专利名称：水仙子糖肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从水仙子中提取的活性物质水仙子糖肽及用途。
背景技术：
自然界中植物、微生物、动物都含有多糖，除以游离态存在外，也可与蛋白质相结合的形式存在。糖与蛋白质结合成糖蛋白，是一些组织器官的结构物质。目前常见的有从牛膝中提取的牛膝糖肽、从猪的小肠中提取的肝素、从猪鼻喉软骨中提取的硫酸软骨素等。专利文献中还记载了从枸杞子中提取的枸杞糖肽。由于原料来源不同，提取物的生物活性也不同。同时受原料来源不同的限制，没有一个统一规范的提取工艺。
水仙子又称五谷虫、工程蝇蛆，从水仙子中提取壳聚糖有已有技术。但目前未发现从水仙子中提取糖肽的记载。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从水仙子中提取的水仙子糖肽，同时提出水仙子糖肽的用途。
本发明的水仙子糖肽，其特征在于为从水仙子中提取的水溶性活性物质，其中糖蛋白的含量为75～97％。
糖蛋白的含量优选为75～92％，为多糖和肽结合结构，分子量为2600～4200。其中多糖含量以无水葡萄糖计不低于糖肽(按干燥品计)总量的25.0％，肽含量不低于糖肽(按干燥品计)总量的50％。优选多糖含量为25～35％，肽含量为50～70％。
水仙子糖肽的用途是制备抗肿瘤药物。其中的糖蛋白为有效活性组分。
水仙子的提取方法，本发明提供的一种方法为将水仙子中的蛋白质凝固，制成熟水仙子，加水打浆成浆液，然后进行酶解得酶解液，灭活酶解液，离心分离得到上清液，然后对上清液进行处理。
水仙子先形成熟水仙子，使蛋白质凝固的方法，可以按照已有技术的多种方式，最常见是通过蒸煮的方法。具体工艺可优选水仙子与1～2倍重量的水在100℃下煮5～10分钟。
熟水仙子用水打浆成浆液，优选熟水仙子与1～3倍重量的水进行打浆。浆液在PH为7～7.5、40～45℃、中性蛋白酶下酶解3～5小时得到酶解液，然后灭活酶解液，使酶终止反应。灭活酶解液进行离心分离，得到上清液和渣，分离出上清液。在酶解时，中性蛋白酶可采用适合的蛋白酶，优选1398中性蛋白酶。
以上得到的上清液，其处理过程包括用有机溶剂进行沉淀，对沉淀物进行溶解提纯，提纯液干燥。给出如下一种具体的操作步骤上清液经过真空浓缩去掉水成浓缩液，离心除渣，清液用乙醇沉淀，分离出沉淀，沉淀用水溶解，得到的水溶液再离心除杂，清液在120～170℃下喷雾干燥得到水仙子糖肽。
所述浓缩液的浓度为20～25％。所用乙醇的浓度最好≥95％，沉淀时间至少为12小时。也可采用其它的有机溶剂，如其它醇类、丙酮。乙醇的用量可选择按照沉淀前的清液∶乙醇＝1∶4～5(体积比)，乙醇量再多一点不影响整个工艺。
上述得到的水仙子糖肽为棕色或棕黄色无定形粉末，气微，味特异，有引湿性。本品在水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中不溶。
以下为有关实验结果一、采用高效凝胶色谱法测定水仙子糖肽的分子量及分子量分布以不同分子量的葡萄糖作为对照品，以三批水仙子糖肽作为样品测定，结果为
在RI-6A示差折光检测器检测出的糖肽色谱图见图1。
试验结果表明，水仙子糖肽(糖蛋白)的分子量为2600～4200，分子量分布为1.0～1.1。由图1的色谱图，在样品出峰处只有一个单独峰形、而无其它峰形出现，可以推断，水仙子糖肽(糖蛋白)是多糖与肽连接在一起的一个整体结构。
二、水仙子糖肽的组成。
1、通过紫外检测法测定水仙子糖肽中肽的组成总氨基酸含量为600～700μg/mg、游离氨基酸含量在39～51μg/mg、组成肽类的结合氨基酸含量为570～660μg/mg。
2、氨基酸分析仪测定肽中氨基酸的种类水仙子糖肽由18种氨基酸组成，构成肽的氨基酸含量为500～530μg/mg。18种氨基酸的组成及比例为名称 g/100g 名称 g/100g天冬氨酸 6.43-6.96 苏氨酸 1.67-1.92丝氨酸 1.91-2.21 谷氨酸 10.00-10.65甘氨酸 2.44-2.55 丙氨酸 2.28-2.40胱氨酸 0.19-0.26 缬氨酸 1.50-1.58蛋氨酸 0.60-0.66 异亮氨酸0.96-1.01亮氨酸 1.43-1.52 酪氨酸 1.55-1.65苯丙氨酸 1.73-1.85 赖氨酸 5.11-5.49组氨酸 1.63-1.74 精氨酸 3.05-3.18脯氨酸 1.38-1.45 色氨酸 0.45-0.513、水仙子糖肽中多糖的组成气相色谱分析结果，水仙子糖肽中的多糖组分主要由葡萄糖和岩藻糖组成，二者分别占糖肽中总糖量的83.4％和16.6％。
