专利名称：枯草菌表面活性剂的生产方法
相关申请的相互参照本申请是基于35 U.S.C.第111(a)节的规定提交的申请，并依据35U.S.C.第119(e)(1)节，要求在2000年12月29日根据35 U.S.C.第111(b)节的规定提交的美国临时申请60/258,560的申请日的权利。
枯草菌表面活性剂易于生物降解，而且在10ppm或以下的低浓度时有降低表面张力的活性，因此，枯草菌表面活性剂作为优良的表面活性剂一直受到关注。关于生产枯草菌表面活性剂的方法，已知有下面的方法。例如，K.Arima等公开了用枯草芽孢杆菌株ATCC 21331或ATCC 21332生产枯草菌表面活性剂的方法(参见，美国专利3,687,926和Biochem.Bioph.Res.Commun.，31，488-494(1968))，而且说明根据这个方法，通过培养24小时可在培养基中积累从0.05到0.1g/L的枯草菌表面活性剂。
因为对于工业应用，这样的生产率是低的，故大量的发明人努力尝试以改进生产率。Cooper等公开了生产枯草菌表面活性剂并同时不断地除去枯草芽孢杆菌ATCC 21332培养过程中产生的泡沫的方法(参见，Appl.Environ.Microbiol.，42，408-412(1981))。根据这个方法，枯草菌表面活性剂的产量是0.7到0.8g/L。
Sheppard等公开了在含有水解泥炭的培养基中生长枯草芽孢杆菌的方法，而且由此取得了0.16g/L的产量(参见，Appl.Microbiol.Biotechnol.，27，110-116(1987))。Mulligan等公开了通过使用突变的枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332提高枯草菌表面活性剂产量的方法(参见，Appl.Microbiol.Biotech.，31，486-489(1989))。根据这个方法，培养40个小时后，枯草菌表面活性剂的产量是0.562g/L。
Okuda等公开了通过在磁场中培养枯草芽孢杆菌增加枯草菌表面活性剂产量的方法(参见，JP-A-6-121668(用在这里的术语“JP-A”意思是“未经过审查的公开的日本专利申请”))。Wei等公开了通过培养枯草芽孢杆菌菌株ATCC 21332，同时添加高浓度铁来增加枯草菌表面活性剂产量的方法(参见，Enz.Microbial Technol.，22，724-728(1998))，这个方法中枯草菌表面活性剂的产量是3.5g/L。
Carrera等公开了枯草芽孢杆菌ATCC 21332的突变株枯草芽孢杆菌ATCC 55033有产生浓度为2.0到4.0g/L的枯草菌表面活性剂的活性(参见，日本专利号3030789，美国专利号5227294)。Kim等公开，在用葡萄糖做为碳源和NH4HCO3做为氮源并限制氧的条件下培养枯草芽孢杆菌C9可生产浓度为7.0g/L的枯草菌表面活性剂(参见，J.Ferment.Bioeng.，84，41-46(1997))。
然而，这些改进对于枯草菌表面活性剂的工业应用是不够的。需要具有更高生产率的株系和能进一步提高生产率的生产方法。
为了克服上述问题，本发明人对各种培养基成分进行了广泛的调查研究。结果发现，当在含有豆粉，如大豆粉或其提取物做为氮源的培养基中培养生产枯草菌表面活性剂的芽孢杆菌属微生物时，在肉汤培养物中枯草菌表面活性剂以高浓度积累，而且因为在枯草菌表面活性剂产生期间这个方法阻止了过多泡沫的产生故不需要采取除去泡沫的手段。而且，还发现当修饰生产枯草菌表面活性剂的芽孢杆菌属微生物，而且在培养基中培养修饰的微生物时，可以在肉汤培养物中以高浓度积累枯草菌表面活性剂。根据这些发现完成了本发明。
更具体地，本发明涉及下面[1]到[20]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，及下面[21]到[26]所述的芽孢杆菌属微生物。生产枯草菌表面活性剂的方法，包括在含有豆粉或其提取物的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物，及在肉汤培养物中积累枯草菌表面活性剂。如[1]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中所述的豆选自大豆，赤豆，豌豆，蚕豆，鹰咀豆，小扁豆，有筋的青刀豆。如[2]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中所述的豆是大豆。如上述[1]-[3]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中在含有酵母提取物的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物。如上述[1]-[4]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，包括步骤在进一步含有可分解代谢的碳源，可分解代谢的氮源和无机盐的液体培养基中，在有氧条件和pH6-9，温度25-42℃下培养芽孢杆菌属微生物，在肉汤培养物中积累枯草菌表面活性剂，且不从发酵罐中除去产生的泡沫，和从获得的肉汤培养物中分离和纯化枯草菌表面活性剂。