多肽微粒化的方法

专利名称：多肽微粒化的方法
技术领域：
本发明涉及多肽微粒化的方法。
此种多肽，由于在生物体内的半哀期短、经口给药消化道难以吸收，所以过去是多次注射给药。但是，因给药方法繁杂、患者负担等问题，人们正探讨更简便的给药方法。
作为此种方法的一个例子可以举出经肺给药。但是，在经肺给药中为使多肽抵达肺泡内就有必要使多肽微粒化。
而且，把多肽包封在生物体内分解性聚合物中制成微球体，通过注射植入生物体内，使多肽长期在生物体内释放的探讨也很广泛。
作为这样的微球体的制法，已知的是，使多肽水溶液在溶有生物体内分解性聚合物的二氯甲烷等有机溶剂中乳化配制W/O乳液，使其在水中乳化得到微球体的方法。但在此法中，存在着多肽变性失活问题，只有一部分多肽能够适用。
为避免此问题，正在探讨的是把粉状多肽直接分散在一种溶有生物体内分解性聚合物的有机溶剂中作为油相，用来配制微球体，但是在此方法中，由于多肽粒径大、包封率不高，加之溶出初期多量释放(初期破裂现象)，所以象气雾剂一样，有必要使多肽微粒化。
作为多肽微粒化的方法，迄今已知的方法如下。
(I)用喷雾干燥器使含有明胶等水溶性高分子物质及多肽的水溶液微粒化的方法(特开平4-36233)。
(II)使含多肽和水溶性高分子物质的水溶液冷冻干燥，所得的冷冻干燥物用射流磨细粉碎的方法(特开平8-225454)。
(III)向丙酮中添加多肽水溶液，使多肽微粒结晶析出的方法(J.ofMicroencapsulation，14(2)，p225-241，1997年)。
(IV)使表面活性剂和多肽在水中混合，急速干燥的方法(特开平9-315997)。
(V)向多肽水溶液中添加水混溶性有机溶剂或挥发性盐类，冷冻干燥的方法(特开平11-322631)。
(VI)使多肽和聚乙二醇的混合水溶液冷冻干燥，用有机溶剂溶解聚乙二醇的方法(特开平11-302156)。
但是，在所有上述方法中存在的问题是，多肽完全失活，回收率低，再分散性差，制造需时长等，这些问题全部解决的方法，尚未找到。
本发明的目的在于提供一种简便快速、高回收率、不导致变性的多肽微粒化的方法。
按照本发明的方法，能够简便快速地以高回收率制得多肽微粒，而且所得微粒的特征是保持高活性、再分散性也好。
也就是说，本发明涉及一种多肽微粒分散液的制法，其特征在于向含有多肽及相分离诱导剂的水溶液冻结物中添加一种多肽不溶性、水混溶性有机溶剂，使冻结物中的相分离诱导剂及冰溶解。
另外，本发明涉及从按照上述方法制得的多肽微粒分散液中除去相分离诱导剂、水及水混溶性有机溶剂制得的多肽微粒。
本发明还涉及一种微球体的制法，其特征在于把上述多肽微粒分散在挥发性的非水混溶性有机溶剂中溶有生物体内分解性聚合物的溶液中，把其分散在水相中制得的O/W乳液，通过蒸馏除去该非水混溶性有机溶剂。
本发明还涉及一种微球体的制法，其特征在于把含有多肽微粒、生物体内分解性聚合物及与水混和的上述聚合物的良溶剂(溶剂A)的聚合物溶液添加到一种含有与溶剂A混溶的上述聚合物的不良溶剂(溶剂B)和与溶剂A不混溶的上述聚合物的不良溶剂(溶剂C)的均匀混合液中，通过乳化制备以聚合物溶液为分散相、以均匀混合液为连续相的乳液，从分散相中除去溶剂A。
本发明还涉及用上述方法制得的微球体制剂。
图2按照本发明方法(实施例1)所得BSA微粒的电子显微镜相片模式图。
图3是表示按照本发明方法所得BSA微粒分散液，将取自该液的粉状BSA微粒再分散的分散液中的BSA微粒的粒度分布的曲线4是表示用按照本发明方法制得的BSA微粒配制成的微球体(实施例15)的溶出试验结果的曲线图。
图5按照比较对照方法(比较例1)所得BSA微粒的电子显微镜相片的模式图作为多肽可以举出种种具有对哺乳动物有用的有生物活性、可用于临床上的多肽或蛋白质。该多肽的分子量作为单体可用例如1,000～200,000的，特别优选为5,000～70,000。在这些多肽中，也含有生物化学领域所谓具有超级结构的分类属于蛋白质的高分子。本发明所用的多肽种类，只要达到本发明的目的，没有特别限制，优选为具有一定水溶性的，其对水的溶解度在20℃为约0.01mg/ml以上，优选为约1mg/ml以上。
