专利名称：含p6a相关序列的咔啉羧酸,它们的合成及在医学上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及P6A相关序列的保护中间体化合物以及脱保护产物的化合物，涉及将脱保护产物的化合物与咔啉羧酸的羧基偶联并脱保护生成相应的拟肽，以及将脱保护产物的化合物与咔啉羧酸的仲氨基偶联并脱保护生成相应的拟肽；涉及它们的制备方法，以及进一步涉及它们在医学中的应用，例如作为溶血栓剂的应用。
本发明按图2所示的路线采用正交策略从Boc保护的L-氨基酸出发采用液相方法逐步接肽，制得通式(2)的保护寡肽中间体。其中Boc-AA3OH共同为OBzl或AA3为Ala残基。
本发明按图3所示的路线在HF的作用下将通式(1)的化合物脱保护得通式(3)的化合物；在HCl的作用下将通式(1)的化合物脱保护得通式(4)的化合物；在NaOH的作用下将通式(1)的化合物脱保护得通式(5)的化合物。其中AA1和AA2的定义同
图1，AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A，G，Q，K，R，N，或AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。
如图4所示，将通式(4)的化合物与N-Boc-咔啉羧酸的羧基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(6)的化合物。其中AA1和AA2的定义同图1，AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A，G，Q，K，R，N，或AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。
如图5所示，将通式(5)的化合物与咔啉羧酸苄酯的氨基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(7)的化合物。其中AA1和AA2的定义同图1，AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A，G，Q，K，R，N，或AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。
本发明按图6所示的路线在HF的作用下将通式(2)的化合物脱保护得通式(8)的化合物；在HCl的作用下将通式(2)的化合物脱保护得通式(9)的化合物；在NaOH的作用下将通式(2)的化合物脱保护得通式(10)的化合物。其中AA3的定义同图2，AA3为Ala残基或AA3缺失。
如图7所示，将通式(9)的化合物与N-Boc-咔啉羧酸的羧基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(11)的化合物。其中AA3的定义同图2，AA3为Ala残基或AA3缺失。
如图8所示，将通式(10)的化合物与咔啉羧酸苄酯的氨基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(12)的化合物。其中AA3的定义同图2，AA3为Ala残基或AA3缺失。
图2是P6A代谢产物的合成路线。
图3是P6A相关系列的保护多肽脱Boc、皂化，以及脱保护。
图4是通式(4)的保护多肽与N-Boc-咔啉羧酸偶联、脱保护。
图5是通式(5)的保护多肽与咔啉羧酸苄酯偶联、脱保护。
图6是P6A代谢产物的保护多肽脱Boc、皂化，以及脱保护。
图7是通式(9)的保护多肽与N-Boc-咔啉羧酸偶联、脱保护。
图8是通式(10)的保护多肽与咔啉羧酸苄酯偶联、脱保护。
本发明采用大鼠动静脉旁路模型评价了通式(3)，(6)，(7)，(8)，(11)和(12)的化合物的溶血栓活性。结果表明，本发明提供的拟肽不仅具有优秀的溶栓作用，而且这种溶栓作用有明确的结构依赖性。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
在化学实施例中，使用的保护氨基酸均为L构型，中间体和产物的纯度以TLC确认，FAB-MS用英国VG公司生产的ZAB-MS型高分辨GC/MS/DS联用仪测定。电喷雾质谱由美国HP公司生产的ES-5989X型质谱仪测定。旋光用Schmidt+Haensch公司生产的旋光仪(Polartronic D型)测定。熔点用显微熔点仪测定，温度计未校正。层析用硅胶由青岛海洋化工厂生产。Sephadex购自Sigma公司。
实施例1.Boc-Lys(ClZ)-OBzl的制备160mg(0.491mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到400mg(0.966mmol)Boc-Lys(ClZ)-OH的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得白色固体，该固体溶于无水DMF，滴加0.112ml(0.98mmol)溴苄，于50℃搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤。分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩，得标题化合物480mg(98.5％)，为无色油状物。
实施例2.HCl·Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.2mmol)Boc-Lys(ClZ)-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，40/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，抽去乙醚，得白色固体，该固体用石油醚(60-90℃)浸泡，倾去石油醚，如此反复数次后抽干得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例3.Boc-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备38mg(0.2mmol)Boc-Ala-OH溶于3ml无水THF中，冰浴下加入30mg(0.22mmol)N-羟基苯并三氮唑和45mg(0.22mmol)DCC。混合33min后待用。将88mg(0.2mmol)HCI·Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应4hr，TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤。分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物112mg(98％)，mp94-96℃，FAB-MS(m/e)5 75[M+H]+，475[M-Boc]+。
实施例4.HCl·Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备115mg(0.2mmol)Boc-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于4ml 4mol/L无水氯化氯/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，2hr后TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例5.Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备
280mg(1.3mmol)Boc-Pro-OH溶于30ml无水THF中，冰浴下加入170mg(1.26mmol)N-羟基苯并三氮唑和270mg(1.31mmol)DCC，混合30min后待用。将657mg(1.28mmol)HCI.Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应6hr，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物134mg(98％)mp86-88℃，FAB-MS(m/e)674[M+H]+实施例6.HCl·Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备128mg(0.19mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢，残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例7.Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将45mg(0.074mmol)HCI Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入33mg(0.077mmol)Boc-Arg(Tos)-OH，10mg(0.074mmol)N-羟基苯并三氮唑和16mg(0.077mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物70mg(96％)mp68-70℃，FAB-MS(m/e)984[M+H]+。