如上述[1]-[5]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中在肉汤培养物中积累8到50g/L浓度的枯草菌表面活性剂。如上述[1]-[6]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中芽孢杆菌属微生物是枯草芽孢杆菌。如上述[7]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。如上述[1]-[8]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中培养液中豆粉或其提取物的浓度是0.5到20w/w％(重量/重量％)。如上述[5]-[9]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的碳源是选自葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水解淀粉，糖蜜，马铃薯提取物，麦芽，泥炭，植物油，玉米浆，果糖，糖浆，糖，液态糖，转化糖，醇，有机酸，有机酸盐和烷烃的一种或多种成分。如上述[10]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的碳源是葡萄糖或麦芽糖。如上述[5]-[11]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的氮源是铵盐或无机或有机氮。如上述[12]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中铵盐是硝酸铵，硫酸铵，氯化铵，醋酸铵，碳酸铵或碳酸氢铵。如上述[12]或[13]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中无机或有机氮是选自氨，硝酸钠，硝酸钾，谷氨酸钠，尿素，蛋白胨，肉膏，玉米浆，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物的一种或多种成分。如上述[5]-[14]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中包含在无机盐中的阳离子是钾离子，钠离子，镁离子，铁离子，锰离子，钙离子，锌离子，钴离子，镍离子，铜离子或钼离子，阴离子是磷酸根离子，硫酸根离子，氯离子或硝酸根离子。如上述[1]-[15]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中在培养基中含有氨基酸和/或维生素。如上述[16]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中氨基酸是选自L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-组氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-精氨酸，L-赖氨酸，D-缬氨酸和D-异亮氨酸的一个或多个成分。如上述[16]或[17]所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中维生素是选自生物素，硫胺素，核黄素，吡哆醇，烟酸，烟酰胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，胆碱，叶酸，钴胺素和氰钴胺素的一个或多个成分。如上述[4]-[18]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中pH是6.9到7.5。如上述[4]-[19]任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中温度是30℃到37℃。芽孢杆菌属微生物，其具有在培养20到90小时后产生浓度为8到50g/L的粗枯草菌表面活性剂的活性。如上述[21]所述的芽孢杆菌属微生物，其在含有豆粉或其提取物的液体培养基中培养20到90小时后，有产生浓度为8到50g/L的枯草菌表面活性剂的活性。如上述[22]所述的芽孢杆菌属微生物，其中所述的豆是大豆。如上述[21]-[23]任一项所述的芽孢杆菌属微生物，其是枯草芽孢杆菌。如上述[24]所述的芽孢杆菌属微生物，其中枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。发明详述下面将详述本发明。
根据本发明，通过向培养基中添加豆粉，如大豆粉或其提取物作为氮源培养生产枯草菌表面活性剂的微生物，可以在肉汤培养物中积累高浓度的枯草菌表面活性剂。
