专利名称：人血管生成素反义寡核苷酸及药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及一种血管生成素的反义寡核苷酸。该反义寡核苷酸可与人血管生成素的信息核糖核酸互补从而抑制人内源血管生成素的合成。本发明还涉及含有该血管生成素反义寡核苷酸的药物组合物。
背景技术：
肿瘤细胞是由正常细胞异变而来。这种异变导致肿瘤细胞无限制的生长并失去正常细胞应有的功能，肿瘤细胞的产生可由一种或多种因素诱导而通过改变正常细胞非常严格的基因调控程序所致。这种异变可以是致癌基因(Oncogenes)的过度表达，也可以是肿瘤抑制因子(Tumor suppressor)的失活，还可以是细胞周期(Cell cycle)和细胞凋亡(Apoptosis)系统的失调。
现在已知，肿瘤的生长和转移至少需要六个方面的同时作用才能对身体造成危害(Hanahan D，Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell 2000；100(1)57-70.)。一是细胞生长信号传递的自我满足，正常细胞需要外界信号刺激才能进入细胞分裂循环，而肿瘤细胞能通过基因突变自我满足这一要求。二是对抑制细胞生长信号的脱敏，正常细胞的生长受生长抑制因子的调节，而肿瘤细胞通过基因突变避开这一关口。三是不受细胞凋亡的影响，通过基因变异而避开正常细胞有规律死亡的途径。四是获得无限的自我复制能力，正常细胞有一定的寿命，而肿瘤细胞通过基因突变能无限地永恒复制。五是持续的血管生成(Angiogenesis)，肿瘤细胞合成分泌大量的促使血管生成的因子从而建立肿瘤组织自身的微循环系统来提供其生长所需的营养和氧气。六是一级肿瘤长到一定程度后的全身转移(Metastasis)。恶性转移是最具危害性的致死原因。
针对以上描述的肿瘤生长的六个大过程以及每一过程中的具体步骤的抗癌药都正在研究发展过程中。前四个过程都是针对肿瘤细胞本身的，由于肿瘤细胞基因组的高突变能力，这类药物的化疗容易产生抗药性。所以，近年来，抗癌研究的另一个重点是针对后二个过程，也即是持续血管生成和癌转移过程(Fidler IJ，Kumar R，Bielenberg DR，Ellis LM.Molecular determinantsof angiogenesis in caneer metastasis.Cancer Journal From ScientificAmerican 1998；4 Suppl 1S58-66.)。这二个过程都与血管增生有关，只有足够的血管增生，肿瘤组织才能增大；也只有足够的血管增生，肿瘤细胞才能进入全身循环而导致转移。所以，抑制血管新生，是治疗肿瘤的一个釜底抽薪的方法。同时，由于组成肿瘤血管的细胞是正常的人血管内皮细胞和平滑肌细胞，相对来说，不易产生抗药性(Kerbel RS.Inhibition of tumorangiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents.Bioessays 199l；13(1)31-6.)。
血管增生是指从一个已经存在的血管派生出微血管形成一个微血管网络形成微循环的一个过程(Yancopoulos GD，Klagsbrun M，Folkman J.Vasculogenesis，angiogenesis，and growth factorsephrins enter thefray at the border.Cell 1998；93(5)661-4.)。血管增生是一个由几个步骤所组成的一整套过程。它是正常生理过程如生育，成长，伤口愈合，月经周期所必需得，同时，在多种病理过程中，如肿瘤生长和转移，风湿性关节炎，糖尿病，视网膜病，牛皮癣等中起着关键作用。从细胞和生化水平上看，血管生成分四个步骤(1)正常血管内皮细胞受血管生成因子的刺激而激活；(2)激活的血管内皮细胞侵入周围组织向着血管生成因子所在的方向移动；(3)跟随其后的血管内皮细胞分裂填补移动细胞所留空隙；(4)新形成的微血管吻合，成熟而成一个具有功能的循环系统。所以，血管增生是一个持续的不间断的复杂过程。每个具体步骤的机理以及调控因子已基本阐明。
肿瘤生长和转移对血管新生的依赖性已经被科学界广泛接受。除非建立其自己的血管网络，否则肿瘤组织只能长到直径1-2毫米的大小。这样大小的肿瘤对人体不构成危害。目前一个广泛被关注和接受的理论是长期使用抑制血管生成的药物，可使肿瘤细胞一直处于潜伏期。这样，癌症就象高血压和糖尿病一样可以长期用药物控制。这是目前癌症治疗研究的一个重要方向(Harris AL.Antiangiogenesis for cancer therapy.Lancet 1997；349 Suppl 2SII13-5.)。
实体肿瘤和血管生成的密切关系是最早被认识到的。已经知道各种恶性肿瘤如肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、骨瘤、上皮瘤等等都分泌血管生成因子。从肿瘤发生的器官上分类，已知人体内各种器官癌变如肺癌、肝癌、乳癌、骨癌、前列腺癌、卵巢癌以及头和颈癌等等都和血管增生密切相关(Hui YF，IgnoffoRJ.Angiogenesis inhibitors.A promising role in cancer therapy.Cancer Practice 1998；6(1)60-2.)。
最近的实验结果也证明，各种体液癌如各类白血病和淋巴癌也和血管增生有关(Schneider P，Jerome MV，Paysant J，Soria PC，Vannier JP.Therole of angiogenesis in leukemia proliferation.American Journal ofPathology 1999；155(3)1007-8.)。这样，几乎人体内所有恶性和良性的肿瘤都与血管增生有关。