4、水仙子糖肽中多糖含量的测定按照分光光度法，以六批样品测定，多糖含量在25～35％之间。
由于目前对糖肽类尚无理想的测定方法，因此以上实验用来证明了水仙子糖肽属于糖肽结构。从样品的实验数据可以看出，水仙子糖肽(糖蛋白)的分子量约2600～4200，其中多糖含量为25～35％，主要由葡萄糖和岩藻糖组成，二者的比例为83.4∶16.6；肽由18种氨基酸组成，含量为500～700mg/g，这些已知组分构成水仙子糖肽的75％以上，是药效学的主要作用所在。除此以外，还有水分、钠离子以及糖残基中可能存在的取代基等部分未知成分。
四水仙子糖肽的主要药效学研究水仙子糖肽是从五谷虫体内提取的具有生物活性的化合物，根据其化学结构、组成分析和药效试验筛选，我们从调节免疫、抑瘤、减毒等三个方面对其进行了初步的药效学研究，现将试验结果报告如下。
<一>、试验材料1.药品水仙子糖肽 山东淄博顺达企业集团总公司提供，批号970323、991028；呋喃脲嘧啶(FT207)济南制药厂生产，批号951207、981003；环磷酰胺 沈阳药科大学制药厂生产，批号961120；复方阿胶浆 山东东阿阿胶集团生产，批号960913。2.动物昆明种小鼠、BALB/C小鼠、SD种大鼠，分别由山东医科大学实验动物(合格证号鲁动质960102、970101、970103)、北京医科大学实验动物科学部(合格证号医动字第01-3046号)提供。3.瘤株和靶细胞S180瘤株、H22瘤株、艾氏腹水癌瘤株，由中国医科院药物所引进、代传；NK敏感细胞Yac-1株，山东医科院基础所免疫室提供；IL-2依赖株CTLL细胞，山东泉城生物技术研究所提供。4.试剂3H-TdR(氚标记的脱氧胸腺嘧啶核苷) 中国科学院原子能研究所(20ci/mM)961019；RPMI1640 GI810 laboratoyies CatNO430-1800EB；FCS(胎牛血清)大连生物制品研究所96810；MTT(噻唑蓝)USA.Sigma Spo120-3；ConA(刀豆蛋白A)USA.Sigma typeVI，活性＜64ug/ml，11028-71-0；IL-2中国军事医学科学院，911201效价400Iu/Amp；CD4(L3T4抗体)、CD8(Lyt-2抗体)试剂盒，北京医科大学免疫教研室提供；5.仪器酶标仪 日本岛津BIO-TEK Intrument Incomp MicroplateEL309；ZT-NB型多头细胞收集器 浙江东浦医疗器械厂；β-液体闪烁计数器，EG2101型，国产；96孔、24孔微量细胞培养板Costar产；恒温箱，荧光显微镜(Olimpas)，德国产。<二>、实验方法与结果1.免疫试验1.1对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响取20～24g健康小鼠，参照文献<新药(西药)临床前研究指导原则汇编>方法进行实验。计算巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，结果见表1。(实验过程略)表1.对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(X±SD)组别 剂量动物数吞噬率 P值 吞噬指数 P值(g/kg)(只) (％)正常对照组-1044.60±5.52＜0.0010.80±0.09 ＜0.001荷瘤对照组-1535.29±3.38- 0.49±0.04 -复方阿胶浆21060.80±3.91＜0.0011.11±0.09 ＜0.001水仙子糖肽组 41041.40±4.17＜0.0010.59±0.09 ＜0.01水仙子糖肽组 21058.22±6.78＜0.0010.80±0.10 ＜0.001水仙子糖肽组 11049.11±4.99＜0.0010.78±0.11 ＜0.001