根据本发明人的知识，在含有豆粉或其提取物做为氮源的培养基中培养芽孢杆菌属微生物对本领域技术人员是常规已知的，然而，在含有豆粉或其提取物做为氮源的培养基中培养生产枯草菌表面活性剂的微生物并在肉汤培养物中高浓度地积累枯草菌表面活性剂的生产方法是未知的，而且是本发明人新发现的。
用在本发明中的豆类包括大豆，小豆(赤豆)，豌豆，蚕豆，鹰咀豆，小扁豆和有筋的青刀豆。可以单独或联合使用它们。在这些豆类中，优选大豆。
不特别限定用在本发明中的芽孢杆菌属微生物，只要它能生产枯草菌表面活性剂即可，然而，例如，本发明人修饰的枯草芽孢杆菌SD901是适宜的。
这个株系是一种新的枯草芽孢杆菌突变株系，其特征在于具有以高浓度积累枯草菌表面活性剂的活性。这个株系与现有株系的区别在于其有极其高的枯草菌表面活性剂生产率，故将这个株系定为新的枯草芽孢杆菌株系是合适的。这个新的株系命名为枯草芽孢杆菌SD901，在2000年8月7日保藏在日本国际工业贸易部工业科学技术研究所生物工程工业技术实验室(Bioengineering Industrial Technology Laboratory，Institute ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry)，保藏号为FERM P-17989 ；而且在2001年7月16日转为国际保藏，国际保藏号FERM BP7666，保藏地址是国际专利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary)，国立现代工业科学技术研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566日本。
因此，枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)本身是本发明的一个主题。本发明包括来源于该株系并与该株系在具有极高枯草菌表面活性剂生产率方面有相同性质的突变株系。
而且，在培养20到90个小时后有生产8到50g/L粗枯草菌表面活性剂的活性的芽孢杆菌属微生物也是本发明的主题。
更具体地描述本发明，本发明枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)来源于枯草芽孢杆菌MI113(pC115)，枯草芽孢杆菌MI113(pC115)是枯草芽孢杆菌MI113(枯草芽孢杆菌Marburg 168株系的突变株系)的转化体。
在Nakayama等的公开文献中描述了枯草芽孢杆菌MI113(pC115)。(参见，Appl.Microbio Biotechnol.，48，80-82(1997))。Huang等公开描述了质粒pC115。(参见，J.Ferment.Bioeng.，76，6，445-450(1993))。在质粒pC115中参与枯草菌表面活性剂生产的基因lpa-14与来源于枯草芽孢杆菌的质粒pNS1981连接形成质粒，由此转化枯草芽孢杆菌MI113。在Hiraoka等的公开文献中描述了lpa-14。(参见，J.Ferment.Bioeng.，74，5，323-326(1992))。在Shishido等的公开文献中描述了质粒pNS1981。(参见，Plasmid，10，224-234(1983))。
通过突变以上获得的转化体，得到本发明的枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)。为了这个目的，使化学或物理诱变剂作用于得到的转化体，并从中分离生产率增加的菌落，由此获得了枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)，即枯草菌表面活性剂产量改变的菌株原种。
可以利用的化学诱变剂的例子包括EMS(甲磺酸乙酯)，硫酸二乙酯和NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)。可以利用的物理诱变剂的例子包括紫外射线，γ射线和X射线，其中每种以可以诱导突变发生的量使用。
制备突变菌株原种的方法的例子包括这样的方法，其中收集在营养培养基，如营养肉汤(Difco Laboratories生产)中生长达到对数期的枯草芽孢杆菌，在生理盐水中洗涤，然后重悬，向悬浮液肉汤中加入数量可诱导突变发生的NTG以诱导突变发生，再一次收集细胞，洗涤以除去NTG，再一次在营养培养基，如营养肉汤(Difco Laboratories生产)中培养，由此制备突变菌株原种。
为了分离生产率增加的菌落，可以，例如，适当稀释突变菌株原种，将其铺于平板培养基上，所述平板培养基是通过向培养基，如添加有绵羊血的Tryptose Blood Agar Base(TBAB，Difco Laboratories生产)中添加琼脂制备的，然后通过比较长出的枯草芽孢杆菌菌落周围形成的澄清区带的大小，可以筛选出具有高浓度地生产枯草菌表面活性剂的能力的突变株系。