实施例8.HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备128mg(0.13mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例9.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备320mg(1.69mmol)Boc-Ala-OH溶于40ml无水THF中，冰浴-下加入220mg(1.63mmol)N-羟基苯并三氮唑和350mg(1.70mmol)DCC，混合30min后待用。将1490mg(1.63mmol)HCI.Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于25ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应16hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得白色泡状粉末1620mg(94％)mp96-98℃，FAB-MS(m/e)1076.7[M+Na]+，1093.4[M+K]+，954.9[M-Boc]+。
实施例10.Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备200mg(1.14mmol)Boc-Gly-OH溶于40ml无水THF中，冰浴下加入150mg(1.11mmol)N-羟基苯并三氮唑和235mg(1.14mmol)DCC，混合30min后待用。将930mg(1.01mmol)HCI.Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应12hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得白色泡状粉末770mg(73％)，mp82-84℃，FAB-MS(m/e)1038.6[M+H]+，1061.7[M+Na]+。
实施例11.Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备340mg(0.82mmol)Boc-Lys(ClZ)-OH溶于40ml无水THF中，冰浴下加入110mg(0.82mmol)N-羟基苯并三氮唑和170mg(0.82mmol)DCC，混合30min后待用。将746mg(0.81mmol)HCl.Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于50ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应16hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得白色泡状粉末850mg(81％)，mp78-88℃，FAB-MS(m/e)1111.3[M+H]+，1132.5[M+Na]+，1010.0[M-Boc]+。
实施例12.Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将467mg(0.51mmol)HCl.Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水DMF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入Boc-Gln-ONp195mg(0.53mmol)，室温反应96hr，TLC(氯仿/甲醇，9/1)显示原料点基本消失，停止反应，室温吹干溶剂，残留物用氯仿溶解，直接经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，10/1)分离纯化，得白色泡状粉末450mg(80％)，mp80-82℃，FAB-MS(m/e)1111.3[M+H]+，1132.5[M+Na]+，1010.0[M-Boc]+。
实施例13.Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将1160mg(1.26mmol)HCI.Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于50ml无水DMF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入Boc-Asn-ONp500mg(1.41mmol)，室温反应96hr，TLC(氯仿/甲醇，9/1)显示原料点基本消失，停止反应，室温吹干溶剂，残留物用氯仿溶解，直接经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，15/1)分离纯化，得白色泡状粉末800mg(57％)，mp86-88℃，FAB-MS(m/e)1097[M+H]+。
实施例14.Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将1636mg(1.78mmol)HCl Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入760mg(1.77mmol)Boc-Arg(Tos)-OH，240mg(1.78mmol)N-羟基苯并三氮唑和370mg(1.80mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点基本消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤。分出的有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得到标题化合物1330mg(58％)，mp90-92℃，FAB-MS(m/e)1293[M+H]+。
实施例15.H-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备250mg(0.237mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入2ml无水HF，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物100mg(77.8％)，mp224-6℃，FAB-MS(m/e)542[M+H]+。
实施例16.H-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备300mg(0.289mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物150mg(98％)，mp168-170℃，FAB-MS(m/e)528[M+H]+。
实施例17.H-Lys-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备290mg(0.227mmol)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物109mg(80％)，mp168-170℃，FAB-MS(m/e)599[M+H]+。
实施例18.H-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备250mg(0.225mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物130mg(96％)，mp180-182℃，FAB-MS(m/e)600[M+H]+。
实施例19.H-Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备102mg(0.1mmol)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物43mg(80％)，mp168-170℃，FAB-MS(m/e)585[M+H]+。
实施例20.H-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备280mg(0.188mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex GIO脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物100mg(85％)，mp168-170℃，FAB-MS(m/e)627[M+H]+。
实施例21.H-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备280mg(0.285mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物100mg(75％)，mp158-160℃，FAB-MS(m/e)472[M+H]+。
实施例22.H-Pro-Ala-Lys-OH的制备280mg(0.417mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应0.5hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物110mg(84％)，mp150-152℃，FAB-MS(m/e)315[M+H]+。
实施例23.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备1000mg(0.95mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于20ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 10ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物880mg(91％)。