吞噬百分率＝[吞噬CRBC的吞噬细胞数/200个巨噬细胞数(吞与未吞)]×100％吞噬指数＝被吞噬的CRBC数/200个巨噬细胞由表1结果可见，荷瘤对照组的腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数均明显低于正常对照组，表明荷瘤组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能低下，而水仙子糖肽大、中、小三个剂量组的上述指标均明显高于荷瘤对照组(P＜0.001)，说明水仙子糖肽可明显提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能。
1.2对荷瘤小鼠迟发性变态反应的影响取体重19～21g健康小鼠，参照文献<新药(西药)临床前研究指导原则汇编>第135页方法进行实验，结果见表2。(实验过程略)表2.水仙子糖肽对荷瘤小鼠DTH反应的影响(X±SD)组别动物数剂量 DTH P值(只)(g/kg) (mg)正常对照组10 - 2.70±0.64 ＜0.001荷瘤对照组9- 1.22±1.03 -荷瘤空白组9- 1.11±0.99 -复方阿胶浆92 3.44±0.83 ＜0.001水仙子糖肽组 10 4 3.10±1.51 ＜0.001水仙子糖肽组 10 2 3.56±1.42 ＜0.001水仙子糖肽10 1 3.33±1.41 ＜0.001表2结果显示，荷瘤对照组的DTH值明显低于正常对照组，与未致敏的荷瘤空白组基本相同；而水仙子糖肽三个剂量组的DTH值则明显高于荷瘤对照组(P＜0.001)，与正常对照组比较无显著性差异；表明水仙子糖肽可提高荷瘤小鼠的DTH反应，使其受损的免疫功能恢复正常。
1.3对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响取18～22g昆明种小鼠，无菌条件下抽取传代7天的S180瘤细胞混悬液，用生理盐水稀释(约相当于1×107个瘤细胞/ml)，与小鼠右腋皮肤碘酒消毒后，皮下注入瘤细胞稀释悬液0.2ml/只；24小时后随机分为模型对照组、FT207阳性对照组(0.125g/kg)和水仙子糖肽大、中、小(4g、2g、1g/kg)三个剂量组，除模型对照组灌胃生理盐水外，其余各组动物每日灌胃给药一次，连续9天(灌胃体积均为0.25ml/10g)，于末次给药后2日，脱颈椎处死小鼠，取胸腺、脾脏，称重，计算胸腺指数与脾指数，结果见表3。
表3.水仙子糖肽对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响(X±SD)组别 动物数 剂量胸腺指数 脾指数(只) (g/kg) (mg/10g) (mg/10g)荷瘤对照组 9- 22.26±11.13 81.83±22.19FT207组10 0.125 15.68±7.8972..22±34.34水仙子糖肽组 10 4 30.62±12.94*92.02±18.24水仙子糖肽组 92 21.93±11.21 73.83±11.22水仙子糖肽组 10 1 28.83±8.58**76.00±13.66与FT207比较*P＜0.05**P＜0.01表3结果表明，化疗药FT207可使荷瘤小鼠的胸腺指数明显降低(与荷瘤对照组比较降低29.56％)，而水仙子糖肽则可明显提高荷瘤小鼠的胸腺指数，与化疗药FT207组比较有显著性差异(P＜0.05)。
1.4对荷瘤小鼠IL-2活性的影响结果见表4。
表4.水仙子糖肽对荷瘤小鼠IL-2水平的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 体重 OD值 IL-2活性(g/kg) 开始 结束 变化(g)正常对照组 -10 10 -1.57 0.0595±0.04 2.281±2.108荷瘤对照组 -14 14 -0.91 0.0535±0.03 2.187±1.656FT207组 0.12514 12 -3.59 0.0784±0.05 2.655±2.060水仙子糖肽 214 12 -1.90 0.1942±0.04 8.125±1.749*#水仙子糖肽 114 13 -1.71 0.3414±0.05 31.25±2.061*#*与荷瘤组比较P＜0.001，#与FT207组比较P＜0.001表4结果表明，水仙子糖肽可使荷瘤小鼠的IL-2水平明显升高，对调节荷瘤小鼠机体免疫功能，抑制肿瘤有积极的作用，与荷瘤组动物比较具有显著性差异(P＜0.001)。
