专利名称：猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明是有关猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗，特别是针对胸膜肺炎放线杆菌所引起的猪胸膜肺炎之疫苗。
背景技术：
1964年Shope{J.Exp.Med.，119357-368}首先于阿根廷报告猪胸膜肺炎暴发流行情形，并可分离到Haemophiluspleuropneumoniae(已改为Actinobacillus pleuropneumoniae简称Ap)。在此之后，其他类似之报告在瑞士有Nicolet及Koning[Vorl.Mitt.Path.Microbiol.29301-306(1966)]。在丹麦、瑞士、英国、加拿大及澳洲有Nielsen[IPVS，p103(1984)]，Little[Vet.Rec.87399-402(1970)]，Schiefer等人[Can.J.Comp.Med.3899-104(1974)]及Mylrea等人[Austr.-Vet.J.50255-259(1974)]。在日本Kume等人[Jpn.J.Vet.Sci.48965-970(1986)]，Nakai及Kume[Jpn.J.Vet.Sci.491141-1144(1987)]及Suzuki等人[Jpn.J.Vet.Sci.501264-1267(1988)]。韩国Gunnarsson等人[Am.J.Vet.Res.381111-1114(1977)]亦有本病之报告。本省首次暴发此病是于1975年7月由徐氏等人所报告[台糖畜产研究所64/65年期研究实验报告，191-197]，以3至6个月龄之肥猪居多，近多年来甚至在4周龄之哺乳猪亦可致病[邱鸿英硕士论文，国立中兴大学兽医研究所，台中，台湾(1987)]，且血清型在1975年至1985年间最常见的为第5血清型，至今除第5型外，尚有第1、2及3型等血清型，并出现很多的抗药性菌株，尤以第1血清型为甚[张，中华民国兽医学会志，22129-135(1996)]，造成养猪经济之损失颇钜。因为此病多为急性感染，常因来不及治疗即已暴毙，因此，即使是有效的药物但如未能及时使用，将导致无法挽救之地步，因而凸显开发有效的疫苗作防疫乃为当务之急。
Ap为Gram氏阴性菌，有12个血清型，其所分泌的外毒素是属于Actinobacillus pleueopneumoniae RTX toxin，简称Apx，分为ApxI、ApxII及ApxIII，其分子量分别为105kDa、103kDa及120kDa[Kamd et al.，Infect.Immun.593079-3085(1991)]，惟新旧分类方法有所不同，近来文献多采用统一命名(即ApxI、ApxII、ApxIII)。ApxI可取自血清型1、5a、5b、10、11等，具有细胞毒性及溶血作用；ApxII可取自血清型1、2、3、4、6、7、8、9、11、12等，具有细胞毒性及较弱的溶血作用；ApxIII可取血清型2、3、4、6、8等，具有细胞毒性，但无溶血作用{Kamp etal.，Infect.Immun.593079-3085(1991)；Chang et al.，DNA8635-647(1989)；Chang et al.，J.Bacteriol.1735151-5158(1991)及Frey et al.，Infect.Immun.601671-1676(1992)}。
在过去的文献报告中指出许多Gram氏阴性菌会分泌一些高分子量(100kDa～110kDa)的细胞毒素。该细胞毒素产生细胞毒性时须有钙离子介入其反应而且与E.coli的a溶血素(Alpha-hemolysin，HlyA)在免疫学上及其基因均有密切的关系。这些毒素后来被归纳为RTX族群(PTX family)，RTX族群之命名是基于发现在这群毒素蛋白的靠C端三分之一处富含有glycine/aspartic acid的重复排列情形，因此，RTX即表示Repeat Toxin[Forestier etal.，Infect.Immun.594212-4220(1991)；Strathdee andLo.，J.Bacteriol.171916-928(1989)]。另者，与这些RTX毒素有关的基因有四个C、A、B、D等(除了ApxII的B、D基因可能在演化过程中消失掉，因此ApxII无B、D基因)A基因属于毒素之结构基因，C基因产物藉由acylation反应去活化A基因，即C基因为activator基因，而B与D基因与RTX毒素的分泌过程有关，即B与D基因具有transporter之角色[Jansen et al.，Infect.Immun.63688-3695(1993)]。
