专利名称：一种免疫抑制药物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属制药领域，具体涉及一种以去甲泽拉木醛为有效成分的免疫抑制药物及其制备方法以及由其制剂在器官移植后抗排斥反应及治疗某些自身免疫性疾病的应用。
已有研究从植物雷公藤中分离到一种淡黄色结晶物质，其分子量为480，熔点为260℃(分解)，分子式为C29H36O6的酚性去甲基三萜化合物，其英文名称为demethylzeylasteral(简称Dzy，T-96，TZ-93)，定名去甲泽拉木醛。其化学结构式如下所表示
本发明药物按下述步骤进行制备1.原料药去甲泽拉木醛的提取工艺过程包括雷公藤原料的干燥、粉碎、有机溶剂的提取，有机溶剂的回收，用硅胶分离，单体化合物的鉴定。其特征是将经干燥并粉碎药材，置回流锅内，加入1-3倍的乙酸乙酯，加热回流3小时，重复2次，得乙酸乙酯提取液，回收溶媒，得干浸膏，得率为8.25％，取浸膏5-10倍量的硅胶进行柱层析，采用正己烷/丙酮梯度洗脱，得到去甲泽拉木醛淡黄色结晶物质。2.去甲泽拉木醛制剂的制备1)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛缓释胶囊的工艺如下将硬脂醇在水浴上加热熔融，加入去甲泽拉木醛搅匀，冷后，研碎，加羟丙甲纤维素凝胶制成软材，制粒，干燥，整粒，装入胶囊即得。
2)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛软胶囊的工艺如下去甲泽拉木醛与少量植物油混合，待分散均匀后加入余量植物油混溶，得药液。另配明胶液，其中明胶100份，甘油55份，水100份备用，采用滴制法，制得去甲泽拉木醛软胶囊。
3)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛的注射剂工艺如下去甲泽拉木醛加适量乙醇和丙二醇研匀，分次加入水混合，微孔滤膜过滤，分装玻璃安瓿中，灭菌，即得。
4)由去甲泽拉木醛原料药制备去甲泽拉木醛的软膏剂工艺如下取单甘酯，十八醇和液状石蜡加热使熔融。另取去甲泽拉木醛10倍量的氯仿和等量的甲醇，加入到去甲泽拉木醛中，使溶解，再缓缓加入上述已熔融的药液中，温度在80℃，不断搅拌，使均匀。另将尼泊金乙酯、十二烷基流酸钠、甘油和水混合后在直火加热至90℃时全部溶解，待温度至80℃时与上述药液在不停搅伴的情况下，缓缓加入完，再继续不停搅伴直至冷成稠膏状，加入适量阿唑蒽，搅匀即得。
本发明对原料药去甲泽拉木醛进行了药效及毒理实验，结果如下(一)药效结果1、去甲泽拉木醛在体外对免疫抑制的实验研究1)、去甲泽拉木醛对脾细胞在丝裂原刺激下转化的抑制作用取BALB/c小鼠脾脏制成脾细胞悬液，在含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液中孵育，加入不同浓度的去甲泽拉木醛、环胞素A(CsA)和雷公藤多甙(TII)，分别在ConA和PHA有丝分裂原刺激下，应用MTT方法测定脾细胞的转化情况，了解去甲泽拉木醛对脾细胞转化的抑制程度。
结果对脾细胞转化的抑制作用在加入浓度为0.125、0.25μg/ml去甲泽拉木醛时，无论是ConA还是PHA刺激，其0D值与未加去甲泽拉木醛的相当(P＞0.05)，而在浓度为0.5μg/ml和1.0μg/ml的去甲泽拉木醛中，OD值明显下降，与未加去甲泽拉木醛比较有显著性差异(P＜0.001)，显示去甲泽拉木醛对ConA、PHA诱导的脾细胞转化有明显的抑制作用。其中加0.5μg/ml去甲泽拉木醛的0D值比加入1μg/ml的TII的OD值更小(p＜0.05)，与加入1μg/ml的CsA时OD值无差异(p＞0.05)，说明去甲泽拉木醛的抑制作用比TII强，且达到一定浓度时与CsA的抑制作用相当。
2)、去甲泽拉木醛对混合淋巴细胞培养的抑制试验取C57BL/6小鼠脾细胞与灭活的BALB/c小鼠脾细胞混合，在RPMI-1640培养液中孵育，并分别加不同浓度的去甲泽拉木醛、CsA或TII，在终止培养前4h加入1μci3H-TdR，将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，在β液闪烁计数仪上测定dpm值，观察脾细胞转化情况，了解去甲泽拉木醛、TII与CsA对脾细胞转化的抑制程度。
结果混合脾细胞转化的抑制作用与丝裂原刺激脾细胞转化的试验研究相似，本试验加入不同浓度的去甲泽拉木醛、TII或CsA均显示对脾细胞转化有抑制作用，不同浓度抑制强度不一。加入1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛对混合脾细胞转化抑制作用特别强。3)、去甲泽拉木醛对诱生IL-2抑制作用的试验.