1.5对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响表5.水仙子糖肽对荷瘤小鼠NK细胞毒的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 NK细胞毒性 P值(g/kg) 开始 结束 (％) * #★正常对照组- 101022.74±6.00 ＜0.05 ＜0.051 -荷瘤对照组- 141233.48±11.00-＞0.05＜0.05FT207组 0.125 121032.00±10.60＞0.05 - ＜0.05水仙子糖肽4 121261.61 ±14.00 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001水仙子糖 2 121251.46±5.00 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001水仙子糖肽1 121245.67±11.00＜0.001 ＜0.001 ＜0.001*与荷瘤组比较，#与FT207组比较，★与正常组比较细胞活性及诱导IL-2活性的增强，对抑制肿瘤生长发挥了积极作用。
1.6对荷瘤小鼠T细胞亚群的影响在T淋巴细胞静活化期，其细胞膜表面出现的抗原性不同的糖蛋白分子，其作用也不同。由于这些分子在T细胞表面的表达相当稳定，这些具有不同抗原性的分子，又称为T细胞表面抗原或表面标志可用以鉴别T细胞及功能状态。存在于小鼠成熟的杀伤(TC)/抑制(TS)T细胞表面的Lyt-2抗原，称为CD8分子，它能增强抗原识别受体(TCR)对外来抗原和自身MHC I类抗原的结合，以增强识别；存在于小鼠成熟的杀伤/抑制T细胞表面的L3T4分子称为CD4分子，它能增强抗原识别受体(TCR)对外来抗原和自身MHC II类抗原的结合。检测T细胞亚群中的CD4、CD8表面分子的表达与比例关系，有助于了解药物的抗肿瘤活性与免疫功能之间的关系，因此，我们进行了水仙子糖肽对纯系荷瘤小鼠(S180)的T细胞亚群影响的试验，现将试验结果报告如下。结果见表6～8。实验过程略。
表6.水仙子糖肽对S180荷瘤小鼠T细胞亚群CD4的影响(X±SD)
组别 剂量 动物数CD4P值(g/kg) 开始 结束 与荷瘤组比 与正常组比正常对照组- 101029.40±4.59＜0.001 /荷瘤对照组- 101019.60±5.18/ ＜0.001FT207组 0.15108 18.29±2.25＞0.05＜0.001水仙子糖肽4 101016.60±5.39＞0.05＜0.001水仙子糖肽2 101018.50±6.97＞0.05＜0.001水仙子糖肽1 101014.10±3.48＜0.05＜0.001表7.水仙子糖肽对S180荷瘤小鼠T细胞亚群CD8的影响(X±SD)组别 剂量 动物数CD8P值(g/kg)开始 结束与荷瘤组比 与正常组比正常对照组-10 1023.20±5.00 ＜0.001 /荷瘤对照组-10 108.50±2.94/ ＜0.001FT207组 0.15 10 8 12.43±3.50 ＜0.05 ＜0.001水仙子糖肽410 1023.00±9.66 ＜0.001 ＞0.05水仙子糖肽210 1029.00±7.27 ＜0.001 ＞0.05水仙子糖肽110 1016.10±6.58 ＜0.001 ＜0.05表8.水仙子糖肽对S180荷瘤小鼠T细胞亚群CD4/CD8的影响(X±SD)组别 剂量 动物数 CD4/CD8P值(g/kg) 开始 结束 与荷瘤组比 与正常组比正常对照组- 10 101.32±0.31 ＜0.001 /荷瘤对照组- 10 102.53±0.91 /＜0.001FT207组 0.1510 81.57±0.42 ＜0.05 ＞0.05水仙子糖肽4 10 100.84±0.41 ＜0.001 ＜0.01水仙子糖肽2 10 100.65±0.21 ＜0.001 ＜0.001水仙子糖肽1 10 100.99±0.40 ＜0.001 ＞0.05表6～8结果显示，荷瘤小鼠除小剂量水仙子糖肽组外，其余各给药组的CD4值与荷瘤对照组比较无显著性差异，而各荷瘤组小鼠与正常组比较均有显著性差异；说明接种肿瘤后，对动物的辅助性T细胞CD4亚群是有影响的，但水仙子糖肽对CD4的变化影响不大；除小剂量水仙子糖肽组外，各给药组小鼠CD8值与正常组比较均无显著性差异，而水仙子糖肽各剂量组与荷瘤对照组比较CD8，则有显著性差异(P值均＜0.001)，说明水仙子糖肽对荷瘤动物的细胞毒性T细胞CD8亚群有明显影响；由于荷瘤小鼠体内受到瘤细胞的侵蚀，其正常的T细胞亚群比例受到多方面因素的影响而失去平衡，因此给药后CD4/CD8的变化亦非常明显，水仙子糖肽各剂量组与荷瘤对照组比较均有显著性差异(P＜0.001)，除小剂量水仙子糖肽组外，各给药组小鼠与正常组比较亦有显著性差异。
