专利名称：一种高纯大豆卵磷脂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高纯大豆卵磷脂的制备方法，尤其是采用柱色谱技术从大豆油脚中提取高纯的天然活性物质——大豆卵磷脂。
背景技术：
天然磷脂主要存在于动、植物的原生质及膜系统中，是构成细胞膜的主要成分之一。
70年代以来，随着分子生物学发展，逐步发现磷脂是众多信息分子前体的储备形式，是神经细胞传递信息，合成脂蛋白代谢的生物活性物质；亦是心、脑、循环、呼吸、生殖等许多疾病形成的化学介质。磷脂是一类复杂的混合物，主要由卵磷脂(PC)、脑磷脂(PF)、肌醇磷脂(PI)和丝氨酸磷脂(PS)等组成。磷脂产品主要是作为油脂精炼的副产物从水化油脚中提取。作为一种营养剂和乳化剂，目前已广泛用于食品、医药、化妆品、饲料、橡胶、涂料等行业。随着磷脂在医药学领域研究不断深入，制药业对高纯磷脂产品的需求量日益增加。尤其是高纯卵磷脂，它不仅具有减少动脉粥样硬化症等重要的生理作用，而且可用于制备静脉脂肪乳输液；作为抗癌药物和基因药物载体的脂质体，在提高药效和减少毒副作用方面有显著疗效；还可作为青霉素添加剂，起到促进药物吸收、减轻疼痛、增加疗效、抗过敏的作用。据资料介绍，国内脂肪乳的市场需求量为2000万瓶/年，需卵磷脂120吨作为青霉素添加剂的卵磷脂需求量为300吨/年。因此，开发制备高纯卵磷脂有着极大的市场潜力。高纯大豆卵磷脂的生产在国内还是空白，国外也只有少数几家公司生产，但价格很高，如Avanti公司生产的纯度大于99％的大豆卵磷脂为$175/g，因此，在油料的副产品综合利用中，大豆卵磷脂是附加值很高的产品。
目前制取高纯天然卵磷脂的原料可分为动物和植物两大类。前者主要是蛋黄和动物组织，后者为一些植物油料如大豆、菜籽等。从蛋黄中提取高纯卵磷脂的质量较好，但成本高。而植物油料中的磷脂是一种脂肪伴随物，随着油脂的提取而溶出，在油脂精炼的水化工序中作为油脚与油脂分离。这些油脚如不及时处理，极易滋生微生物而造成环境污染，但如能加以利用，则可变废为宝，制备出高附加值的磷脂产品。因此，与以蛋黄为原料相比，从大豆油脚中提取磷脂产品，其意义就显得更为重大。在这些油料中，大豆中的磷脂含量最高，质量也较好，最适宜作为提取磷脂的原料。目前全世界大豆产量约1.77亿吨/年，我国为1500万吨/年，其中85％用于制油，理论上可提取磷脂约5.1万吨(以大豆含油16％，豆油中含磷脂2.5％计)，卵磷脂约1万吨(以磷脂中含卵磷脂20％计)。
高纯卵磷脂的制备技术主要有无机盐沉淀法、乙酰化法、超临界流体萃取法、膜分离法、薄层色谱法(TCL)、高效液相色谱法(HPLC)、柱色谱法等。无机盐沉淀法和乙酰化法由于加入了反应试剂，后处理的难度加大；超临界流体法中较常用的是超临界CO2，它溶油能力较强而溶解磷脂的能力较弱，只适合制备混合磷脂产品而不适合用于各种磷脂的分级分离纯化，且设备费用比较昂贵；膜分离法的材料、设备费用也较高，实现磷脂的分级也有一定的技术困难；薄层色谱法(TCL)和高效液相色谱法(HPLC)均可获得纯度高、质量好的分级产品，但HPLC法的处理量不大，且设备及维护费较高，而TLC法不易更换展开剂，所用展开剂为混合溶剂，后处理较繁琐；柱色谱法设备简单，可灵活改变洗脱剂强度得到最理想的分离效果，且该法易于扩大化，是制备磷脂分级产品最有发展潜力的方法之一。