过去20年来有翁氏等人[中华民国兽医学会志，267-71(1976)；台糖畜产研究所65/66年期研究实验报告，219-224(1977)]，徐氏等人[台糖畜产研究所65/66年期研究实验报告，147-155(1978)]以及张氏等人[台糖畜产研究所67/68年期研究实验报告，163-173(1979)；台糖畜产研究所68/69年期研究实验报告，103-11(1980)；台糖畜产研究所70/71年期研究实验报告，83-87(1982)]曾分别对死菌疫苗之研制及其免疫学上各问题进行探讨。罗氏[中华民国兽医学会志，13119-126(1987)]亦曾应用第5型血清型荚膜抗原免疫猪只后作评估，上述各作者均颇有成就。惟至目前为止，尚未有任何文献报告涉及应用基因工程的方法将Ap所分泌之毒素制成次单位疫苗作为此病之预防。我们多年的经验深知ApxI(105kDa)深厚的潜力，虽然张甘楠(本件发明人之一)过去曾利用Ap第一血清型所分泌之外毒素(104kDa)制成类毒素与死菌混合疫苗(已取得专利权，经济部中央标准局专利证书，专利权号数发明第50415号)其免疫保护率高达82％以上，由于Ap第一血清型在本省地区是最具毒性且最具有抗药性之菌株，该毒素取自第一血清型的Ap，然而以传统方法培养抽取Ap外毒素需用昂贵的NAD(Nicotinamide adeninedinucleotide)，导致制造成本偏高，若采用基因重组方法制成次单位疫苗则可降低10倍左右之成本，因而提高效益及实用性，可造福养猪业界。
发明内容
本发明是有关一新颖胸膜肺炎放线杆菌疫苗，特别是针对猪胸膜肺炎之疫苗。包括以分子选殖之方法取自Ap第1血清型之ApxI基因所得之重组ApxI多胜肽，以及Ap第1血清型、第2血清型与第5血清型之死菌混合疫苗。不同于Frey与Nicolet[Infect.Immun.562570-2575(1998)]及Frey等人[Infect.Immun.572050-2056(1989)]于Ap第1血清型的细胞培养上层液内所发现的分子量为105kDa，PI值为4.3之不耐热溶血素以及分子量仅为27kDa之辅溶血素(cohaemolysin)，本案发明人利用50％至70％的硫酸铵盐析方法自Ap细胞培养上层液内分离纯化蛋白，初期得到主要含有一分子量为104kDa，pI值为7.1，不具有溶血作用之耐热的多胜肽[Chang and Chen，Proceedings，The 8thSeminaron S cience andTechnology，p.103-115(1988)]。本案发明人进一步发现，当以此新分离的多胜肽以人工接种方式感染小白鼠与猪只之呼吸系统时，其于小白鼠与猪只肺部引起的组织病变类似于以Ap活菌进行感染者，其所导致的肺部损害包括单核细胞与多形核细胞的浸润，出血，水肿等。此外，当以猪抗Ap血清与此多胜肽进行抗原抗体反应时，发现该抗血清会与此多胜肽结合，因此这些实验结果应可证明此新分离出的多胜肽是Ap所分泌之一种溶血素可能与Ap之毒性或致病力有关，职是，以该多胜肽作为免疫猪只不受Ap感染之疫苗或其有效成分应是可行。
本案发明人于是进一步研究，当以上述新颖之基因工程重组多胜肽混撬Ap死菌来配制疫苗时，其对猪只是否能产生免疫保护效用。令人兴奋地，试验结果发现，由此Ap之ApxI类毒素与Ap第1、2及5血清型之死菌所构成之混合疫苗确实可提供较传统式死菌疫苗为优之免疫保护作用(表二)。
选择适用于配制本案胸膜肺炎放线菌类毒素ApxI与死菌混合疫苗之佐剂，应属熟于此项技艺人士所知之范围，而配合施予疫苗之方式，该等佐剂可包括氢氧化铝水性佐剂、矿物油、明矾、合成聚合物以及完全或不完全Freund氏佐剂等，尤以不完全Freund氏佐剂为佳。
本案混合疫苗之组成可以1ml之死菌疫苗，其中该死菌是将Ap第1、第2及5血清型之死菌等量混合而成，其每型之死菌浓度以50mg/ml为佳，再加上1ml之Ap类毒素混合即成，其中该类毒素之浓度为2mg/ml。于配制此疫苗时可加入1ml之不完全Freund氏佐剂予以乳化。
应注意的是本发明疫苗之施予方式并不限于此处所教示者，其依制备型式而可分为肌肉内、皮下或者与饲料混合或制成锭剂以口服式施予。
图1、说明ApxI PCR DNA片段及载体pET32a DNA1.λ/HindIII分子标示2.ApxI PCR DNA片段(3.0kbp)3.载体pET32a DNA(5.9kbp)图2、说明筛选之ApxI-9864 DNA用BamHI及XhoI切之结果Mλ/HindIII分子标示1ApxI DNA片段(3.0kb)及Vector pET32a DNA(5.9kbp)图3、说明本发明所研发之pET32a与ApxI之重组构筑图。
图4、说明SDS平板电泳分析结果M分子量标示1ApxI(取自选殖株CH9864)以8M尿素萃取之粗制蛋白质2～6为Ni-NTA亲和性管柱分离纯化之各阶段(fraction)，其中5及6均可得到纯化，分子量为130kDa之重组ApxI重组蛋白质7取自Ap第1血清型之ApxI(104kDa)(对照组)图5、说明西方氏转渍法分析结果M分子量标示1ApxI(取自选殖株ApxI-9864)表现之重组融合蛋白，分子量为130kDa2取自Ap第1血清型之溶血素(分子量为104kDa)3pET32a在E.coli BL21(DE-3)所表现之蛋白质(对照组)图6、说明以基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗免疫之猪只以3×109活菌(Ap第1、2、5血清型各为1×109混合而成)点鼻攻击后，肺脏之组织病理无特异性之变化。
