专利名称：脱水剂和使用该脱水剂的含水物的脱水方法,以及利用该方法得到的脱水物品的制作方法
技术领域：
本发明涉及到以具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖(该糖由于其结构而在本说明书中以下称之为「环状四糖」)为有效成分的脱水剂以及使用脱水剂的含水物的脱水方法，以及利用该方法得到的脱水物品。
背景技术：
使用糖的脱水方法就象以前本发明人等在特开昭62-136240号公报、特开昭62-152536号公报、特开昭62-152537号公报、特开平6-170221号公报等中公布的那样，是无水糖捕获水变成含水结晶过程中发挥脱水能力的方法。该方法与加热干燥等方法不同，由于不需要苛刻条件，具有不使含水物变质、劣化，变成脱水物品的特征。
然而，在这些方法中当使用特开昭62-152536号公报公布的无水葡萄糖、无水半乳糖等无水醛己糖时，虽然脱水量比较大，但由于还原性糖富于反应性，容易与氨基酸、肽等发生褐变反应，担心脱水物品的保存稳定性。另外，无水醛己糖在比较高的湿度下也不能转变为含水结晶，表明缺乏脱水能力。另外在使用特开昭62-136240号公报中公布的无水麦芽糖时和使用特开昭62-152537号公报中公布的无水palatinose时，虽然其还原能力弱，但还基本上是还原性糖，仍担心脱水物品的长期稳定性。而且可以捕获的水量无论哪种情况大约都是糖的5w/w％，比较少，所以表明作为脱水剂存在着需要大量的无水麦芽糖或无水palatinose的缺点。
而特开昭62-152537号公报中公布的无水棉子糖、无水吡喃葡糖基蔗糖、无水松三糖等非还原性无水糖基果糖甙由于没有还原能力，所以与氨基酸、肽等不发生褐变反应，在长期保存稳定性方面具有优越性。但是，其分子内含有耐酸性小的果糖甙键，所以作为酸性含水物的脱水剂未必合适，也担心得到的脱水物品的稳定性。另外特开平6-170221号公报中公开的无水α，α-海藻糖由于没有还原性，在长期保存稳定性方面具有优越性，另外可以捕获的水量大约是糖的10w/w％，比较多，可以说作为脱水剂比上述糖更合适。但是，依然需要大量的无水α，α-海藻糖，所以更需要脱水和/或干燥效率高的脱水剂。
发明内容
本发明人等将解决在使用糖的脱水方法中存在的缺点作为目的，对天然型非还原性糖的无水物进行检索，一直对更好的脱水剂的确立和其利用进行着锐意研究。
本发明人等首先确立了以淀粉为原料工业水平比较廉价地大量生产先前实验室水平制造方法已知的环状四糖的方法。而且弄清楚了在环状四糖中作为含水状态至少存在着含5至6个水结晶以及含1个水结晶，以及作为无水状态存在着无水结晶和无水非结晶形态，后来的研究发现无水结晶、含1个水结晶和无水非晶型的环状四糖可以吸收水分，容易转换为含水状态的含5至6个水结晶。
当将该特征用于脱水剂进一步研究时发现从上述无水结晶、含1个水结晶和无水非结晶选择出的环状四糖具有优越的脱水能力，而且由于得到的脱水物品非常稳定，可以应用于很广的范围，作为脱水剂比以往已知的糖更合适。就是说发现使含水的食品、含水的药品等含有、接触或共存从具有脱水能力的环状四糖、即无水结晶环状四糖、含1个水结晶环状四糖和无水非晶型的环状四糖中选择的糖之后，通过转换为含有5至6个水结晶环状四糖，以环状四糖的结晶水捕获大量水份，由于有着非常强的脱水剂的作用以及稳定性，可以运用到包括酸性含水物在内的广泛范围的含水物，确认了能够容易制造风味良好的高品质的脱水食品和高活性且稳定的脱水药品等脱水物品，完成了本发明。
因此本发明正是选择了以往完全没有引人注目的环状四糖，特别是使含水物含有、接触或共存作为脱水剂的具有脱水能力的环状四糖，对含水物进行脱水的方法以本发明为开端。
附图的简单说明
图1是表示将通过α-异麦芽糖基转移酶反应得到的糖经高效液相层析得到的洗脱曲线图。
图2是表示通过α-异麦芽糖基转移酶反应得到的环状四糖的核磁共振谱图(1H-NMR谱)。