柱色谱法用于制备高纯卵磷脂，关键在于固定相、洗脱剂的选择。这关系到能否得到高纯的分级产品、后处理技术难易、生产周期长短等，这些是决定该方法能否规模放大的重要因素。在现有技术中，吸附剂多为硅胶和氧化铝，且多采用混合溶剂梯度淋洗的方式，采用这些技术制取的卵磷脂产品虽然纯度较高，但溶剂的脱除，回收及配比等后处理工序在工业化大规模生产中很难控制。也有少数文献报道采用95％乙醇作为淋洗剂，但由于淋洗剂中含水使得吸附剂失活，需经常更换吸附剂，故也不适合工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种高纯大豆卵磷脂的制备方法，该方法简单且易于工业化生产。
本发明提供的技术方案是一种高纯大豆卵磷脂的制备方法，以大豆油脚经预处理后得到粗卵磷脂为原材料，以硅胶为吸附剂、用90～100％(重量百分比)甲醇作为洗脱剂进行柱色谱分离得到高纯卵磷脂。
上述为无水甲醇；吸附剂采用100-300目的硅胶。
原料油脚首先经预处理后得到粗卵磷脂(含有较多卵磷脂和少量脑磷脂)，然后用硅胶为吸附剂、90～100％甲醇作为洗脱剂进行柱色谱分离。90～100％甲醇作为洗脱剂，不仅洗脱能力强，分离选择性高，可大大缩短分离时间，减少洗脱剂用量，而且简化了溶剂的脱除、回收及循环利用等后处理工序。
图1为本发明以大豆油脚经预处理后得到的粗卵磷脂为原材料制备高纯卵磷脂的工艺流程图；图2为粗卵磷脂HPLC分析图；图3为高纯卵磷脂HPLC分析图。
具体实施例方式
参见图1，本发明以大豆油脚经预处理后得到粗卵磷脂为原材料，以硅胶(100-300目)为吸附剂、用90～100％甲醇作为洗脱剂进行柱色谱分离、将纯卵磷脂收集液经真空脱溶、干燥得到高纯卵磷脂。
本发明也可用从蛋黄等动物类得到的粗卵磷脂为原材料按上述方法制备高纯卵磷脂。
大豆油脚预处理可采用溶剂萃取法(参见中国财经出版社出版的《油脂工业副产品综合利用》张根旺等著)大豆油脚中约含50％水分，33％的磷脂及17％的油脂。油脚先经干燥脱除水分，得到浓缩磷脂。再用1～2倍的丙酮浸洗3～6次，脱除油脂后得粉末磷脂。然后用2～4倍量的95％乙醇于60℃下浸提粉末磷脂3～5次至浸提液为浅黄色，合并每次浸提后的浸提液真空浓缩。所得浓缩物用少量乙醚溶解，经离心分离去除固体杂质，然后加入丙酮使卵磷脂沉淀。分离沉淀物和溶剂，所得沉淀经真空脱溶、干燥后得粗卵磷脂备用。粗卵磷脂的HPLC分析图见图2(图中1为溶剂，2为脑磷脂，3为卵磷脂，4为磷脂酸)。如大豆油脚预处理立即进行柱色谱分离，也可不干燥，直接用无水甲醇溶解即可。
柱色谱分离柱色谱分离用色谱柱为带活塞玻璃柱或带阀门不锈钢柱或其他材料制成的带阀门柱均可，长径比为10∶1～25∶1。根据所用色谱柱的容积称取一定量的硅胶(100～300目)，置于105～130℃烘箱中活化20～90分钟。用90～100％甲醇为溶剂湿法装柱，装好后备用。
称取吸附剂重量的1～3％的粗卵磷脂，用4～16倍粗卵磷脂量的90～100％甲醇溶解后上样。然后用90～100％甲醇作为洗脱剂，进行柱色谱分离，滴速控制在粗卵磷脂量的1～4倍/分钟。根据柱容积及处理量的大小不同，确定每次收集的体积数。总的原则是总洗脱体积为吸附剂介质体积的3～4倍，收集次数不超过20次。收集液经HPLC法检测后，将纯卵磷脂收集液合并，经真空脱溶、干燥后，可得高纯卵磷脂。高纯卵磷脂的HPLC分析图见图3，(5为溶剂，6为卵磷脂)。
上述色谱检测条件4.6×150mm自装硅胶柱(5um硅胶)；流动相乙腈—甲醇—磷酸(90∶3∶1)；流速0.7ml/min；紫外检测器，检测波长为206nm。