实际上，Mulligan等已揭示了形成的澄清区带的大小与枯草芽孢杆菌产生的枯草菌表面活性剂的量成比例(参见，J.Ferment.Technol.，62，158-179(1984))。随后，用MI113(pC115)做为对照，试管培养由此分离的枯草芽孢杆菌突变株，籍此可以证实枯草菌表面活性剂的生产率。通过这种方法，可以获得本发明的枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)。
现在在采用大豆的情况下示例本发明的枯草菌表面活性剂的生产方法，其中大豆是优选的豆类。为了最简单和方便地构成枯草菌表面活性剂的生产方法，可以，例如在含有10ppm四环素的营养培养基，如L培养基中，在25℃到42℃，优选28℃到40℃，更优选30℃到37℃的温度下培养枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)约5到24个小时，以0.1到10w/w％，优选0.5到7w/w％，更优选1到5w/w％的浓度在含有大豆粉或其提取物做为氮源的培养基中接种得到的肉汤培养物，然后在25℃到42℃，优选28℃到40℃，更优选30℃到37℃的温度下培养细胞约20到90个小时。如果温度偏离了上述范围，枯草菌表面活性剂的产量将不利地急剧减少。
在本发明的术语“豆粉或其提取物”中，大豆粉或其提取物指通过粒状粉碎大豆或脱脂大豆得到的大豆粗颗粒，粉碎的大豆粉或其提取物如热水提取物，或水解产物如酸水解产物和酶水解产物等等。不特别限定大豆粉或其提取物的浓度，然而，由于枯草菌表面活性剂的产量随着培养基中大豆粉或其提取物的浓度成比例地增加，故在某种程度上，为了获得高产量，优选0.5w/w％或以上的浓度。然而，如果大豆粉或其提取物的浓度过高，则可能引起不充分的灭菌，因此，优选大豆粉或其提取物的浓度不超过20w/w％。
因此，为了获得高产量，大豆粉或其提取物的浓度为0.5到20w/w％，优选2到15w/w％，更优选4到12w/w％。
除了大豆粉或其提取物外，本发明中使用的培养基可以包含常用的可分解代谢的碳源，可分解代谢的氮源和无机盐。如果期望的话，也可以进一步添加氨基酸和/或维生素。
可以利用的可分解代谢的碳源的例子包括葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水解淀粉，糖蜜，马铃薯提取物，麦芽，泥炭，植物油，玉米浆，果糖，糖浆，糖，液态糖，转化糖，醇，有机酸，有机酸盐和烷烃及其它通用的碳源。可以单独或联合使用它们。在这些碳源中，优选葡萄糖和麦芽糖。通常可以以0.01到50w/w％，优选大约1到40w/w％的浓度使用可分解代谢的碳源。
可以利用的可分解代谢的氮源的例子包括铵盐，如硝酸铵，硫酸铵，氯化铵，醋酸铵，碳酸铵和碳酸氢铵，及含有无机或有机氮的那些氮源，如，氨，硝酸钠，硝酸钾，谷氨酸钠，尿素，蛋白胨，肉膏，玉米浆，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物。可以单独或联合使用它们。在这些氮源中，考虑到枯草菌表面活性剂的生产率，优选酵母提取物。可分解代谢的氮源的适宜使用浓度通常是0.01到30w/w％，优选大约0.1到10w/w％。
而且，优选添加阳离子或阴离子做为无机盐，其例子包括钾离子，钠离子，镁离子，铁离子，锰离子，钙离子，锌离子，钴离子，镍离子，铜离子，钼离子，磷酸根离子，硫酸根离子，氯离子和硝酸根离子。添加的浓度随培养条件而变化，然而，通常磷酸盐从0.01到5w/w％，镁盐从10ppm到2w/w％，其它盐大约从0.1ppm到1,000ppm。
添加的氨基酸的例子包括L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-组氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-精氨酸，L-赖氨酸，D-缬氨酸和D-异亮氨酸，并且可以添加它们中的一种或多种。在本发明中，特别优选L-精氨酸，L-色氨酸。添加的浓度为0.001到5％w/w％，优选大约0.01到1w/w％。
维生素的例子包括生物素，硫胺素，核黄素，吡哆醇，烟酸，烟酰胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，胆碱，叶酸，钴胺素和氰钴胺素，且可以添加它们中的一种或多种。添加的浓度是0.1到100ppm，优选1到50ppm。
在本发明中，所述培养在强有力的通气条件下，通过向容器，如试管，烧瓶或发酵罐中添加上述培养基进行。不是特别需要除去产生的泡沫。
在传统的培养方法中，因为伴随着枯草菌表面活性剂的积累会剧烈产生泡沫使培养变得困难，故在培养期间要除去泡沫，回收包含在其中的枯草菌表面活性剂。然而，这个方法不能以工业规模实施。在本发明中，因为积累的枯草菌表面活性剂吸附到源于培养基中的大豆粉或其提取物的不可溶物质上，由此抑制了过多的泡沫，而且也因为源于大豆粉或其提取物的成分有抑制泡沫的作用，所以可以认为不需要除去培养期间产生的泡沫。鉴于这些，可以以类似于普通的发酵生产的方式进行工业规模的生产。在添加有大豆粉或其提取物的培养基中存在源于大豆粉或其提取物的不可溶物质，因此与以相同浓度添加有可溶成分的培养基比较，这种培养基无高渗透压。这些不可溶物质在培养期间逐渐溶解和消耗，因此可以在含有高浓度营养源的培养基中实施发酵生产，而且产生高产量的枯草菌表面活性剂。