图3是表示通过α-异麦芽糖基转移酶反应得到的环状四糖的核磁共振谱图(13C-NMR谱)。
图4是表示环状四糖的结构为环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}的图。
图5是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图6是表示pH对来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图7是表示来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的温度稳定性的图。
图8是表示来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的pH稳定性的图。
图9是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性的影响图。
图10是表pH对来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性的影响图。
图11是表示来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的温度稳定性的图。
图12是表示来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性的图。
图13是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图14是表示pH对来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图15是表示来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的温度稳定性的图。
图16是表示来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的pH稳定性的图。
图17是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性的影响图。
图18是表pH对来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性的影响图。
图19是表示来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基转移酶的温度稳定性的图。
图20是表示来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性的图。
图21是表示通过α-异麦芽糖基葡糖生成酶反应得到的α-异麦芽糖基麦芽三糖的1H-NMR谱图。
图22是表示通过α-异麦芽糖基葡糖生成酶反应得到的α-异麦芽糖基麦芽四糖的1H-NMR谱图。
图23是表示通过α-异麦芽糖基葡糖生成酶反应得到的α-异麦芽糖基麦芽三糖的13C-NMR谱图。
图24是表示通过α-异麦芽糖基葡糖生成酶反应得到的α-异麦芽糖基麦芽四糖的13C-NMR谱图。
图25是将含5至6个水结晶环状四糖以显微镜照相表示在显示器上的中间调画面(visualized intermediate picture)。
图26是用粉末X射线衍射法对含5至6个水结晶环状四糖状粉末进行解析时的衍射谱图。
图27是表示对含5至6个水结晶环状四糖状粉末进行热重量测定时的热重量曲线图。
图28是用粉末X射线衍射法对本发明的含1个水结晶环状四糖粉末进行解析时的衍射谱图。
图29是表示对本发明的含1个水结晶环状四糖粉末进行热重量测定时的热重量曲线图。
图30是表示用粉末X射线衍射法对含5至6个水结晶环状四糖粉末经40℃真空干燥得到的无水结晶环状四糖粉末进行解析时的衍射谱图。