血管增生和肿瘤的转移也有密切的关系。这个关系体现在两方面，一是原始肿瘤必须依靠血管生成才能进入血液循环，到达转移目的地。二是当进入血液循环的肿瘤细胞在目的地着床以后，必须促使新生血管的形成以达到生长，扩大的目的。
对于血管生成和肿瘤生长及转移的关系，还可参见许多专利文献，例如美国专利6265388，国际专利申请出版物WO99158126，及中国专利公开号CN1145636A。
血管生成是一个多步骤的复杂过程。所以，血管生成的调控也是复杂的。这是一个动态的、控制非常严密的过程，是由血管生成因子以及血管生成抑制剂所决定的。目前已知的血管生成因子有大约二十五种(Iruela-Arispe ML，Dvorak HF.Angiogenesisa dynamic balance of stimulators andinhibitors.Thrombosis & Haemostasis 1997；78(1)672-7.)。它们的理化性质各不相同。但都有一个共同的性质，那就是促进血管的生成。它们都已被纯化测序，其基因都已被克隆。比较常见的血管生成因子有血管生成素(Angiogenin)，血管内皮生长因子(VEGF)，酸性及碱性成纤维生长因子(aFGF和bFGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板生长因子(PDGF)，血小板激活因子(PAF)，血小板内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子(IGF)以及白细胞介素-8(IL-8)等等。在很多情况下，这些生长因子在血液中的浓度和肿瘤生长呈正相关。在众多的血管生成因子中，血管生成素是唯一的一个只靠测定体内血管生成活力而提纯的血管生成因子(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，RiordanJF，Vallee BL.Isolation and characterization of angiogenin，anangiogenic protein from human carcinoma cells. Biochemistry 1985；24(20)5480-6.)。其它的血管生成因子开始都是以其它的生物活力而提取，然后才发现它们同时也具有促使血管生成的活力。
血管生成素是一个具有强烈刺激血管生成活力的蛋白质，人血管生成素由123个氨基酸组成，分子量为14400，等电点为9.2。血管生成素最早于1985年被发现，是第一个也是到目前为止唯一的一个仅仅靠测定体内血管生成活力而提纯分离的血管生成因子(Fett JW，Strydom DJ，Lobb RR，Alderman EM，Bethune JL，Riordan JF，Vallee BL.Isolation and characteri zation ofangiogenin，an angiogenic protein from human carcinoma cells.Biochemistry 1985；24(20)5480-6.)。在众多的血管生成因子中，血管生成素诱导血管新生的活力是最高的，在受精鸡蛋绒毛膜(ChorioallantoicMembrane)的测定血管生成的活力体系中，1纳克(lng)的纯血管生成素就有明显的促使血管生成的活力。所以，血管生成素在血管生成领域有其特殊的意义。
在上文所述的血管生成的各个步骤中，血管生成素都参与并起着重要的作用(Riordan JF.Angiogenin.InD’Alessio G，Riordan JF，editors.RibonucleasesStructures and Functions.New YorkAcademic Press；1997.pp 459-489.)。现在已经知道，血管生成素可以与血管内皮细胞及血管平滑肌细胞表面结合，诱导产生细胞内信号传递的第二信使包括二酯甘油(DAG)及三磷酸肌醇(IP3)，同时激活磷酸脂酶C(Phospholipase C)和MAP激酶包括Erk1/2和SAPK/JNK等。血管生成素和细胞表面的结合蛋白结合而激活细胞的蛋白酶系统从而促使细胞降解细胞外介质，引起细胞移动和侵入周围组织。如上所述，细胞的移动和侵入周围组织是血管生成的一个重要步骤，血管生成素还能在适当条件下和细胞表面专一的受体结合，诱导细胞分裂，这是血管生成过程中的另一个重要步骤(Hu GF，Riordan JF，Vallee BL.A putativeangiogenin receptor in angiogenin-responsive human endothelial cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America 1997；94(6)2204-9.)。除此之外，血管生成素还能促使血管内皮细胞成形管状结构，并能辅助细胞黏附。所有这些，都是血管生成过程中所必需的。所以，血管生成素是促使血管生成的多面手，在血管生成的各个环节，都有它的作用。最近发现，血管生成素还能直接进入细胞核，集中在核仁里，和DNA结合而直接作用于细胞的基因转录系统(Hu G，Xu C，Riordan.JF.Human angiogenin is rapidly translocated to the nucleus of humanumbilical vein endothelial cells and binds to DNA.J Cell Biochem2000；76(3)452-62.)。