在疾病状态下，局部浸润的T细胞及其功能状态，关系到疾病的病理过程及疾病的愈合。
上述试验结果显示，水仙子糖肽具有较好的机体免疫调节作用；通过增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、调节机体免疫功能、影响T细胞亚群的活性、提高NK细胞活性及诱导IL-2活性的增强，对抑制肿瘤生长发挥了积极的作用。
2.抑瘤试验2.1对S180瘤株的抑制作用(实验过程略)结果见表9～11。
表9水仙子糖肽对荷瘤小鼠S180瘤体生长的影响(一)组别 剂量 给药 动物数 瘤体重(g) 抑瘤率(g/kg) 途径 开始结束(X±SD)(％)模型对照组25ml×9 P.024 21 1.25±0.60 -FT207组 0.125×9P.010 9 0.49±0.24 60.81***水仙子糖肽4×9P.010 9 0.70±0.45 44.00*水仙子糖肽2×9P.010 9 0.80±0.24 36.00*水仙子糖肽1×9P.010 9 1.44±0.52 -15.20与荷瘤组比较***P＜0.001*P＜0.05
表10水仙子糖肽对荷瘤小鼠S180瘤体生长的影响(二)组别 剂量 给药 动物数 瘤体重 抑瘤率(g/kg) 途径 开始 结束(X±SD) (％)模型对照组25ml×9P.025 231.28±0.88-FT207组 0.1259 P.010 9 0.40±0.2568.75**水仙子糖肽4×9 P.010 9 0.53±0.3458.59**水仙子糖肽2×9 P.010 9 0.66±0.2248.44*水仙子糖肽1×9 P.010 8 0.82±0.5035.94与荷瘤组比较**P＜0.01*P＜0.05表11水仙子糖肽对荷瘤小鼠S180瘤体生长的影响(三)组别 剂量 给药 动物数 瘤体重 抑瘤率(g/kg) 途径 开始 结束(X±SD) (％)模型对照组 25ml×9 P.0 25 231.91±0.79-FT207组 0.125×9P.0 10 9 0.77±0.3359.69***水仙子糖肽 4×9P.0 10 8 0.83±0.3256.54***水仙子糖肽 2×9P.0 10 8 1.21±0.5736.65*水仙子糖肽 1×9P.0 10 9 1.48±0.8322.51与荷瘤组比较***P＜.0.001*P＜0.05表9～11结果表明通过三次对荷瘤小鼠S180瘤体生长影响的试验，水仙糖肽大、中、小三个剂量组的平均抑瘤率分别为53.04％、40.36％、14.42％；与荷瘤对照组比较，水仙子糖肽大、中剂量组对S180瘤体生长均有明显的抑制作用(P＜0.01-0.001)；结果还显示，水仙子糖肽对小鼠S180瘤体生长的抑制作用存在一定的量效关系。
2.2对H22瘤株的抑制作用结果见表12～14。
表12水仙子糖肽对荷瘤小鼠H22瘤体生长的影响(一)
组别 剂量 给药 动物数 瘤体重(g)抑瘤率(g/kg)途径 开始 结束(X±SD) (％)模型对照组25ml×9 P.025 221.87±0.21-FT207组 0.125×9 P.010 9 0.41±0.1979.68***水仙子糖肽组 4×9 P.010 9 1.01±0.2845.99***水仙子糖肽组 2×9 P.010 9 1.48±0.2020.86**水仙子糖肽组 1×9 P.010 9 1.82±0.242.67与荷瘤组比较***P＜0.001**P＜0.001表13水仙子糖肽对荷瘤小鼠H22瘤体生长的影响(二)组别 剂量 给药动物数瘤重(g)抑瘤率(g/kg) 途径 开始 结束 (X±SD) (％)模型对照组25ml×9P.02524 1.98±0.37 -FT207组 0.125×9 P.01010 0.31±0.11 84.38***水仙子糖肽组 4×9 P.01010 0.96±0.33 51.52***水仙子糖肽组 2×9 P.01010 1.03±0.53 47.98***水仙子糖肽组 1×9 P.0109 1.27±0.73 35.86**与荷瘤组比较***P＜0.001**P＜0.01表14水仙子糖肽对荷瘤小鼠H22瘤体生长的影响(三)组别剂量 给药 动物数 瘤重(g) 抑瘤率(g/kg)途径 开始 结束 (X±SD)(％)模型对照组25ml×9P.025 24 2.15±0.43-FT207组 0.125×9 P.010 10 1.03±0.4552.09***水仙子糖肽组 4×9 P.010 91.39±0.4835.35***水仙子糖肽组 2×9 P.010 91.34±0.5637.67***水仙子糖肽组 1×9 P.010 91.44±0.4433.02***与荷瘤组比较***P＜0.001