在用容器如试管或烧瓶的情况下，通过强有力摇动容器进行通气，而且将培养基的最初pH调节为6.5到8.0。
在用容器如发酵罐进行高浓度生产的情况下，通入无菌空气，通过搅拌进行培养，而且当由于泡沫使培养变得困难时，可以添加常用的消泡剂。
优选将培养基维持在pH6到9，优选6.5到8.0，更优选6.9到7.5。通过添加碱性水溶液如氨，氢氧化钾，氢氧化钠，碳酸钠和碳酸钾的水溶液调整pH。其中，优选使用氢氧化钠和氨水。氢氧化钠的优选浓度是大约20w/w％，氨水的优选浓度是8到25w/w％。在这样的优选条件下进行培养，在20到90个小时内可以获得含有浓度为8到50g/L的粗枯草菌表面活性剂的肉汤培养物。
从此肉汤培养物中，可以回收枯草菌表面活性剂，并纯化。可以通过已知的方法进行纯化，这样可以通过添加硫酸，盐酸或硝酸使肉汤培养物呈酸性，对沉淀的枯草菌表面活性剂进行超滤，用有机溶剂如甲醇或二氯甲烷进行提取，用活性碳处理或结晶。代替通过添加酸进行沉淀，可以通过添加钙盐进行沉淀。
以此方式，每1L培养基可以获得6到40g的纯化枯草菌表面活性剂。
根据本发明得到的枯草菌表面活性剂可以用于，例如去污剂，乳化剂，湿润剂，分散剂，增溶剂，抗静电剂，防晕剂(anticlouding)，润滑剂，管道减阻剂等等领域，而且对于化妆品，食品，药品，农药，墨水等等是有效的。
向悬浮液中加入0.05ml的2000ppm N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍水溶液，在30℃放置10分钟。离心悬浮液，弃去上清液，用5ml同样的缓冲液洗细胞3次，在1ml的新L培养基中再一次悬浮。向4ml添加有10ppm四环素的L培养基中加入悬浮液，在35℃培养细胞过夜，加入2.5ml的50w/w％甘油水溶液，将由此得到的肉汤培养物等份装入几个小瓶用于细胞保藏并贮藏在-135℃以制备转化体贮藏原种。
随后，用无菌水稀释转化体的贮藏原种，将其铺在含有5w/v％绵羊血，4w/v％葡萄糖，0.1w/v％营养肉汤(Difco Laboratories生产)和0.1％酵母提取物的琼脂平板培养基(见，Cooper等，Appl.Environ.Microbiol.，42，408-412(1981))上以形成约200个菌落/平板。在35℃温育20到48个小时后，观察到了在生长的菌落周围形成澄清区带，筛选在其周围形成大澄清区带的菌落做为枯草菌表面活性剂的高产菌株。这些株系之一命名为枯草芽孢杆菌SD901，保藏号为FERM BP-7666。实施例3在试管培养中氮源对枯草菌表面活性剂产量的影响在添加有10ppm四环素的L平板培养基上划线枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)，35℃过夜生长。之后，向试管中分装入1ml具有以下组成A的培养基，在该培养基中接种从L平板培养基上挑取的一环细胞，在35℃培养72小时。
组成A(w/w％)1.4％ K2HPO40.6％ KH2PO40.1％ 柠檬酸钠0.02％ MgSO4·7H2O0.005％ FeSO4·7H2O3ppmMnCl2·4H2O1ppmZnCl20.1ppm CoCl2·6H2O0.02ppm CuCl2·2H2O0.02ppm Na2MoO4·2H2O3％ 葡萄糖0.01％ 酵母提取物
0.1％ L-色氨酸0.1％ L-精氨酸向上述组成中，添加下列氮源之一。
0.5w/w％ 大豆粉0.5w/w％ 硝酸钾0.5w/w％ 硝酸铵0.5w/w％ 硫酸铵0.5w/w％ 尿素0.5w/w％ 谷氨酸钠0.5w/w％ 蛋白胨离心肉汤培养物，通过HPLC方法在下列条件下定量包含在上清液中的枯草菌表面活性剂。
样品的量20μl柱子ODS-2，4.6mm×250mm，GL Science Co.，Ltd.制造。
柱子温度40℃洗脱液 80v/v％乙腈，3.8mM三氟乙酸流速1.5ml/min检测器 UV检测器波长205nm根据用枯草菌表面活性剂(Sigma-Aldrich Co.生产)的标准样品制成的标准曲线进行定量。下面以各氮源为基础显示了枯草菌表面活性剂的量大豆粉 5g/L硝酸钾 0.6g/L硝酸铵 0.6g/L硫酸铵 0.6g/L尿素 0.6g/L谷氨酸钠 0.9g/L蛋白胨 0.6g/L实施例4试管培养中大豆粉的浓度对枯草菌表面活性剂产量的影响在添加有10ppm四环素的L平板培养基上划线枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)，35℃过夜生长。之后，向试管中分装具有下面组成B，C或D的培养基各1ml，在每个培养基中接种从L平板培养基上挑取的一环细胞，在35℃培养48小时。