作为多肽的具体例子可以举出如激素类、酶类、细胞分裂素类、生长因子类等。更具体地可以举出下面的多肽。
作为激素的例子可以举出生长激素(GH)、生长激素释放因子(GRF)、胰岛素、胰高血糖素、胃泌素、催乳激素、促肾上腺皮脂激素(ACTH)、促甲状腺激素(TSH)、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、降血钙素等。
作为酶类可以举出组织血纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)、尿激酶(UK)、链激酶、蛋白质C、金属蛋白酶类、超氧化物歧化酶(SOD)、第VIII及第IX因素、过氧化物酶等。
作为细胞因子类可以举出干扰素类(IF/F-α、-β、-γ等)、白细胞介素(如IL-1～IL-11)、恶病质素、制瘤素、菌落刺激因子如G-，M-及GM-CSF等)、血小板生成素(TPO)及红血球生成素(EPO)。
作为生长因子类可以举出神经生长因子(NGF-1、NGF-2等)、神经营养因子(NTF)、上皮细胞生长因子(EGF)、源于血小板的生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(如IGF-1、IGF-2及IGF-3等)、成纤维细胞增殖因子(αFGF及bFGF)、成骨质生长因子(如BMP-1、BMP-2，BMP-3及BMP-4)，前房利钠尿多肽(ANP)、软骨诱导因子等。
这些多肽既可含有糖链、或其糖链结构也可不同。而且，它们也可含有突变蛋白，衍生物、类似物及活性片段等。
本发明中所用的多肽既可来自天然，也可由基因重组技术制得。
而且，作为本发明所用的多肽也可为金属盐，作为金属盐中的金属可以举出如碱土类金属(如钙、镁等)、锌(II价)、铁(II、III价)、铜(II价)、锡(II、IV价)、铝(II、III价)等。在本说明书中所说的多肽也包括它的这些金属盐。
作为本发明所用的相分离诱导剂，若是当多肽及相分离诱导剂高浓度地溶于水时(例如，多肽200mg/ml以上，相分离诱导剂50mg/ml以上)，能引起富含多肽相及富含相分离诱导剂相发生相分离作用的化合物，没有特别限制，例如可以举出非多肽性水溶性高分子。
适于用作非多肽性水溶性高分子的平均分子量为400～200,000，优选为6,000～70,000。这种非多肽性水溶性高分子的具体例子可以举出聚氧乙烯类、纤维素衍生物、聚乙烯衍生物、环糊精衍生物等。
作为聚氧乙烯类可以举出聚乙二醇、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚氧乙烯-聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯等。
作为纤维素衍生物可以举出羟丙基纤维素等。
作为聚乙烯衍生物可以举出聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等。
作为环糊精衍生物可以举出二甲基-β-环糊精等。
其中特别优选的相分离诱导剂可以举出聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮，最优选的是聚乙二醇。聚乙二醇的平均分子量优选在400～200,000范围内，特别优选在6,000～70,000范围内。
相分离诱导剂既可1种单用，也可2种以上组合使用。
含多肽及相分离诱导剂的水溶液的配制方法既可把多肽、相分离诱导剂两者同时溶于水，也可使一个溶解后再使一个溶解、或者把多肽水溶液与相分离诱导剂水溶液混合。总之，多肽及相分离诱导剂最后溶解于水即可，对配制方法没有特别限制。