取BALB/c小鼠脾制成脾细胞悬液，在RPMI-1640培养液中孵育，不加或加ConA刺激观察细胞生成IL-2，并加不同浓度的去甲泽拉木醛、TII或CsA，取上清液为待测样本。用依赖IL-2的CTLL-2细胞和已制备的待测样本在RPMI-1640培养液中培养，用MTT方法测定CTLL-2的转化，以标准的rIL-2结果计算样本的IL-2活性。
结果去甲泽拉木醛对淋巴细胞生成IL-2的抑制作用在对淋巴细胞的培养中，不加ConA刺激，成熟的淋巴细胞也生成并释放IL-2，其释放量较低。不加抑制药时，在12小时、24小时和36小时培养时间，IL-2的释放量分别是7.50±0.26、2.43±0.12和2.37±0.007u/ml，其中12小时与另两个时间组比较有明显差异(p＜0.001)，显示淋巴细胞释放的IL-2活性以培养12小时最高，去甲泽拉木醛、TII和CsA对成熟淋巴细胞释放的IL-2无影响，证实去甲泽拉木醛无直接的杀伤细胞作用。在培养的淋巴细胞中，加入有丝分裂原ConA后，IL-2的活性显著增高，在不加抑制剂的样本中，其在培养12小时、24小时和36小时中IL-2量分别为48.75±3.14、45.33±2.24和27.37±1.16U/ml，36小时较1 2小时为低(p＜0.05)。在加入去甲泽拉木醛药后，培养12小时去甲泽拉木醛浓度为1μg/ml时，IL-2的抑制十分显著(12.36±2.39U/ml)，与对照样本(48.75±3.14U/ml)比较有显著差别(p＜0.001)，与1μg/ml浓度的TII样本(43.17±2.65U/ml)比较，去甲泽拉木醛样本内IL-2明显低于TII样本，提示去甲泽拉木醛较TII的抑制作用强(p＜0.001)；与各浓度的CsA抑制作用比较，去甲泽拉木醛的抑制作用不及CsA作用强，CsA在0.25、0.5、1μg/ml时的IL-2活性分别是10.17±1.59、8.70±0.46、5.37±0.70u/ml，均有显著性抑制，其IL-2的生成量较1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛均低。值得提出的是与CsA和对照样本比较，IL-2活性应随12小时、24小时、36小时时间的延长而逐渐消耗减少，但在有去甲泽拉木醛的样本内培养12小时至36小时，IL-2活性并未见减低的趋势，提示去甲泽拉木醛除有抑制IL-2生成外，还有抑制IL-2受体活性的作用，而减少IL-2的消耗。
4)、去甲泽拉木醛对重组IL-2促进CTLL-2细胞增殖的抑制作用在依赖IL-2的CTLL-2细胞悬液中加入不同浓度的去甲泽拉木醛、TII、CsA，并加rIL-2使CTLL-2转化，用MTT方法测定OD值，了解去甲泽拉木醛对rIL-2促CTLL-2细胞转化的抑制作用。
结果在培养的依赖IL-2的CTLL-2细胞中加入rIL-2，空白OD值为0.154±0.013，当加入0.5μg/ml和1μg/ml浓度的去甲泽拉木醛后，其OD值明显下降，分别为0.024±0.001和0.014±0.003，提示去甲泽拉木醛有抑制IL-2受体活性的作用(p＜0.001)。在0.5μg/ml和1μg/ml浓度的TII组中，其OD值与对照组比较也有小幅下降(P＜0.05和P＜0.01)，但不及去甲泽拉木醛强。各浓度的CsA OD值均与空白样本相当(p＞0.05)，表明CsA对IL-2受体活性无影响。