实施例24.Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备230mg(0.221mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于6ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 2.5ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物180mg(86％)。
实施例25.Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备250mg(0196mmol)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 2.0ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物200mg(86％)。
实施例26.Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备770mg(0.694mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于18ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 7.0ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物610mg(86％)。
实施例27.Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备300mg(0.210mmol)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 2.0ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物230mg(83％)。
实施例28.Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备600mg(0.464mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于10ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 4.0ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物420mg(76％)。
实施例29.Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备500mg(0.51mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 5ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，15/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物380mg(84％)，mp 108-110℃，TOF-MS(m/e)893.2[M+H]+，915.5[M+Na]+，937.2[M+2Na]+。
实施例30.Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OH的制备135mg(0.2mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 2.0ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，20/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物100mg(86％)。
实施例31.Boc-Pro-OH的制备(1)Boc-N3法800mg(6.96mmol)脯氨酸悬浮于12ml无水DMF中，加入1.8ml三乙胺，冰浴搅拌下，30分钟内加入1.5mlBoc-N3，固体溶解，溶液澄清，室温搅拌3天，TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料基本反应完毕，停止反应，吹干溶剂，残留物以50ml乙酸乙酯溶解，依次以5％KHSO4、饱和氯化钠水溶液洗，酯层以无水硫酸镁干燥，过滤，蒸至近干时，将其浓溶液放置于冰箱内析晶，得1200mg白色结晶，收率80％。
(2)(Boc)2O法800mg(6.96mmol)脯氨酸悬浮于20ml无水THF中，加入2.5ml三乙胺，室温下加入1625mg(7.45mmol)(Boc)2O，室温搅拌过夜，TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料基本反应完毕，停止反应，蒸干溶剂，残留物以50ml乙酸乙酯溶解，依次以5％KHSO4，饱和氯化钠水溶液洗，酯层以无水硫酸镁干燥，过滤，蒸至近干时，将其浓溶液放置于冰箱内析晶，得1350mg白色结晶，收率90％。
实施例32.Boc-Pro-OBzl的制备33mg(0.10mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到43mg(0.20mmol)Boc-Pro-OH的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得白色固体，该固体溶于无水DMF，滴加34mg(0.2mmol)溴苄，于50℃恒温搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤。分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩，残留物以石油醚研磨，得标题化合物54mg(88％)，呈无色油状物。
实施例33.HCl-Pro-OBzl的制备61mg(0.2mmol)Boc-Pro-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，抽去乙醚，得白色固体，该固体用石油醚(60-90℃)浸泡，倾去石油醚，如此反复数次后抽干得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例34.Boc-Arg(Tos)-Pro-OBzl的制备将18mg(0.075mmol)HCI Pro-OBzl溶于5ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入33mg(0.077mmol)Boc-Arg(Tos)-OH，10mg(0.074mmol)N-羟基苯并三氮唑和16mg(0.077mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物37mg(80％)，mp60-62℃，FAB-MS(m/e)617[M+H]+。
实施例35.HCl·Arg(Tos)-Pro-OBzl的制备123mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例36.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl的制备280mg(1.3mmol)Boc-Ala-OH溶于30ml无水THF中，冰浴下加入170mg(1.26mmol)N-羟基苯并三氮唑和270mg(1.31mmol)DCC，混合30min后待用。将793mg(1.44mmol)HCI.Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水THF，滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，加入上面得到的混合物，0℃反应2hr后，室温反应6hr，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得到标题化合物550mg(55％)，mp86-88℃，FAB-MS(m/e)685[M+H]+，724[M+K]+。
实施例37.HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl的制备137mg(0.2mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例38.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-OH的制备550mg(0.80mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl溶于10ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 5ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，20/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物130mg(27％)。