图7、说明以商品化死菌免疫之猪只以3×109活菌(Ap第1、2、
5血清型各为1×109混合而成)点鼻攻击后，肺脏之组织仍会呈现水肿、出血等病灶。
图8及图9、说明对照组之猪只以3×109活菌(Ap第1、2、5血清型各为1×109混合而成)点鼻攻击后之(图9)肉眼病变，肺呈现肿胀、出血、硬块之病灶；及组织病理变化，呈现出血、水肿及单核细胞呈纺锤状(或燕麦型细胞)漩涡状排列，即呈现典型的放线杆菌胸膜肺炎之病变。
该疫苗现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市中关村北一条13号中科院微生物所；保藏日期2002年7月22日；保藏编号0778；分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
具体实施例方式
实验案例一、菌株(1)野外菌株自台湾南部各养猪场之病例中分离，以下述标准菌株免疫兔子后所得之抗血清加以鉴定之。该野外菌株进一步供作本案发明人所自制之死菌疫苗成分。
(2)标准菌株(供鉴定上述野外菌株用)Ap第1、2及5血清型由台糖畜产研究所张靖男博士分让。
案例二、胸膜肺炎放线杆菌(Ap)第1血清型溶血素ApxI之制备(1)细菌基因体(genomic)DNA的制备细菌基因体DNA的制备是Roussel及Chabbert{J.Gen.Microbioi，104269-276(1978)}的方法稍作修改将第1血清型之Ap野外株(CH9800)培养于200ml的BHI培养液并含有0.01％NAD(nicotinamide adenine dinucleotide，Sigma)18小时候，于4℃，10,000xg离心30分钟后，取其沉淀加15ml之TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，Ph8.0)混合，再以10,000xg离心15分钟，取其沉淀物加4ml TE，并同时加入100μl之Lysosome(10mg/ml in TE)及100μl之Rnase A(10mg/ml in 0.15MNaCl)于37℃作用30分钟后，再加入200μl之20％sodium laurylsulphate及最后浓度为100μl/ml的proteinase K，于室温作用18小时，再以12,000xg，于4℃离心30分钟，取上清液加入等体积的phenolchloroformisoamylacohol(25∶24∶1)萃取溶液，均匀混合，以10,000xg离心10分钟后，取上清液，重复萃取一次，再缓缓加入等量的乙醚，10,000xg离心10分钟后取底层溶液(含genomic DNA)置于68℃水浴槽中直到无乙醚味道，加入1/25体积的5M NaCl及2.5倍体积的100％酒精，置于-70℃中15分钟加入5ml的70％酒精，再以12,000xg，于4℃离心10分钟后，弃上清液，将沉淀物置于真空干燥机中干燥15分钟，加入适量TE溶液使genomicDNA充分溶解后备用。
(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)根据已发表的第1血清型Ap之ApxI基因合成两个引子(ApxI-B15’GCGGGATCCATGGCTAACTCTCAGCTCGA3’及ApxI-XS5’AAGCCCGGCTCGAGTTAAGCTGCTTGTGCTAAAGAATA3’，其中GGATCC为限制酶BamHI切位，CCCGGG为限制酶SmaI切位，CTCGAG为限制酶XhoI切位)。利用这两个引子及第1血清型之Ap基因体DNA为模板进行PCR反应，而得到一具有3072核苷酸(3.072kbp)的DNA产物。
PCR的反应过程如下于94℃下作用5分钟，将两股DNA分开(即所谓的变性)之后再重复下列反应35次；94℃变性1分钟之后于50℃，1分钟使引子粘至DNA上互补的位置，再于68℃，1.5分钟让DNA聚合酶进行DNA的合成，每次反应后之68C的反应时间比前次增加3秒钟，35次后再于68℃反应5分钟。
(3)表现载体pET32a表现载体pET32a购自美国Novagen公司(Novagen，WI，USA)。此载体能大量表现选殖于其上的基因，而且所表现之融合蛋白质上带有6X His·Taq，以方便而后蛋白质的纯化。
(4)重组表现载体之构筑将上述聚合肽链反应DNA产物以限制酶BamHI及XhoI处理后再粘结(ligated)到用相同之限制酶处理并去磷过的表现载体pET32a。将粘结完毕之重组载体DNA转形(transform)到E.coliBL21(DE-3)，并将此转形菌液均匀地涂抹于含ampilillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB agarplate上，经18小时的培养。之后，从培养基中挑选单独之菌落于4ml，含ampicillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB液体培养基中，经37℃培养18小时后，抽取质体(plasmid)。将抽取之质体DNA，用限制酶BamHI及XhoI处理后，经agarose电泳分析以判定所选殖的菌株中的载体是否含有插入的外源ApxI基因(3.072kbp)，并将DNA定序以确定ApxI基因之核苷酸序列。