多肽-相分离诱导剂水溶液中多肽的浓度只要在多肽溶解范围内即可，没有特别限制，若举例，则为0.01～200mg/ml，优选为1～100mg/ml。
多肽-相分离诱导剂水溶液中相分离诱导剂的浓度若在相分离诱导剂溶解范围内，则没有特别限制，若举例，则为0.025～200mg/ml，优选为0.25～100mg/ml。
然后，使多肽-相分离诱导剂水溶液冻结，向所得冻结物中添加多肽不溶解性、水混溶性的有机溶剂，通过使相分离诱导剂及冰溶解，制得想要的多肽微粒的分散液。
使多肽-相分离诱导剂水溶液冻结，水溶液的温度缓缓下降的条件比急剧下降的条件优选。用设定温度为-20～-80℃的通常的冷库或冷冻干燥机进行冷冻很容易，更具体地说，初期降温速度(冷却开始后水溶液每分钟降温度数)为约2～40℃/分钟，优选为约10～30℃/分钟。
在本发明方法的冻结过程中，由于最初是从该水溶液中的水开始凝固的，所以不结冰部分多肽及相分离诱导剂的浓度增高，结果引起富含多肽相及富含相分离诱导剂富相发生相分离作用。
这种相分离现象，有富含多肽相在富含相分离诱导剂相中形成微小液滴的情况，有富含相分离诱导剂相在富含多肽相中形成微小液滴的情况，形成哪一种相分离形态则取决于多肽-相分离诱导剂水溶液中相分离诱导剂/多肽的浓度比(以下称为浓度比)。只要此浓度比在取决于多肽、相分离诱导剂的种类的一定值(以下称为转相比)以上，便可得到富含多肽相在富含相分离诱导剂相中形成微小液滴的形态。
如果浓度比在转相比以上，通常就能得到粒径较小的球形微粒。另一方面，浓度比在转相比以下的情况，所得粒子是无定形的，粒径也稍大。所以，为了得到粒径较小，如平均粒径在10μm以下的微粒，优选浓度比在转相比以上。
转相比是随着多肽，相分离诱导剂种类的变化而变化的，要用各种合适浓度比的多肽-相分离诱导剂水溶液配制微粒，通过观测其粒径及其形状就能够不费力地决定转相比。
平均分子量在6,000以上的聚乙二醇用作相分离诱导剂的情况，其转相比可根据多肽的分子量做一定程度的推测。也就是说，多肽的分子量(M)与转相比(T)之间的关系可用下列近似式表达T＝102.7/M0.68把所用多肽的分子量代入上式，即可求出转相比。
如上所述，转相比是随着多肽、相分离诱导剂种类等的变化而变化的，例如，为得到平均粒径在10μm以下的微粒，浓度比是在0.25以上，优选在0.5以上，更优选在1以上。
在使本发明的多肽-相分离诱导剂水溶液冻结阶段，为使多肽相在相分离诱导剂相中成为分散状态，通过仅使冻结物中的冰及相分离诱导剂溶解，能得到多肽微粒。为使冻结物中的冰及相分离诱导剂溶解，可向该冻结物中添加多肽不溶解性、水混溶性的有机溶剂。由于该有机溶剂的添加，冻结物中的冰可发生下列两种情况，(a)直接溶于有机溶剂中的情况及(b)熔融成水后，混合到有机溶剂中的情况，而本发明中冰的熔融，不仅发生(a)的情况，而且还发生水立即混入有机溶剂(b)的情况。
作为多肽不溶性、水混溶性的有机溶剂，若加到多肽-相分离诱导剂水溶液冻结物上，若多肽不溶解、而冰及相分离诱导剂溶解，则没有特别限制。作为这类有机溶剂，例如和水完全混溶，20℃多肽的溶解度在1mg/ml以下，以向100mg/ml的相分离剂水溶液中添加5倍量的该有机溶剂也不析出相分离诱导剂为宜，以按照多肽、相分离诱导剂的种类适当选用为宜。这类有机溶剂的具体例子可以举出如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲基-2，4-戊二醇等低级醇类，丙酮等酮类，四氢呋喃、二噁烷等醚类等之外，还有乙腈、吡啶、二甲基甲酰胺、二甲亚砜等，其中丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、2-甲基-2，4-戊二醇等是优选的，特别优选的是丙酮。这些有机溶剂也可两种以上混合使用。