实施例39.H-Ala-Arg-Pro-OH的制备105mg(0.153mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物10mg(19％)，mp150-2℃，FAB-MS(m/e)344[M+H]+。
实施例40.HCl·Ala-OBzl的制备1070mg(0.012mol)L-Ala加入到25ml苄醇和5g多磷酸得均匀溶液中，反应液在90-95℃反应4小时，然后将反应液倾入到含10ml浓盐酸的200ml水中，加入乙醚，分出水层，醚层用2％盐酸洗3次，合并水相，加固体碳酸钠使PH约为10，加100ml乙醚振摇，分出醚层，以无水硫酸钠干燥后，过滤，向滤液中通入无水氯化氢气体，有大量白色柱状沉淀生成，过滤，沉淀以无水乙醚洗，干燥，得1500mg(58％)，mp140-142℃，文献140℃。
实施例41.Boc-Pro-Ala-OBzl的制备将500mg(2.326mmol)HCI Ala-OBzl溶于50ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入500mg(2.326mmol)Boc-Pro-OH，300mg(2.222mmol)N-羟基苯并三氮唑和480mg(2.331mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物782mg(89％)mp100-101℃，FAB-MS(m/e)377[M+H]+。
实施例42.HCl·Pro-Ala-OBzl的制备75mg(0.2mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，30/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例43.Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl的制备将72mg(0.231mmol)HCl.Pro-Ala-OBzl溶于50ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，往反应液中加入100mg(0.234mmol)Boc-Arg(Tos)-OH，31mg(0.230mmol)N-羟基苯并三氮唑和48mg(0.233mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物120mg(75.6％)mp70-71.5℃，FAB-MS(m/e)688[M+H]+。
实施例44.HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl的制备137mg(0.2mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例45.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl的制备将45mg(0.072mmol)HCl·Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl溶于50ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入15mg(0.079mmol)Boc-Ala-OH，10mg(0.074mmol)N-羟基苯并三氮唑和16mg(0.077mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物粗品，经200-300目硅胶常压柱层析(展开剂CHCl3/CH3OH，30/1)分离纯化，得到标题化合物30mg(54％)mp80-82℃，FAB-MS(m/e)758[M+H]+。
实施例46.HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl的制备151mg(0.2mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl溶于3ml 4mol/L无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，20min后有白色沉淀生成，2hr后TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解，并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例47.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OH的制备550mg(0.726mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl溶于20ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 8ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，15/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物330mg(67％)。
实施例48.H-Ala-Arg-Pro-Ala-OH的制备250mg(0.330mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用SephadexG-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物80mg(58％)，mp157-159℃，FAB-MS(m/e)415[M+H]+。
实施例49.2，3，4，9-Tetrahydro-1H-Pyrido[3，4-b]-Indole-3-Carboxylic Acid的制备1g(5mmol)色氨酸加入到含0.5ml浓H2SO4的80ml水中，搅拌10分钟后，加入8ml甲醛(36-38％)，反应液澄清后即又析出大量固体，室温搅拌2hr后，用浓氨水调溶液PH值6-7，冰箱放置过夜，抽滤得黄色固体，将其溶于250ml 50％得乙醇中，加热到50℃，滴加浓氨水使溶液澄清，加入0.4g活性炭脱色，过滤，滤液浓缩析出大量固体，抽滤得类白色粉末6.0g，母液浓缩后得3.0g浅黄色固体，总收率85％。
实施例50.2-N-tert-Butyloxycarbonyl-3，4，9-Trihydro-1H-Pyri-do[3，4-b]-Indole-3-Carboxylic Acid的制备0.9g(4.17mmol)化合物(49)悬浮于含1.25g(Boc)2O和1.5ml三乙胺的15ml无水DMF溶液中，45℃下反应4hr，反应过程中化合物49渐渐溶解，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示反应完毕，蒸干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次用5％KHSO4，饱和NaCl洗，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干，氯仿重结晶得1g标题化合物，收率76％，TLC(氯仿/甲醇，20/1)与标准品一致，mp168-171℃，文献165-170℃。
实施例51.2，3，4，9-Tetrahydro-1H-Pyrido[3，4-b]-Indole-3-Carboxylic AcidBenzyl Ester的制备280mg(0.86mmol)Cs2CO3溶于蒸馏水，加入到540mg(1.71mmol)化合物(50)的无水乙醇溶液中，40min后减压除去溶剂，残留物置干燥器过夜，得白色固体，该固体溶于无水DMF，滴加0.2ml(1.75mmol)溴苄，于50℃恒温搅拌16hr后，滤除CsBr沉淀，滤液减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在37℃下减压浓缩至10ml体积时停止浓缩，往反应液中加入20ml 4mol/L无水氯化氢一乙酸乙酯溶液，室温搅拌，30min后有褐色沉淀生成，TLC(氯仿/甲醇，20/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，用饱和碳酸氢钠水溶液洗至碱性，再用饱和氯化钠水溶液洗，分出有机层并用无水硫酸钠干燥，过滤，蒸干得近白色固体400mg(76％)，TLC(氯仿/甲醇，20/1)与标准品一致。
实施例52.Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将320mg(1.046mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入600mg(1.031mmol)化合物30，140mg(1.037mmol)N-羟基苯并三氮唑和220mg(1.068mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物890mg(98％)，mp68-70℃，FAB-MS(m/e)872[M+H]+。
实施例53.Boc-KL-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将390mg(0.670mmol)HCI Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入210mg(0.686mmol)Boc-KL-OH，100mg(0.149mmol)N-羟基苯并三氮唑和150mg(0.728mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物520mg(89％)mp76-78℃，FAB-MS(m/e)870[M+H]+。
