专利名称：偃麦草钠离子反向转运蛋白基因及其克隆方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及偃麦草中Na+反向转运蛋白ENHX1基因的克隆、重组及耐盐性功能的分析及应用，属于分子生物学和生物技术领域。
由于Na+反向转运蛋白基因在耐盐过程中所起的作用，本发明人从耐盐植物偃麦草中分离编码Na+反向转运蛋白的基因。根据其它植物中发表的Na+反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从耐盐植物偃麦草中分离出编码质膜上的Na+反向转运蛋白基因。进一步构建正义表达载体，转化模式植物拟南芥，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
发明内容
本发明首次从耐盐植物偃麦草中分离出编码Na+反向转运蛋白的全长的cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，获得的转基因植株耐盐性高达200mM。
从偃麦草根中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na+反向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计一对兼并引物正向引物5′-CA(CT)TA(CT)AC(CT)TGGCA(CT)AA(CT)GT-3′反向引物5′-CAT(GC)AG(ACT)CC(AGT)GCCCACCA(AGT)AT-3′进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。具体的PCR试剂与条件为10×反应缓冲液 5μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA4μlTaqDNA聚合酶0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果扩增到一个DNA片段。取2μlPCR产物连接到pGEM-T载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。
经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为1955bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1638bp，由此推得具546个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的小麦、水稻和拟南芥的Na+反向转运蛋白相比，氨基酸同源性分别为87％、60％和58％，表明经过上述克隆步骤得到了编码Na+反向转运蛋白的基因。该基因序列如下序列表(1)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*长度1955碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否
(e)最初来源偃麦草(f)序列描述 SEQ IN NO.11ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-6061 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-10201021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-10801081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-11401141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-12001201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-12601261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-13201321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-13801381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-14401441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-15001501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-15601561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-16201621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-16801681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-17401741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-18001801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-18601861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-19201921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA-1955(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*长度546氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MGLDLGAIAL KYTGLAVSDH GSIVAINIFI ALLCGCIVFG HLLEGNRWVN ESTTALVLGL 6061 ITGGVILICS KGVNSRILIF SEDIFFIYLL PPIIFNAGFQ VKKKQFFRNF ATIILFGAAG 120121 TLISFVIITF GAMGLFSKLG VGPLELGDYL AIGAIFSATD SVCTLRVLNQ DEAPLLYSLV 180181 FGEGVVNDAT SVVLFNAIQN IDINHFDVFV LLQFIGKFLY LFFTSTVLGV AAGLLSAYII 240241 KKLCSARHST DREVAIMILM AYLSYMLSML LDLSGILTVF FCGIVMSHYT WHNVTESSRV 300301 TTKHTFATLS LIAEIFLFLY VGMDALDIDK WKLASSSPKK PIALSAVILG LVMVGRAAFV 360361 FPLSFLSNLS KKESHPKISF NQQVIIWWAG LMRGAVSIAL AYNKFTTSGH TAVRVNAVMI 420421 TSTIIVVLFS TMVFGLLTKP LINLLIPPRP GTAADISSQS FLDPLTASLL GSDFDVGQLT 480481 PQTNLQYLLT MPTRSVHRVW RKFDDKFMRP MFGGRGFVPF VPGSPIERSV HGPGLLGTVT 540541 EAEDRS546根据上述序列，设计构建表达载体的引物正向引物5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′反向引物5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连接到pGEM-T载体上，进行测序鉴定。然后用XbaI和SacI切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105。