图31是表示用粉末X射线衍射法对含5至6个水结晶环状四糖状粉末经120℃真空干燥得到的无水结晶环状四糖粉末进行解析时的衍射谱图。
图32是表示对本发明的无水结晶环四糖粉末进行热重量测定时的热重量曲线图。
图33是表示用粉末X射线衍射法对将环状四糖水溶液冷冻干燥和真空干燥得到的无水非结晶环状四糖粉末进行解析时的衍射谱图。
具体实施例方式
本发明中含水物的脱水方法作为含有水分的含水物、特别是含有与结晶水那样的结合水不同的游离水分的含水物的脱水方法很理想，例如非常适用于通过使本发明的脱水剂与封入了干燥食品等的防湿容器内共存，降低环境所含的水分的情况，另外也适用于例如通过使食品、药品、化妆品、工业化学品、这些原材料和加工中间物等各种含水物含有或接触本发明脱水剂使含水物的游离水分降低情况等。
如果使这些含水物含有、接触或共存具有脱水能力的环状四糖，具有脱水能力的环状四糖将该重量的大约11％乃至15w/w％(以下在本说明书中，只要没有特别强调，将「w/w％」略记为「％」)水分以含5至6个水的结晶环状四糖的结晶水形式从含水物中强力吸出(该值相当于使用无水麦芽糖脱水的2.2至3倍量、或者相当于α，α-海藻糖的1.1至1.5倍量)、可以实质性地将含水物的水分降低，脱水和/或干燥。
例如在封入调味海苔、小甜饼干等的干燥食品的防湿容器内，通过使充填到纸制等透湿小袋的具有脱水能力的环状四糖共存，可以使容器内的相对湿度极度降低，能够使干燥食品、粉末状物等长时间地维持高品质、且稳定。此时具有脱水能力的环状四糖在捕获水分后转换为含5至6个水的结晶环状四糖的过程中和转换后不会粘糊、流动，不必担心会污染干燥食品和防湿容器。
另外，对于例如白兰地、食用醋、高级果子酱、新鲜冰激凌、蛋黄酱等液体状、膏状等高水分食品使其含有具有脱水能力的环状四糖，通过转换为含5至6个水结晶环状四糖，可以非常容易地制造实质性降低水分的高品质的脱水食品、例如浆(マスキツト)状、粉末状等食品。
这种情况下，如果具有脱水能力的环状四糖加的量在使食品原材料等含有的水分可充分脱水的量以上时，具有脱水能力的环状四糖的一部分转换成含5至6个水结晶环状四糖。结果通过本发明得到的脱水食品由于减少了游离水分，可以防止由于微生物污染、水解、酸败、褐变等引起的变质、劣化，长期稳定维持风味良好而且品质高的商品。
本发明的脱水方法由于环状四糖是非还原性糖，稳定，而且不需要加热干燥等苛刻的条件，所以具有不会使液体状或膏状的高水分食品变质、劣化，容易转换成风味良好、水分降低的脱水食品。另外，环状四糖本身甜度大约为蔗糖甜度的20％，是无毒、无害的甜味剂，没有任何危险。
另外也可以使淋巴因子、抗生素等水溶液、药用人参提取物、甲鱼提取物等膏状药品含有具有脱水能力的环状四糖，通过转换成含5至6个水结晶环状四糖，可以非常容易地制造实质性降低水分的高品质的脱水药品，例如浆(マスキツト)状、粉末状等药品。该方法由于不需要加热干燥等苛刻条件，另外具有脱水能力的环状四糖不仅起到脱水剂，也可以起到药品有效成分稳定剂的作用，所以可以制备高品质、而且稳定的脱水药品。
例如，向小药瓶中加入充足量的具有脱水能力的环状四糖，然后加入例如含有淋巴因子、激素等生理活性物质的水溶液，密封之后制造固态制剂等也能有效实施。在这种情况下，具有脱水能力的环状四糖对含有生理活性物质的水溶液进行脱水是没有问题的，可以对小药瓶内的环境进行防湿干燥。这样得到的脱水固态药品不仅具有其制造工程容易，而且具有长期稳定维持其高品质，另外具有使用时能快速溶解于水等特征。
另外将充足量的具有脱水能力的环状四糖一边搅拌，一边将他与即定量的具有生理活性物质的水溶液混合，将得到的粉末直接封入容器中，制成高品质而且稳定的固体制剂，另外将该粉末按照常规方法制成颗粒、片剂等之后利用也都可以有效实施。
本发明的使用具有脱水能力的环状四糖的脱水剂与以往已知的硅胶、氧化钙等脱水剂不同，不仅是可食性，经口摄取后难消化，无热量乃至低热量的糖脱水剂，而且作为各种生理活性物质等的稳定剂也可有效地利用。
