一种人白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用的制作方法

文档序号:3506410阅读:395来源:国知局
专利名称:一种人白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域
本发明涉及一种人白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用。
尽管目前已克隆了至少7种IL-17家族配体成员,但有关该家族成员的受体研究却知之甚少。IL-17R是第一个被鉴定的IL-17受体家族成员,广泛表达于多种不同的组织。但是,IL-17与IL-17R的亲和力较弱,与IL-17具有的广泛的生物学功能并不匹配,并且IL-17R并不含有与先前已知蛋白相似的结构。IL-17Rh1/IL-17BR与IL-17R一样,并不含有与先前已知蛋白相似的结构域,但它们的胞外结构域具有保守的胱氨酸残基,胞内结构域含有与IL-17R相似的氨基酸残基序列,暗示它们可能具有相似的下游信号事件。研究结果表明NF-κB是它们共同介导的下游信号分子。
曾报道,IL-17A和IL-17E能诱导核转录因子NF-κB的活化,另外也有研究结果表明IL-17A所诱导的下游信号事件包括活化胞外调控激酶(ERK-1/ERK-2),氮末端激酶(JNK,c-Jun),p38有丝分裂原激酶,Raf、Stats等下游信号分子。IL-17AR的敲基因小鼠研究表明,在肿瘤坏死因子-α结合因子-6(TRAF-6)缺陷的细胞系,IL-17诱导的下游信号事件明显阻断,提示TRAF-6对于IL-17刺激的信号是必要的。由于已知的几种IL-17受体成员的胞内结构域并不含有与Toll/IL-1R相似的结构,因此寻找和鉴定未知的IL-17家族成员的潜在受体显得尤其必要。
一种人白细胞介素-17受体样蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
本发明的人白细胞介素-17受体样蛋白命名为hIL-17RLM-S,是一种单跨膜细胞因子受体,由595个氨基酸残基组成。胞外区分别含有4个胱氨酸残基和4个潜在的N-糖基化部位。跨膜区由23个氨基酸组成。在临近跨膜区的3’端含有一个Toll/IL-1R样结构域。5’端并不含有潜在的信号肽或前导序列。
本发明采用多组织Northern Blot方法,检测了hIL-17RLM-S的mRNA组织表达分布,结果表明hIL-17RLM-S mRNA主要在肾及睾丸表达,在脑、心、脾、子宫有微弱的mRNA表达。但并未检测到hIL-17RLM-S在胸腺、胰腺、前列腺、外周血、小肠、结肠、骨骼肌、肝、肺、胎盘等组织的表达。表明hIL-17RLM-S的mRNA表达具有组织特异性。检测了hIL-17RLM-S在众多细胞系的表达分布,结果表明IL-17RLM在所选择的大多数细胞系如293,293T,HepG2,Ho8910,SGC7901,CNE,Hela,L02,A431,CHO,Cos7,GBE,Jurcat,K562,6T-CEM等皆有表达,但在某些白血病细胞系如HL60,U937,THP1和成纤维细胞3T3并未检测到其表达。
本发明的第二个目的是提供编码人白细胞介素-17受体样蛋白的基因。
一种人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明人白细胞介素-17受体样蛋白hIL-17RLM-S的编码基因由4508个碱基组成,位于人3号染色体(3p21.1)距NT_005787.8 420,648到506,133的位置,其基因组位置与IL-17BR和Toll receptor9基因非常临近,hIL-17RLM-S的起始编码氨基酸位于第五个外显子,共有14个外显子组成。
研究表明,本发明的人白细胞介素-17受体样蛋白可以使Stat5因子活化、介导细胞增殖,并可望在促进或抑制精子形成的药物或其它方面得到应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
将hIL-17RLM-S瞬时转染于Cos7细胞,检测其在胞内的表达和糖基化情况。hIL-17RLM-S在Cos7细胞的表达显示其分子量约为70kD。与预测的hIL-17RLM-S胞外区含有多个氮糖基化位点相匹配。
为了检测hIL-17RLM-S在细胞的内源性表达,采用免疫沉淀方法,使用抗hIL-17RLM-S兔多克隆抗血清,检测hIL-17RLM-S是否在人肾癌细胞系GRC-1有内源性蛋白表达。结果表明hIL-17RLM-S在人肾癌细胞系GRC-1存在内源性蛋白表达,其分子质量约100kD,很可能为hIL-17RLM-S的一种选择性剪切形式。但是,在GRC-1细胞系,并未同时检测到hIL-17RLM-S几种选择性剪切形式的蛋白表达。说明hIL-17RLM-S几种选择性剪切形式的内源性蛋白表达存在组织、细胞特异性。
对hIL-17RLM-S在细胞器的表达定位进行研究。将hIL-17RLM-S构建于EGFP-N1真核表达载体,将其瞬时转染于Cos7细胞,结果显示其主要表达在细胞膜上。为了进一步检测hIL-17RLM-S在细胞的内源性表达定位,进行了免疫荧光染色实验。借助hIL-17RLM-S兔多克隆抗血清,选择两种肾癌细胞系786-O和GRC-1,进行免疫染色研究,以检测hIL-17RLM-S在细胞的内源性表达定位。结果清楚表明hIL-17RLM-S主要定位在细胞膜。