利用渗透法转化拟南芥，收获的种子在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在10mM，100mM和200mM氯化钠的培养基上培养。结果表明，与野生型相比，转基因植株仍能正常生长，具较高的耐盐能力。
根据上述技术，从偃麦草分离出编码Na+反向转运蛋白的基因ENHX1，该基因过量表达能导致转基因拟南芥具较高的耐盐性。偃麦草为单子叶禾本科植物，让该基因在与偃麦草亲源关系较近的小麦，水稻，玉米等植物中表达，将会提高这些植物的耐盐性，将使得这些植物可以在盐碱地上种植，具有非常重要的经济效益和社会效益.(四)具体发明实施方式实施方式1偃麦草Na+反向转运蛋白基因的克隆方法1.总RNA的提取采用一步法或RNA kit提取总RNA2.cDNA第一条链的合成取2微克总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μ，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃反应60分钟，85℃分钟终止反应，稀释至200μl。
3.PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起10×反应缓冲液5μl
脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA 4μlTaqDNA聚合酶 0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
4.基因克隆取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-Teasy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5.质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
6.序列测定本工作在大连宝生物工程公司进行。
7.3′和5′序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行8.同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。实施方式2偃麦草Na+反向转运蛋白基因ENHX1，如下序列(1)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*长度1955碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源偃麦草(f)序列描述SEQ IN NO.11 ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-6061 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-10201021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-10801081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-11401141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-12001201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-12601261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-13201321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-13801381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-14401441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-15001501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-15601561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-16201621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-16801681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-17401741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-18001801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-18601861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-19201921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA-1955(3)SEQ INNO.2的信息(a)序列特征*长度546氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MGLDLGAIAL KYTGLAVSDH GSIVAINIFI ALLCGCIVFG HLLEGNRWVN ESTTALVLGL 6061 ITGGVILICS KGVNSRILIF SEDIFFIYLL PPIIFNAGFQ VKKKQFFRNF ATIILFGAAG 120121 TLISFVIITF GAMGLFSKLG VGPLELGDYL AIGAIFSATD SVCTLRVLNQ DEAPLLYSLV 180181 FGEGVVNDAT SVVLFNAIQN IDINHFDVFV LLQFIGKFLY LFFTSTVLGV AAGLLSAYII 240241 KKLCSARHST DREVAIMILM AYLSYMLSML LDLSGILTVF FCGIVMSHYT WHNVTESSRV 300301 TTKHTFATLS LIAEIFLFLY VGMDALDIDK WKLASSSPKK PIALSAVILG LVMVGRAAFV 360361 FPLSFLSNLS KKESHPKISF NQQVIIWWAG LMRGAVSIAL AYNKFTTSGH TAVRVNAVMI 420421 TSTIIVVLFS TMVFGLLTKP LINLLIPPRP GTAADISSQS FLDPLTASLL GSDFDVGQLT 480481 PQTNLQYLLT MPTRSVHRVW RKFDDKFMRP MFGGRGFVPF VPGSPIERSV HGPGLLGTVT 540541 EAEDRS546实施方式3表达载体的构建1.根据分离出的Na+反向转运蛋白基因的核苷酸序列，设计引物正向引物5′-TATTCTAGACGAGGTGGCGACCGGCATGG-3′反向引物5′-GACGAGCTCCTTAACTACGGTCTTCTGC-3′以根的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应.