尽管血管生成素最早是从肿瘤细胞分泌液中提取的，现在知道，它也存在于正常人的血液中。存在于正常血液循环中的血管生成素是由肝脏合成分泌的，在维持血管正常动态平衡，伤口愈合以及正常妊娠中起重要作用。正常人血中的血管生成素含量在250-360ng/ml之间。如果孕妇血中的血管生成素含量降低，就会导致流产或早产(Spong CY，Ghidini A，Sherer DM，Pezzullo JC，Ossandon M，Eglinton GS.Angiogenina marker for preterm delivery inmidtrimester amniotic fluid.American Journal of Obstetrics &Gynecology 1997；176(2)415-8.)。在多种肿瘤病人中，包括肝癌、胰腺癌、乳癌、胃癌、结肠腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌等等，其血中的血管生成素含量都大大升高(Shimoyama S，Kaminishi M.Increasedangiogenin expression in gastric cancer correlated with cancerprogression.Journal of Cancer Research & Clinical Oncology 2000；126(8)468-474.)。所以，抑制血管生成素的活力，特别是抑制血管生成素的生物合成，在肿瘤治疗上有着现实意义。
反义寡核苷酸(Flanagan WM.Antisense comes of age.Cancer &Metastasis Reviews 1998；17(2)169-76.)是指一段可以与其靶基因的碱基互补配对的核苷酸，准确地说，如果与其互补的核酸是单链的话，此段顺序称为反义。如果与其互补的核酸是双链的话，此段顺序称为反基因(Antigene)。反义寡核苷酸可以抑制相应基因的表达。美国专利6265388中公开了使用第一代寡核苷酸抑制血管生成素合成的方法。其中，第一代寡核苷酸为巯基取代的脱氧核苷酸衍生物，这种化合物尽管能有效地进入细胞，不被细胞内的降解机制所快速消除，但对细胞的非专一性毒性是较大的。
因此，本领域迫切需要开发新的血管生成素的反义寡核苷酸，以便能更高效、低毒或无毒地抑制血管生成素的合成，进而治疗与血管增生有关的各种疾病。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的血管生成素反义寡核苷酸，用于高效、低毒或无毒地抑制血管生成素的合成，进而治疗与血管生成过度有关的疾病，包括各种实体肿瘤、各种白血病及风湿性关节炎、糖尿病视网膜病，爱滋病综合症等等。
本发明人通过广泛而深入的研究，通过对人血管生成素作用机理的阐述，设计了专一的人血管生成素的反义寡核苷酸，用以抑制人内源血管生成素的合成从而抑制血管新生最终导致肿瘤生长的抑制。本发明人还意外地发现，人血管生成素反义寡核苷酸能使血管内皮细胞对其它促使血管生成的因子脱敏。此外，人血管生成素反义寡核苷酸能直接作用于肿瘤细胞本身而抑制肿瘤细胞的生长。在此基础上，完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种血管生成素反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸抑制人细胞内源血管生成素的合成。通常，所述反义寡核苷酸含有SEQID NO1中连续15-35个核苷酸序列的反义序列，且该反义寡核苷酸中至少2个核苷酸是2-甲氧基核苷酸。
在本发明的一个优选例中，所述反义寡核苷酸的长度为18-25个核苷酸。
在另一优选例中，所述反义寡核苷酸包含序列5’-CAACAAAACGCCCAGGCC-3’(SEQ ID NO2)。更佳地，所述反义寡核苷酸的序列是5’-CAACAAAACGCCCAGGCC-3’(SEQ ID NO2)。
在另一优选例中，该反义寡核苷酸中至少4个，较佳地至少6个，更佳地至少8个核苷酸是2-甲氧基核苷酸。2-甲氧基核苷酸可以位于任何位置，但优选3’端。一种特别优选的反义寡核苷酸例子是5’-CAACAAAACGCCCAGGCC-3’，且其5’末端的6个核苷酸为硫代脱氧核苷酸，3’末端的12个核苷酸为2-甲氧基核苷酸。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它含有治疗有效量的本发明的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
在本发明的第三方面，提供了本发明的反义寡核苷酸的用途，用于制备治疗以下疾病的药物(a)治疗人体肿瘤生长及转移；(b)治疗人体与血管增生过度有关的疾病。
在本发明的第四方面，提供了一种血管生成素反义寡核苷酸的用途，它被用于制备抑制血管生成因子活性的药物，其中所述的相关生成因子不是血管生成素。
在一优选例中，所述的血管生成因子选自下组血管内皮生长因子(VEGF)，酸性及碱性成纤维生长因子(aFGF和bFGF)，表皮生长因子(EGF)，血小板生长因子(PDGF)，血小板激活因子(PAF)，血小板内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PIGF)，肝细胞生长因子(HGF)，胰岛素样生长因子(IGF)以及白细胞介素-8(IL-8)。更佳地，所述的血管生成因子选自下组血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。
图1显示了血管生成素反义寡核苷酸抑制血管内皮细胞的生长。
图2显示了血管生成素反义寡核苷酸抑制人内源血管生成素的合成。图2A为Western杂交结果，用人血管生成素的多克隆抗体检测。图2B为Northern杂交结果，用专一的人血管生成素探针检测。图2C为PCR扩增结果用溴乙锭显色，所示条带为人血管生成素的cDNA。图2D为b-Actin的PCR扩增结果，四个样品中的终一条带表示上样量的平均以及CT-1处理对血管生成素合成影响的专一性。
图3显示了血管生成素反义寡核苷酸抑制bFGF，VEGF和EGF的促血管内皮细胞生长活力。图中，bFGF，VEGF和EGF的生长活力以细胞增长百分数表示。图3A为CT-1对bFGF的活力的影响，图3B为CT-1对VEGF活力的影响，图3C为CT-1对EGF活力的影响。
图4显示了人血管生成素促进核糖体核糖核酸(rRNA)合成的活力。
图5显示了人血管生成素在人前列腺肿瘤细胞PC-3中的核转移。