上述实验结果证实去甲泽拉木醛对有丝分裂原ConA或PHA以及异体MHC抗原刺激小鼠脾细胞的转化有明确的抑制作用，去甲泽拉木醛抑制免疫反应的作用比TII的作用更强，在达到一定浓度时，其抑制作用的强度甚至与CsA相当。去甲泽拉木醛不仅有抑制脾淋巴细胞生成或释放IL-2的作用，还有对IL-2受体活性的抑制作用。
2、去甲泽拉木醛对大鼠原位肾移植模型的实验研究1)、建立大鼠原位肾移植研究模型采用250-300g体重，雄性Wistar和SD大鼠作为肾移植的供、受体鼠。暴露供体大鼠的左肾并在手术显微镜下解剖游离左肾动静脉、输尿管上段，阻断左肾血管的上下腹主动脉，经腹主动脉对左肾灌注0～4℃的肾保存液8ml，切取左肾并修整左肾血管和输尿管。充分暴露受体大鼠的左侧肾脏，在手术显微镜下游离左肾及血管、输尿管上段，紧靠腹主动脉阻断肾动脉、静脉，横断动静脉及输尿管上段切除左肾，残端血管肝素盐水冲洗，分别间断端端吻合供肾动脉与受体肾动脉，两定点连续端端缝合肾静脉，开放血管见肾血供良好、颜色红润、输尿管流尿，输尿管与输尿管上段间断缝合，切除右肾。术毕大鼠保温直到苏醒。结果经本方法建立的大鼠肾移植模型的成功率较高，可达80％的成功率，手术成功的大鼠排泄性尿路造影见移植肾功能好，排泄通畅，无明显尿路梗阻。血BUN、Cr检查正常范围。与术前自身的BUN、Cr比较，t检验P＞0.05，差别无显著性，提示肾功能良好。手术3天移植肾切取做病理观察，镜下肾组织有少量淋巴细胞浸润，肾小球及肾小管完好。结论在手术显微镜下建立左肾原位大鼠肾移植模型，能达到肾功能正常的要求。
2)、去甲泽拉木醛与TII抑制大鼠移植肾排斥作用的比较研究雄性Wistar、SD大鼠为供、受体，行肾移植大鼠70只，随机分为7个组，每组8只，其一为对照组。每组另有2只预备在14天时处死。对照组每天每只鼠生理盐水4ml灌胃，去甲泽拉木醛用药三个组分别每天每鼠灌4ml内含5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的去甲泽拉木醛药液，TII分三个组，分别每天每鼠灌胃4ml内含20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg药液。灌胃时间为每天至死亡或14天。观察大鼠活动和进食情况，用药前及用药14天各取血一次检查血红蛋白、肝功能情况，用药14天处死1只或死亡时取肠、肝、肾行病理组织学检查。分别记录各组大鼠存活天数。
结果去甲泽拉木醛用药5mg/kg大鼠平均存活时间为7.1±0.65天，与对照组6.9±0.64天比较无显著性差异(P＞0.05)，提示去甲泽拉木醛5mg/kg对大鼠移植肾排斥无抑制作用；去甲泽拉木醛用10mg/kg和20mg/kg时，其平均生存期提高到14.7±1.04天和18.0±1.51天，与对照组比较差异显著(p＜0.001)，表明此两个剂量去甲泽拉木醛对大鼠移植肾存活有延长作用。其两组间比较20mg/kg组较10mg/kg组存活期长。与TII用药组比较，去甲泽拉木醛10mg/kg存活期与TII 40mg/kg和60mg/kg的存活期相当(p＞0.05)，但去甲泽拉木醛20mg/kg的存活期较TII任何一组都长(p＜0.01)。