专利名称：具有抗病毒、抗癌活性的氨基糖肽类新化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一系列新的氨基糖肽类抗生素和其药学上可接受的酸的盐；本发明也涉及这一系列新化合物的制备方法及生产方法；本发明还涉及这一系列化合物在制造抗病毒、抗肿瘤药物上的用途。
该系列新化合物属水溶性氨基糖肽类化合物，为博莱霉素族抗生素中博莱霉素A5和博莱霉素A6的衍生物。已知的博莱霉素族抗生素是日本科学家Umezawa及其合作者于1966年从轮枝链霉菌发酵液中首次分离得到的，博莱霉素族的抗生素大多具有抗肿瘤活性。大量研究表明该类化合物具有的断裂DNA，从而导致细胞死亡的作用是其具有抗肿瘤活性的关键。该类抗生素中，首先应用于临床的是博莱霉素(Blenoxan，布兰诺克塞，以A2、B2为主)，在临床上对肺鳞状细胞癌、恶性淋巴癌、头颈癌等具有优良的治疗效果。随后相继用于临床的还有日本的匹莱霉素(Pepleomycin，PEP)和我国的平阳霉素(博莱霉素A5)。目前在我国已经进入临床实验的还有博安霉素(博莱霉素A6)。许鸿章等1999年就发酵得到的博莱霉素A6的衍生物博宁(bonin)已申请了中国专利(CN 1231340)，据报道有较低的毒副作用。博莱霉素族抗生素具有如下结构 其中主要组分的R基团分别为A1-NH(CH2)3S(O)CH3A2-NH(CH2)3S(CH3)2A5-NH(CH2)3NH(CH2)4NH2A6-NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2B2-NH(CH2)4NHC(＝NH)NH2B4-NH(CH2)4NH(CH2)4NHC(＝NH)NH2博宁-NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCOCH3近年又有报道，博莱霉素类化合物还具有抗病毒活性，特别是具有抗HIV病毒活性引起了人们极大兴趣。N.A.Georgioa等报道(Inter.J.of Antimicro.Agents，18，(2001)513-518)博莱霉素与抗HIV药物AZT等合用，可极大提高治疗效果，降低治疗成本，有可能成为新抗病毒药物或成为HIV药物组合治疗方案用药组分之一。然而博莱霉素类化合物作用机理为断裂DNA、从而导致细胞死亡，主要为细胞毒作用，药物作用的特异选择性不强，毒副作用较大，特别是它的肺毒性，能导致不可逆的肺纤维化，限制了博莱霉素类化合物的应用。因此提高该类化合物的治疗效果，降低毒副作用，拓宽其应用范围具有重要现实意义。
自从博莱霉素发现以来，国内外学者及研究机构就从各方面对博莱霉素进行了广泛的研究，其中包括博莱霉素类化合物结构研究、药理研究、代谢研究、构效关系研究、作用机理研究、分子识别及靶向特异性研究等基础研究和大量的以博莱酶素为先导化合物的结构改造研究。然而对博莱霉素结构改造主要基于发酵的方法，由于博莱酶素结构复杂，采用合成的方法对其进行结构改造非常困难，研究的人较少，且合成过程复杂，工业前景黯淡。因此，目前国内外临床上应用的这类化合物均是采用微生物发酵得来的，发酵采用的是链霉菌属厌氧微生物及其变种。微生物发酵的方法涉及到菌种的提取、优化、保持等，同时不同的链霉菌属变种对不同的博莱霉素化合物其发酵单位不同；另外得到的发酵产物组成复杂，含量低，分离、提取、纯化产物困难。采用发酵的办法对博莱霉素进行结构改造，特别是对博莱霉素进行专一性结构改造尤为困难，同时受发酵条件的影响结构改造的范围也受到很大限制。基于上述原因，严重限制了博莱霉素新衍生物出现的速度，影响了更为有效、安全的博莱霉素类药物的出现。要解决这一问题，寻找简便易行的化学合成方法来对博莱霉素进行结构改造无疑是理想的选择。
本发明的目的是利用化学合成的方法制备一系列新的氨基糖肽类抗生素(博莱霉素A5、A6新衍生物)，该类化合物具有较好的抗病毒、抗肿瘤活性和较低的毒副作用，特别是具有优良的抗HIV活性。本发明的合成方法具有操作简单，原料易得的特点，具有良好的工业化前景。
本发明确切地讲涉及式(I)的化合物和式(II)的化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸的盐。 式(I) 式(II)其中R1、R2所代表的基团为氢原子或COR3，R1、R2代表的基团可以相同也可以不同，但至少有一个为COR3。
其中R3代表氢原子、烃基、烷氧基、芳基、环烷烃基、杂环基、胍基烃基、氨基烃基等的一种或几种基团(对于式(II)，当R2＝H时，R3≠CH3)。
以上所代表的化合物及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐等。
——“烃基”被定义为直链或支链的饱和或不饱和的基团，环状和非环状基团，芳香和非芳香基团，杂环和非杂环基团；——“烷氧基”被定义为各烃基部分可以是直链或支链的基团，可以是饱和或不饱和的烃基，也可以是含芳基、杂环、环烷基的烃基；——“芳基”被定义为苯基、萘基，各自任选地被一个或多个相同或不同的基团取代，取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基，直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、氨基、直链或支链(C1-C6)烷基氨基；——“环烷基”被定义为连接有饱和或不饱和直链或支链烷基侧链的饱和或不饱和的环状烷基，和不含侧链的环状烷基。在这里环状烷基包括饱和和不饱和的环状烷基，环的大小是指三元环、四元环、五元环、六元环等。