在本发明中使用的环状四糖以及具有脱水能力的环状四糖不管其来源、制法如何都可以。另外作为具有脱水能力的环状四糖就象以下叙述的那样，作为环状四糖无水物的无水结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖由于摄取水分转换为含5至6个水结晶环状四糖，特别好用。同样含1个水结晶环状四糖摄取水分转换为含5至6个水的结晶环状四糖，也可以对含水物发挥脱水作用。因此在本发明中使用的具有脱水能力的环状四糖不限于完全的无水物，例如即使是含水结晶物只要是也具有脱水能力，都可以有效利用。因此，要对本发明的具有脱水能力的环状四糖进行定义时，可以通过其中含有的水分量进行判断，其水分量可以通过Karl Fischer法等众所周知的技术进行测定。作为本发明的脱水剂有效成分的环状四糖中含有的水分量当然越少越好，优选低于4％，更优选低于3％。当含有4％以上10％以下水分时虽然具有脱水能力，但作为脱水剂的功能和效率降低。
本发明人等在本发明中首先就具有脱水能力的环状四糖、特别是无水结晶环状四糖、含有1个水结晶环状四糖、以及无水非结晶环状四糖的制造方法进行了研究。
首先，作为环状四糖的制造方法有诸如除了『Europian Journalof Biochemistry』、第226卷、641至648(1994年)公布的使水解酶alternanase作用于alternan的制造方法之外，还有本发明人等先前专利2000-229557号说明书和专利2000-234937号说明书公布的使α-异麦芽糖基转移酶作用于用淀粉制备的α-葡糖基麦芽糖，转换为环状四糖的制造方法，以及使α-异麦芽糖基葡糖基生成酶和α-异麦芽糖基转移酶联合作用于淀粉制造环状四糖的方法等以淀粉作为原料的利用酶法的制造方法。另外就象以前申请的说明书记载的那样，本发明人等阐明了作为环状四糖的制造方法，利用以比alternan丰富、价廉的淀粉作为原料的酶法的方法由于可以高效、价廉地制造环状四糖，所以有利于在工业上实施，另外也初步阐明了作为环状四糖的形态存在着含5至6个水结晶、无水结晶、含1个水结晶、无水非结晶等形态。
而作为产生α-异麦芽糖基葡糖基生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的微生物，如于平成12年4月25日以保藏编号FERM BP-7143寄托于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的圆孢芽孢杆菌C9菌株，以及于平成12年4月25日以保藏编号FERM BP-7144寄托于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的圆孢芽孢杆菌C11菌株。
其次，本发明人等就无水结晶环状四糖粉末的制造方法进行研究，确立了该方法。即，该方法是例如将利用上述方法由淀粉通过酶法得到的环状四糖水溶液作成水分大约在低于15％、最好是2.0％以上、低于12％的高浓度的糖浆，将该糖浆与无水结晶环状四糖的种晶共存下，维持在50至180℃的温度范围，使无水结晶环状四糖结晶析出，加工成粉末，制造无水结晶环状四糖粉末。
另外为了制造含1个水结晶环状四糖粉末，例如可以将含5至6个水结晶环状四糖粉末再于大约100至180℃的温度进行适度干燥制造。
另外为了制造无水非结晶环状四糖粉末，例如可以通过将用上述方法得到的环状四糖水溶液于例如冷冻干燥和于大约100至180℃的温度下常压干燥或真空干燥后，进行粉碎来制造。另外将该环状四糖水溶液作成浓度约为40％至85％的糖浆，进行冷冻干燥和真空干燥后，进行粉碎来制造，或通过高压喷嘴法或旋转圆盘法等喷雾干燥法也可以直接制造粉末。
作为加工成粉末的方法，除了上述的喷雾干燥法之外，还可以适当采用块料粉碎法、挤压造粒法、流动造粒法等众所周知的方法。
