专利名称：一种冬凌草甲素的制备方法
技术领域：
本发明涉及植物药物提取纯化的方法，更具体涉及一种冬凌草甲素的制备方法。
背景技术：
传统的冬凌草甲素的提取方法主要有乙醚提取法、乙醇提取法。
乙醚提取法的步骤是冬凌草原料加3～5倍量乙醚提取2～3小时，回收乙醚，得绿褐色粘稠物用甲醇溶解，加活性炭脱色，将得到的淡黄色澄明甲醇液减压浓缩，浓缩液静置过夜，过滤，滤液再浓缩得稠膏状物，上Al2O3柱，先用苯洗脱，再用乙醚洗脱，乙醚洗脱液回收溶剂后得到粗结晶，经丙酮处理得冬凌草甲素。
该法具有提取收率较高的优点，但由于大量用到乙醚、苯等有毒、易燃易爆的溶剂，极不安全，根本不适于工业生产。
乙醇提取法的步骤是冬凌草原料加10倍量95％乙醇，在提取罐中加热提取2小时，回收乙醇，得绿褐色粘稠膏体，用无水乙醇溶解，加粉状活性炭回流脱色1小时，抽滤除去活性炭后浓缩得浸膏，浸膏用乙酸乙酯溶解，再用5％Na2CO3溶液萃取，回收溶剂得糖浆状物，上硅胶柱，用氯仿、丙酮混合溶剂或石油醚、丙酮混合溶剂洗脱，收集相应流份减压浓缩，然后结晶得冬凌草甲素。
该法的用工业酒精代替了乙醚和甲醇，比较适于工业生产，但缺点是提取收率低。
上述两法虽然都考虑将冬凌草提取物进行柱层析分离，但有一个共同的缺陷都未阐明如何将获得的冬凌草甲素粗晶进一步精制成高纯度的冬凌草甲素结晶。
袁珂等在1997年第22卷第8期《中国中药杂志》上发表的“柱层析法分离制备冬凌草甲素的新工艺”中，比较了以乙醚提取后浓缩至浸膏状→甲醇溶解并用活性炭脱色→继续浓缩至一定量后与适量硅胶拌匀装于柱顶进行层析分离→分别以石油醚、氯仿、丙酮依次洗脱，可得到冬凌草甲素结晶的原工艺，指出该工艺中所用的溶剂乙醚等溶剂有毒易燃爆，且极易挥发，价格较高，洗脱所用的溶剂系统较多，操作费时麻烦。故该法仅适合实验室少量制备冬凌草甲素，不适于工业化生产。因此，对其分离制备工艺进行了改进。即将冬凌草的乙醇提取物用适量95％乙醇溶解，加入约醇提物干浸膏2倍量(W/W)柱层析硅胶，再加入适量95％乙醇，使硅胶全部被乙醇湿润后置水浴上拌炒，炒至呈干粉状后取出，晾至室温备用。将处理好的柱层析硅胶装入下方垫有药棉和滤纸的玻璃柱(柱高150cm，直径8cm)中。干浸膏与分离用的硅胶用量比例为1∶10(W/W)。以一定比例的石油醚-丙酮为洗脱液进行洗脱。收集冬凌草甲素流份合并蒸干后，加入适量甲醇热溶放置，即有冬凌草甲素结晶析出。该法虽然较前法所用溶剂系统有所简化，但仍然将提取液浓缩后再用95％乙醇溶解才能与柱层析硅胶混合，所选用的层析柱径高比为1∶18.75，工业化生产所要求的设备庞大，洗脱液流速为1/150/分钟～1/220/分钟(洗脱液体积/吸附剂体积/分钟)，太慢，显然也不是大工业化生产的最佳工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种冬凌草甲素的制备方法，利用混合溶剂进行萃取，通过短程硅胶柱层析，以混合溶剂系统解吸，然后分步结晶和重结晶，制得高纯度的冬凌草甲素。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案以冬凌草为原料，经二氯甲烷∶丙酮(4∶1～9∶1)或三氯甲烷∶乙醇(4∶1～9∶1)回流萃取，提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加3～5倍石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到冬凌草甲素含量为10～15％的提取物浸膏，采用混合溶剂解吸系统，通过硅胶柱短程层析，收集解吸液，浓缩、结晶即可得到含量大于90％的冬凌草甲素。冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara为唇形科香茶菜属植物，我国民间主要用于治疗食管癌、贲门癌和原发性肝癌。冬凌草甲素(oridonin)是冬凌草中抗肿瘤的主要成分。实验证明冬凌草甲素在体外对Hela细胞及食管鳞癌细胞株(CaEs-17)均有明显的细胞毒作用；在体内对多种动物移植性肿瘤如艾氏腹水瘤(腹水型及实体型)、S-180肉瘤(腹水型及实体型)、肝癌(腹水型及实体型)、网状细胞肉瘤(ARS)等均有抑制作用；能防止亚硝胺所引起的大鼠食管上皮增生(癌前病变)转变为癌。临床试验证明，对食管癌，贲门癌，肝癌，及乳癌等有明显的缓解症状作用，稳定和缩小瘤体及延长病人生命的效果。与化疗合用，可减轻化疗药物的不良反应，提高疗效，对食管上皮重度增生亦有一定的疗效。