实施例2、hIL-17RLM-S胞内结构域的功能——活化Stat5和介导细胞增殖本发明的发明人构建了一系列嵌合受体,通过对hIL-17RLM-S胞内区人工二聚化,证实了其传递信号的能力。
发明人将EPOR的胞外区和跨膜区与hIL-17RLM-S的胞内区构建一嵌合受体,借助EPO的刺激,进而检测hIL-17RLM-S的胞内区传递信号的潜力。首先进行了荧光素酶报道分析,瞬时共转染指示的受体表达质粒,Stat5应答的荧光素酶报道质粒4FTKSLN,pRL-TK载体(内对照),转染36小时后,使用重组人EPO刺激或不刺激(PBS)约30分钟后,收获细胞,进行荧光素酶报道分析。结果显示EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体与全长EPOR一样,在EPO的刺激作用下,能够介导Stat5的活化;并且当共转染Stat5的负显性突变体(dominant mutant)-Stat5 CYF时,EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体介导Stat5的活化被明显抑止;全长hIL-17RLM-S的过表达并不能介导Stat5的活化。这个结果暗示,hIL-17RLM-S的胞内区具有能够介导Stat5活化的潜力。
Stat5活化的一个重要标志是其在Jak激酶的作用下,Stat5的酪氨酸被磷酸化,然后转位入核,介导下游靶基因的表达。为了进一步检测hIL-17RLM-S的胞内区介导Stat5活化的潜力,采用免疫沉淀方法,检测EPOR/hIL-17RLM-S是否能够介导Stat5酪氨酸磷酸化。向Cos7细胞共转染嵌合受体-EPORextm/hIL-17RLM-Sicd或全长EPOR或空载体(Mock),Jak2,stat5高纯度表达质粒。在EPO刺激前30分钟,培养基中补加NaV3O4以抑制内源性磷酸化酶的水解。使用重组人EPO刺激或不刺激(PBS)约30分钟后,收获细胞,制备总细胞裂解液,一部分用于免疫沉淀,另一部分直接用于Western blot以检测转染质粒的表达情况。结果表明EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受体同EPOR一样,在EPO的刺激下,能够介导Stat5酪氨酸磷酸化;而在EPO未刺激组和空载体组,并未检测到Stat5酪氨酸磷酸化。这一结果进一步表明hIL-17RLM-S的胞内区能够介导Stat5酪氨酸磷酸化。
为了进一步证实hIL-17RLM-S胞内区具有介导Stat5活化的潜力,采用gel shiftassay以分析是否EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体能够介导细胞核抽提物Stat5-DNA结合复合体的形成,以证实其介导Stat5活化。具体做法是共转染指示的表达质粒于Cos7细胞,在EPO的作用后,制备细胞核抽提物,进行凝胶电泳阻滞分析实验。实验结果显示EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受体同EPOR一样,在EPO的刺激下,能够介导Stat5-DNA结合复合体的形成;而在EPO未刺激组和空载体组,并未检测到Stat5-DNA结合复合体的形成。采用冰冷的未标记的特异性结合Stat5的DNA探针,能够竞争性抑止Stat5-DNA结合复合体的形成。这一结果表明hIL-17RLM-S胞内区具有介导特异性Stat5-DNA结合复合体形成的特性。
为了进一步确定Stat5-DNA结合复合体的特异性和Stat5具体成分,分别借助抗Stat5ab,Stat5b,Stat1和Stat3特异性抗体,进行了Supershift分析实验。结果显示抗Stat5ab或Stat5b能够显著超迁移这个DNA结合复合体,而Stat1或Stat3特异性抗体却并不能超迁移这个DNA结合复合体,暗示EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体所介导的Stat5-DNA结合复合体主要为Stat5b-DNA复合体。这一结果进一步表明了hIL-17RLM-S胞内区具有活化Stat5信号的潜力。
上述实验结果显示hIL-17RLM-S具有活化Stat5的信号潜力。为了进一步鉴定是否细胞内稳定表达的EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受体在重组人红细胞生成素(rhEPO)的刺激下也具有介导Stat5活化的信号能力,发明人建立了稳定表达细胞系,命名为稳定表达EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd的阳性细胞系Ba/F3,采用Northern blot和western blot方法鉴定具有稳定表达EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受体的阳性细胞克隆。
对稳定表达EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd的阳性Ba/F3细胞系进行gelshift assay实验。结果表明EPOR/hIL-17RLM-S与EPOR稳定表达细胞系一样,EPO能够以时间依赖方式诱导其细胞核抽提物Stat5-DNA结合复合体的形成;然而在野生型Ba/F3细胞系,却并未诱导其细胞核抽提物Stat5-DNA结合复合体的形成。进一步表明hIL-17RLM-S的胞内区具有活化Stat5的信号能力。