组织病理学检查对照组死亡鼠肾脏表现为典型及严重的急性排斥反应，去甲泽拉木醛5mg/kg组与TII 20mg/kg组的移植肾改变与对照组相似。去甲泽拉木醛10mg/kg组与TII 40mg/kg和60mg/kg组，在14天移植肾组织中见较多的淋巴细胞，已有排斥反应出现，只有去甲泽拉木醛20mg/kg组14天时肾组织中仅见少量淋巴细胞浸润，未见有明显的排异征象。小肠和肝组织检查未见异常。用药前和用药14天的血红蛋白、ALT、TP检查差别无显著性(p＞0.05)。
结论去甲泽拉木醛给药对大鼠移植肾的排斥有确切的抑制作用，其作用强度与剂量呈正相关。，10mg/kg和20mg/kg用药14天均能显著延长移植肾的存活，但以20mg/kg组更为理想，与TII用药组比较，去甲泽拉木醛20mg/kg作用要强。去甲泽拉木醛20mg/kg给药14天尚不至于对大鼠造成毒性副作用。3)、去甲泽拉木醛与CsA抑制大鼠移植肾排斥作用的比较研究以雄性Wistar、SD大鼠为供、受体，行肾移植大鼠80只，随机分为8组，每组8只。每组另有2只预备在14天时处死。各组分别给予4ml含Pred 10mg/kg、去甲泽拉木醛10mg/kg、去甲泽拉木醛20mg/kg、去甲泽拉木醛10mg/kg+Pred 10mg/kg、CsA 5mg/kg、CsA10mg/kg和CsA 10mg/kg+Pred 10mg/kg药液，每鼠每天灌胃一次至死亡或14天。同时观察记录各组大鼠的生存天数，取死亡鼠或14天处死预备大鼠取小肠、肝、肾等做组织病理切片检查，以及用药前和14天时的血红蛋白、ATL、TP检查。
结果单用去甲泽拉木醛两个剂量组(10mg/kg和20mg/kg)均能显著延长大鼠的存活时间，与对照组比较均有明显差异(p＜0.01)。其中10mg/kg组存活时间与单用CsA的5mg/kg剂量组相当，差别无显著性(p＞0.05)。单用强的松10mg/kg预防大鼠移植肾排斥几乎无作用，其平均生存期与对照组比较差别无显著性意义(p＞0.05)。但去甲泽拉木醛10mg/kg与Pred 10mg/kg合用却能延长大鼠的生存期至31.75±6.48天。用药14天时的移植肾在去甲泽拉木醛20mg/kg、CsA10mg/kg组及两个联合用药组，肾病理检查无明显病变，而其他组已有不同程度的排斥征象如淋巴细胞浸润。各组在用药14天的血红蛋白、ALT、TP检查无异常，14天时取肝、小肠做病理检查也未见异常。
结论证实去甲泽拉木醛具有较强的免疫抑制作用，单独应用10mg/kg或20mg/kg能显著地延长大鼠移植肾的存活时间，存活时间在一定范围内随剂量加大而延长。单独应用Pred 10mg/kg对肾移植大鼠存活期无延长作用，但与去甲泽拉木醛10mg/kg合用，却能成倍地延长单用同剂量的去甲泽拉木醛的大鼠存活时间，在短时间内应用适当剂量的去甲泽拉木醛，不会出现可见的毒性副作用。(二)、毒理实验结果1、急性毒性试验取雌雄小鼠体重为18～22g，各30只，随机分为6组，每组雌雄小鼠各5只，各组分别按192mg/kg、240mg/kg、300mg/kg、375mg/kg和468mg/kg给每只小鼠去甲泽拉木醛一次灌胃，对照组给生理盐水，容积为0.8-0.9ml，观察小鼠死亡情况，求LD50值，并取脏器病理检查。