——“杂环基”被定义为饱和或不饱和的单一或二环基团，具有芳族和非芳族特征，具有5至12个环原子，含有1-3个相同或不同的杂原子，杂原子可以是氧、氮和硫中的一种或几种。杂环同时被理解为可以任意的被一个或多个相同或不同的取代基取代，取代基可以是卤素、羟基、直链或支链(C1-C6)烃基、直链或支链(C1-C6)烷氧烃基、硝基和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基取代)。
在杂环中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃4-酮、吡嗪基、嘧啶基、异恶唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。
——“胍基烃基”定义为烃基基团的末端含有胍基，胍基的数量可以是1-3个，烃基的含义如前面所定义。
——“氨基烃基”定义为烃基基团的末端或中间碳上连有氨基，连有氨基的数量可以是1-5个，所连接氨基上的氢可以任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基。烃基的含义如前面所定义。
在药学上可接受的酸的盐是指盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、碳酸等无机酸和甲酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸以及葡萄糖酸等有机酸形成的盐。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表氢原子、C1-C6的直链烷基和烯基、C1-C10的支链烷基和烯基。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表-R4O5，这里R4和R5分别代表C1-C6的直链烷基和烯基、C1-C10的支链烷基和烯基、苯和取代苯基、杂环和取代杂环基。R4和R5可以相同也可以不同。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表苯基和取代苯基、萘基和取代萘基等芳香基团，取代基位置可以是芳环上任意位置，取代基的个数为1-4，取代基的种类包括卤素、羟基、氰基、硝基，直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链烷氧基(C1-C6)、氨基、直链或支链(C1-C6)烷基氨基等，多个取代基可以相同也可以不同。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表连接有(C1-C6)的饱和或不饱和直链或支链烃基侧链的饱和或不饱和的环状烃基，和不含侧链的环状烃基。在这里环状烃基的大小是指三元环、四元环、五元环、六元环等，环的个数为1-3。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表杂环基，杂环基为饱和或不饱和的单一或二环基团，具有芳族和非芳族特征，具有4至12个环原子，含有1-3个相同或不同的杂原子，杂原子可以是氧、氮和硫中的一种或几种。杂环可以是带有和不带有取代基的杂环，取代基可以是一个或多个相同或不同的取代基，取代基可以是卤素、羟基、直链或支链(C1-C6)烃基、直链或支链(C1-C6)烷氧烃基、硝基、氧代和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基取代)等。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表基团的末端含有胍基的烃基基团，胍基的数量可以是1-3个，烃基可以是C1-C6的直链或支链烷基和烯基、C1-C6直链或支链的烷氧基、C1-C6直链或支链的氨基烷基、含苯基和取代苯基取代基以及含杂环和取代杂环取代基的C1-C6的直链或支链烷基和烯基。
作为一种优化，本发明涉及的取代基团变化为R2＝H，R1＝COR3，R3代表末端或中间碳上连有氨基的烃基基团，连有氨基的数量可以是1-5个，所连接氨基上的氢可以任意被一个或两个C1-C6的直链或支链的烃基取代，也可以不取代，连接氨基的烃基基团可以是C1-C6的直链或支链烷基和烯基、C1-C6直链或支链的烷氧基、含苯基和取代苯基取代基以及含杂环和取代杂环取代基的C1-C6的直链或支链烷基和烯基、苯基和取代苯基、杂环和取代杂环基等。
按照本发明，对于式(I)和式(II)优选的化合物是当R2＝H；R1＝COR3时，R3＝-H；-CH3(仅对式I)；-CH2CH3；-(CH2)2CH3；-(CH2)2CH3的化合物。
当R2＝H；R1＝COR3时R3＝-C6H6；-C6H6-p-CH3的化合物。
当R2＝H；R1＝COR3时，R3＝-C5H5N的化合物。
当R2＝H时，R1＝-C(＝NH)NH2的化合物。
当R2＝H；R1＝COR3时，R3＝-CH2NHC(＝NH)NH2；-(CH2)3NHC(＝NH)NH2的化合物。
当R2＝H；R1＝COR3时，R3＝-CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2的化合物。
优选化合物以及它们与药学上可接受的酸所形成的加成盐构成本发明的完整内容的一部分。