(5)DNA定序核苷酸序列之决定是利用DNA自动分析仪(DNA antomatedsequencer，ABI Prism，model 337，version 3.0，AppliedBiosystems，USA)行之，在定序过程，所用的引子是根据前面已解析出来的核苷酸序列而设计。
(6)ApxI蛋白质之表现将选殖成功之菌株于4ml，含ampicillin(100μg/ml)及chloramphenicol(34μg/ml)的LB液体培养基中，于37℃培养18小时，取1ml菌液加入9ml同样的培养基中再于37℃培养2.5小时，加入10μl之IPTG(1M)后，于37℃再培养4小时。在4℃把菌液以10,000xg离心15分钟后，取其沉淀加2ml含10％glycerin之PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na2HPO4.7H2O，1.4Mm KH2PO4，pH7.3)溶液，用sonicator将细胞打破，再以12,000xg离心15分钟，去上清液后将沉淀物加入0.8ml的蛋白质萃取缓冲液(proteinextraction buffer1.5％N-lauryl sarcosin，25mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH8.0)，或采用8M尿素(urea)溶于0.1M磷酸缓冲溶液(pH8.0)内，置于4°C作用18小时，以12,000xg离心15分钟后取上清液，将此萃取液装入透析膜并置入PBS内透析18小时，即得粗制之表现蛋白质。
(7)蛋白质之纯化蛋白质之纯化是以Ni-NTA column(QUAGEN GmbH，Hilden，Germany)进行，先组合Ni-NTA所附之column，加入600μl缓冲液B(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH8.0)于column中，以2,000xg离心2分钟，丢弃离心下来之液体，重新组合column并加入上述之萃取蛋白质上清液600μl(经缓冲液B处理过)，以2,000xg离心2分钟后，保存离心下之液体(此为a部份)，再将Ni-NTAcolumn重新组合加入600μl缓冲液C(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH6.3)，以2,000xg离心2分钟后，保存离心下之液体(此为b部份)，再将Ni-NTA column重新组合加入200μl缓冲液E(8M Urea，0.1M Na-phosphate，0.01M Tris-HCl，pH4.5)，以2,000xg离心2分钟后，保存离心下之液体(此为c部份)，取适当量之a，b，c做SDS-PAGE电泳分析，判读结果。
(8)SDS-PAGE电泳分析根据Sambrook等人{Molecular Cloning，p.18.47-18.48(1989)}的方法将表现所得的纯化蛋白质和SDS sample buffer以等量混合，于100℃煮2.5分钟后，用12％SDS-PAGE经150伏特，1.5小时电泳，后以0.2％Coomassie brilliant blue染色，7％醋酸溶液脱色后观看结果。
案例三、死菌之制备将第1、2及5血清型之胸膜肺炎放线杆菌分别培养于上述BHI中6小时，然后以4℃，10,000xg，离心30分钟，取其沉淀之菌体(上清液供制备外毒素之用)，经0.9％NaCl，洗涤三次，然后分别将每一血清型之菌液以0.9％NaCl调制适当量，加0.2％福马林于37℃，18小时后，再以0.9％NNTal洗涤三次，然后将菌液分别调至50mg/ml(湿重)之菌液。将第1、2及5型(50mg/ml)之菌液做成等体积之混合，存于-20℃备用。
案例四、胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素与死菌混合疫苗之制备如上述案例三所制备之死菌，即Ap血清第1、2及5型之死菌各50mg与上述二以分子基因选殖所表现的ApxI粗制蛋白2mg混合成1ml(经0.2％福马林化)，然后与佛氏不完全佐剂等量混合乳化后，即为对每一头猪的一个免疫剂量。免疫时，对猪行肌肉注射，至于小鼠之免疫途径则按“动物用药品管理法”之规定进行之。
案例五、安全及效力试验(1)安全试验(a)选10～15公克健康小白鼠40只，各以本剂腹腔接种0.5公摄，另取40只为对照，观察二周，须无任何反应而健存。
(b)选体重约350公克健康天竺鼠2只，各以本剂皮下接种1公摄，观察10天，须无任何反应而健存。
(c)选嗜血杆菌抗体阴性(6至8周龄)小猪2头，依用法各接种5剂量，观察2周，须无任何不良反应而健存。