实施例54.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-KL-OBzl的制备将320mg(1.046mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入130mg(0.218mmol)化合物38，30mg(0.222mmol)N-羟基苯并三氮唑和45mg(0.218mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物140mg(73％)mp70-72℃，FAB-MS(m/e)886[M+H]+。
实施例55.Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl的制备将208mg(0.335mmol)HCI Ala-Arg(Tos)-Pro-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入110mg(0.348mmol)Boc-KL-OH，45mg(0.333mmol)N-羟基苯并三氮唑和72mg(0.350mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，15/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物150mg(51％)mp76-78℃，FAB-MS(m/e)883[M+H]+。
实施例56.Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将100mg(.326mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入290mg(0.338mmol)化合物29，40mg(0.296mmol)N-羟基苯并三氮唑和70mg(.340mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物340mg(89％)mp114-6℃，FAB-MS(m/e)884[M+H]+。
实施例57.Boc-KL-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将450mg(0.490mmol)HCI Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入180mg(0.570mmol)Boc-KL-OH，70mg(0.518mmol)N-羟基苯并三氮唑和120mg(0.582mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物500mg(83％)，白固，mp94-96℃，FAB-MS(m/e)1182[M+H]+，1214[M+CH3OH]+。
实施例58.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-KL-OBzl的制备将160mg(0.522mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入330mg(0.495mmol)化合物47，70mg(0.518mmol)N-羟基苯并三氮唑和110mg(534mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物200mg(42％)mp104-6℃，FAB-MS(m/e)1183[M+H]+。
实施例59.Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl的制备将250mg(0.361mmol)HCI Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入120mg(0.392mmol)Boc-KL-OH，50mg(0.370mmol)N-羟基苯并三氮唑和80mg(0.388mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物160mg(45％)mp98-100℃，FAB-MS(m/e)957[M+H]+实施例60.HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.080mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例61.HCl·Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.081mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例62.HCl·Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.068mmol)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例63.HCl·Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.076mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例64.HCl·Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.077mmol)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例65.HCl·Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备100mg(0.067mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例66.Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将280mg(0.915mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入860mg(0.893mmol)化合物23，120mg(0.889mmol)N-羟基苯并三氮唑和190mg(0.922mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物850mg(76％)mp109-110℃，FAB-MS(m/e)1253.9[M+H]+，1277.3[M+Na]+。
实施例67.Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将280mg(0.283mmol)HCI Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入100mg(0.316mmol)Boc-KL-OH，43mg(0.318mmol)N-羟基苯并三氮唑和65mg(0.315mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物300mg(84.7％)mp129-31℃，FAB-MS(m/e)1252.1[M+H]+，1274.0[M+Na]+，1152.7[M-Boc]+。
实施例68.Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备(将60mg(0.196mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入180mg(0.190mmol)化合物24，25mg(0.185mmol)N-羟基苯并三氮唑和40mg(0.194mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物220mg(93％)mp118-9℃，FAB-MS(m/e)1239.4[M+H]+，1275.7[M+K]+。
实施例69.Boc-KL-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将300mg(0.307mmol)HCI Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入115mg(0.364mmol)Boc-KL-OH，50mg(0.370mmol)N-羟基苯并三氮唑和75mg(0.364mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物270mg(72％)mp114-6℃，FAB-MS(m/e)1239.1[M+H]+，1261.4[M+Na]+，1137.9[M-Boc]+，1373.9[M+Cs]+。
实施例70.Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将53mg(0.173mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入200mg(0.1683mmol)化合物25，23mg(0.170mmol)N-羟基苯并三氮唑和36mg(0.175mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物200mg(80％)mp94-6℃，FAB-MS(m/e)[M+H]+1477。