按照本发明，对于式(I)和式(II)化合物的制备方法，其特征在于分别使用博莱霉素A5和博莱霉素A6的铜配合物作为原料 博莱霉素A5 博莱霉素A6按照有机合成中DCC缩合形成酰氨键的方法和条件，与RCOOH反应得到式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物或式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物的衍生物。这里R为前面所定义的R3或含有反应活性基团保护基的R3的衍生物。
采用经典的脱除反应活性基团保护基的方法，脱除式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物的衍生物中的保护基团，得到式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物。
采用文献脱铜方法进行脱铜处理，并采用层析色谱、吸附色谱技术对所得化合物进行分离纯化，最后得到式(I)化合物和式(II)化合物。
本发明还涉及药物组合物，包含至少一种式(I)化合物或式(II)化合物或这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐作为活性成分，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体。
在按照本发明的药物组合物中，可以特别提到适用于口服、胃肠外(静脉内、肌肉或皮下)，经皮或透皮、经鼻、直肠、经舌的那些，特别是片剂或糖衣丸、胶囊剂、锭剂、栓剂、皮肤凝胶、可注射制剂等。
本发明化合物具有明显的抗HIV活性、抗癌活性。含有至少一种式(I)化合物或式(II)化合物或这些化合物所形成的在药学上可接受的酸的盐作为活性成分化合物的药物组合因此可以用于病毒的治疗、癌症治疗等，特别是用于HIV病毒的治疗。部分化合物体外细胞筛选抗肿瘤、HIV-1病毒活性结果列于表1和表2表1部分化合物体外细胞筛选抗肿瘤活性(IC50，μM)
表2部分化合物体外细胞筛选抗HIV-1活性(IC50，μM)
下列实施例用来进一步说明本发明而不是用来限制本发明。
所用原料和(或)试剂均为已知的产品，或者是按照已知操作制备的产品。
实施例和合成步骤中所述化合物的结构是按照常规的光谱技术(红外，UV、NMR、MS)测定的。
实施例1N1-[3-[[4-[[2-氨基-5-[(氨基亚氨甲基)氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(化合物1)步骤ANα-硝基-精氨酸制备室温下将100克L-精氨酸盐酸盐缓慢加入到200毫升浓硫酸中，室温搅拌使其溶解，减压抽出HCl气体，至反应液不鼓泡，得澄清溶液。搅拌下缓慢加入50克粉状硝酸铵，15分钟后减压脱出气泡，反应物搅拌下倾入碎冰的，得水溶液，水溶液用浓氨水调PH＝6.8，置冰箱中冷却结晶，抽滤，沉淀分别用水、乙醇、乙醚洗涤数次，干燥，产物在水中重结晶，得产物98克，收率86.5％，熔点255℃(dec.)。
步骤BNα-硝基-N-苄氧羰基-精氨酸制备
5.8克Nα-硝基-精氨酸溶于26.4ml 1N NaOH水溶液中，冰盐浴中，0℃以下滴加7克苄氧羰酰氯和26.4ml 1N NaOH水溶液，加毕后，反应1小时，用HCl调PH＝2-3，得油状产物，冰箱中放置使其结晶，过滤，产物用甲醇-水混合溶剂重结晶，收率52％，熔点127-128。
步骤CN1-[3-[[4-[[2-[(苄氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亚氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物制备42毫克Nα-硝基-N-苄氧羰基-精氨酸加入100毫升反应瓶中，冰水浴冷却，加入10毫升甲醇，搅拌使其溶解，然后加入50毫克DCC，保持0℃以下反应30分钟，然后滴加90毫克博莱霉素铜配合物的5毫升甲醇溶液，加毕后于0℃反应48小时。所得反应液减压浓缩，过滤除去不溶物，母液用硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂为甲醇∶10％乙酸铵∶10％氨水＝100∶9∶1，所得产物经浓缩、冷冻干燥得兰色固体，为目标化合物，用于下一步分离。熔点无固定熔点，加热分解。
步骤D N1-[3-[[4-[[2-[(苄氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亚氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨步骤C所得的N1-[3-[[4-[[2-[(苄氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亚氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物中加入10毫升15％EDTA溶液，25-30℃搅拌反应24小时，加入到大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水洗涤，然后用甲醇-盐酸混合溶剂解吸附，所得甲醇-盐酸洗脱液40℃以下减压浓缩，最后产物冷冻干燥，得目标化合物白色蓬松固体82毫克，收率73％，熔点无固定熔点，加热分解。