(2)效力试验将安全试验后之免疫小白鼠，分成四组，各组分别以强毒菌株培养液之100至10-3稀释量接种于腹腔内攻击；对照小白鼠亦分四组，各以10-1至10-4四个稀释量菌液接种于腹腔内，观察一周，然后二群分别依Beherens-Karber法计算LD50，结果其防御力价大于10倍以上。
案例六、实验动物及饲料实验动物为体重20公克之小鼠(BALB/C)及六周龄猪(LYD三品种)；饲料之主要成分为玉米、豆粉、鱼粉、钙、磷、维他命等。
案例七、抗体之测定采用细菌凝集试验{Gunnarsson et al.，Am.J.Vet.Re s.381111-1114(1977)}，阳性对照组采用人工感染之猪血清，而阴性对照组用SPF猪血清。
案例八、西方氏墨点转渍法(Wesern Blotting Assay)[Towbinet al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 764350-4354(1978)]蛋白质经上述SDS平板电泳完成后立即使用西方氏墨点转渍套组(Bio-Rad)将SDS-聚丙烯醯胺胶片转渍至Nitrocellulose纸(0.2μm)上，实施之条件为1A，150V，1小时，并有冰水冷却循环系统。第一抗体使用Ap外毒素免疫猪或Ap感染猪之血清，第二抗体使用兔抗猪之IgG抗体与过氧化氢的结合体，基质为0.1％H2O2，呈色剂为Diamino-benzidine(DAB，Sigma)。
案例九、蛋白质浓度之测定采用Bio-Rad系统测定之[张甘楠，中华民国兽医学会志，1341-56(1976)]。
案例十、等电焦点(Isolectric Focussing，IEF)采用Pharmaciapha stsystem，pH3-10梯度聚丙烯醯胺胶片实施，条件为2000V，2.5mA，3.5W，410Vh，染色及脱色如上述SDS-平板电泳方式。
案例十一、病理组织切片经过人工接种攻击后，及肺脏除肉眼判定其肺脏病灶点数{张甘楠，中华民国兽医学会志，1745-57(1991)}外，将有病变或必要之组织如气管、肺门淋巴及肺组织固定于10％福马林溶液内后以石腊包埋，作成切片，经H.E.染色，镜检。本发明所以采用组织病理学来评估疫苗之效力是因为在攻击后，虽然活存但肺如有组织病理变化时则仅仅依其活存率来评估疫苗之效力并非客观，因此免疫猪在攻击后一周尚存活者予以全部扑杀剖检，检视其组织病理之变化，以求得真正的免疫保护效力。
结果本发明是采用基因遗传工程方法，将取自Ap(Actinobacilluspleuropneumoniae)第1血清型之菌体DNA(genomic DNA)当作模版，设计一对特异性的引子(primer)，以聚合酶连锁反应(polymerasechain reaction，PCR)方法以增幅其ApxI之基因(大小为3.0kb)做为嵌入DNA(insert DNA)，并采用pET32a为载体(vector，其大小为5.9kb)，以进行DNA重组，经选殖手续，得一重组DNA之选殖株(clone)，命名为ApxI-9864，该重组DNA载体，pApxI-9864以BamHI及SamI限制酶切割后，经1.2％琼脂平板(agarose)电泳分析结果确实可得到一嵌入DNA为3.0kb，载体为5.9kb(如图1)。本发明所研发之pET32a与ApxI之重组构筑图，如图2所示。
该重组之DNA(图2)经转殖于大肠杆菌BL21(DE-3)后，以1mMIPTG诱发进行蛋白质表现，经SDS平板电泳分析结果获知其主要成分为含有一分子量为130kDa之ApxI溶血素之融合多胜肽，与取自Ap第1血清型之6小时培养液上层液所得之溶血素104kDa有所区别(如图3)，但西方氏转渍法分析结果显示取自Ap CH9864重组之融合蛋白与Ap第1血清型之溶血素特异性抗体有强烈的结合反应(如图4)。
本发明所提出申请专利之选殖株ApxI-9864经DNA之核苷酸及蛋白质之氨基酸序列分析如图5所述。
本发明是采用Ap血清型第1、2、5型之死菌各50mg与上述选殖株ApxI-9864所表现的粗制蛋白ApxI 2mg混合成1ml，然后与等量的佛氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant)混合，乳化后即为每一头猪之一个免疫剂量，免疫猪时采用肌肉注射，至于小鼠之免疫途径则依照“动物用药品管理法”之规定进行之。免疫后之结果如表一，表二及表三所示表一猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗之效力试验项目 攻 击 前攻击后之保护效力b攻击 免疫组 对照组 免疫组 对照组 防御菌量a (小鼠总数)(小鼠总数)(小鼠死亡/总数) (小鼠死亡/总数) 力价10010 - 10/10 -10-110 10 1/10 10/1010-210 10 0/10 7/10 101.910-310 10 0/10 3/10 (74.9)10-4-10 - 0/10a攻击之菌量为Ap血清型1、2、5型等三种，经18小时培养之菌液以等量混合，其菌量为4×109/ml，攻击菌量为此菌量依10倍稀释法连续稀释之。