实施例71.Boc-KL-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将330mg(0.271mmol)HCI Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入90mg(0.285mmol)Boc-KL-OH，40mg(0.296mmol)N-羟基苯并三氮唑和60mg(0.291mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物320mg(79％)mp86-88℃，FAB-MS(m/e)1477[M+H]+实施例72.Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将180mg(0.570mmol)化合物(51)溶于25ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入540mg(0.529mmol)化合物26，70mg(0.52mmol)N-羟基苯并三氮唑和120mg(0.582mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物550mg(79％)mp118-120℃，FAB-MS(m/e)1311.4[M+H]+，1333.4[M+Na]+，1209.1[M-Boc]+。
实施例73.Boc-KL-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将440mg(0.421mmol)HCI Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于35ml无水DMF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入140mg(0.443mmol)Boc-KL-OH，60mg(0.444mmol)N-羟基苯并三氮唑和90mg(0.437mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物250mg(45％)mp126-8℃，FAB-MS(m/e)1309.3[M+H]+，1209.3[M-Boc]+。
实施例74.Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将13mg(42.48umol)化合物(51)溶于10ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入40mg(39.76umol)化合物27，6mg(44.44mol)N-羟基苯并三氮唑和9mg(43.69umol)DCC的无水DMF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物40mg(77％)mp115-7℃，FAB-MS(m/e)1553[M+8CH3OH+H]+。
实施例75.Boc-KL-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将94mg(0.091mmol)HCI Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水DMF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入30mg(0.095mmol)Boc-KL-OH，20mg(0.148mmol)N-羟基苯并三氮唑和25mg(0.121mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物50mg(42％)mp123-126℃，FAB-MS(m/e)1351[M+C4H9]+实施例76.Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl的制备将120mg(0.392mmol)化合物(51)溶于35ml无水THF，0℃下依次往反应液中加入420mg(0.349mmol)化合物28，50mg(0.370mmol)N-羟基苯并三氮唑和80mg(0.388mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物230mg(44％)mp96-99℃，FAB-MS(m/e)1491[M+H]+。
实施例77.Boc-KL-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl的制备将665mg(0.541mmol)HCI Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于15ml无水THF，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，保持在0℃，依次往反应液中加入180mg(0.570mmol)Boc-KL-OH，80mg(0.592mmol)N-羟基苯并三氮唑和120mg(0.582mmol)DCC的无水THF溶液，0℃反应2hr后，转入室温反应5hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，滤除DCU，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，得到标题化合物350mg(43％)，mp120-122℃，FAB-MS(m/e)1492[M+H]+。
实施例78.H-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备500mg(0.330mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应0.5hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集标题化合物水溶液，冷冻干燥后得标题化合物250mg(85％)，mp130-134℃，FAB-MS(m/e)669[M+H]+实施例79.H-KL-Prolyl-Alanyl-Lysine的制备200mg(0.230mmol)Boc-KL-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入3ml无水HF，0℃反应0.5hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物70mg(67％)，mp 186-188℃，FAB-MS(m/e)513[M+H]+。
实施例80.H-Ala-Arg-Pro-KL-OH的制备120mg(0.230mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应0.5hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集标题化合物水溶液，冷冻干燥后得标题化合物250mg(85％)，mp130-134℃，FAB-MS(m/e)669[M+H]+。
实施例81.H-KL-Alanyl-Arginyl-Proline的制备120mg(0.230mmol)Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Obzl与1ml苯甲醚混合后，通入3ml无水HF，0℃反应0.5hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物40mg(55％)，mp 186-188℃，FAB-MS(m/e)541[M+H]+。
实施例82.H-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备220mg(0.186mmol)Boc-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入3ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物60mg(48％)，mp114-116℃，FAB-MS(m/e)667[M+H]+。
实施例83.H-KL-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备440mg(0.373mmol)Boc-KL-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1.5ml苯甲醚混合后，通入1ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 3ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物240mg(96％)，mp240-245℃分解。FAB-MS(m/e)669[M+H]+。
实施例84.H-Ala-Arg-Pro-Ala-KL-OH的制备220mg(0.186mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入3ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用SephadexG-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物60mg(48％)，mp114-116℃，FAB-MS(m/e)612[M+H]+。