步骤E N1-[3-[[4-[[2-氨基-5-[(氨基亚氨甲基)氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备步骤D所得的N1-[3-[[4-[[2-[(苄氧羰基)氨基]-5-[[(Nα-硝基)氨基，亚氨甲基]氨基]1-羰基]氨基]戊基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨用10毫升甲醇溶解，加入氢化反应瓶中，然后加入10毫克10％钯-碳催化剂，于2个大气压下催化氢解，2小时后，过滤，固体水洗，溶液减压浓缩，用大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水洗涤，然后用甲醇-盐酸混合溶剂解吸附，所得甲醇-盐酸洗脱液40℃以下减压浓缩，最后产物冷冻干燥，得目标化合物白色蓬松固体66毫克。收率65％，熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1597(M++1)实施例2N1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(化合物2)步骤AN1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物的制备13毫克苯甲酸加入100毫升反应瓶中，冰水浴冷却，加入10毫升甲醇，搅拌使其溶解，然后加入50毫克DCC，保持0℃以下反应30分钟，然后滴加90毫克博莱霉素A5铜配合物的5毫升甲醇溶液，加毕后于0℃反应48小时。所得反应液减压浓缩，过滤除去不溶物，母液用硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂为甲醇∶10％乙酸铵∶10％氨水＝100∶9∶1，所得产物经浓缩、冷冻干燥得兰色固体，为目标化合物，用于下一步分离。
步骤BN1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备步骤A所得的N1-[3-[[4-[[(1-苯基-1-羰基)甲基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物中加入10毫升15％EDTA溶液，25-30℃搅拌反应24小时，加入到大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水洗涤，然后用甲醇-盐酸混合溶剂解吸附，所得甲醇-盐酸洗脱液40℃以下减压浓缩，最后产物冷冻干燥，得目标化合物白色蓬松固体78毫克，收率80.3％。熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1545(M++1)实施例3 N1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(化合物3)步骤AN1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物的制备操作同实施例2中的步骤A，以乙酸代替实施例2中步骤A中的苯甲酸，乙酸的投料量为7.2毫克。
步骤BN1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备操作同实施例2的步骤B，原料为步骤A得到的N1-[3-[[4-[[(1-羰基)乙基]氨基]-丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物。目标化合物白色蓬松固体65毫克，收率71.4％。熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1483(M++1)实施例4N1-[3-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(化合物4)步骤AN1-[3-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物的制备130毫克甲基异硫脲硫酸盐加入100毫升反应瓶中，冰水浴冷却，加入5毫升甲醇，搅拌使其溶解，然后加入10％氨水O.5毫升，随后保持0℃以下迅速加入90毫克博莱霉素A5铜配合物的5毫升甲醇溶液，加毕后于0℃反应48小时。所得反应液减压浓缩，除去溶剂甲醇，加入5毫升水溶解反应物，加入到大孔吸附树脂柱吸附，用蒸馏水洗涤，除去未反应的甲基异硫脲和无机盐等，然后用甲醇-盐酸混合溶剂解吸附，所得甲醇-盐酸洗脱液40℃以下减压浓缩，产物冷冻干燥，冷冻干燥产物用甲醇溶解，用硅胶H进行柱层析分离，洗脱剂为甲醇∶10％乙酸铵∶10％氨水＝10∶9∶1，洗脱产物经浓缩、冷冻干燥得兰色固体，为目标化合物，用于下一步脱铜精制。
步骤BN1-[3-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备操作同实施例2的步骤B，原料为步骤A得到的N1-[3-[4-[(氨基亚氨甲基)氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物。目标化合物白色蓬松固体41毫克，收率43.7％。熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1482(M++1)实施例5N1-[3-[4-[[(4-氨基-1-羰基)丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(化合物5)步骤AN-苄氧羰基-氨基丁酸的制备3克氨基丁酸溶于15ml2N NaOH水溶液中，冰盐浴中，0℃以下滴加10克苄氧羰酰氯和25ml 2N NaOH水溶液，维持反应液pH大于9，加毕后，反应1小时，加入乙醚30毫升萃取除去未反应的苄氧羰酰氯，水相加入30毫升乙酸乙酯，搅拌下用HCl调pH＝2-3，分出乙酸乙酯层，再用乙酸乙酯萃取2次，合并酯层，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，蒸除乙酸乙酯，得油状产物，冰箱中放置使其结晶。称重的白色结晶6克，收率86.4％，直接用于下一步反应。