结果去甲泽拉木醛的LD50为286.135mg/kg。LD50的95％可信限283.92-288.39mg/kg。去甲泽拉木醛的主要毒性器官是肠道和肝。
2、亚急性毒性试验取小鼠40只，随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。分别给予各组按生理盐水、去甲泽拉木醛10mg、20mg、和80mg/kg，给每只小鼠每天灌胃一次，共14天，容积为0.8ml，观察小鼠活动、饮食、体重、血常规、血生化和脏器的病理检查。
结果去甲泽拉木醛每天80mg/kg给药时，初始可造成小鼠厌食，体重下降，可能与进食减少有关。80mg/kg组用药14天，血红蛋白和WBC有一定下降，肝功能检查及病理检查提示80mg/kg对肝脏有轻度的毒性作用，小肠粘膜绒毛轻度肿胀，固有膜内少量炎症细胞浸润，而10mg和20mg/kg组未见有上述病变。
毒理研究证明去甲泽拉木醛与目前雷公藤中提到的主要成分相比，如雷公藤多甙(TII)小鼠口服LD50为159.70mg/kg，腹腔注射为93.99mg/kg；雷公藤甲素(雷公藤内酯醇)小鼠腹腔注射的LD50为0.9mg/kg；雷公藤红素是10.9mg/kg；而去甲泽拉木醛的小鼠口服LD50为286.135mg/kg，毒性明显低于这些化合物。
本发明免疫抑制药物毒性副作用极少、来源广泛、生产成本低，价格便宜、应用方便，还可用于治疗临床其他自身免疫性疾病如红斑狼疮等。
权利要求
1.种免疫抑制药物，其特征是含有有效剂量的去甲泽拉木醛和药学上可接受的赋形剂。2、根据权利要求1所述的免疫抑制药物，其特征是所述的去甲泽拉木醛和赋形剂配比是1∶20-300。3、根据权利要求1和2所述的免疫抑制药物，其特征是可制成缓释胶囊、软胶囊，注射剂和软膏剂。4、根据权利要求3所述的药物，其特征是去甲泽拉木醛的含量是a、缓释胶囊每粒在10-30mg，，b、软胶囊每粒在10-20mg，，c、注射剂每ml在1-5mg，，d、软膏剂为0.15-3％。5、根据权利要求1所述的免疫抑制药物的制备方法，其中所述的去甲泽拉木醛是由下列方法得到雷公藤根皮经干燥并粉碎处理，向已处理的原料中加入乙酸乙酯，，加热回流，得提取液，回收溶媒，得干浸膏，进行硅胶柱层析，用正己烷/丙酮梯度洗脱，得淡黄色粉状物--去甲泽拉木醛原料药。6、根据权利要求5所述的制备方法，其中所述的乙酸乙酯加入量为原料的1-3倍，所述的硅胶加入量为浸膏的5-10倍量。
全文摘要
本发明属制药领域,具体涉及一种从雷公藤中提取得到单体化合物去甲泽拉木醛,以其为有效成分的免疫抑制药物及其制备方法。本发明单体化合物去甲泽拉木醛可作为药物原料制成口服缓释制剂、软胶囊、注射剂、软膏剂等。本发明免疫抑制药物毒性副作用极少、来源广泛、生产成本低,价格便宜、应用方便,本发明药物用于器官移植后抗排斥反应效果明显,还可用于治疗临床其他自身免疫性疾病如红斑狼疮等。
文档编号C07J63/00GK1369266SQ0211082
公开日2002年9月18日 申请日期2002年2月8日 优先权日2002年2月8日
发明者杨春欣, 林宗明 申请人:复旦大学附属中山医院