实施例85.H-KL-Ala-Arg-Pro-Ala-OH的制备440mg(0.373mmol)Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl与1.5ml苯甲醚混合后，通入1ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 3ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物240mg(96％)，mp240-245℃分解。FAB-MS(m/e)612[M+H]+。
实施例86.H-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备100mg(0.080mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与0.5ml苯甲醚混合后，通入1ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物50mg(84.6％)，mp236-239℃分解，ESI-MS(m/e)741[M+H]+。
实施例87.H-KL-Ala-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备100mg(0.080mmol)Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入0.5ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物45mg(76％)，mp220-224℃分解，FAB-MS(m/e)740[M+H]+。
实施例88.H-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备100mg(0.081mmol)Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-KL-OBzl与0.5ml苯甲醚混合后，通入1ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物50mg(85％)，mp214-218℃，FAB-MS(m/e)726[M+H]+。
实施例89.H-KL-Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备250mg(0.330mmol)Boc-KL-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用SephadexG-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物45mg(75％)，mp210-213℃，FAB-MS(m/e)726[M+H]+。
实施例90.H-Lys-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备185mg(0.125mmol)Boc-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与0.5ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，-再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物90mg(87％)，mp250-260℃，FAB-MS(m/e)797[M+H]+。
实施例91.H-KL-Lys-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备290mg(0.196mmol)Boc-KL-Lys(ClZ)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物130mg(83％)，mp206-208℃，FAB-MS(m/e)797[M+H]+。
实施例92.H-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备280mg(0.200mmol)Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入3ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物130mg(81％)，mp230-232℃分解，FAB-MS(m/e)798[M+H]+。
实施例93.H-KL-Gln-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备250mg(0.330mmol)Boc-KL-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物80mg(58％)，mp218-220℃，FAB-MS(m/e)797[M+H]+。
实施例94 H-Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备200mg(0.182mmol)Boc-Asn-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物70mg(51％)，mp198-200℃，FAB-MS(m/e)782[M+H]+。
实施例95 H-KL-Asn-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备250mg(0.330mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用SephadexG-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物80mg(58％)，mp211-214℃，FAB-MS(m/e)784[M+H]+。
实施例96 H-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-KL-OH的制备200mg(0.134mmol)Boc-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OBzl与0.5ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物80mg(72％)，mp208-212℃分解，FAB-MS(m/e)825[M+H]+。
实施例97 H-KL-Arg-Arg-Pro-Ala-Lys-OH的制备340mg(0.228mmol)Boc-KL-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl与1ml苯甲醚混合后，通入2ml无水HF，0℃反应2hr，减压除去HF，再次通入无水HF 2ml，0℃反应1hr，减压除去HF，残留物用无水乙醚固化，抽滤后的固体物用Sephadex G-10脱盐，蒸馏水为流动相，茚三酮检测收集水溶液，冷冻干燥后得标题化合物130mg(69％)，mp238-240℃分解，FAB-MS(m/e)825[M+H]+。
实施例98 Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OH的制备550mg(0.439mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl溶于10ml甲醇中，冰浴下滴加2mol/L NaOH 50ml，30min后TLC(氯仿/甲醇，10/1)检测原料点消失，加入适量2mol/L HCl中和反应液至pH7，减压浓缩蒸去甲醇，残留物加适量2mol/L HCl使pH1-2，倾入大量蒸馏水中，有大量白色沉淀生成，抽滤，滤饼以蒸馏水洗涤数次，置干燥器中过夜，得标题化合物450mg(88％)，FAB-MS(m/e)1201.2[M+K]+。
实施例99HCl·Ala-Arg-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OH的制备100mg(0.086mmol)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ)-KL-OH溶于5ml无水氯化氢/乙酸乙酯溶液，室温搅拌，5hr后TLC(氯仿/甲醇，5/1)显示原料点消失。反应混合物在室温下减压浓缩，残留物用乙酸乙酯溶解并在室温下浓缩，如此反复数次，直到除净游离的氯化氢。残留物用无水乙醚研磨，得标题化合物，直接用于下一步反应。
实施例100.Cyclo(Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(ClZ))的制备100mg化合物(93)溶于2ml无水DMF中，0℃下加入15mg(0.111mmol)N-羟基苯并三氮唑和20mg(0.097mmol)DCC，0℃反应5hr后，TLC显示原料点消失，加入无水DMF 200ml，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，0℃下滴加N-甲基吗啉使溶液pH8-9，转入室温反应36hr，TLC(氯仿/甲醇，10/1)显示原料点消失，停止反应，吹干溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解，依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液、5％硫酸氢钾水溶液洗涤，分出的有机层用无水硫酸镁干燥。过滤，滤液在37℃减压浓缩至干，残留物走大板分离得到标题化合物10mg(10％)，ESI-MS(m/e)1045[M+H]+，1061[M+H2O]+。