图6显示了血管生成素反义寡核苷酸抑制人前列腺肿瘤细胞PC-3的生长。
图7显示了血管生成素反义寡核苷酸抑制人结肠腺癌细胞HT-29在裸鼠身上的生长。一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。每组8个裸鼠，共3组。第1组用生理盐水处理，第2组用5微克CT-1处理，第3组用5微克CT-2处理。处理方法为每天皮下注射。注射位点在肿瘤细胞接种点附近。观察方法为每天观察触摸，用游标卡尺测定肿瘤体积。
具体实施例方式
如本文所用，“反义寡核苷酸”指为反义的核苷酸寡聚物。反义寡核苷酸通过碱基互补(A-T，A-U和G-C)配对与双链DNA形成三链(反基因)，或与单链RNA形成杂交双链(反义)，从而阻断基因的复制、转录或转录后mRNA的加工和翻译。同时，双链RNA能被细胞内的核糖核酸酶H(RNase H)所降解，从而更有效地阻断靶基因的表达。由于反义核苷酸只能与反向互补的靶序列结合，具有专一性高，副作用小的特点。
本发明的反义寡核苷酸的长度没有特别限制，一般来说，为了达到杂交的专一性，反义寡核苷酸需要至少15个单体组成的核苷酸。通常反义寡核苷酸的长度为15-35bp，较佳地为18-25bp。
本发明的人血管生成素反义寡核苷酸，其序列可与如SEQ ID NO1所示的人血管生成素mRNA的任何部位互补，并且宜不与任何其它蛋白的mRNA序列互补。在SEQ ID NO1中，cDNA为106--731位，CDS为185--553位。转录起始位点为1位，翻译起始位点为113位。较佳地，人血管生成素反义寡核苷酸的序列与人血管生成素mRNA的翻译起始区互补，如SEQ ID NO1所示的第113位至186位。
一种特别优选的人血管生成素反义寡核苷酸的序列为5’-CAACAAAACGCCCAGGCC-3’(SEQ ID NO2)，与人血管生成素mRNA的第122-139位互补。该序列是通过计算机模拟和搜查，将人血管生成素的mRNA与人类基因组的核苷酸序列详细对比，而设计出的。
本发明所提供的反义寡核苷酸为第二代产物，它含有至少2个，通常至少4个，较佳地至少6个，更佳地至少8个核苷酸没有毒性副作用的2位甲氧基取代的核苷酸。这样，第二代反义寡核苷酸与靶序列能继续有效配对，但毒性大幅降低(3倍)。同时，由于2位甲氧基取代的核糖核酸比脱氧核糖酸在细胞内的半衰期更长。
本发明首次公开了血管生成素在核糖体核糖核酸(rRNA)转录中的重要作用。本发明人发现，除了强烈刺激血管生成的功能外，血管生成素还具有强烈促使肿瘤细胞合成核糖体核糖核酸(rRNA)的功能。血管生成素进入细胞核后，和rRNA基因的转录调控区的特定部位结合而促使rRNA的转录。
由于rRNA是组成细胞核糖体的关键成分，核糖体是细胞内蛋白质合成的工厂，其数量多少直接决定细胞生长的速度。核糖体核糖核酸是核糖体(ribosome)生物合成的速度限制步骤，而核糖体的数量决定了蛋白质翻译的速度，是细胞生长速度的决定因素。因此，抑制血管生成素的活力不仅切断了肿瘤组织的供给线(血管生成)，而且同时捣毁了肿瘤细胞自己的加工厂(核糖体)。这样，血管生成素的抑制剂在治疗肿瘤上比单单针对血管生成的抑制剂或单单针对肿瘤细胞的抑制剂更有效，有事半功倍的效果。
本发明的实验证实了使用本发明公开的血管生成素反义寡核苷酸不仅能抑制细胞的自发生长，而且能够使细胞脱敏不受其他血管生成因子的刺激。所以，血管生成素在众多的血管生成因子中居于中心位置，在血管生成领域中起着关键的，不可取代的作用。本发明的反义寡核苷酸针对抑制内源血管生成素的合成而设，有其特定的优越性。
本发明的应用范围包括所有与血管增生过度有关的疾病。
首先，本发明所提供的人血管生成素反义寡核苷酸可用于治疗人体与血管增生过度有关的疾病，其中包括但并不限于风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
其次，鉴于血管增生和肿瘤生长及转移之间的密切关系，本发明所提供的人血管生成素反义寡核苷酸，不仅能抑制原始肿瘤的生长和扩展，同时也能抑制肿瘤转移的发生和扩大。适用的肿瘤例子包括但并不限于各种实体肿瘤和白血病，如肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
肿瘤需要血管增生建立肿瘤血管循环系统来提供其快速生长所需的养料和排除废料。本发明通过抑制血管增生而达到抑制肿瘤生长与转移的目的。临床实验已经证明，血管新生抑制剂能有效地抑制各种人体肿瘤的生长和转移，并且没有抗药性。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明血管生成素反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。
使用药物组合物时，是将安全有效量的血管生成素反义寡核苷酸施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的反义寡核苷酸配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的反义寡核苷酸可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF--α、TGF--β，IFN--α，Angiostatin，Endostatin，甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、甲基ECNU、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。
本发明具有以下优点(1)使用第二代反义寡核苷酸抑制人血管生成素的生物合成。本发明的第二代反义寡核苷酸与美国专利6265388所描述的第一代反义寡聚脱氧核苷酸相比，毒性低，副作用小，半衰期长。
(2)选择一个最高特异性的靶位点作为反义寡核苷酸的作用部位，因此本发明所提供的反义寡核苷酸非特异性结合位点少，专一性高。