步骤B N1-[3-[4-[[[4-(苄氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物的制备操作同实施例1中的步骤D，以N-苄氧羰基-氨基丁酸代替实施例1中步骤A中的Nα-硝基-N-苄氧羰基-精氨酸，N-苄氧羰基-氨基丁酸的投料量为30毫克。
步骤C N1-[3-[4-[[[4-(苄氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备操作同实施例1的步骤D，原料为步骤C得到的N1-[3-[4-[[[4-(苄氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨铜配合物。目标化合物为白色蓬松固体。
步骤D N1-[3-[4-[[(4-氨基-1-羰基)丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨的制备(A5-BN)操作同实施例1的步骤E，原料为步骤D得到的N1-[3-[4-[[[4-(苄氧羰基)氨基-1-羰基]丁基]氨基]丁基]氨基]丙基]-博莱霉素酰氨。目标化合物为白色蓬松固体，称重68毫克，收率72.9％。熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1525(M++1)实施例6N1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博莱霉素酰氨的制备(化合物6)步骤AN1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博莱霉素酰氨铜配合物的制备操作同实施例2中的步骤A，以异烟酸代替实施例2中步骤A中的苯甲酸，异烟酸的投料量为13毫克。
步骤BN1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博莱霉素酰氨的制备操作同实施例2的步骤B，原料为步骤A得到的N1-[3-[[4-[[1-(3-吡啶基)-1-羰基]甲基]氨基]丁基]氨基]丙基-博莱霉素酰氨铜配合物。所得目标化合物为白色蓬松固体78毫克，收率81.7％。熔点无固定熔点，加热分解；紫外吸收光谱呈现博莱霉素类化合物的特征吸收曲线，FAB-MS1546(M++1)本发明化合物的药理研究。
实施例8 抗癌筛选试验分别用KB、Hela、HL-60、BGC-823及BEL-7402肿瘤细胞株采用MTT法或SRB法进行试验。
MTT法分别将生长状态良好的、处于对数生长期的HL-60、BGC-823、Bel-7402、KB及Hela细胞以1×104个/mL浓度接种于96孔板，37℃5％CO2培养箱中培养24小时，加入灭菌处理的待筛选化合物，继续培养48小时后，每孔加20μL含5mg/mL MTT的SBS溶液，继续培养4小时。弃去上层液，室温晾干。每孔中分别加入200μL酸化异丙醇溶液溶解紫色残留物，于570nm处酶标仪上测定OD值，计算抑制率和IC50。
SRB法分别将生长状态良好的、处于对数生长期的HL-60、Bel-7402、BGC-823、KB及Hela细胞以1×104个/mL浓度接种于96孔板，37℃5％CO2培养箱中培养24小时。加入灭菌处理的化合物，继续培养48小时后，弃去上清液，每个小孔中加入100μl 10％TCA(三氯醋酸)，静置5分钟后，于4℃放置1小时固定。然后倒掉固定液，每个小孔用水洗5遍。室温干燥后，每孔加入0.4％SRB 100μl，室温放置10分钟后，用1％HOAc(醋酸)洗5遍，空气干燥，加入10mM Tris 200μl/每孔，振荡溶解，于540nm单波长处测定OD值，计算抑制率和IC50实施例9抑制HIV-1复制体外实验将生长状态良好的MT4细胞配成浓度为40×105个/毫升的细胞悬液，每孔100微升加入96孔板。待测药物过滤除菌，用RPMI1640培养液进行系列稀释(1.0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM、0.03125μM)，每孔50μL加入96孔板中。再加滴度分别是100TCID50和1000TCID50(tissue cultured infection dose)的HIV-1 50μL，每种药物浓度和病毒滴度组合做4复孔。设阳性对照(AZT+MT4细胞+HIV-1)、阴性对照(水+MT4细胞+HIV-1)、药物毒性对照(药物+MT4细胞)和空白对照(MT4细胞+HIV-1)。在37℃、5％CO2条件下培养7天。每天定时观察细胞生长情况，培养第三天每孔补加50μL新鲜培养基，第六天观察细胞病变(CPE)。
全部实验按照操作规程在生物安全3级(BSL-3)实验室内进行，重复两次。计算抑制率和IC50。
权利要求