组成B(w/w％)2％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O3.4％ 麦芽糖组成C(w/w％)4％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O6.7％ 麦芽糖组成D(w/w％)8％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O
22ppm MnCl2·4H2O6.7％ 麦芽糖离心肉汤培养物，通过HPLC方法定量包含在上清液中的枯草菌表面活性剂。下面以各培养基为基础显示了枯草菌表面活性剂的量。
组成B8g/L组成C16g/L组成D23g/L实施例5发酵罐中枯草菌表面活性剂的生产在添加有10ppm四环素的L平板培养基上划线枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)，35℃过夜生长。在带挡板的烧瓶中制备100ml添加有10ppm四环素的L培养基，向其中接种1环来自上述肉汤培养物的细胞，在35℃和150rpm培养12小时。在5L体积的发酵罐中，制备2L具有下面组成E的培养基，向其中加入L培养基中的肉汤培养物，在35℃培养细胞90小时，同时通过添加20％ NaOH水溶液调节pH从6.5到7.5。
组成E(w/w％)10％ 大豆粉0.5％ K2HPO40.05％MgSO4·7H2O0.018％ CaCl2·2H2O25ppm FeSO4·7H2O22ppm MnCl2·4H2O0.1％ 酵母提取物17％ 麦芽糖0.1％ L-色氨酸
0.1％ L-精氨酸随时间进程从肉汤培养物中取样，通过HPLC方法定量离心后包含在上清液中的枯草菌表面活性剂。各培养时间的枯草菌表面活性剂的量如下所示。
20小时 8g/L32小时 18g/L52小时 36g/L64小时 44g/L70小时 48g/L80小时 50g/L90小时 50g/L工业实用性根据本发明，在广泛的领域，如药品，农药，食品，化妆品，化学产品，资源/能源和环境中有用的枯草菌表面活性剂，可以利用廉价培养基原料以比现有方法高许多的浓度产生。
序列表<110>昭和电工株式会社(SHOWA DENKO K.K.)<120>枯草菌表面活性剂的生产方法<130>SDF-3897PCT<150>JP2000-300300<151>2000-09-29<150>US60/258560<151>2000-12-29<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工<220><223>引物<400>1gtggtcgatg aaagagagct ttatcaaaca ggccgg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工<220><223>引物<400>2ccggcctgtt tgataaagct ctctttcatc gaccac 36<210>3<211>46<212>DNA<213>人工<220><223>引物<400>3cccggatccg gactagtcta gagctctacg cgatctccgg gcgggc 46<210>4<211>36<212>DNA<213>人工<220><223>引物<400>4cccggatcct taagcttgag tacgacggtt tttctg 3权利要求
1.生产枯草菌表面活性剂的方法，包括在含有豆粉或其提取物的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物，及在肉汤培养物中积累枯草菌表面活性剂。
2.如权利要求1所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中所述的豆选自大豆，赤豆，豌豆，蚕豆，鹰咀豆，小扁豆，有筋的青刀豆。
3.如权利要求2所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中所述的豆是大豆。
4.如权利要求1-3任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中在含有酵母提取物的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物。
5.如权利要求1-4任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，包括步骤在还含有可分解代谢的碳源，可分解代谢的氮源和无机盐的液体培养基中，在有氧条件和pH6-9，温度25-42℃下培养芽孢杆菌属微生物20-90个小时；在肉汤培养物中积累枯草菌表面活性剂，且不从发酵容器中除去产生的泡沫，和从得到的肉汤培养物中分离和纯化枯草菌表面活性剂。
6.如权利要求1-5任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中枯草菌表面活性剂在肉汤培养物中以8到50g/L的浓度积累。
7.如权利要求1-6任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中芽孢杆菌属微生物是枯草芽孢杆菌。