b攻击后观察一周，然后免疫组与对照组分别依Beherens-Karber法计算其LD50，求其防御力价须大于10倍以上才算合格。本试验之防御力价为免疫组LD50/对照组LD50＝10-0.6/10-2.6＝101.9＝74.9＞10。因此，按“动物用药品管理法”第五十八节第138条第六项效力试验，防御力价大于10倍以上，即为合格之疫苗。
表二猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗使用于胸膜肺炎放线杆菌污染猪场之效力试验。
项目商品化死菌疫苗a基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗b免疫猪头数 100 64免疫后有咳嗽症状头数72 15免疫后发病死亡头数 37 9
保护效力 63％(63/100) 85.9(55/64)a免疫时间为第六周龄及第九周龄，各免疫注射一次(肌肉注射)，然后现场追踪其临床症状及死亡情形，观察期间为八周(即至猪只至第17周龄为止)。
b凡死亡之猪只携回实验室进行病理解剖，并进行Ap细菌分离及鉴定，并以组织病理学方法评估之，以上确定有分离到Ap者及特征之组织病理变化者判定为死亡病例。
表三猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗或死菌疫苗免疫猪只后，对以活菌攻击的猪只之保护效力测试。
a以胸膜肺炎放线杆菌(Ap)血清型1、2、5活菌(每一血清型1×109)共3×109/ml对每一头猪以点鼻方式行人工攻击。攻击后1～3天进行肺脏病灶点数判读。
b肺脏病灶点数(lesion scorse)之判读0正常，1轻微病灶，2中等程度，3严重程序，4死亡。
c细菌回收试验是从肺脏病灶处，每个肺脏以四个巧克力培养基分离以Api系统进行细菌鉴定，并采用标准血清进行血清型之鉴定。
+可分离到Ap，-不能分离到Ap。
由表一可知本发明之猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗之防御力价为74.9倍(大于10倍)，此结果符合。
由表二获知在污染猪胸膜肺炎放线杆菌之养猪场，若使用本发明之基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗免疫之猪只，其保护效力高达85.9％(55/64)，优于商品化之死菌疫苗之保护效力63％(63/100)，此为现场追踪之结果。另者，本发明之试验过程中将现场免疫后之猪只携回实验室以3×109活菌进行人工点鼻攻击及细菌回收试验，结果得知基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗免疫之猪只其肺脏病灶点数(lesion scores)平均为0.3，死菌疫苗免疫组平均0.75，而对照组(未经免疫)平均为3.75，各组之间有着显著之差异(p＜0.01)。至于细菌回收试验结果，基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗免疫组在攻击后其细菌回收率为10％(3/30)，死菌疫苗免疫组(商品化之死菌疫苗)细菌回收率为50％(6/12)，而对照组之细菌回收率为83.330％(10/12)。总之，本发明之基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗对猪胸膜肺炎放线杆菌之回收率低(10％)均优于市售之商品化死菌疫苗。市售死菌疫苗细菌回收率为50％。
死菌疫苗之菌株若与现场所流行之菌株之血清型不同时，疫苗之效力将会大打折扣，而基因工程类毒素ApxI刺激猪只产生抗ApxI之抗体，可以克服不同血清型之困扰，因为ApxI毒素有许多血清型均会分泌，如此以CloneApxI-9864所产生的抗体可以涵盖多种血清型之特异性免疫反应，致使类毒素ApxI疫苗呈现优异的保护效力，至于类毒素ApxI混合死菌之理由，乃是取该死菌之K-抗原，本发明不愿放弃Ap之K-抗原，使本发明之猪胸膜肺炎放线杆菌类毒素ApxI与死菌混合疫苗之抗原性具备其周全性。
另者，本发明之试验过程中特以组织病理学来评估以3×109活菌点鼻攻击后各免疫组之肺脏组织病理学变化，并计算其病变点数(lesion scores)因为攻击后之猪只存活乃为假象，应以实际上肺脏之病灶点数及肺的组织病理学病变为真正判定之标准，才能确定疫苗真正的效力。试验结果获知以本发明之基因工程类毒素ApxI与死菌混合疫苗免疫后之猪只经上述活菌攻击后其肺脏无特异性之病变(如图6)，而死菌疫苗(商品化之死菌疫苗)免疫后之猪只其肺脏仍有出血、水肿等之病变(如图7)，至于对照组则呈现肉眼可见之放线杆菌猪胸膜肺炎的明显病变(如图8)组织病理学变化亦呈现出血、水肿、单核细胞之浸润、而且单核细胞呈纺锤状且有漩涡状之排列(如图9)。