象这样制造的本发明的具有脱水能力的环状四糖粉末可以达到具有上等的低甜味的非还原性的具有流动性的白色粉末，其水分含量低，实质上无水，通过Karl Fischer法测定，通常不到4％，更优选是不到3％。另外其形态也可以作成无水结晶粉末、含1个水的结晶粉末或无水非结晶粉末。
本发明的具有脱水能力的环状四糖粉末根据用途不同，将粒径按大小分开利用也可以有效实施。例如在制造象药品那样少量分装或片剂等情况下，为了使粒径越小有效成分越要均一分散，很合适。本发明的脱水剂粉末的粒径通过使用目等通常进行的分级手段进行适当选择，可以有效制造20μm至500μm，优选是50μm至200μm粒径的粉末。
还有，本发明中所谓的具有脱水能力的环状四糖粉末只要是可以转换为含5至6个水结晶环状四糖的发挥强力脱水作用的实质上无水物都可以，例如为了促进具有脱水能力的环状四糖向含5至6个水结晶环状四糖转换，提高作为脱水剂的效果，利用尽可能少量的种晶、通常不到5％、优选是不到1％的含5至6个水结晶环状四糖与脱水剂混合的粉末也可以有效实施。
如果使例如食品、药品、化妆品、工业化学品等含水物中含有象上述那样得到的本发明的具有脱水能力的环状四糖粉末，这些物品中含有的游离水分以含5至6个水的结晶环状四糖的结晶水捕获，固定，对含水物起到强力脱水剂的作用。
作为能够有效应用本发明的脱水剂的情况，如共存于防湿容器内，对防湿容器内的环境进行除湿、干燥情况，或通过使在加热干燥、真空干燥等工程容易发生变质、劣化的含水物或干燥困难的含水物中含有、接触，制造高品质的膏状、粉末状、固体状等脱水物品的情况。
作为本发明的脱水剂适用的除湿、干燥的情况，如可以用于防止调味海苔、小甜饼干等吸湿。另外也可以用于吸湿之后容易结块的粉末状物、例如米粉、小麦粉、大豆粉等谷物粉、炒米粉、黄豆面、磨碎芝麻等加工谷物粉、布丁混合粉、热饼混合粉等预混合粉、食盐、砂糖等微细结晶调味料、粉末酱油、粉末寿司醋、虎杖粉末调料、粉末复合调味料等粉末调味料、辣椒粉、大蒜粉、肉桂粉、肉豆蔻粉、芝麻粉、鼠尾草粉等粉末香辣料、酵母提取物粉末、奶粉、酸乳酪粉、干酪粉、果汁粉、中草药粉末、维生素粉、颗粒汤粉、颗粒肉汤、鱼粉、血粉、骨粉、粉末乳酸菌剂、粉末酶剂、颗粒消化剂等粉末状物品配合具有脱水能力的环状四糖进行包装，可以使包装容器内的相对湿度降低，防止粉末状物品的粘着、结块，长期维持刚制造后的流动性良好的高品质等目的。
另外作为适用本发明的脱水剂对含水物进行脱水的情况，如对来自动物、植物、微生物的器官、组织、细胞、磨碎物、提取物、成分、或由这些成分构成的调制物等各种含水物进行脱水情况可以有效地利用。
例如将本发明的脱水剂运用到食品、其原材料或加工中间物时可以很容易由下列物品制造一些稳定且风味良好的脱水食品鲜果、饮料、蔬菜提取物、豆奶、芝麻酱、果仁酱、鲜馅、糊化淀粉糊、小麦粉等农产品、海胆酱、牡蛎(oyster)提取物、沙丁鱼酱等水产品、鲜蛋、卵磷脂、牛奶、乳清、鲜奶油、酸乳酪、黄油、奶酪等畜产品、枫糖浆、蜂蜜、大豆酱、酱油、蛋黄酱、食物饰品、鲣提取物、肉提取物、海带提取物、鸡肉提取物、牛肉提取物、酵母提取物、蘑菇提取物、甘草提取物、ステビ ア提取物、这些提取物的酶处理物、腌物用调味液等含水调味料、日本酒、葡萄酒、白兰地、威士忌、药用酒等酒类、绿茶、红茶、咖啡等嗜好饮料、从薄荷、 山芋菜、大蒜、芥末、花椒、肉桂、鼠尾草、月桂、胡椒、柑橘等提取的含水香辣料、从西洋茜草、红木(Bixa orellana L.)、郁金香、红辣椒、红甜菜、红花、栀子、藏红花、红曲菌等提取的含水着色料、由糖脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、以及脱水山梨糖醇脂肪酸酯制备的含水乳化剂、熏液、发酵液等保存液等液体状乃至膏状物。