8.如权利要求7所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。
9.如权利要求1-8任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中培养液中豆粉或其提取物的浓度是0.5到20w/w％。
10.如权利要求5-9任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的碳源是选自葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，水解淀粉，糖蜜，马铃薯提取物，麦芽，泥炭，植物油，玉米浆，果糖，糖浆，糖，液态糖，转化糖，醇，有机酸，有机酸盐和烷烃的一种或多种成分。
11.如权利要求10所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的碳源是葡萄糖或麦芽糖。
12.如权利要求5-11任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中可分解代谢的氮源是铵盐或无机或有机氮。
13.如权利要求12所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中铵盐是硝酸铵，硫酸铵，氯化铵，醋酸铵，碳酸铵或碳酸氢铵。
14.如权利要求12或13所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中无机或有机氮是选自氨，硝酸钠，硝酸钾，谷氨酸钠，尿素，蛋白胨，肉膏，玉米浆，酪蛋白水解物，羽毛粉和酵母提取物的一种或多种成分。
15.如权利要求5-14任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中包含在无机盐中的阳离子是钾离子，钠离子，镁离子，铁离子，锰离子，钙离子，锌离子，钴离子，镍离子，铜离子或钼离子，阴离子是磷酸根离子，硫酸根离子，氯离子或硝酸根离子。
16.如权利要求1-15任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中在培养基中含有氨基酸和/或维生素。
17.如权利要求16所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中氨基酸是选自L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-半胱氨酸，胱氨酸，L-甲硫氨酸，L-色氨酸，L-组氨酸，L-脯氨酸，L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-精氨酸，L-赖氨酸，D-缬氨酸和D-异亮氨酸的一种或多种成分。
18.如权利要求16或17所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中维生素是选自生物素，硫胺素，核黄素，吡哆醇，烟酸，烟酰胺，泛酸，吡哆醛，吡哆醇，肌醇，胆碱，叶酸，钴胺素和氰钴胺素的一种或多种成分。
19.如权利要求4-18任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中pH是6.9到7.5。
20.如权利要求4-19任一项所述的生产枯草菌表面活性剂的方法，其中温度是30℃到37℃。
21.芽孢杆菌属微生物，其具有在培养20至90个小时后产生浓度为8至50g/L的粗枯草菌表面活性剂的活性。
22.如权利要求21所述的芽孢杆菌属微生物，其在含有豆粉或其提取物的液体培养基中培养20到90个小时后，有产生浓度为8到50g/L的枯草菌表面活性剂的活性。
23.如权利要求22所述的芽孢杆菌属微生物，其中所述的豆是大豆。
24.如权利要求21到23任一项所述的芽孢杆菌属微生物，其是枯草芽孢杆菌。
25.如权利要求24所述的芽孢杆菌属微生物，其中枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。
26.枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP-7666)或其突变株。
全文摘要
本发明公开了一种生产枯草菌表面活性剂的方法，包括在含有豆粉如大豆粉或其提取物做为氮源的液体培养基中培养芽孢杆菌属微生物，及在肉汤培养物中积累枯草菌表面活性剂；本发明还公开了在培养20到90个小时后，具有产生浓度为8到50g/L的粗枯草菌表面活性剂的活性的芽孢杆菌属微生物。
文档编号C07K14/195GK1466626SQ01816513
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月28日 优先权日2000年9月29日
发明者米田正, 御代田喜昭, 古谷和男, 续木敏, 喜昭, 男 申请人:昭和电工株式会社