专利名称：利用生物合成和化学修饰技术生产胸腺素al单体的方法
技术领域：
本发明属于生物合成和化学修饰技术领域，特别涉及用于提高人免疫能力和应用于多种疾病治疗的胸腺素α1的生产方法。
目前胸腺素α1纯品为一化学药物，在国内外都已经上市。由于胸腺素α1是由28个氨基酸组成的小分子多肽，结构与作用非常明确，因此可以采用化学合成方法制备。但是化学方法制备胸腺素α1成本高，大规模实现难度大，采用有毒试剂比较多。
本发明提出的利用生物合成和化学修饰技术生产胸腺素α1单体的方法，主要包括以下步骤(1)利用人工基因合成技术，获得胸腺素α1基因的全序列；(2)利用人工基因合成技术对该全序列构建“多胸腺素α1”融合蛋白重组基因质粒，并导入宿主细胞中合成多胸腺素α1；(3)利用基因工程技术对该多胸腺素α1发酵获得“多胸腺素α1”重组融合蛋白表达产物；(4)通过对该表达产物进行纯化获得“多胸腺素α1”；(5)利用化学裂解技术将“多胸腺素α1”裂解为胸腺素α1单体；(6)利用化学修饰技术或酶促合成方法将该胸腺素α1单体修饰成为天然结构；(7)通过纯化方法获得纯度达96％以上的天然结构胸腺素α1单体。
本发明上述方法步骤(1)中，所说的胸腺素α1基因来自GeneBank公用数据库公布的人28肽胸腺素α1基因序列。
上述第(2)步方法中，所说的构建“多胸腺素α1”融合蛋白基因的方式为
a.双分子连接，即胸腺素α1---胸腺素α1，或b.三分子连接，即胸腺素α1---胸腺素α1---胸腺素α1；上述的分子间的连接方式可以是直接分子连接或借助其它蛋白连接肽。
上述步骤(3)中，多胸腺素α1重组融合蛋白的表达方式，可以是直接表达，或者再与其它任意蛋白质融合表达(如各种融合表达标签、各种蛋白纯化标签)在各种原核系统，酵母系统，真菌系统和其它真核系统表达。
上述步骤(5)中，所说的裂解方法包括各种化学裂解，如溴化氰裂解、羟胺裂解、酸裂解以及各种酶裂解等方法。
上述步骤(6)中，所说的化学修饰方法包括各种化学修饰如乙酸酐化学修饰方法；各种酶修饰如N-乙酰转移酶修饰方法。
本发明还可利用上述方法，获得几种胸腺素α1的衍生物，如N端非乙酰化胸腺素α1、C端高丝氨酸化胸腺素α1、以及N-乙酰-C-高丝氨酸胸腺素α1。
本发明的特点及效果本发明利用生物工程技术，将多个胸腺素基因进行重组，在大肠杆菌中表达该重组基因而获得高表达的多个胸腺素融合体；利用化学技术将该融合体裂解和修饰，最终形成胸腺素α1单体。
本发明克服了小分子多肽很难在生物体内合成的问题，通过将胸腺素α1的基因导入宿主细胞(例如常用大肠杆菌DH5α)，在宿主细胞中合成多胸腺素α1，经过化学修饰、分离纯化，从而获得与目前上市的化学合成胸腺素α1结构完全一致的产品，而且胸腺素α1单体的纯度可以达到96％以上。且工艺简单，生产成本低，便于大规模生产。
本实施例方法包括以下步骤1.利用人工基因合成技术，获得胸腺素α1基因的全序列；具体包括1)设计胸腺素α1基因序列片段，利用DNA全自动合成仪进行合成，其合成的片段如下片断1AAT ATG TCT GAT GCT GCT GTT GAT ACT TCT TCT GAG ATT ACT ACTAAA GAT CTT AAG GAG AAG AAG GAA GTT GTC GAA GAG GCT GAG(87mer)片断2CAT ATT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTT CTT CTC CTT AAG ATCTTT AGT AGT AAT CTC AGA AGA AGT ATC AAC AGC AGC ATC AGA(87mer)片断3AGT AGT AAT CTC AGA AGA AGT ATC AAC AGC AGC ATC AGA(39mer)片断4ATT GGT ACC CTT GGC AAA GCA TGC GTT CTC AGC CTC TTC GAC AACTTC CTT CTT CTC CTT AAG ATC TTT 3′(69mer)2)上述4个片断可以通过核酸片段退火、连接形成任意个胸腺素α1的连接体，包括单分子体、双分子体、三分子体、四分子体等；3)通过琼脂糖凝胶电泳技术，分离胸腺素α1双分子体或三分子体基因。
2.利用基因工程技术将上述双分子体或三分子体基因插入原核表达质粒中，获得基因工程重组质粒。将质粒转化大肠杆菌DH5α，获得双分子体或三分子体基因工程重组表达菌株。
3.利用基因工程技术，诱导上述基因工程表达菌株，使大肠杆菌表达胸腺素α1双分子体或三分子体融合蛋白。
4.利用离子交换层析、反向层析、凝胶过滤等分离纯化方法，获得纯化胸腺素α1双分子体或三分子体融合蛋白。