Supershift分析结果显示采用抗Stat5ab或Stat5b,能够超迁移Stat5-DNA结合复合体,然而采用抗Stat5a或Stat1特异性抗体却并未超迁移Stat5-DNA结合复合体。这表明EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体主要介导Stat5b的活化,而不是Stat5a的活化。另外。使用冰冷的未标记Stat5 DNA特异性结合探针,能够特异地竞争性抑止Stat5-DNA结合复合体地形成,而使用无关的探针却不能竞争性抑止Stat5-DNA结合复合体的形成。这些结果充分证明了EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受体主要介导Stat5b的活化,而不是Stat5a的活化。这一结果也与通过瞬时过量表达EPOR/hIL-17RLM-S在Cos7细胞所介导Stat5活化的结果相吻合。据此可以得出,在Cos7细胞瞬时过量表达和在Ba/F3细胞稳定表达EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受体都能够介导Stat5活化,表明hIL-17RLM-S胞内区具有活化转录因子Stat5的信号潜力。
通常,I型细胞因子受体应答其偶连配体具有传递细胞增殖的信号能力。借助[3H]-Thymidine整合,进行了细胞增殖分析实验。结果表明EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌和受体稳定表达的Ba/F3细胞系和EPOR稳定表达的Ba/F3细胞系一样,能够应答EPO的刺激,出现细胞增殖现象,并且这种增殖效应为EPO浓度依赖的方式和刺激时间依赖的方式。这暗示hIL-17RLM-S的胞内结构域具有传递细胞增殖的信号潜力。
实施例3、hIL-17RLM-S与FGFRs的相互作用、共定位及对细胞分化的影响免疫沉淀和Western blot结果显示hIL-17RLM-S能够与爪蟾(Xenopus)mFGFR1或mFGFR2在瞬时共转染的Cos7细胞相互作用。但并未检测到hIL-17RLM-S与mFGFR3或mFGFR4的相互作用。
为了进一步确定hIL-17RLM-S与mFGFR1或mFGFR2的相互作用,进行了免疫染色实验,并进行Merge分析。Merge实验结果显示,hIL-17RLM-S与mFGFR2共定位于细胞膜和胞浆部位。
为了探讨是否hIL-17RLM-S与FGFR1或FGFR2在人体内源性组织中共定位表达。首先借助常规免疫组化的方法,检测hIL-17RLM-S、FGFR1和FGFR2在人体组织中的原位表达分布。结果表明hIL-17RLM-S、FGFR1和FGFR2在人体肾和睾丸组织中具有非常相似的表达分布,表达在组织的相同细胞类型,并且主要表达在组织细胞膜及细胞浆部位。另外FGFR1在肾及睾丸组织中的表达明显强于FGFR2的表达。
为了进一步确定是否hIL-17RLM-S与FGFR1在人体某些组织共定位表达,使用人多组织阵列(tissue array),采用双重或三重免疫组化染色试剂盒,大量筛检了hIL-17RLM-S与FGFR1在人体多种组织中的表达分布,并进行merge分析。结果显示在睾丸、肾组织,hIL-17RLM-S(绿光)和FGFR1(红光)具有极强的阳性免疫染色,并且具有非常相似的表达样式和细胞特异性。另外merge实验分析结果表明,hIL-17RLM-S和FGFR1明显共表达定位于睾丸组织的特异细胞类型。在肾组织和其它组织,尽管hIL-17RLM-S和FGFR1具有较强的阳性免疫染色和相似的表达分布,但是merge结果却并未显示hIL-17RLM-S和FGFR1的共定位表达分布。这表明hIL-17RLM-S和FGFR1的共定位表达分布具有组织特异性。也暗示hIL-17RLM-S与FGFR1在睾丸组织生精细胞中的特异性共定位表达很可能与精子的形成有关。
实施例4、hIL-17RLM-S抑制FGF介导的下游信号通路有资料表明FGF介导的下游Ras-Raf-MEK-MAPK信号通路受Sprouty家族成员的负调节。在早期斑马鱼胚胎发育过程中,由于FGF3,FGF8,spouty2,sprouty4与zSef/zhIL-17RLM-S为一协同表达组。因而,我们假设hIL-17RLM-S有可能同sprouty家族成员一样,具有在高等生物抑制FGF介导的下游信号通路及相应的某些生物学功能。
实验中,首先构建了EGFP-tagged hIL-17RLM-S(WT),EGFP-hIL-17RLM-Secdtm(ΔC)(含有hIL-17RLM-S的胞外结构域和跨膜结构域),EGFP-hIL-17RLM-Stmcyd(ΔN)(含有hIL-17RLM-S的胞内结构域和跨膜结构域)和EGFP-hIL-17RLM-S(DNΔ327-333)(缺失含有潜在酪氨酸磷酸化部位的一段基因序列)真核表达质粒。经DNA测序证实和western blot检测其在细胞的过表达正确。
在大鼠嗜铬神经细胞瘤细胞系-PC12细胞过表达上述真核表达质粒,转染36小时后,使用碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)刺激细胞约72小时后,荧光显微镜拍照和计数细胞分化的百分率。结果显示野生型hIL-17RLM-S能够显著抑制FGF2诱导PC12细胞的分化。然而,野生型全长hIL-17RLM-S对FGF2诱导PC12细胞分化的这种抑制作用能够被EGFP-hIL-17RLM-Secdtm(ΔC)逆转,但并不能够被EGFP-hIL-17RLM-Stmcyd(ΔN)和EGFP-hIL-17RLM-S(DNΔ327-333)所逆转。这一结果暗示hIL-17RLM-S的胞内结构域对与hIL-17RLM-S对FGF2诱导PC12细胞分化的抑制作用是必需的,然而hIL-17RLM-S的胞外结构域以及hIL-17RLM-S的胞内区潜在酪氨酸磷酸化部位却并不需要。这一结果也表明hIL-17RLM-S的胞内结构域是对FGF2诱导PC12细胞分化抑制作用的功能结构域。
