专利名称：一种d－氨基酸氧化酶提取纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种半合成头孢菌素合成的关键中间体7-氨基头孢烷酸用的D-氨基酸氧化酶提取纯化方法。
背景技术：
头孢菌素是有着重要疗效的抗生素，而半合成头孢菌素则具有更强抗菌能力或可使药物动力学性质得到改善。而半合成头孢菌素的关键中间体为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，以往的传统生产的方法主要是通过化学方法，有四大步骤，过程复杂，所用试剂昂贵，污染严重，且收率较低，质量较差。而生物转化方法是一种较好的方法。研究表明，头孢菌素C可被D-氨基酸氧化酶氧化脱氨基，并进一步脱羧反应生成GL-7-ACA，而GL-7-ACA的7-位侧链可被戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(GL-7-ACA ACY)所水解得到7-ACA，因而D-氨基酸氧化酶是生成7-ACA的关键酶。因而，D-氨基酸氧化酶的提取纯化也是十分重要的。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种对D-氨基酸氧化酶进行纯化可使酶液比活力提高的方法。
本发明的方法为一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，先用稀盐酸将经过发酵生产的发酵液PH调7.0-7.2，再用氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8，离心得离心菌液。控制菌液活力8-10u/ml，加入表面活性剂，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时，纯化过程则是用氯化钙溶液下调浸泡后菌液PH至5.8-6.2，板框过滤收集酶清液，用氢氧化钠溶液上调酶清液PH至7.6-8.0，再板框过滤收集清液。
所述的表面活性剂为相当于菌液量的2％，以g/l计。
所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
所述的壳聚糖为菌体量2％，以g/l计。
所述的氯化钙溶液为20％的氯化钙溶液。
所述的氢氧化钠溶液为10％的氢氧化钠溶液。
本发明通过对D-氨其酸氧化酶进行提取纯化，可使酶液的比活力提高一倍以上。
具体实施例方式实施例1D-氨基氧化酶的提取、纯化过程为首先用稀盐酸将发酵生产的发酵液PH调7.0，再用20％的氯化钙下调PH到6.6，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6。用高速离心机离心得离心菌液。控制菌液活力8u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂十六烷基三甲溴化铵，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3小时。纯化过程用20％氯化钙溶液下调浸泡后菌液PH至5.8，板框过滤收集酶清液，用10％氢氧化钠溶液上调酶清液PH至7.6，再板框过滤收集清液。清液比活力从4.2u/mg提高到9.5u/mg，纯化收率为91％。
实施例2D-氨基氧化酶的提取、纯化过程为首先用稀盐酸将发酵生产的发酵液PH调7.2，再用20％的氯化钙下调PH到6.8，然后加入菌体量2％的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.8。用高速离心机离得离心菌液。控制菌液活力10u/ml，加入相当于菌液2％(g/l)的表面活性剂十六烷基三甲溴化铵，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡5小时。纯化过程用20％氯化钙溶液下调浸泡后菌液PH至6.2，板框过滤收集酶清液，用10％氢氧化钠溶液上调酶清液PH至8.0，再板框过滤收集清液。清液比活力从4.2u/mg提高到9.5u/mg，纯化收率为91.5％。
权利要求
1.一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，先用稀盐酸将发酵生产的发酵液PH调7.0-7.2，再用氯化钙下调PH到6.6-6.8，然后加入的壳聚糖，最后用稀碱将PH调到7.6-7.8，离心得离心菌液。控制菌液活力8-10u/ml，加入表面活性剂，用稀碱调PH到9.0，用热水升温到45℃，搅拌维持20分钟，自然搅拌浸泡3-5小时，纯化过程则是用氯化钙溶液下调浸泡后菌液PH至5.8-6.2，板框过滤收集酶清液，用氢氧化钠溶液上调酶清液PH至7.6-8.0，再板框过滤收集清液。
2.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，所述的表面活性剂为相当于菌液2％，以g/l计。
3.根据权利要求1或2所述的一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。
4.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，所述的壳聚糖为菌体量2％，以g/l计。
5.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，所述的氯化钙溶液为20％的氯化钙溶液。
6.根据权利要求1所述的一种D-氨基酸氧化酶提取纯化方法，所述的氢氧化钠溶液为10％的氢氧化钠溶液。
全文摘要
一种D－氨基酸氧化酶提取纯化方法，先用稀盐酸将发酵生产的发酵液调pH，再用加入20％的氯化钙，然后加入的壳聚糖，最后用稀碱将pH调到7.6－7.8，离心得离心菌液。控制菌液活力8－10u/ml，加入表面活性剂，用稀碱调pH用热水升温，搅拌，自然搅拌浸泡3－5小时，纯化过程则是用氯化钙溶液下调浸泡后菌液pH，板框过滤收集酶清液，用氢氧化钠溶液上调酶清液pH至7.6－8.0，再板框过滤收集清液。本发明可使酶液的比活力提高一倍以上。
文档编号C07K1/14GK1428420SQ0213988
公开日2003年7月9日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者许岗, 朱敏, 莫章华, 曾红宇, 柳杏辉, 唐卫红, 胡爱红 申请人:湖南福来格生物技术有限公司