(3)提供了详细的细胞生物学的数据(a)人血管内皮细胞经过人血管生成素反义寡核苷酸CT-1处理后，抑制了人内源血管生成素的合成从而抑制血管新生。
(b)人血管内皮细胞经CT-1处理后，不仅抑制了人内源血管生成素的合成，而且同时使细胞不受其他的血管生成因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及表皮生长因子(EGF)的刺激。这样，通过抑制一个血管生成因子而使细胞免于其它血管生成因子的作用是难于预见的。
(c)CT-1不仅抑制人血管内皮细胞的生长，还直接抑制肿瘤细胞的生长。这样，人血管生成素反义寡核苷酸治疗癌症的作用是多管齐下。动物实验证明CT-1抑制人体肿瘤在裸鼠上生长的效果达100％。这在本领域是不常见的。一般认为，40-50％的抑制已经是很高了。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1材料的获得本发明所用材料来源如下。人血管生成素由重组核糖核酸方法制备。碱性成纤维细胞生长(bFGF)和表皮生长因子(EGF)由美国Promega公司购入；血管内皮生长因子(VEGF)由美国R and D公司购入。血管内皮细胞专用培养基(HE-SFM)和细胞转化试剂Lipofectin由美国Gibco/BRL公司购入。核糖核酸酶(RNase A)，脱氧核糖核酸酶(DNase I)和蛋白酶K(Protease K)由美国Sigma公司购入。人胎盘静脉血管内皮细胞(HUVE)和平滑肌细胞(SMC)由美国Cell System公司购入；人结肠腺癌细胞HT-29和人前列腺癌细胞PC-3由美国ATCC公司购入；癌细胞培养基DMEM及胎牛血清(FBS)由美国Biowhittaker公司购入。实验用有免疫缺陷的裸鼠由美国Charles River公司购入。第二代反义寡核苷酸由美国Oligo Etc公司合成。
实施例2细胞培养人胎盘静脉血管内皮细胞(HUVE)培养于含有10％胎牛血清及每毫升10纳克碱性成纤维细胞生长因子的血管内皮细胞专用培养基(HE-SFM+10％FCS+10ng/ml bFGF)中。培养条件为37摄氏度恒温恒湿，5％二氧化碳气相。每隔二天换一次培养基，以1∶3的比率传代培养。用第三代至第十五代的HUVE细胞做实验。
人胎盘静脉血管平滑肌细胞和人前列腺肿瘤细胞PC-3，人结肠腺癌细胞HT-29培养在含有10％胎牛血清的DMEM中。以1∶4的比率传代培养。
实施例3反义寡核苷酸处理HUVE细胞用胰蛋白酶-EDTA处理，用血球计数板或Coulter计数器测定细胞数，然后以每平方厘米十万个细胞的密度培养在35-mm的细胞培养皿中。在37摄氏度保温24小时后，用Opti-MEM洗三次，这样的细胞就可以进行反义寡核苷酸处理的实验了。不同浓度的反义寡核苷酸与适量的脂转细胞试剂Lipofectin混合，在室温预保温45分钟后，加到上述细胞中于37摄氏度保温5小时至72小时。在某些实验中，每隔24小时，细胞将再一次用同样的反义寡核苷酸重新处理。在另一些实验中，经上述反义寡核苷酸处理后的细胞用不同的血管生成因子处理48小时以测定细胞分裂速度。
实施例4Western杂交，Northern杂交，PCR细胞在不同条件下经反义寡核苷酸处理一定时间后用PBS洗三次，提取RNA用于Northern杂交及PCR分析，提取蛋白质用于Western杂交实验。RNA和蛋白质由美国Gibco/BRL公司提供的Trizol试剂提取。
Northern杂交所使用的探针是一段与血管生成素mRNA互补的核苷酸，由美国Genosys公司合成。此探针经32P同位素标记后可以与人血管生成素的mRNA互补配对并在放射自显影中给出信号，从而可以测定mRNA的含量。
PCR扩增实验的探针为分别与人血管生成素cDNA正链及反链的3”末端互补，这样，扩增后的核酸序列为血管生成素的全套cDNA序列，能准确反映细胞内血管生成素的mRNA水平。
Western杂交中所用的抗体为人血管生成素的多克隆抗体，第二抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG多克隆抗体。Western杂交显色由美国Piece公司提供的试剂盒进行。
实施例5血管生成素反义核苷酸对血管内皮细胞的影响血管内皮细胞是组成血管的主要细胞，也是众多血管生成因子的靶细胞。这种细胞在血管生成因子的刺激作用下迁移，分裂，重新组合而形成新生血管的雏形。为了证明血管生成素对血管内皮细胞自发生长以及受刺激后生长的影响，血管生成素的反义核苷酸在脂转化试剂的辅助下按实施例3所述方法被转化到血管内皮细胞内，然后测定细胞生成的速度。
具体方法为人胎盘静脉血管内皮细胞，以每平方厘米十万个细胞的密度在HE-SFM培养基中培养，在每毫升2微升的Lipofectin存在下用不同浓度的5’-CAACAAAACGCCCAGGCC-3’(CT-1)(SEQ ID NO2)或5’-CCGGACCCGCAAAACAAC-3’(CT-2)(SEQ ID NO3)处理后在37摄氏度继续培养48小时。细胞数由COULTER计数仪测定。
结果如图1所示，在不同浓度的血管生成素反义寡核苷酸CT-1处理48小时后，细胞生长速度大幅下降。然而，在对照组中，同样的细胞在同样的条件下，用CT-2处理，细胞的生长速度没有太多的变化。CT-2是CT-1的对照反向寡核苷酸，两者的碱基组成是一样的，CT-1和血管生成素mRNA的靶位点配对互补，构成反义核苷酸从而抑制血管生成素的合成。CT-2因为其核苷酸序列是反向的，不和血管生成素mRNA的任何位点互补。
实施例6血管生成素反义寡核苷酸降低细胞内血管生成素的含量为了证明实施例5中所显示的细胞生长速度的下降是由于细胞内血管生成素的含量降低所致，HUVE细胞用CT-1的CT-2按实施例3所述的方法处理后，进行细胞内血管生成素蛋白质含量以及mRNA含量的分析测定血管生成素的蛋白质含量按实施例4中描述的Western杂交方法进行，mRNA含量按实施例4中所述的Northern杂交及PCR的方法进行。