表12～14结果表明通过三次对荷瘤小鼠H22瘤体生长影响的试验，水仙子糖肽大、中、小三个剂量组的平均抑瘤率分别为44.29％、35.50％、23.85％，与荷瘤对照组比较，大、中剂量组对小鼠H22实体瘤的生长均有明显的抑制作用(P＜0.01～0.001)。实验结果还显示水仙子糖肽对小鼠H22瘤生长的抑制作用存在一定的量效关系。
2.3对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响结果见表15～17。
表15水仙子糖肽对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响(一)组别剂量动物数体重生存时间 T/C P值(g/kg) (只) 变化(g) 天(X±SD)生理盐水组25ml×10 25 4.18 16.04±2.86 - -FT207组 0.125×10 10 6.20 20.70±5.33 1.29＜0.01水仙子糖肽组 4×10 10 11.2020.10±5.06 1.25＜0.01水仙子糖肽组 2×10 10 8.40 19.20±5.39 1.19＜0.05水仙子糖肽组 1×10 10 10.0917.60±2.12 1.10＞0.05表16水仙子糖肽对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响(二)组别 剂量 动物数体重(g) 生存时间 T/C P值(g/kg) (只) 变化天(X±SD)生理盐水组 25ml×10 26 3.8114.46±0.90- -FT207组0.125×1010 4.1015.40±2.501.06＞0.05水仙子糖肽组 4×1010 7.5015.70±0.671.09＜0.001水仙子糖肽组 2×1010 5.9015.50±0.851.07＜0.01水仙子糖肽组 1×1010 2.4015.20±1.141.05＜0.05表17水仙子糖肽对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响(三)组别 剂量动物数体重 生存时间 T/C P值(g/kg)(只)变化(g) 天(X±SD)生理盐水组25ml×10 27 7.6214.70±0.72FT207组 0.125×10 8 4.1016.88±2.301.15＜0.001水仙子糖肽组 4×10 10 8.8016.50±1.081.12＜0.001水仙子糖肽组 2×10 10 3.2015.50±2.221.05＞0.05水仙子糖肽组 1×10 10 7.7016.20±4.661.10＞0.05
表15～17结果表明水仙子糖肽大剂量组对延长艾氏腹水癌小鼠存活期有一定的作用，生存时间与荷瘤组比较有显著性差异(P＜0.01～0.001)；中剂量组亦有一定的延长生存期作用，生存时间与荷瘤组比较亦有显著性差异(P＜0.01～0.001)；小剂量组的作用不明显。三次试验结果进行综合分析，水仙子糖肽大、中剂量组与荷瘤组比较，具有一定的延长荷瘤小鼠生存期的作用。
2.4与环磷酰胺联合应用对小鼠H22瘤的抑制作用结果见表18。
表18水仙子糖肽与环磷酰胺合用对H22瘤株生长的影响(g，X±SD)组别 剂量 动物数 平均瘤重抑瘤率 P值(g/kg) 开始 结束(％)生理盐水组25ml×10 20181.29±0.47 - -环磷酰胺组0.025×1010100.74±0.43 42.6 ＜0.01水仙子糖肽组 2×10109 0.75±0.48 41.9 ＜0.01水仙子糖肽+ 2×10+环磷酰胺组0.025×1010100.64±0.18 50.39 ＜0.001表18结果表明，单独用药组环磷酰胺(25ml/kg)、水仙子糖肽(2g/kg)的抑瘤率分别为42.6％和41.9％，而联合用药组(环磷酰胺25ml/kg+水仙子糖肽2g/kg)的抑瘤率则为50.39％，与单独用药组比较，抑瘤率均有所提高；从上述试验结果可以看出水仙子糖肽与小剂量的化疗药合用，不仅可减轻化疗药的毒副作用，同时还可提高抑瘤率，显示了联合用药的优势。