CloneApxI-9864ATG GCT AAC TCT CAG CTC GAT AGA GTC AAA GGA TTG ATT GAT TCA CTT AAT 51Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu AsnCAA CAT ACA AAA AGT GCA GCT AAA TCA GGT GCC GGC GCA TTA AAA AAT GGT 102Gln Hls Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys Asn GlyTTG GGA CAG GTG AAG CAA GCA GGG CAG AAA TTA ATT TTA TAT ATT CCG AAA 153Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu lle Leu Tyr Ile Pro LysGAT TAT CAA GCT AGT ACC GGC TCA AGT CTT AAT GAT TTA GTG AAA GCG GCG 204Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu Val Lys Ala AlaGAG GCT TTA GGG ATC GAA GTA CAT CGC TCG GAA AAA AAC GGT ACC GCA CTA 255Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val Hls Arg Ser Glu Lys Asn Gly Thr Ala LeuGCG AAA GAA TTA TTC GGT ACA ACG GAA AAA CTA TTA GGT TTC TCG GAA CGA 306Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu Leu Gly Phe Ser Glu ArgGGC ATC GCA TTA TTT GCA CCT CAG TTT GAT AAG TTA CTG AAT AAG AAC CAA 357Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp Lys Leu Leu Asn Lys Asn GlnAAA TTA AGT AAA TCG CTC GGC GGC TCA TCG GAA GCA TTA GGA CAA CGT TTA 408Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg LeuAAT AAA ACG CAA ACG GCA CTT TCA GCC TTA CAA AGT TTC TTA GGT ACG GCT 459Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr AlaATT GCG GGT ATG GAT CTT GAT AGC CTG CTT CGT CGC CGT AGA AAC GGT GAG 510Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly GluGAC GTC AGT GGT TCG GAA TTA GCT AAA GCA GGT GTG GAT CTA GCC GCT CAG 561Asp Val Ser Gly Ser Glu Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala GlnTTA GTG GAT AAC ATT GCA AGT GCA ACG GGT ACG GTG GAT GCG TTT GCC GAA 612Leu Val Asp Asn Ile Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Lla Phe Ala GluCAA TTA GGT AAA TTG GGC AAT GCC TTA TCT AAC ACT CGC TTA AGC GGT TTA 663Gln Leu Gly Lys Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly LeuGCA AGT AAG TTA AAT AAC CTT CCA GAT TTA AGC CTT GCA GGA CCT GGG TTT 714Ala Ser Lys Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly PheGAT GCC GTA TCA GGT ATC TTA TCT GTT GTT TCG GCT TCA TTC ATT TTA AGT 765Asp Ala Val Ser Gly lle Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe lle Leu SerAAT AAA GAT GCC GAT GCA GGT ACA AAA GCG GCG GCA GGT ATT GAA ATC TCA 816Asn Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly lle Glu Ile SerACT AAA ATC TTA GGC AAT ATC GGT AAA GCG GTT TCT CAA TAT ATT ATT GCG 867Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile AlaCAA CGT GTG GCG GCA GGC TTA TCC ACA ACT GCG GCA ACC GGT GGT TTA ATC 918Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly Leu Ile