5利用化学裂解技术将胸腺素α1双分子或三分子体裂解为胸腺素α1单体；具体包括以下步骤；1)溴化氰化学裂解方法在分子间连接的蛋氨酸处裂解，将胸腺素α1双分子体或三分子融合蛋白体裂解为胸腺素α1单体和C-端高丝氨酸化胸腺素α1单体；2)酶裂解方法改变分子间的连接方式，可以使用相应的特异性蛋白酶将其进行裂解，如活化的凝血酶、肠激酶等；3)将裂解产物进行纯化，可以直接获得纯度达96％以上的胸腺素α1，和C-高丝氨酸化胸腺素α1。
6利用化学或酶修饰技术将胸腺素α1单体或C-端高丝氨酸化胸腺素α1单体修饰为N-乙酰化胸腺素α1(天然结构胸腺素α1)或N-乙酰-C-高丝氨酸化胸腺素α1；具体包括以下步骤1)酶修饰方法利用N-乙酰转移酶和乙酰辅酶A在适当条件下对胸腺素α1进行乙酰化；2)化学修饰方法利用乙酸酐在适当条件下对胸腺素α1进行乙酰化。
7通过反向色谱和分子筛技术，获得纯度达96％以上的天然结构胸腺素α1，和N-乙酰-C-高丝氨酸化胸腺素α1。
用上述方法制备的天然结构胸腺素α1进行活性测定，具有与化学合成胸腺素α1相同的活性。
本发明的效果实验本工艺生产的胸腺素α1对淋巴细胞的增殖效应从人全血分离得到淋巴细胞，PBS洗后，悬于含10％FCS的1640培养液中，向96孔培养板中加入4×105/孔的脾细胞和12.5ug/孔的ConA，每样设5个重复。CO2孵箱中37℃培养6h，再加入不同浓度的胸腺素α1，继续培养72h，每孔加入3H-TdR18.5×103GBq继续培养6h，收获于玻璃纤维滤纸上，晾干后测定cpm值，按下列公式计算出增殖率。 对照组cpm结果加入不同浓度的最终胸腺素α1，能明显增加淋巴细胞的增殖。
权利要求
1.一种利用生物合成和化学修饰技术生产胸腺素α1单体的方法，主要包括以下步骤(1)利用人工基因合成技术，获得胸腺素α1基因的全序列；(2)利用人工基因合成技术对该全序列构建“多胸腺素α1”融合蛋白重组基因质粒，并导入宿主细胞中合成多胸腺素α1；(3)利用基因工程技术对该多胸腺素α1发酵获得“多胸腺素α1”重组融合蛋白表达产物；(4)通过对该表达产物进行纯化获得“多胸腺素α1”；(5)利用化学裂解技术将“多胸腺素α1”裂解为胸腺素α1单体；(6)利用化学修饰技术或酶促合成方法将该胸腺素α1单体修饰成为天然结构；(7)通过纯化方法获得纯度达96％以上的天然结构胸腺素α1单体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，所说的胸腺素α1基因来自GeneBank公用数据库公布的人28肽胸腺素α1基因序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述第(2)步骤中，所说的构建“多胸腺素α1”融合蛋白基因的方式为a.双分子连接，即胸腺素α1---胸腺素α1，或b.三分子连接，即胸腺素α1---胸腺素α1---胸腺素α1；所说的分子间的连接方式为直接分子连接或借助其它蛋白连接肽。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，所说的多胸腺素α1重组融合蛋白的表达方式为直接表达，或者再与其它任意蛋白质融合表达，在各种原核系统，酵母系统，真菌系统和其它真核系统表达。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤(5)中，所说的裂解方法包括各种化学裂解，以及各种酶裂解方法。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤(6)中，所说的化学修饰方法包括各种化学修饰；各种酶修饰。
7.一种利用如权利要求1所述的方法获得胸腺素α1的衍生物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所说的胸腺素α1的衍生物包括N端非乙酰化胸腺素α1、C端高丝氨酸化胸腺素α1、以及N-乙酰-C-高丝氨酸胸腺素α1。
全文摘要
本发明属于生物合成和化学修饰技术领域,涉及利用生物合成方法和化学修饰方法生产胸腺素α1单体的方法。本发明利用生物工程技术,将多个胸腺素基因进行重组,在宿主细胞中表达该重组基因而获得高表达的多个胸腺素融合体;利用化学技术将该融合体裂解和修饰,最终形成胸腺素α1单体。利用该生产工艺可以生产出与化学合成完全一致的胸腺素α1,且具有工艺简单,生产成本低,便于大规模生产的优点。本发明同时也提供其它几种胸腺素α1衍生物的生产方法。
文档编号C07K14/435GK1388133SQ0212526
公开日2003年1月1日 申请日期2002年7月22日 优先权日2002年7月22日
发明者吴建中 申请人:吴建中