2.取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-T easyVector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3.用XabI和SacI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
4.将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。实施方式4基因耐盐性分析1.种植拟南芥。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.离心，农杆菌沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％Silwet L-77)悬浮，菌液OD600在0.8左右。
4.将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
5.收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将T3代纯合株系种子种于10mM，100mM，200mM氯化钠培养基上培养，7天后统计萌发率。序列表<110>山东农业大学<120>偃麦草钠离子反向转运蛋白基因及其克隆方法与应用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>1955<212>cDNA<213>偃麦草(agropyron elongatum)<221>1-1955<400>1atccgccgag gtggcgaccg gcatggggct cgatttggga gccatcgctc tcaagtacac 60ggggctggcg gtgtcggacc acggctccat cgtcgccatc aacatcttca tcgcgctgct 120ctgcggctgc attgtcttcg gccacctgct cgaggggaac cgctgggtca atgagtccac 180caccgcgctt gtcctggggc tcatcaccgg tggtgtgatt ctgatctgct ccaaaggggt 240gaattcgcgc atccttatct tcagcgagga tattttcttc atctacttgc tcccgcccat 300catttttaac gccgggtttc aagtaaagaa aaagcaattc ttccgcaact ttgcgacaat 360tattttattt ggtgctgctg gaacattgat atcctttgta ataatcacgt tcggtgctat 420gggattgttc agcaaacttg gtgttggtcc actcgagctt ggggactatc ttgcaattgg 480ggctatcttc tcagcaacag attctgtttg caccttacgg gtgcttaacc aggatgaagc 540acccctactc tatagtctag tttttggtga aggtgttgtt aatgatgcta catcagttgt 600gctcttcaat gcaattcaaa acattgatat taatcatttt gatgtctttg ttctactaca 660attcattgga aaattcctct acctattctt caccagcacc gttcttggag tagctgctgg 720gttgcttagt gcatacatta ttaagaaact ttgttctgca agacactcaa ctgacagaga 780agttgctatc atgatactca tggcatacct ttcgtatatg ctgtcaatgt tgctggatct 840gagtggcatt ctaactgtgt tcttctgtgg aatagtaatg tcacattaca cttggcataa 900tgtcacagaa agctcaaggg ttactaccaa gcatactttt gcaactttat cacttattgc 960tgagattttt ctttttctct atgtcgggat ggatgcattg gacattgata aatggaaatt 1020agctagtagc agtcctaaga aaccaattgc tttaagcgct gttatattgg gtttggttat 1080ggttggaaga gcagcattcg tattcccttt atcttttcta tcgaacttaa gtaaaaagga 1140gtcacaccca aagatttcct tcaaccaaca ggttatcatc tggtgggcag gtctcatgag 1200aggagcagtt tcaattgcac ttgcttataa caagtttaca acatctggtc atactgccgt 1260gcgagttaat gctgtcatga tcacgagcac aatcattgtt gttctgttca gcacaatggt 1320tttcggcttg ctgactaagc ctctgattaa tctcctcatc ccaccaagac ctggcactgc 1380agctgatatc tcgagccagt cattcctaga cccacttacg gcgagcttgt tgggatcgga 1440cttcgatgta ggccagctca cccctcaaac aaaccttcag tatcttctca ccatgccaac 1500tcgctcggtt catcgtgtat ggcgcaagtt cgatgataag ttcatgcgcc caatgtttgg 1560gggaagaggc ttcgtcccat ttgtgcctgg ttcacccata gagaggagcg tccatgggcc 1620tggcttgttg ggcactgtga cggaggcaga agaccgtagt taagttgaag cccagaaggt 1680gcaagtgtat ttctgtaaat gctcagatat cactcagttt tgctcttggg attctttcgg 1740tgtattatcg ctatttgttg gtgtatattg tgcagatagt ttctacagga ccatgtacgc 1800tgtgtagagt tttgggagcc attcaagatg tacaattaat ctgtaaatta atttcgttct 1860tgttcagaca gaacaatcag atgctggata ttagcattca tgtataaaag gaactcaggt 1920ggataactaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 195权利要求