3.减毒试验检验结果见表20～22。实验过程略表19环磷酰胺模型大鼠肝、肾生化指标检测值(X±S)项目动物 剂量 ALT(u/L)AST(u/L) CR(umol/L)BUN(mmol/L)(数) (g./kg)正常对照组 7 /36.29±4.96 72.57±11.44 32.79±5.62 7.60±2.13模型对照组 8 /47.63±13.73 79.50±13.81 28.52±19.75 8.63±1.38水仙子糖肽 7 434.00±13.56 77.00±12.58 26.36±8.15 7.92±0.73水仙子糖肽 7 240.56±11.98 67.33±8.19 33.79±20.14 7.53±1.02水仙子糖肽 7 143.86±15.67 88.14±17.57 27.11±13.17 8.18±0.99
与正常对照组比较P＞0.05表20水仙子糖肽对环磷酰胺大鼠骨髓有核细胞数的影响(X±SD)组别剂量动物数骨髓有核细胞数P值(g/kg)(只) (109/L) 与环磷酰胺组比较正常对照组 -7 6.88±2.16 ＜0.05环磷酰胺组 -8 3.45±1.23 -水仙子糖肽 47 5.94±2.46 ＜0.05水仙子糖肽 27 5.81±2.93 ＜0.05水仙子糖肽 17 3.65±0.76 ＞0.05表20结果表明，大鼠注射环磷酰胺后，可使骨髓有核细胞数量显著下降；给药一周后，环磷酰胺模型组检测值与正常对照组比较降低49.85％而水仙子糖肽大、中剂量组检测值明显高于模型组，与正常对照组比较无明显差异，与模型组比较则具有显著性差异(P＜0.05)；说明大、中剂量的水仙子糖肽对骨髓有核细胞具有保护作用，对化疗药造成的骨髓造血功能抑制具有一定的减毒效果。
表21环磷酰胺模型大鼠试验前血液学指标检测值(X±SD)组别 动物 剂量 检测值(数) (g/kg)WBC(109/L) Hb(g/L) RBC(1012/L) PLC(109/L)正常对照组 10 / 18.56±3.58 137.60±8.65 8.14±0.55568.60±82.01模型对照组 12 / 21.91±7.37 128.20±10.37 7.48±0.95466.90±82.42水仙子糖肽 10 4 25.02±8.55 131.10±10.04 7.03±1.16503.70±81.91水仙子糖肽 10 2 20.83±7.70 129.36±11.38 8.26±1.65458.91±71.89水仙子糖肽 10 1 23.96±4.13 134.70±10.04 7.68±0.68474.40±135.83与正常对照组比较，P＞0.05表22环磷酰胺大鼠试验后血液学指标检测值(X±SD)组别 动物 剂量检测值(数) (g/kg) WBC(109/L) Hb(g/L) RBC(1012/L) PLC(109/L)正常对照组 7 /27.29±5.31 133.70±5.40 8.40±3.33 608.20±47.53模型对照组 8 /4.23±2.02 121.20±8.02 7.00±0.72 299.60±52.14水仙子糖肽 7 44.11±2.32 121.80±7.07 7.12±0.78 619.60±123.39*水仙子糖肽 7 24.33±1.37 125.20±6.68 7.10±0.51 523.00±98.72*水仙子糖肽 7 14.98±2.61 119.50±6.34 7.33±0.55 527.80±104.19*与环磷酰胺模型组比较*P＜0.01
表21结果表明，大鼠注射环磷酰胺后对白细胞、血小板有明显影响，可使其数值显著下降；给药一周后，各组血小板测量值与正常对照组比较，环磷酰胺组和水仙子糖肽小剂量组的下降值最为明显；而水仙子糖肽大、中剂量组的血小板测量值降低幅度较小，其检测值明显高于模型对照组，与模型组比较具有显著差异(P＜0.05)；提示水仙子糖肽大、中剂量对环磷酰胺造成的血小板减少有较好的对抗作用，可以在一定程度上减轻化疗药的毒副作用。