序列表<160>2<210>1<211>4508<212>DNA<213>人属人种(Homo sapiens)<400>1cagcagtggt aacgacgcac agtacgcggg ggaaaagaaa cgggaagtgg ccgtgggccg 60gtgaattccg tgtagtggcc aagctttgtt ccaaagaggg ggaggtggtg acagtctctt120gcccactgaa gcgtgccaga cagagtgcta ggcatggggg cagaggtgaa tcagatgaca180gccacctctc accacgagga gtggctgaaa gtgtgactgg actacaggca atcctggcct240tggcagggag tggggccagc cagcagaaac agtgggctgt acaacatcac cttcaaatat300gacaattgta ccacctactt gaatccagtg gggaagcatg tgattgctga cgcccagaat360atcaccatca gccagtatgc ttgccatgac caagtggcag tcaccattct ttggtcccca420ggggccctcg gcatcgaatt cctgaaagga tttcgggtaa tactggagga gctgaagtcg480gagggaagac agtgccaaca actgattcta aaggatccga agcagctcaa cagtagcttc540aaaagaactg gaatggaatc tcaacctttc ctgaatatga aatttgaaac ggattatttc600gtaaaggttg tcccttttcc ttccattaaa aacgaaagca attaccaccc tttcttcttt660agaacccgag cctgtgacct gttgttacag ccggacaatc tagcttgtaa acccttctgg720aagcctcgga acctgaacat cagccagcat ggctcggaca tgcaggtgtc cttcgaccac780gcaccgcaca acttcggctt ccgtttcttc tatcttcact acaagctcaa 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Leu560 565 570Leu Ser Ser Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Cys Arg Ser Tyr575 580 585Thr Asp Glu Leu His Ala Val Ala Pro Leu590 59权利要求
1.一种人白细胞介素-17受体样蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质,其特征在于所述蛋白质具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.一种人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因,其特征在于所述人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.权利要求1所述的人白细胞介素-17受体样蛋白在使Stat5因子活化中的应用。
6.权利要求1所述的人白细胞介素-17受体样蛋白在介导细胞增殖中的应用。
7.权利要求1所述的人白细胞介素-17受体样蛋白在制造促进或抑制精子形成的药物中的作用。
8.权利要求1所述的人白细胞介素-17受体样蛋白在高等生物抑制FGF介导的下游信号通路中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因与应用。本发明的目的是提供一种新的人白细胞介素-17受体样蛋白及其编码基因。一种人白细胞介素-17受体样蛋白,它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。一种人白细胞介素-17受体样蛋白的编码基因,它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列;2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有95%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的人白细胞介素-17受体样蛋白可以使Stat5因子活化、介导细胞增殖,并可望在促进或抑制精子形成的药物中得到应用。
文档编号C07K14/435GK1465592SQ02123540
公开日2004年1月7日 申请日期2002年7月1日 优先权日2002年7月1日
发明者熊世勤, 常智杰, 傅新元 申请人:清华大学
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