提取冬凌草甲素的步骤如下1、将冬凌草粉碎至20～100目，先后用6～8倍、4～6倍、3～5倍、4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流萃取，每次3～5小时；2、提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加3～5倍石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到冬凌草甲素含量为10～15％的提取物浸膏；3、加1～3倍丙酮或乙醇处理，按1∶1～2∶1比例与200～300目柱层析硅胶拌混均匀，摊于阴凉通风处干燥，使溶剂挥发干净；4、取4～6倍拌混硅胶的新鲜硅胶装柱，再将拌混硅胶装于其上，用于柱层析分离的层析柱的径高比为1∶1.5～1∶4，层析柱用不锈钢、搪瓷、玻璃或其它耐腐蚀材料制作，先用5～8倍体积的二氯甲烷洗脱，再用4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮混合溶剂解吸，洗脱液流速控制在1/60～1/70/分钟；5、在混合溶剂洗出5～7倍装柱体积时，开始收集含冬凌草甲素的流份，收集解吸液的体积为装柱体积的1.5～2.5倍时停止解吸，解吸液在温度为45～55℃、真空度0.5～0.6Mpa条件下浓缩10～15倍；6、浓缩液置结晶罐中静置8～12小时结晶，待达到饱和结晶状态时进行离心，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全；7、上述工艺制备的冬凌草甲素结晶可用10～15倍的甲醇溶液进行重结晶精制。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(1)萃取冬凌草原料的溶剂用的是二氯甲烷∶丙酮(4∶1～9∶1)或三氯甲烷∶乙醇(4∶1～9∶1)混合溶剂；(2)由于柱程短、浸膏冬凌草甲素含量高，故用较少的硅胶就能完成冬凌草甲素的柱层析分离；(3)由于层析柱径高比仅为1∶1.5～1∶4，即可节约设备投资，又可减少车间占用空间和面积；(4)洗脱液流速控制在1/60/分钟～1/70/分钟(洗脱液体积/吸附剂体积/分钟)，较高的生产效率大大缩短了生产周期；(5)选用二氯甲烷和丙酮(4∶1～9∶1)混合溶剂系统进行硅胶柱层析，使解吸的冬凌草甲素流份较为集中；(6)选用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇等溶剂系统，相对使用安全；(7)在前述工艺的基础上，所用结晶和重结晶技术可以制备出质量稳定、高纯度的冬凌草甲素，含量可达90％以上。(8)层析柱短程，操作方便，分离速度快，效果好，成本低，色泽微黄色至白色，进一步精制可得含量大于99％的纯品。
具体实施例方式
实施例1.取冬凌草30千克，粉碎至40～80目，先后加220千克、160千克、130千克三氯甲烷∶乙醇(9∶1)溶液回流三次，每次3.5小时，提取液经减压浓缩得到冬凌草甲素含量11.3％的冬凌草浸膏1千克，用乙醇处理均匀，与200～300目硅胶1.5千克拌混，摊干，取8千克新鲜硅胶装柱，将拌混硅胶加于其上。先用50升二氯甲烷洗柱除前杂，再用二氯甲烷和丙酮(4∶1)的混合溶剂解吸，待65升混合溶剂洗过柱体之后，开始收集冬凌草甲素流份至15升，在温度50℃、真空度0.6Mpa条件下浓缩至1.5升，浓缩液于搪瓷盘中静置10小时结晶，经0.8Mpa真空抽滤，滤液继续减压浓缩分步结晶3次，使冬凌草甲素从母液中分离完全，得到的冬凌草甲素结晶合并后用1.6升甲醇溶液溶解，进行重结晶，挥干溶剂，在45℃下真空(0.9Mpa)干燥3小时，得到0.05千克冬凌草甲素。经检测冬凌草甲素含量为92％。