水混溶性有机溶剂的添加量应该是达到使冻结物中的冰溶于水混溶性有机溶剂形成的含水有机溶剂的含水率达到使多肽不能再溶于其中的含水率的足够量。这个添加量取决于多肽、相分离诱导剂、水混溶性有机溶剂的种类等，通常可为多肽-相分离诱导剂水溶液中水的1～100倍量，优选为2～20倍量。
本发明通过添加水混溶性有机溶剂，使相分离诱导剂及冰溶解，添加有机溶剂后，通过搅拌能快速完成溶解。搅拌过程中也可添加有机溶剂。可用磁搅拌器、螺旋桨、搅动混合器、超声波等已知搅拌方法进行搅拌。
所得多肽微粒分散液，如有必要，可用透析、离心分离清洗、过滤清洗等已知手段来交换分散介质或除去溶于分散液中的相分离诱导剂及水。而且，用滤取或离心分离等手段从分散液中除去分散介质(溶有水及相分离诱导剂的水混溶性有机溶剂)，通过干燥能够制得粉状微粒。
所得的多肽微粒可加工气雾制剂、微球体制剂等。
气雾制剂既可用来自分散液的粉状多肽微粒单独配制，也可添加用于提高微粒分散性的表面活性剂进行配制。作为表面活性剂可以举出山梨糖醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油醇、固化蓖麻油衍生物等，其添加量相对于多肽重量，在0.001～5％(w/w)范围，优选为0.05～2％(w/w)。
而且，必要时也可添加稳定剂、赋形剂等。作为稳定剂可以举出人血清白蛋白、明胶等，其添加量优选为多肽重量的0.01～200％(w/w)。作为赋形剂可以举出乳糖、麦芽糖、山梨糖、海藻糖、木糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇等糖或糖醇，其添加量在多肽重量的0.01～200％(w/w)范围内，优选为1～50％(w/w)。
此外，也可适当添加本来生物体中存在的维持渗透压必要的矿物离子如钙离子、镁离子、钠离子、钾离子、氯离子等，为了抑制对生物体的刺激性，必要时也可添加肺胞由来的表面活性剂。
这样配制的气雾制剂用多肽组合物直接或与压缩空气、压缩二氧化碳气等作为喷雾气，或分散于适当喷射剂中，经口腔内或鼻腔内吸入咽头部或肺内。作为可用的挥发剂可以举出含氯氟烃(Flon11、12、114等)、含氢的氯氟烃(Flon 123、124、141b等)、不含氯的碳氟化合物(Flon 125、134a等)等。
在加工成微球体制剂的情况，可用下列方法进行制备。
(A)喷雾干燥法把分散有多肽微粒的生物体内分解性聚合物的有机溶剂溶液由喷射嘴喷向喷雾干燥机的干燥室内，使喷雾液滴中的有机溶剂急速蒸发(特开平1-155942、特开平8-151321、特开平9-221417、DrugDevelopment and Industrial Pharmacy，24(8)卷p703～727，(1998)年(以下简称文献1)等)。
(B)相分离法(凝聚法)在搅拌情况下向分散有多肽微粒的生物体内分解性聚合物的有机溶剂的溶液中缓缓添加凝聚剂，使微球体析出、固化(特开昭60-67417、特开平8-151321、特开平9-221417、上述文献1等)。
(C)液体中干燥法把多肽微粒分散在在挥发性的水不混溶性有机溶剂中溶有生物体内分解性聚合物的溶液中，将其分散在水相中配制成O/W乳液，把该有机溶剂通过蒸馏除掉(特开昭49-12024、特开昭63-91325、特开平8-151321、上述文献1等)，或者把2种以上生物体内分解性聚合物分别溶于相同或不同的挥发性的水不溶性有机溶剂中，多肽微粒分散后，两者混合，配制成O/O乳液。接着把它分散于水相中配制成O/O/W乳液，通过蒸馏除掉该有机溶剂(特开平6-211648)。