实施例101.通式(3)、(6)、(7)的溶栓活性101.1血栓的制备往垂直固定的玻璃管(长15mm，内径2.5mm，外径5.0mm，管底用胶塞密封)中注入0.1ml枸橼酸化的大鼠动脉血液，该血液复钙未凝。往管内迅速插入一根不锈钢质料的血栓固定螺栓。该血栓固定螺栓用直径为0.2mm的不锈钢丝绕成，螺旋部分长12mm，含15个螺圈，螺圈的直径为1.0mm，托柄与螺旋相连，长7.0mm，呈问号型。血液凝固15分钟后，打开玻璃管底部的胶塞，用镊子固定血栓固定螺旋的托柄，从玻璃管中小心地取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精确称重(质量范围为74-84mg)。
101.2旁路管道的制备旁路管道由3段构成，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm，两端为相同的聚乙烯管，长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm，该管的一端拉紧成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm，另一端的外部套一段长7.0mm，外径3.5mm的聚乙烯管，用于插入中段的聚乙烯管内。3段管的内壁均硅烷化。将精确称重的血栓包裹的血栓固定螺栓放入中段聚乙烯管内，胶管的两端分别与刚描述过的两根聚乙烯管的套管端相连。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50 IU/kg体重)，备用。
101.3大鼠颈动静脉旁路插管模型Wistar大鼠(雄性，250～300g)按80mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定后进行手术分离气管，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将上面制备好的旁路管道的尖管由斜口插入左颈外静脉开口的近心端，同时远离旁路管中段血栓固定螺栓的托柄。用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50Iu/kg)，此时注射器不要撤离聚乙烯管。在右颈总动脉的近心端用动脉夹止血，在距动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部插入动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线与动静脉固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从动脉流向静脉。于是，构成了大鼠动静脉旁路溶栓模型。
101.4通式(3)(6)(7)的化合物的溶栓作用用头皮针将生理盐水(3ml/kg)、尿激酶的生理盐水溶液(20000IU/kg)、通式(3)、(6)、(7)的化合物的生理盐水溶液(10umol/kg)通过旁路管的中段刺入远离血栓固定螺旋的近静脉处，缓慢注入到血液中(大约6分钟)。使生理盐水(空白对照)、尿激酶(阳性对照)以及通式(3)、(6)、(7)的化合物过血液循环，按静脉—心脏—动脉的顺序作用到血栓上。从开始注射对照液或药物溶液开始计时，1.5小时后从旁路管中取出血栓固定螺栓，精确称重，求出每只大鼠旁路管道中血栓固定螺栓进入旁路管道前后的质量差，统计各组动物的血栓质量差值(x±S)，并进行t检验，数据列入表1。
表1.通式(3)、(6)、(7)的化合物的溶栓作用组别剂量(剂量/kg)血栓减重(x±S)NS3ml 15.31±3.57UK20000IU 24.10±3.54P6A 5.4mg18.84±3.181)2)GP6A 5.3mg25.90±2.051)QP6A 6.0mg21.28±3.461)2)dAKL 7.4mg26.43±3.841)dKLA 7.4mg16.13±7.832)dGKL 7.2mg24.02±5.211)dKLG 7.2mg19.7±3.712)dQKL 8.0mg22.88±9.211)dKLQ 8.0mg17.27±3.572)dPAKKL5.1mg26.40±4.211)3)dPAKKL2.5mg22.31±3.661)dPAKKL0.5mg18.22±5.842)3)dKLPAK5.1mg20.80±3.962)1)与NS相比，P＜0.05；2)与UK相比，P＜0.05；3)与dPAKKL2.5mg/mg相比，P＜0.05，N＝9结果表明，dPAKKL的溶栓活性具有剂量依赖性。10umol/kg组，5umol/kg组和1umol/kg组的溶栓活性与剂量具有线性相关性。P6A组，GP6A组和QP6A组溶栓活性呈结构依赖性。dXKL(X＝Ala，Gly，Gln，PAK)组活性与UK相当，相应的dKLX(X＝PAK，Ala，Gly，Gln)组没有溶栓活性。
权利要求
1.通式(1)、(3)、(4)和(5)的P6A相关序列多肽，是通过液相法逐步接肽，或者进一步脱保护制得Boc-AA1-AA2-Pro-Ala-Lys(ClZ)-OBzl(1)H-AA1’-AA2’-Pro-Ala-LysOH(3)HCl·AA1-AA2-Pro-Ala-Lys(C1Z)-OBzl(4)Boc-AA1-AA2-Pro-Ala-Lys(ClZ)OH(5)其中AA1和AA2共同为H，或AA1为A、G、Q、K、N或R，AA2为Arg(Tos)残基；AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A、G、Q、K、R或N，AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。
2.通式(2)、(8)、(9)和(10)的P6A相关序列多肽，是通过液相法逐步接肽，或者进一步脱保护制得Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-AA3-OBzl (2)H-Ala-Arg-Pro-AA3OH(8)HCl·Ala-Arg(Tos)-Pro-AA3-OBzl (9)Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-AA3OH(10)在上述各式中，其中AA3为Ala残基或AA3缺失。
3.一种拟肽，其特征在于它包括了P6A相关序列多肽和咔啉羧酸残基。
4.根据权利要求3的拟肽，其特征在于它包括了以下通式的化合物及其衍生物 其中AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A，G，Q，K，R或N，AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。 其中AA1’和AA2’共同为H；或AA1’为A，G，Q，K，R，N，或AA2’为Arg残基；或AA1’为H，AA2’为Arg残基。 其中AA3为Ala残基或AA3缺失。 其中AA3为Ala残基或AA3缺失。
5.通式(6)的化合物的制备方法，包括将权利要求1中通式(4)的化合物与N-Boc-咔啉羧酸的羧基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(6)的化合物。
6.通式(7)化合物的制备方法，包括将权利要求1中通式(5)的化合物与咔啉羧酸苄酯的氨基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(7)的化合物。
7.通式(11)的化合物的制备方法，包括将权利要求2中通式(9)的化合物与N-Boc-咔啉羧酸的羧基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(11)的化合物。
8.通式(12)的化合物的制备方法，包括将权利要求2中通式(10)的化合物与咔啉羧酸苄酯的氨基缩合，缩合产物经HF脱保护得通式(12)的化合物。
9.权利要求1或2的P6A相关序列多肽作为溶血栓剂的应用。
10.权利要求1或2的P6A相关序列多肽在制药中，尤其在制备治疗血栓性疾病，如冠心病、脑血栓、心肌梗塞、脑栓塞、肺栓塞、静脉血栓形成等的药物中的应用。
11.权利要求3或4的拟肽作为溶血栓剂的应用。
12.权利要求3或4的拟肽在制备治疗血栓性疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及P6A相关序列的保护中间体化合物以及脱保护产物的化合物,涉及将脱保护产物的化合物与咔啉羧酸的羧基偶联并脱保护生成相应的拟肽,以及将脱保护产物的化合物与咔啉羧酸的仲氨基偶联并脱保护生成相应的拟肽;涉及它们的制备方法,以及进一步涉及它们在医学中的应用,例如作为溶血栓剂的应用。本发明的化合物表现了较强的溶栓活性。
文档编号C07K7/06GK1373139SQ0210042
公开日2002年10月9日 申请日期2002年1月28日 优先权日2002年1月28日
发明者彭师奇, 赵明, 王超, 吴艳芬 申请人:广州白云山制药股份有限公司广州白云山制药总厂