1.式(I)的化合物和式(II)的化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸的盐。 式(I) 式(II)其中R1、R2所代表的基团为氢原子或COR3，R1、R2代表的基团可以相同也可以不同，但至少有一个为COR3。这里R3代表氢原子、烃基、烷氧基、芳基、环烷烃基、杂环基、胍基烃基、氨基烃基等的一种或几种基团(对于式(II)，当R2＝H时，R3≠CH3)。本专利包括以上所代表的化合物及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐。——“烃基”被定义为直链或支链的、饱和或不饱和的基团；环状或非环状基团；芳香或非芳香基团；杂环或非杂环基团；——“烷氧基”被定义为各烷氧基部分可以是直链或支链的基团，这些基团可以是饱和或不饱和的烃基，也可以是含芳基、杂环、环烷基的烃基；——“芳基”被定义为苯基、萘基、四氢萘基、二氢萘基、茚基或2，3-二氢茚基，各自任选地被一个或多个相同或不同的基团取代，取代基选自卤素、羟基、氰基、硝基、直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链(C1-C6)烷氧基、氨基、直链或支链(C1-C6)烷基氨基；——“环烷基”被定义为连接有饱和或不饱和直链或支链烷基侧链的饱和或不饱和的环状烷基、不含侧链的环状烷基。在这里环状烷基包括饱和和不饱和的环状烷基，环的大小是指三元环、四元环、五元环、六元环等；——“杂环基”被定义为饱和或不饱和的单环或二环基团，具有芳族和非芳族特征，具有5至12个环原子，含有1-3个相同或不同的杂原子，杂原子可以是氧、氮和硫中的一种或几种。杂环同时被理解为可以任意的被一个或多个相同或不同的取代基取代，取代基可以是卤素、羟基、直链或支链(C1-C6)烃基、直链或支链(C1-C6)烷氧烃基、硝基、氧代和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基取代)。在杂环中，可以象征性而不加任何限制地提到吡啶基、噻吩基、呋喃基、咪唑基、4-H-吡喃4-酮、吡嗪基、嘧啶基、异恶唑基、四唑基、吡咯基、吡唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、1，2，3-噻二唑基……。——“胍基烃基”定义为烃基基团的末端含有胍基，胍基的数量可以是1-3个，烃基的含义如前面所定义；——“氨基烃基”定义为烃基基团的末端或中间碳上连有氨基，连有氨基的数量可以是1-5个，所连接氨基上的氢可以任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基。烃基的含义如前面所定义；
2根据权力要求1的式(I)的化合物和式(II)的化合物所形成的在药学上可接受的酸的盐是指盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、碳酸等无机酸和甲酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、酒石酸以及葡萄糖酸等有机酸形成的含结晶水或不含结晶水的盐；
3根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)的化合物，其特征在于R3是代表C1-C6直链或支链的、饱和或不饱和的烃基基团，环状和非环状烃基基团，芳香和非芳香烃基基团，杂环和非杂环烃基基团。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
4根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表C1-C6的直链烷基和烯基、C1-C10的支链烷基和烯基。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
5根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表氢原子。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
6根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表-R4OR5，这里R4和R5分别代表C1-C6的直链烷基和烯基、C1-C10的支链烷基和烯基、苯和取代苯基、杂环和取代杂环基。R4和R5可以相同也可以不同。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
7根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表苯基和取代苯基、萘基和取代萘基等芳香基团，取代基位置可以是芳环上任意位置，取代基的个数为1-4，取代基的种类包括卤素、羟基、氰基、硝基，直链或支链(C1-C6)烷基、直链或支链烷氧基(C1-C6)、氨基、直链或支链(C1-C6)烷基氨基等，多个取代基可以相同也可以不同。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
8根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表连接有(C1-C6)的饱和或不饱和直链或支链烃基侧链的饱和或不饱和的环状烃基，和不含侧链的环状烃基。在这里环状烃基的大小是指三元环、四元环、五元环、六元环等，环的个数为1-3。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