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权利要求
1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI，其特征在于以基因工程方法制造之胸膜肺炎放线杆菌Ap第1血清型的溶血素ApxI，该溶血素系Clone自ApxI-9864。
2.根据权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI，其特征在于其基因DNA序列及氨基酸序列为(如图6内容)。
3.根据权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI，其特征在于其系以基因工程方法选殖自胸膜肺炎放线杆菌第一血清型之菌体DNA，并构筑于表现载体pET32a，经转形于大肠杆菌大量表现而得到之类毒素。
4.根据权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI，其特征在于该基因工程类毒素ApxI为分子量为130kDa之融合蛋白，不具溶血作用，但能与胸膜肺炎放线杆菌第1血清型之溶血素104kDa之特异性抗体产生强烈之结合反应。
5.一种防治温血动物感染疾病之疫苗，其特征在于其含有根据根据权利要求1所述的猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程类毒素ApxI，胸膜肺炎放线杆菌第1血清型、第2血清型及第5血清型死菌，及制造疫苗容许之佐剂及赋型剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于其中所含类毒素ApxI之浓度为0.1mg/ml至5mg/ml，其中以2mg/ml为最佳。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于其中死菌系由Ap第1血清型、第2血清型或第5血清型，并以0.2％福马林化之死菌疫苗等量混合而成，死菌之浓度为10mg/ml至70mg/ml之间，其中以50mg/ml为佳。
8.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于其中之佐剂如水性氢氧化铝、矿物油、明矾、合成聚众合物例如poly(I)、poly(A)、poly(U)或poly(C)、Freund氏不完全佐剂及大肠杆菌忌热性肠毒素LT(heat-labile enterotoxin)及该LT之次单位LTA2/B或LTB，其中以Freund氏不完全佐剂为佳。
9.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于免疫途径系以肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、混合于动物饲料中，或制成锭剂以口服方法施予。
10.一种根据权利要求1制造溶血素ApxI的方法，其包含(i)将ApxI基因构筑于pET32a之表现质体，可得到clone ApxI-9864，以容许之诱导剂诱导后经4小时37℃震荡表现经10％甘油磷酸缓冲溶液处理再以蛋白质萃取缓冲溶液(1.5％N-lauryl sarcosin，25mMTris-Hcl，1mM EDTA，pH8.0)或8M尿素(Urea)溶于0.1M磷酸缓冲溶液(pH8.0)内获得类毒素ApxI。(ii)根据申请专利范围第5项该类毒素ApxI可标定效价，其中以每头猪2mg的剂量为佳。
11.根据权利要求1至5项中的任一项，其特征在于类毒素ApxI基因之构筑可连接其他细菌或病毒之基因进行蛋白质表现，及其所衍生出来的具有类似与本发明之类毒素ApxI功能之融合蛋白。
全文摘要
一种含有以基因工程方法所研制之胸膜肺炎放线杆菌(Ap)第1血清型的溶血素ApxI加入胸膜肺炎放线杆菌第1血清型、第2血清型与第5血清型死菌之混合疫苗。该ApxI溶血素是以基因工程方法选殖自胸膜肺炎放线杆菌第一血清型之菌体DNA，并构筑于表现载体pET32a经转形于大肠杆菌大量表现而得到之类毒素ApxI，其主要万分为含有一分子量为130kDa之ApxI溶血素的融合多胜肽，是一种强力之免疫原，但不具有溶血作用。
文档编号C07K14/195GK1511844SQ02138068
公开日2004年7月14日 申请日期2002年7月31日 优先权日2002年7月31日
发明者张甘楠, 何国杰 申请人:张甘楠, 何国杰