具体方法为HUVE细胞以每平方厘米十万个细胞的密度在血管内皮细胞完整培养基(HE-SFM+10％FCS+10ng/ml bFGF)中培养24小时，用Opti-MEM洗三次，在每毫升2微升的Lipofectin辅助下用0.5mM终浓度的CT-1或CT-2处理5小时。经PBS洗三次后，收集细胞用Trizol试剂提取蛋白质和细胞总RNA进行Western杂交，Northern杂交和PCR分析。
图2A为Western杂交结果，用人血管生成素的多克隆抗体检测。图2B为Northern杂交结果，用专一的人血管生成素探针检测。图2C为PCR扩增结果用溴乙锭显色，所示条带为人血管生成素的cDNA。图2D为b-Actin的PCR扩增结果，表示上样量的均一。结果表明，经CT-1处理后，HUVE细胞内的血管生成素的蛋白含量和mRNA水平都大大降低。然而，在同样条件下经CT-2处理或者仅经Lipofectin处理，对细胞内血管生成素含量没有影响。
实施例7血管生成素反义寡核苷酸使血管内皮细胞对其他血管生成因子脱敏如前面所述，目前已知的血管生成因子有20多种，其中大部分都能刺激血管内皮细胞的生长和分裂。对血管内皮细胞的刺激作用普遍被认为是这些血管生成因子诱导血管生成机理的重要部分。然而，众多的血管因子是如何协调作用诱导血管生成的一直不很清楚，同时，它们的相互依赖性也不知道。本实验证明了血管生成素在血管生成过程中居于中心位置。
具体方法为HUVE细胞以每平方厘米五万个细胞的密度在血管内皮细胞完整培养基中培养24小时，在用Opti-MEM洗二次后，用每毫升2微升的Lipofectin辅助进行CT-1和CT-2处理。CT-1和CT-2的终浓度为0.5mM。5小时后，用HE-SFM洗三次，换到HE-SFM培养基中加10ng/ml的bFGF，VEGF或EGF，继续在37摄氏度保温48小时，收集细胞，用COULTER计数仪测定细胞数。图中，bFGF，VEGF和EGF的生长活力以细胞增长百分数表示。图3A为CT-1对bFGF的活力的影响、图3B为CT-1对VEGF活力的影响，图3C为CT-1对EGF活力的影响。
图3显示，在经过CT-1处理后，bFGF，VEGF和EGF对细胞生长和分裂的活力大大降低。这组实验证明了其他血管生成因子的促使血管内皮细胞分裂的活力需要血管生成素的参与。当细胞内血管生成素的含量降低后，细胞减少或失去对其他血管生成因子的感受力。这些结果建议，血管生成素的反义寡核苷酸不仅能抑制血管生成素诱导的血管生成，同时还能抑制其他血管生成因子诱导的血管生成。
实施例8血管生成素诱导核糖体核糖核酸的合成真核细胞内有三种核糖核酸信使核糖核酸(mRNA)，转移核糖核酸(tRNA)和核糖体核糖核酸(rRNA)。其中rRNA占80％，tRNA占15％，mRNA占5％。在任何情况下rRNA合成起码占细胞内RNA总转录的60％真核细胞大量转录rRNA的原因是因为rRNA是组成核糖体(ribosome)的关键成分，而每一代细胞生长周期中，必须合成一千万个核糖体以满足蛋白翻译的需要。由于血管生成素能进入细胞核内，集中在核仁里并和DNA直接结合，更由于核仁是核糖体生物合成的地方，本实施例用于检测了血管生成素对rRNA合成的影响。
具体方法为HUVE细胞核由亚细胞结构分组的方法提取，与四种核苷三磷酸混合物在不同血管生成素的浓度下于30摄氏度保温。反应条件如下，50mM HEPES，20％甘油，90mM氯化钠，5mM氯化镁，0.2mM DTT，2mM EDTA，0.3mM ATP，0.3mM GTP，0.3mM UTP，0.03mMCTP以及10mCi32P-CTP。为了保证新合成的RNA是rRNA而不是mRNA和tRNA，在反应体系中还包含了10mg/ml的a-鹅膏覃素(a-Amanitin)，在这个浓度的a-鹅膏覃素存在下tRNA和mRNA的合成都被抑制，只有rRNA的合成还能发生。新合成的有放射性同位素参入的RNA经酚抽提后，用凝胶过滤柱去除单体，在液闪计数仪上测定同位素的参入量。
图4显示，细胞核内rRNA合成的速度随着血管生成素浓度的增加而升高，表明血管生成素增加rRNA合成的速度。这个结果也为实施例7中的现象提供了一个合理的解释。因为不管什么信号刺激的细胞生长都离不开蛋白质的翻译，也就离不开核糖体的生物合成。所以，抑制核糖体的生物合成也就广泛地抑制了细胞的生长能力。血管生成素反义寡核苷酸抑制血管生成素的合成，也就抑制了rRNA的转录，从此引起核糖体生物合成的降低，蛋白质翻译速度的下降，最终导致细胞对其它生长信号的脱敏。
实施例9血管生成素在肿瘤细胞中的核转移肿瘤的生长离不开血管的新生，当然，更离不开肿瘤细胞自己的分裂。本实施例测定了血管生成素在人前列腺肿瘤细胞PC-3中的分布，发现血管生成素能进入PC-3细胞的细胞核内，然而，在正常的人前列腺细胞核中，检测不到人血管生成素的存在。
具体方法为PC-3细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养基中；人前列腺正常上皮细胞在Clonetics公司提供的专门培养基中培养直到单层细胞基本长满后，用不含胎牛血清的新鲜培养基洗1次。细胞用-20摄氏度的甲醇固定，用含5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液饱和非专一性吸附部位后，加入每毫升10微克的抗人血管生成素单克隆抗体在37摄氏度保温5小时，用PBS洗3次后，加入萤光标记的第二抗体于37摄氏度保温1小时，在萤光载玻片上固定后用Nikom Labphot萤光显微镜观察记录。
如图5所示，用萤光免疫标记的方法证明血管生成素有选择性地集中在PC-3细胞的细胞核中。在实施例8中已经证明，细胞核内的血管生成素与rRNA的合成有关。这样，人血管生成素可能与肿瘤细胞自身的rRNA合成，蛋白质翻译及细胞生长有密切的关系。
实施例10人血管生成素反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞的生长。