(D)用水混溶性有机溶剂的微球体配制法把含有多肽微粒、生物体内分解性聚合物及与水混溶的上述聚合物的良溶剂(溶剂A)的聚合物溶液添加到含有与溶剂A混溶的上述聚合物的不良溶剂(溶剂B)和与溶剂A不混溶的上述聚合物的不良溶剂(溶剂C)的均匀混合液中，通过乳化作用制备以聚合物溶液为分散相、以均匀混合液为连续相的乳液，通过从分散相中除去溶剂A能够制得微球体(专利申请2000-122469)。
按照方法(D)制造微球体，首先制备含有多肽微粒、生物体内分解性聚合物及与水混溶性的上述聚合物良溶剂(溶剂A)的聚合物溶液。
聚合物溶液中的多肽微粒含量为0.001～90重量％，优选为0.01～50重量％。
作为生物体内分解性聚合物，制剂领域通常使用的生物体内分解性聚合物都可使用，优选的是聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物。聚合物溶液中生物体内分解性聚合物的浓度通常为1～80重量％，优选为20～60重量％。
作为水混溶性生物体内分解性聚合物的良溶剂(溶剂A)，若完全溶解1g生物体内分解性聚合物所需的溶剂量低于25g，与水完全混溶，则没有特别限制，例如丙酮、四氢呋喃是优选的，丙酮是最优选的。这些溶剂不只1种单用，也可两种以上混合使用。
其次，把制得的聚合物溶液添加到含有与溶剂A混溶的生物体内分解性聚合物的不良溶剂(溶剂B)和与溶剂A不混溶的生物体内分解性聚合物的不良溶剂(溶剂C)的均匀混合液中，通过乳化制备以聚合物溶液为分散相、以均匀混合液为连续相的乳液。
作为溶剂B，若完全溶解1g生物体内分解性聚合物所需的溶剂量在25g以上，与溶剂A完全混合，则没有特殊限制，具体例如优选水、乙醇，特别优选水。作为溶剂C，若完全溶解1g生物体内分解性聚合物所需量在25g以上，与溶剂C100重量份混溶的溶剂A在25重量份以下，与溶剂B完全混溶形成均匀混合液，则没有特别限制，作为具体例子可以举出甘油。
均匀混合液中溶剂B对溶剂C的重量比优选在10∶90～50∶50范围内，最优选在20∶80～40∶60范围内。
另外，该均匀混合液中也可含有乳化稳定剂，作为乳化稳定剂，优选的是例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮，甲基纤维素、羟丙基纤维素。
尽管溶剂A与含溶剂B和溶剂C的均匀混合液部分混溶，由于混溶速度受到限制，所以能够形成含有药物、生物体内分解性聚合物及溶剂A的以聚合物溶液为分散相、以均匀混合液为连续相的乳液。而且，在形成乳液的同时，或者与乳液形成平行，溶剂A从聚合物溶液缓缓迁移到均匀混合液中，微球体也开始形成。
聚合物溶液对均匀混合液的重量比，优选在1∶2～1∶200范围内，特别优选在1∶3～1∶75范围内。
聚合物溶液乳化成均匀混合液可通过螺旋桨式搅拌机、涡轮乳化机、高压乳化机、超声波分散装置、静态混合机等已知的乳化装置通过在搅拌下把聚合物溶液添加到均匀混合液中就能够不费力的完成。乳化所需时间随使用的乳化装置、液体量等的变化而变化，是在1～10分钟左右。用膜乳化、喷雾等方法也能很好地实施乳化。
乳化后，用适当的方法使所得的乳液流动，从分散相除去残余的溶剂A。这样，分散相的溶剂A移向连续相，分散相的生物体内分解性聚合物完全凝固，能够得到微球体。
流动方法可通过循环或搅拌来进行。循环可用泵由乳液下部抽吸部分乳液通过管子返回乳液上部来进行。搅拌可用搅拌器、磁搅拌器等通常的搅拌手段进行。
并且，乳化后，若所得乳液的连续相量增大，就能促进溶剂A移出分散相。而且，通过量增大，由于乳化过程中移向连续相的溶剂A得到稀释，就防止了连续相中溶剂A对形成阶段的微球体的不良影响。
再者，乳化后残余的溶剂A移出分散相时，如果加温、减压等，就能进一步促进溶剂A的消除。
所得微球体可用离心分离或过滤等方法分离取出，用蒸馏水洗，通过风干或真空干燥等完全除去溶剂。
用上述(A)～(D)等各方法所得的微球体可以直接作为植入剂向生物体给药。并且，也可用作制备各种制剂的原料。具体制剂的例子可以举出注射液、口服制剂、透皮制剂、栓剂、经鼻制剂、口腔制剂及眼内给药制剂等。