这样得到的脱水食品，例如粉末农水畜产品、粉末油脂、粉末香料、粉末着色料、粉末乳化剂、粉末保存料等可以有效地用作风味良好的天然型散装调味料等，蛋黄酱、汤料等调味料、硬糖、饼等点心类、热饼混合粉、即饮饮料等预混合粉等也可以作为各种饮食物的加工材料有效地使用。
另外在将本发明的脱水剂运用到药品、其原料或加工中间物的情况时，可以很容易制造如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、游走巨噬细胞抑制因子、神经刺激因子、转移因子、白介素II等淋巴因子含有液、胰岛素、生长激素、催乳激素、促红细胞生成素、卵细胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、小儿麻痹疫苗、天花疫苗、破伤风类病毒、ハブ抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂含有液、青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、肝油、胡萝卜素、麦角固醇、生育酚等维生素含有液、EPA、DHA、花生四烯酸等高不饱和脂肪酸或他的酯衍生物、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白激酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶含有液、药用人参提取物、甲鱼提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、プロポリス提取物等提取物等或高级凝胶等各种生理活性物质、以及病毒、乳酸菌、酵母等活菌膏等不失去其有效成分、活性，而稳定的高品质脱水药品、脱水健康食品等。
另外为了使本发明的脱水剂适用于化妆品、其原料和加工中间物时，与上述食品、药品情况一样，如果对鲜蛋、卵磷脂、鲜奶油、蜂蜜、甘草提取物、香料、着色料、酶等进行脱水，可以容易得到高品质的脱水化妆品。该化妆品作为美肌剂、美发剂、育发剂等可以有效利用。
另外适合使用本发明脱水剂作为脱水物品运用到酶的情况中，可以作为食品、药品、工业原料等的加工用催化剂，作为治疗剂、消化剂等、以及酶洗净剂等有效地利用。
作为含有、接触或共存对含水物具有脱水能力的环状四糖的方法可以适当选择诸如混合、混揉、溶解、浸透、分散、涂布、喷雾、注入等众所周知的方法直至目的脱水物品完成为止。
使含水物含有、接触或共存具有脱水能力的环状四糖的量根据含水物含有的水分量、目的脱水物品的性状改变，如果需要，也可以用其他众所周知的方法先将含水物进行部分脱水或浓缩后，再使具有脱水能力的环状四糖含有、接触或共存也可以，通常相对于1重量份含水物使用0.001至200重量份，优选是0.01至50重量份。
为了使本发明中得到的脱水物质，例如食品、药品、化妆品等品质进一步提高，与适当的香料、着色料、呈味料、稳定剂、增量剂等合用也可以有效实施。特别是稳定剂，由于本发明是通过具有脱水能力的环状四糖进行的强力脱水方法，不必限定于抗氧化剂等低分子化合物，以往认为干燥困难的水溶性高分子化合物，例如可溶性淀粉、糊精、茁霉多糖、ェルシナン、葡聚糖、呫吨橡胶、阿拉伯胶、locust bean gum、グア胶、黄蓍胶、罗望子胶、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、果胶、琼脂、明胶、清蛋白、酪蛋白等物质作为稳定剂都可以有效利用。
在使用这些水溶性高分子化合物时，例如通过预先将水溶性高分子均一地溶解于液体状乃至膏状含水物，然后再用混合、混揉等方法使含水物均一地含有具有脱水能力的环状四糖，可以得到使微细的含5至6个水结晶环状四糖析出的脱水物品。
来自含水物的香味成分、有效成分等被高分子化合物的皮膜被膜，或与含5至6个水结晶环状四糖一起包裹在被该皮膜包围的微囊中，另外香味成分、有效成分等与环状四糖形成包合化合物之后稳定，由于可以防止其挥发、品质劣化，在维持来自含水物的香味成分、有效成分的稳定中本品非常优越。此时，如果需要，作为水溶性高分子，与和香味成分形成包合化合物的α-、β-或γ-环糊精合用也可以有效实施。
