链和一个或多个氨基酸衍生物，并且其C-末端修饰有脂肪链或多元环。
21.权利要求20的方法，其中所述疾病症状是炎症。
22.权利要求20的方法，其中所述炎症是哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，，粉瘤，动脉粥样硬化，或类风湿性关节炎。
23.权利要求20的方法，其中所述疾病症状是HIV引起的或者与HIV相关。
全文摘要
本发明公开了包括为了调制效力和药物动力学性质而化学修饰的羧基－末端(C－末端)和/或氨基－末端(N－末端)的趋化因子受体调制剂，其制备方法和用途。通过CC和CXC趋化因子新的N－末端，C－末端和N－/C－末端类似物举例说明了本发明的化合物和方法。本发明的趋化因子受体调制剂类似物用于治疗涉及本发明的类似物所拮抗的天然存在的趋化因子的疾病，例如治疗HIV和AIDS相关疾病和治疗哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，粉瘤/动脉粥样硬化，器官移植排异，和类风湿性关节炎。
文档编号C07K19/00GK1441808SQ01812629
公开日2003年9月10日 申请日期2001年7月12日 优先权日2000年7月12日
发明者R·奥福德, H·盖尔特纳, O·哈特利 申请人:格莱风治疗公司