实施例一色谱柱为φ30×300mm带活塞玻璃柱。称取硅胶(100～200目)约100克，置于120℃烘箱中活化60分钟，用100％甲醇作溶剂湿法装柱。称取粗卵磷脂约2克，用少量100％甲醇溶解后上样，并用100％甲醇洗脱，滴速控制在2毫升/分钟，每50ml收集一瓶，共收集15瓶。经HPLC法检测，纯卵磷脂在第7～9瓶。合并收集液，经真空浓缩、干燥后得高纯卵磷脂0.6克。
实施例二色谱柱为φ30×600mm带阀门不锈钢柱。称取硅胶(200～300目)约100克，置于105℃烘箱中活化80分钟，用93％甲醇作溶剂湿法装柱。称取粗卵磷脂约1.5克，用少量93％甲醇溶解后上样，并用93％甲醇洗脱，滴速控制在3毫升/分钟，每50ml收集一瓶，共收集15瓶。经HPLC法检测，纯卵磷脂在第6～7瓶。分别合并收集液，经真空浓缩、干燥后得高纯卵磷脂0.42克。
实施例三色谱柱为φ30×600mm带活塞玻璃柱。称取硅胶(100～200目)约100克。置于130℃烘箱中活化25分钟，用98％甲醇作溶剂湿法装柱。称取粗卵磷脂约3克，用少量98％甲醇溶解后上样，并用98％甲醇洗脱，滴速控制在2毫升/分钟，每50ml收集一瓶，共收集15瓶。经HPLC法检测，纯卵磷脂在第7～11瓶。分别合并收集液，经真空浓缩、干燥后得高纯卵磷脂0.93克。
实施例四色谱柱为φ20×500mm带活塞玻璃柱。称取硅胶(100～200目)约60克。置于120℃烘箱中活化60分钟，用无水甲醇作溶剂湿法装柱。称取粗卵磷脂约1克，用少量无水甲醇溶解后上样，并用无水甲醇洗脱，滴速控制在4毫升/分钟，每50ml收集一瓶，共收集15瓶。经HPLC法检测，纯卵磷脂在第5～6瓶。分别合并收集液，经真空浓缩、干燥后得高纯卵磷脂0.33克。
权利要求
1.本发明以大豆油脚经预处理后得到粗卵磷脂为原材料，以硅胶为吸附剂、用90～100％的甲醇作为洗脱剂进行柱色谱分离得到高纯卵磷脂。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是所用甲醇为无水甲醇。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征是吸附剂采用100-300目的硅胶。
4.根据权利要求1或2或3所述的测定方法，其特征是称取吸附剂重量的1～3％的粗卵磷脂，用4～16倍粗卵磷脂量的甲醇溶解后上样；然后用甲醇作为洗脱剂，进行柱色谱分离，滴速控制在粗卵磷脂量的1～4倍/分钟，总洗脱体积为吸附剂介质体积的3～4倍，收集次数不超过20次；收集液经HPLC法检测后，将纯卵磷脂收集液合并，经真空脱溶、干燥得高纯卵磷脂。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征是柱色谱分离用色谱柱长径比为10∶1～25∶1；称取所用色谱柱的容积20～80％量的硅胶，置于105～130℃烘箱中活化20～90分钟；用90～100％甲醇为溶剂湿法装柱得色谱柱。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征是色谱柱为带活塞玻璃柱或带阀门不锈钢柱。
全文摘要
本发明涉及一种高纯大豆卵磷脂的制备方法，以大豆油脚经预处理后得到粗卵磷脂为原材料，以硅胶为吸附剂、用无水甲醇作为洗脱剂进行柱色谱分离得到高纯卵磷脂。本发明以无水甲醇作为洗脱剂，不仅洗脱能力强，分离选择性高，可大大缩短分离时间，减少洗脱剂用量，而且简化了溶剂的脱除、回收及循环利用等后处理工序。
文档编号C07F9/00GK1429828SQ0214775
公开日2003年7月16日 申请日期2002年11月28日 优先权日2002年11月28日
发明者达世禄, 冯钰锜, 张维农, 何海波 申请人:武汉大学