1.一种克隆的偃麦草Na+反向转运蛋白基因ENHX1，其特征在于它具有SEQ IN NO1所示的序列，(a)序列特征*长度1955碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源偃麦草(f)序列描述SEQ IN NO.11ATCCGCCGAG GTGGCGACCG GCATGGGGCT CGATTTGGGA GCCATCGCTC TCAAGTACAC-6061 GGGGCTGGCG GTGTCGGACC ACGGCTCCAT CGTCGCCATC AACATCTTCA TCGCGCTGCT-120121 CTGCGGCTGC ATTGTCTTCG GCCACCTGCT CGAGGGGAAC CGCTGGGTCA ATGAGTCCAC-180181 CACCGCGCTT GTCCTGGGGC TCATCACCGG TGGTGTGATT CTGATCTGCT CCAAAGGGGT-240241 GAATTCGCGC ATCCTTATCT TCAGCGAGGA TATTTTCTTC ATCTACTTGC TCCCGCCCAT-300301 CATTTTTAAC GCCGGGTTTC AAGTAAAGAA AAAGCAATTC TTCCGCAACT TTGCGACAAT-360361 TATTTTATTT GGTGCTGCTG GAACATTGAT ATCCTTTGTA ATAATCACGT TCGGTGCTAT-420421 GGGATTGTTC AGCAAACTTG GTGTTGGTCC ACTCGAGCTT GGGGACTATC TTGCAATTGG-480481 GGCTATCTTC TCAGCAACAG ATTCTGTTTG CACCTTACGG GTGCTTAACC AGGATGAAGC-540541 ACCCCTACTC TATAGTCTAG TTTTTGGTGA AGGTGTTGTT AATGATGCTA CATCAGTTGT-600601 GCTCTTCAAT GCAATTCAAA ACATTGATAT TAATCATTTT GATGTCTTTG TTCTACTACA-660661 ATTCATTGGA AAATTCCTCT ACCTATTCTT CACCAGCACC GTTCTTGGAG TAGCTGCTGG-720721 GTTGCTTAGT GCATACATTA TTAAGAAACT TTGTTCTGCA AGACACTCAA CTGACAGAGA-780781 AGTTGCTATC ATGATACTCA TGGCATACCT TTCGTATATG CTGTCAATGT TGCTGGATCT-840841 GAGTGGCATT CTAACTGTGT TCTTCTGTGG AATAGTAATG TCACATTACA CTTGGCATAA-900901 TGTCACAGAA AGCTCAAGGG TTACTACCAA GCATACTTTT GCAACTTTAT CACTTATTGC-960961 TGAGATTTTT CTTTTTCTCT ATGTCGGGAT GGATGCATTG GACATTGATA AATGGAAATT-10201021 AGCTAGTAGC AGTCCTAAGA AACCAATTGC TTTAAGCGCT GTTATATTGG GTTTGGTTAT-10801081 GGTTGGAAGA GCAGCATTCG TATTCCCTTT ATCTTTTCTA TCGAACTTAA GTAAAAAGGA-11401141 GTCACACCCA AAGATTTCCT TCAACCAACA GGTTATCATC TGGTGGGCAG GTCTCATGAG-12001201 AGGAGCAGTT TCAATTGCAC TTGCTTATAA CAAGTTTACA ACATCTGGTC ATACTGCCGT-12601261 GCGAGTTAAT GCTGTCATGA TCACGAGCAC AATCATTGTT GTTCTGTTCA GCACAATGGT-13201321 TTTCGGCTTG CTGACTAAGC CTCTGATTAA TCTCCTCATC CCACCAAGAC CTGGCACTGC-13801381 AGCTGATATC TCGAGCCAGT CATTCCTAGA CCCACTTACG GCGAGCTTGT TGGGATCGGA-14401441 CTTCGATGTA GGCCAGCTCA CCCCTCAAAC AAACCTTCAG TATCTTCTCA CCATGCCAAC-15001501 TCGCTCGGTT CATCGTGTAT GGCGCAAGTT CGATGATAAG TTCATGCGCC CAATGTTTGG-15601561 GGGAAGAGGC TTCGTCCCAT TTGTGCCTGG TTCACCCATA GAGAGGAGCG TCCATGGGCC-16201621 TGGCTTGTTG GGCACTGTGA CGGAGGCAGA AGACCGTAGT TAAGTTGAAG CCCAGAAGGT-16801681 GCAAGTGTAT TTCTGTAAAT GCTCAGATAT CACTCAGTTT TGCTCTTGGG ATTCTTTCGG-17401741 TGTATTATCG CTATTTGTTG GTGTATATTG TGCAGATAGT TTCTACAGGA CCATGTACGC-18001801 TGTGTAGAGT TTTGGGAGCC ATTCAAGATG TACAATTAAT CTGTAAATTA ATTTCGTTCT-18601861 TGTTCAGACA GAACAATCAG ATGCTGGATA TTAGCATTCA TGTATAAAAG GAACTCAGGT-19201921 GGATAACTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAA-1955
2.一种权利要求1所述的Na+反向转运蛋白基因的克隆方法，其特征在于从偃麦草中提取总RNA，然后利用2微克总RNA反转录成cDNA，根据其它植物中的Na+反向转运蛋白保守的氨基酸序列设计一对兼并引物正向引物5′-CA(CT)TA(CT)AC(CT)TGGCA(CT)AA(CT)GT-3′反向引物5′-CAT(GC)AG(ACT)CC(AGT)GCCCACCA(AGT)AT-3′进行常规聚合酶链式反应，将扩增出的DNA片段连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，用于序列测定，然后经过3’/5’末端快速扩增得到全长的cDNA为1955bp。
3.一种权利要求1所述基因ENHX1的耐盐性，其特征在于该基因在拟南芥中过量表达，能提高植物的耐盐性，该基因可用于小麦、水稻和玉米等农作物的遗传转化以提高耐盐性。
全文摘要
本发明涉及偃麦草中Na
文档编号C07H21/00GK1408722SQ0213554
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者张宪省, 乔卫华, 李兴国, 李全梓 申请人:山东农业大学