9根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表杂环基，杂环基为饱和或不饱和的单一或二环基团，具有芳族和非芳族特征，具有4至12个环原子，含有1-3个相同或不同的杂原子，杂原子可以是氧、氮和硫中的一种或几种。杂环可以是带有和不带有取代基的杂环，取代基可以是一个或多个相同或不同的取代基，取代基可以是卤素、羟基、直链或支链(C1-C6)烃基、直链或支链(C1-C6)烷氧烃基、硝基、氧代和氨基(任意被一个或两个直链或支链(C1-C6)烃基取代)等。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
10根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表基团的末端含有胍基的烃基基团，胍基的数量可以是1-3个，烃基可以是C1-C6的直链或支链烷基和烯基、C1-C6直链或支链的烷氧基、C1-C6直链或支链的氨基烷基、含苯基和取代苯基取代基以及含杂环和取代杂环取代基的C1-C6的直链或支链烷基和烯基。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
11根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，其特征在于R3代表末端或中间碳上连有氨基的烃基基团，连有氨基的数量可以是1-5个，所连接氨基上的氢可以任意被一个或两个C1-C6的直链或支链的烃基取代，也可以不取代，连接氨基的烃基基团可以是C1-C6的直链或支链烷基和烯基、C1-C6直链或支链的烷氧基、含苯基和取代苯基取代基以及含杂环和取代杂环取代基的C1-C6的直链或支链烷基和烯基、苯基和取代苯基、杂环和取代杂环基等。所得到的这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
12根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-H；-CH3(仅对式I)；-CH2CH3；-(CH2)2CH3；-(CH2)2CH3；这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
13根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-C6H5；这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
14根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3；R3＝-C5H5N；它们的异构体以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
15根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝-C(＝NH)NH2这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐；
16根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H；R1＝COR3R3＝-CH2NHC(＝NH)NH2；-(CH2)3NHC(＝NH)NH2；这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐。
17根据权力要求1和2的式(I)化合物和式(II)化合物，它是R2＝H； R1＝COR3R3＝-CH(NH2)(CH2)3NHC(＝NH)NH2；这些化合物以及这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐。
18式(I)化合物和式(II)化合物的制备方法，其特征在于使用博莱酶素A5和博莱酶素A6的铜配合物作为原料 博莱霉素A5 博莱霉素A6按照有机合成中DCC缩合形成酰胺键的方法和条件，与RCOOH反应得到式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物或式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物的衍生物。这里R为前面所定义的R3或含有反应活性基团保护基的R3的衍生物。采用经典的脱除反应活性基团保护基的方法，脱除式(I)化合物、式(II)化合物的铜配合物的衍生物中的R3基团的保护基团，得到式(I)化合物和式(II)化合物的铜配合物。采用文献脱铜方法脱铜，并采用层析色谱技术对所得化合物进行分离纯化，最后得到式(I)化合物和式(II)化合物；
19药物组合物，包含至少一种根据权利要求1至17任意一项的式(I)化合物或这些化合物所形成的在药学上可接受的酸盐作为活性成分，单独或结合一种或几种药学上可接受的、惰性的、无毒的赋形剂或载体；
20根据权利要求19的药物组合物，包含至少一种根据权利要求1至17任意一项的活性成分，用于抗病毒、抗癌治疗；
全文摘要
采用化学合成方法得到的如图所示的化合物其中R
文档编号C07H15/00GK1390846SQ0212084
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月5日 优先权日2002年6月5日
发明者杨铭, 徐志栋, 王敏, 肖苏龙, 许鸿章 申请人:北京大学