由于血管生成素能直接转移到肿瘤细胞核中，并能促进细胞合成rRNA，血管生成素可能直接参与肿瘤细胞的生长和分裂。所以抑制血管生成素的活力可能直接抑制肿瘤细胞的生长。本实施例证明了血管生成素反义寡核苷酸能降低人前列腺肿瘤细胞PC-3的体外生长速度。
具体方法为前列腺癌细胞PC-3以每平方厘米5000个细胞的密度培养于35mm的细胞培养皿中，经5ml的Lipofectin辅助用1mM血管生成素反义寡聚核酸CT-1处理24小时后，收集细胞用Coulter计数仪测定细胞数。在另一组实验中，经CT-1处理24小时的细胞在无血清培养基洗3次后，用同样浓度的CT-1重复处理另外24小时。
如图6所示，PC-3细胞经1mM CT-1处理后，其生长速度趋于零。在对组中，PC-3继续增长。这些结果证明，血管生成素的反义寡核苷酸不仅能抑制血管生成，同时还能直接抑制肿瘤细胞生长。这样在肿瘤生长和转移中二个最关键的步骤都能被血管生成素的反义寡核苷酸抑制。
实施例11人血管生成素反义寡核苷酸抑制人体肿瘤在裸鼠上的生长为了证明人血管生成素反义寡核苷酸的抗肿瘤作用，进行了如下的动物实验。无胸腺小鼠(裸鼠)因为免疫缺陷，外源肿瘤细胞能在其身上建立并快速生长。在肿瘤生长抑制剂的处理下，肿瘤生长速度下降，停止或不发生。
具体方法为一万个HT-29人结肠腺癌细胞皮下注射入每个裸鼠的右肩。每组8个裸鼠，共3组。第1组用生理盐水处理，第2组用5微克CT-1处理，第3组用5微克CT-2处理。处理方法为每天皮下注射。注射位点在肿瘤细胞接种点附近。观察方法为每天观察触摸，用游标卡尺测定肿瘤体积。
如图7所示，裸鼠经人结肠腺癌细胞HT-29结种后，所有动物都长肿瘤并导致最终死亡。在每天皮下注射人血管生成素反义寡核苷酸的处理下，没有一个动物长上肿瘤。注射30天后停止，继续观察100天再进行动物解剖，发现所有动物都没有肿瘤生长迹象。这些结果证明人血管生成素反义寡核苷酸CT-1有强烈的抗癌活力。对照寡核苷酸CT-2处理不影响肿瘤的生长，说明CT-1的抗癌作用是专一的。
实施例12不同长度和含有不同数目2-甲氧基核苷酸的反义寡核苷酸的抑制作用在本实施例中，以SEQ ID NO2为基础，合成和测试了不同长度以及含有不同数目2-甲氧基核苷酸的反义寡核苷酸对血管生成素合成抑制作用。结果如下表所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海福缘生化药学研发有限公司<120>人血管生成素反义寡核苷酸及药物组合物<130>017682<160>8<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>731<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgatgccgt gtcagagagc aaagctcctg tccttttggc ctaatttggt gatgctgttc60ttgggtctac cacacctcct tttgccctcc gcaggagcct gtgttggaag agatggtgat120gggcctgggc gttttgttgt tggtcttcgt gctgggtctg ggtctgaccc caccgaccct180ggctcaggat aactccaggt acacacactt cctgacccag cactatgatg ccaaaccaca240gggccgggat gacagatact gtgaaagcat catgaggaga cggggcctga cctcaccctg300caaagacatc aacacattta ttcatggcaa caagcgcagc atcaaggcca tctgtgaaaa360caagaatgga aaccctcaca gagaaaacct aagaataagc aagtcttctt tccaggtcac420cacttgcaag ctacatggag gttccccctg gcctccatgc cagtaccgag ccacagcggg480gttcagaaac gttgttgttg cttgtgaaaa tggcttacct gtccacttgg atcagtcaat540tttccgtcgt ccgtaaccag cgggcccctg gtcaagtgct ggctctgctg tccttgcctt600ccatttcccc tctgcaccca gaacagtggt ggcaacattc attgccaagg gcccaaagaa660agagctacct ggaccttttg ttttctgttt gacaacatgg ttaataaata aaaatgtctt720gatatcagta a 731<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>2caacaaaacg cccaggcc 18<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>不与SEQ ID NO1互补的随机寡核苷酸<400>3ccggacccgc aaaacaac 18<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>4acaaaacgcc caggcc 16<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>5gcccatcacc atctcttc 18<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>6acaacaaaac gcccaggccc 20<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>7caacaacaaa acgcccaggc ccat 24<210>8<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>SEQ ID NO1的反义寡核苷酸<400>8gaccaacatc accaacaaaa cgcccaggcc 30