(2)这些水溶液在-20℃下冻结后，添加5ml在-20℃下预冷的丙酮，用搅动混合器室温搅拌，使PEG6000及冰溶解于丙酮中，制得BSA微粒分散液。离心分离(2,000rpm，5分钟)，除去上层清液后，加2ml丙酮，制得BSA微粒分散液(PEG6000及水已除)。
(3)用激光衍射粒度分布测定装置(SALD-1100，岛津制作所制)测定(2)中所得分散液(PEG6000及水已除)中的微粒平均粒径。结果示于

图1。BSA-PEG6000水溶液的浓度比(PEG6000/BSA)在0.25以上，能得到平均粒径在约10μm以下的微粒。
(4)对(2)中所得BSA微粒分散液(PEG6000及水已除)进行离心分离(2,000rpm，5分钟)，除去上层清液后减压干燥一个夜晚，回收到BSA微粒的干燥粉末。
(5)(4)中所得BSA微粒(浓度比3)的电子显微镜相片模式图示于图2。由图2可知，按照本发明所得BSA微粒是球形的。
(6)(4)中所得BSA微粒(浓度比3)分散在丙酮中立刻迅速再分散。再分散的BSA微粒的平均粒径为2.85μm，与减压干燥前、即(2)中所得微粒分散液时(2.09μm)基本相同。而且粒度分布在减压干燥前后也几乎没有变化(图3)。
用Sumilon“过氧化物酶用发色试剂盒O”(住友Bakelite制)测定HRP微粒的活性，结果保持着基本100％的活性。
(2)所得BSA微粒25mg分散在二氯甲烷1350mg中后，添加475mg的PLGA5020(乳酸-乙醇酸共聚物、平均分子量20,000、乳酸/乙醇酸摩尔比50/50，和光纯药制)，使之溶解。将其添加到4ml的15℃的0.25％(w/w)甲基纤维素(Metholose SM-4000，信越化学制)水溶液中，用Polytron均化器(Kinematica AG Littau制，8,000rpm、3分钟)乳化。把所得乳液添加到400ml的15℃水中，用螺旋桨搅拌机(Three One Motor BL600，Heidon，400rpm)边搅拌边用3小时升温到30℃，进行液体内干燥，使之形成微球体，所得微球体分散液经150μm筛网过滤、再经20μm筛网滤取微球体，使之冻结干燥。
(3)用微型BCA蛋白质定量试剂盒(PIERCE制)测定了所得微球体的BSA包封率，装入量84.9％的BSA包封在微球体中。
(4)把微球体10mg放入带塞试管中，添加PBS(9.6mM的磷酸化生理食盐水)10ml，用旋转培养器(Tai tech制、25rpm、37℃)做溶出试验。定时把试管从旋转培养器中取出，离心分离(2,000rpm、5分钟)，采取上层清液9ml，添加新PBS 9ml，继续溶出试验。用微型BCA蛋白质定量试剂盒测定所采上层清液中BSA的量，求出由微球体放出的BSA量，结果示于图4。
所得微球体的BSA包封率用与实施例15(3)一样的方法测定，装入量79.1％的BSA包封在微球体内。比较例(1)配制1ml BSA浓度10mg/ml、PEG6000浓度30mg/ml的水溶液(浓度比3)。添加5ml在-20℃下预冷的丙酮，用搅动混合器室温搅拌，制得BSA微粒分散液，离心分离(2,000rpm、5分钟)，除去上层清液后，加2ml丙酮，制得BSA微粒分散液(PEG6000及水已除)。所得微粒分散液的平均粒径为2.58μm。
(2)离心分离(1)中所得BSA微粒分散液(PEG6000及水已除)(2,000rpm、5分钟)，除去上层清液后减压干燥一个夜晚，得到BSA微粒的干燥粉末。
(3)所得BSA微粒的电子显微镜相片模式图示于图5。由图5可知，如果不做冻结处理就得不到球形微粒。
尝试把所得BSA微粒分散到丙酮中，但是一点也不分散。
按照本发明，能使多肽的微粒化既简便迅速又不导致失活，所得的多肽微粒纯度极高，再分散性也很好。