<三>、小结上述各项实验结果表明，从舍蝇成熟幼虫体内提取的生物活性物质—水仙子糖肽，具有明显的调节机体免疫功能、抑制肿瘤生长、与化疗药合用减轻其毒副作用和增强抑瘤效果的协同作用1.水仙子糖肽可提高机体的免疫功能明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和胸腺指数，恢复荷瘤动物低下的DTH反应，通过影响T细胞数量、增强NK细胞毒性和IL-2的活性，达到调节机体免疫功能与抑瘤的双重作用。
2.水仙子糖肽可抑制S180瘤株与H22瘤株的生长，三个剂量组的抑瘤率分别为53.04％、40.36％、14.42％％和44.29％、35.50％、23.85％，对艾氏腹水癌小鼠的生存期有稳定的延长作用；同时与低于治疗剂量的小剂量环磷酰胺合用，可产生抑瘤的协同作用，提高抑瘤率。
3.水仙子糖肽对环磷酰胺造成的大鼠血小板减少和骨髓有核细胞数量减少具有保护作用，提示水仙子糖肽与化疗药联合应用，具有一定的减毒作用。
综上所述，通过调节免疫、抑瘤、减毒三个方面的药效学试验研究表明水仙子糖肽具有较好的提高机体免疫功能、抗肿瘤、减轻化疗药毒副作用和与化疗药联合应用的协同抑瘤作用。
图1为水仙子糖肽高效凝胶色谱图。
具体实施例方式
实施例一10kg水仙子与1.5倍重量的水在100℃下煮5分钟，得到熟水仙子，再与2倍重量的水混合进行打浆成浆液，浆液在PH为7、温度为45℃、1398中性蛋白酶下酶解3小时得到酶解液，90℃下灭活得到灭活酶解液。灭活酶解液进行离心分离，去除渣，得到上清液。上清液在60℃下真空浓缩成浓缩液，浓度为20～25％，离心除渣，清液用95％的乙醇沉淀12小时，清液∶乙醇＝1∶5(体积比)。静止沉降，分离出沉淀，沉淀用水溶解，得到的水溶液再离心除杂，清液在120℃下喷雾干燥得到水仙子糖肽250克。
水仙子糖肽为棕色或棕黄色无定形粉末，气微，味特异，有引湿性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中不溶。
耐碱度PH5.5～7.5干燥失重＜6.0％烧灼残渣＜13％重金属＜20ppm砷盐＜2ppm糖蛋白含量为90％，其中多糖为28％，肽62％。
实施例二10kg水仙子与1.5倍重量的水在100℃下煮5分钟，得到熟水仙子，再与2倍重量的水混合进行打浆成浆液，浆液在PH为7.5、温度为40℃、1398中性蛋白酶下酶解4小时得到酶解液，90℃下灭活得到灭活酶解液。灭活酶解液进行离心分离，去除渣，得到上清液。上清液在60℃下真空浓缩成浓缩液，浓度为20～25％，离心除渣，清液用95％的乙醇沉淀14小时，清液∶乙醇＝1∶4(体积比)。静止沉降，分离出沉淀，沉淀用水溶解，得到的水溶液再离心除杂，清液在120℃下喷雾干燥得到水仙子糖肽245克。
水仙子糖肽为棕色或棕黄色无定形粉末，气微，味特异，有引湿性。在水中易溶，在乙醇、丙酮、氯仿中不溶。
耐碱度PH5.5～7.5干燥失重＜6.0％烧灼残渣＜13％重金属＜20ppm砷盐＜2ppm糖蛋白含量为80％，其中多糖为26％，肽54％。
权利要求
1.水仙子糖肽，其特征在于为从水仙子中提取的水溶性活性物质，其中糖蛋白的含量为75～97％。
2.根据权利要求1所述的水仙子糖肽，其特征在于糖蛋白的含量为75～92％。
3.根据权利要求1或2所述的水仙子糖肽，其特征在于所述糖蛋白为多糖和肽结合结构，分子量为2600～4200。
4.根据权利要求3所述的水仙子糖肽，其特征在于所述多糖含量以无水葡萄糖计不低于糖肽(按干燥品计)总量的25.0％，肽含量不低于糖肽(按干燥品计)总量的50％。
5.根据权利要求4所述的水仙子糖肽，其特征在于所述多糖含量为25～35％，肽含量为50～70％。
6.水仙子糖肽的用途是制备抗肿瘤药物。
全文摘要
水仙子糖肽，为从水仙子中提取的水溶性活性物质，其中糖蛋白的含量为75～97％。糖蛋白为多糖和肽结合结构，分子量为2600～4200。其中多糖含量以无水葡萄糖计不低于糖肽(按干燥品计)总量的25.0％，肽含量不低于糖肽(按干燥品计)总量的50％。水仙子糖肽的用途是制备抗肿瘤药物。
文档编号C07K14/415GK1443772SQ02110170
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月11日 优先权日2002年3月11日
发明者王淦, 宋淑玉, 宋波, 杜晓敏 申请人:淄博顺达企业集团总公司