权利要求
1.一种反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸含有SEQ ID NO1中连续15-35个核苷酸序列的反义序列，且该反义寡核苷酸中至少2个核苷酸是2-甲氧基核苷酸。
2.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，反义寡核苷酸的长度为18-25个核苷酸。
3.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述反义寡核苷酸包含序列5′-CAACAAAACGCCCAGGCC-3′。
4.如权利要求1所述的反义寡核苷酸，其特征在于，所述的反义寡核苷酸的序列是5′-CAACAAAACGCCCAGGCC-3′。
5.如权利要求4所述的反义寡核苷酸，其特征在于，5′末端的6个核苷酸为硫代脱氧核苷酸，3′末端的12个核苷酸为2-甲氧基核苷酸。
6.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1-5中任一项所述的反义寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求1所述的反义寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制备治疗以下疾病的药物(a)治疗人体肿瘤生长及转移；(b)治疗人体与血管增生过度有关的疾病。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组肺癌、小细胞肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、乳房癌、前列腺癌、睾丸癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊性腺癌、囊性癌、髓状癌、支气管癌、肾细胞癌、上皮癌、胆管癌、绒毛膜癌、胚癌、精原细胞癌、维尔姆斯瘤、胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、声带神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、成纤维细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、纤维软骨瘤、纤维囊瘤、纤维粘液瘤、纤维骨瘤、纤维粘液肉瘤、纤维乳头状瘤、粘液肉瘤、粘液囊瘤、粘液软骨瘤、粘液软骨肉瘤、粘液软骨纤维肉瘤、粘液腺瘤、成粘液细胞瘤、脂肉瘤、脂肪瘤、脂肪腺瘤、成脂细胞瘤、脂肪软骨瘤、脂肪纤维瘤、脂肪血管瘤、脂肌瘤、粘液脂瘤、软骨肉瘤、软骨瘤、软骨肌瘤、脊索瘤、绒毛膜腺瘤、绒毛血管瘤、绒毛上皮瘤、成绒毛膜细胞瘤、骨肉瘤、成骨细胞瘤、破骨细胞瘤、骨软骨纤维瘤、骨软骨肉瘤、骨软骨瘤、骨囊瘤、骨牙质瘤、骨纤维瘤、骨纤维肉瘤、血管肉瘤、血管瘤、血管脂肪瘤、血管软骨瘤、成血管细胞瘤、血管角质瘤、血管神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管纤维瘤、血管肌瘤、血管脂肪瘤、血管淋巴管瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管肌脂瘤、血管肌神经瘤、血管粘液瘤、血管网状内皮瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉牙瘤、淋巴管瘤、淋巴瘤、淋巴粘液瘤、淋巴肉瘤、淋巴管纤维瘤、淋巴细胞瘤、淋巴上皮瘤、成淋巴细胞瘤、内皮瘤、成内皮细胞瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤、结缔组织瘤、尤因瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成平滑肌瘤、平滑肌纤维瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌粘液瘤，急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性白血病、红细胞增多症、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
9.如权利要求7所述的用途，所述的人体与血管增生过度有关的疾病选自下组风湿性关节炎、糖尿病视网膜病、早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、牛皮癣、红斑痤疮、卡波济肉瘤、特异性反应性角膜炎、流行性角膜结膜炎、新生血管性青光眼、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原生动物感染、分支杆菌感染、多动脉炎、肉样瘤、巩膜炎、潮红、口干眼燥关节炎综合症、全身性红斑狼疮、爱滋病综合症、梅毒。
10.一种血管生成素反义寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制备抑制血管生成因子活性的药物，其中所述的相关生成因子不是血管生成素。
全文摘要
本发明提供了用以抑制人内源血管生成素合成的反义寡核苷酸和药物组合物。这种反义寡核苷酸作用于内源血管生成素的信使核糖核酸，从而抑制血管生成素的生物合成。细胞和动物实验证明了这种反义寡核苷酸能抑制血管内皮细胞的生长，并使细胞不受其它促使血管新生的因子刺激。此外，这种反义寡核苷酸还能直接抑制肿瘤细胞的生长，动物实验证明能抑制人体肿瘤在裸鼠上的生长。
文档编号C07H21/00GK1431217SQ0211053
公开日2003年7月23日 申请日期2002年1月11日 优先权日2002年1月11日
发明者胡国富 申请人:上海福缘生化药学研发有限公司