由于微粒回收时几乎没有损失，本发明的回收率基本为100％。
而且，若用本发明所得的多肽微粒可容易地制得长期使用过程中能以一定速度释放，且初期破裂率非常低的高含量的微球体制剂。
权利要求
1.一种多肽微粒分散液的制法，其特征在于把多肽不溶性的水混溶性有机溶剂添加到含有多肽及相分离诱导剂的水溶液冻结物中，使冻结物中的相分离诱导剂及冰溶解。
2.按照权利要求1的方法，其中，相分离诱导剂是非多肽性水溶性高分子。
3.按照权利要求2的方法，其中，非多肽性水溶性高分子为选自聚氧乙烯类、纤维素衍生物、聚乙烯衍生物及环糊精衍生物中的一种或两种以上。
4.按照权利要求3的方法，其中，聚氧乙烯类是聚乙二醇、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，纤维素衍生物是羟丙基纤维素，聚乙烯衍生物是聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇，环糊精衍生物是二甲基-β-环糊精。
5.按照权利要求1的方法，其中，相分离诱导剂是聚乙二醇。
6.按照权利要求5的方法，其中，聚乙二醇的平均分子量是400～200,000。
7.按照权利要求5的方法，其中，聚乙二醇的平均分子量是6,000～70,000。
8.按照权利要求1～7任一项的方法，其中，多肽不溶性的水混溶性有机溶剂为选自甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、2-甲基-2，4-戊二醇、丙酮、四氢呋喃、二噁烷、乙腈、吡啶、二甲基甲酰胺及二甲基亚砜中的1种或两种以上。
9.按照权利要求1～8任一项的方法，其中，含多肽及相分离诱导剂的水溶液中相分离诱导剂/多肽的浓度比在转相比以上。
10.按照权利要求1～8任一项的方法，其中，含多肽及相分离诱导剂的水溶液中相分离诱导剂/多肽的浓度比在0.25以上。
11.按照权利要求7的方法，其中，含多肽及相分离诱导剂的水溶液中相分离诱导剂/多肽的浓度比在102.7/M0.68以上，式中M表示多肽的分子量。
12.用权利要求1～11任一项的方法制得的多肽微粒分散液。
13.按照权利要求12的多肽微粒分散液，其中，多肽微粒是平均粒径在10μm以下的球形微粒。
14.多肽微粒，可用权利要求1～11任一项的方法从所得的多肽微粒分散液中除去相分离诱导剂、水及水混溶性有机溶剂制得。
15.一种微球体的制法，其特征在于把权利要求14的多肽微粒分散在在挥发性的水不溶性有机溶剂中溶有生物体内分解性聚合物的溶液中，把其分散在水相中制得的O/W乳液，蒸馏除去该水不溶性有机溶剂。
16.一种微球体的制法，其特征在于把含有权利要求14的多肽微粒、生物体内分解性聚合物及与水混和的上述聚合物的良溶剂A的聚合物溶液添加到含有与良溶剂A混和的上述聚合物的不良溶剂B和与良溶剂A不混和的上述聚合物的不良溶剂C的均匀混合液中，通过乳化形成以聚合物溶液为分散相、以均匀混合液为连续相的乳液，从分散相中除去良溶剂A。
17.按照权利要求15或16的制法得到的微球体制剂。
全文摘要
本发明涉及多肽微粒分散液的制法，其特征在于把多肽不溶性的水混溶性的有机溶剂添加到含有多肽及相分离诱导剂的水溶液冻结物中，使其中的相分离诱导剂及冰溶解；用上述方法制得的多肽微粒分散液；从该多肽微粒分散液中除去相分离诱导剂、水及水混和性有机溶剂制得多肽微粒；微球体的制法其特征在于把该多肽微粒分散在在挥发性水不溶性有机溶剂中溶有生物体内分解性聚合物的溶液中，将其分散在水相中制得O/W乳液，通过蒸馏除去该水不溶性有机溶剂；以及由此制得的微球体制剂。
文档编号C07K1/00GK1469753SQ01817272
公开日2004年1月21日 申请日期2001年10月11日 优先权日2000年10月12日
发明者松本昭博, 森田孝广, 广 申请人:田边制药株式会社