实施例2.将市售药材冬凌草500千克，粉碎至40～80目，先后用3000千克、2000千克、1000千克二氯甲烷∶丙酮(4∶1)溶液回流三次，每次3小时，合并提取液经减压浓缩，得到冬凌草甲素含量12.8％的浸膏约10千克，用丙酮处理均匀，拌混到18千克200～300目柱层析硅胶中，摊晾使溶剂挥干，先在15个层析柱中各预装8千克新鲜硅胶，然后将样品拌混硅胶均匀地装于15个层析柱的上部，每个层析柱分别先用60升二氯甲烷洗脱，再用二氯甲烷和丙酮(4∶1)混合溶剂解吸，当混合溶剂洗出大约70升时，开始收集含冬凌草甲素流份的解吸液，每个层析柱收集解吸液18升，将解吸液合并后在温度50℃、真空度0.55Mpa条件下浓缩至18升，浓缩液置结晶罐中静置10小时结晶，待达到饱和结晶状态时进行离心，使冬凌草甲素结晶与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全，合并分离出的冬凌草甲素结晶，用20升甲醇溶液溶解，进行重结晶，离心分离，在45℃下真空(0.9Mpa)干燥3小时，得到92.5％冬凌草甲素0.78千克。
权利要求
1.一种冬凌草甲素的制备方法，包括下列步骤A、将冬凌草粉碎至20～100目，先后用6～8倍、4～6倍、3～5倍、4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流，每次3～5小时；B、提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加3～5倍石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到冬凌草甲素含量为10～15％的提取物浸膏；C、加1～3倍丙酮或乙醇处理，按1∶1～1∶2比例与200～300目柱层析硅胶拌混均匀，摊于阴凉通风处干燥；D、取4～6倍拌混硅胶的新鲜硅胶装柱，再将拌混硅胶装于其上，用5～8倍装柱体积的二氯甲烷洗脱，再用4∶1～9∶1的二氯甲烷、丙酮混合溶剂解吸；E、收集含冬凌草甲素的流份，收集解吸液体积为装柱体积的1.5～2.5倍时停止解吸，解吸液在温度为45～55℃、真空度0.5～0.6Mpa条件下浓缩10～15倍；F、浓缩液置结晶罐中静置8～12小时结晶，离心，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全；G、冬凌草甲素结晶用10～15倍的甲醇溶液进行重结晶精制。
2.根据权利要求1所述的一种冬凌草甲素的制备方法，其特征在于用于柱层析分离的层析柱径高比为1∶1.5～1∶4。
3.根据权利要求2所述的一种冬凌草甲素的制备方法，其特征在于层析柱用不锈钢、搪瓷、玻璃制作。
4.根据权利要求1所述的一种冬凌草甲素的制备方法，其特征在于洗脱液流速控制在1/60～1/70/分钟。
全文摘要
本发明公开了一种冬凌草甲素的制备方法，将冬凌草粉碎，用二氯甲烷、丙酮或三氯甲烷、乙醇的混合溶剂进行回流，提取液经减压浓缩得到稠膏状提取物，加石油醚脱脂，滤掉并挥干石油醚得到浸膏，加丙酮或乙醇处理，用柱层析硅胶拌混，然后均匀地将拌混硅胶装于上层，用二氯甲烷洗脱，再用二氯甲烷和丙酮的混合溶剂解吸，收集含冬凌草甲素的解吸液流份，减压浓缩，浓缩液置结晶罐中静置结晶，使冬凌草甲素晶体与母液分离，母液可继续减压浓缩分步结晶，直至冬凌草甲素从母液中分离完全，冬凌草甲素结晶用甲醇溶液进行重结晶精制。本发明层析柱程短，分离速度快、效果好，产品纯度高，生产成本低，冬凌草甲素含量达到90％以上。
文档编号C07C49/00GK1482115SQ02139049
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月13日 优先权日2002年9月13日
发明者王有为, 卢大炎, 王跃进, 龚复俊, 斯缨, 王暐, 叶晚成, 丁时东 申请人:中国科学院武汉植物研究所