作为环糊精，没有必要限定于高纯度的环糊精，也可以有效利用难于干燥的加工成粉末困难的低纯度的环糊精，例如同时含有大量的麦芽糖糊精和各种环糊精的糖稀状的淀粉部分水解物、以及环糊精的葡萄糖衍生物等。
制造本发明的脱水物品，特别是制造粉末状物品的方法可以采用各种各样的方法。例如可以使食品、药品、化妆品、他们的原材料或加工中间物等水分含量比较高的含水物中均匀地含有具有脱水能力的环状四糖，环状四糖的量相当于脱水物品的总重量水分大约50％以下，优选是10％至40％范围内，然后放到垫板等上面放置0.1至5天，温度约10至50℃，例如放置于室温，转换为含5至6个水结晶环状四糖，例如固化成块状，然后通过切割、粉碎等方法制造。如果需要，也可以在切削、粉碎等粉末化工序后加上干燥工序、分级工序等。
另外通过喷雾等方法可以直接制造粉末产品。例如一边使具有脱水能力的环状四糖流动，一边向流动的环状四糖按即定量喷雾液体状或膏状的含水物，使他们接触进行造粒，然后根据需要，于大约30至60℃下进行大约0.1至10小时熟化，转换成含5至6个水结晶环状四糖，或使具有脱水能力的环状四糖与液体状或膏状的含水物混合、混揉等之后，直接使他开始向含5至6个水结晶环状四糖转换，喷雾得到的粉末产品根据需要可进行同样的熟化，转换为含5至6个水结晶环状四糖的方法作为大量生产粉末状脱水物品的方法很合适。
这样得到的粉末状脱水物品可以直接，或根据需要，与增量剂、赋形剂、结合剂、稳定剂等合用，进一步随意作成颗粒、片剂、胶囊、棒状、板状、立方体形等适当的形状。
另外，一般来说，淀粉为了使其膨润、糊化，需要很多水分。因此糊化淀粉很容易受到微生物污染。具有脱水能力的环状四糖可以作为这样的糊化淀粉的脱水剂有效地利用。例如，牛皮糖样的点心等糊化淀粉通过含有具有脱水能力的环状四糖，转换为含5至6个水结晶环状四糖，可以实质上降低水分，防止微生物污染。
另外具有脱水能力的环状四糖由于容易与糊化淀粉均一混合，就象下面叙述的那样起到老化防止剂的作用，所以可以大幅度延长含有糊化淀粉的各种加工食品的商品寿命。
而当将具有脱水能力的环状四糖用于例如去皮香蕉、橙、切片的蒸芋、剖开的海参、秋刀鱼、生面、煮面、饼点心等表面容易受微生物污染的高水分食品时，其表面上撒满例如具有脱水能力的环状四糖粉末，使他们接触，转换为含5至6个水结晶环状四糖，由于可以实质性降低其表面的水分，使这些食品的保存日期提高，改良品质，所以可作为食品的防腐剂、稳定剂、品质改良剂等有效利用。此时，如果需要，可以合用乳酸、柠檬酸、乙醇等，真空包装、充气包装、冷藏等，自由地进一步延长该商品寿命。
另外具有脱水能力的环状四糖对醇具有高的亲和力。由于这一性质，也可以作为包含在甲醇、乙醇、丁醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇等醇或醇可溶物中水分的脱水剂有效利用。
例如，用具有脱水能力的环状四糖对清酒、烧酒、葡萄酒、白兰地、威士忌、伏特加等酒类进行脱水，可以有效地制造在生成的含5至6个水结晶环状四糖中保持其有效成分、香味等的浆(マスキツト)状、粉末状等产品。这样制造的粉末酒类可以用于点心、预混合面等，用水复原可供饮用。
本发明的具有脱水能力的环状四糖不仅作为脱水剂、稳定剂包含在脱水物品中，而且也可以发挥作为上等的甜味、稠度、适度粘度给予剂等的效果。
另外将碘等的醇溶液与具有脱水能力的环状四糖混合，通过加到含有水溶性高分子的水溶液中，转换为含5至6个水结晶环状四糖，制造不使碘等有效成分挥发、变质而且保持稳定、具有适当浓度、延伸率、粘着性的浆(マスキツト)状膏药等也可有效实施。
使含水脂溶性物质、乳化物、胶乳等含浸在具有脱水能力的环状四糖中进行混合等，使具有脱水能力的环状四糖转换为含5至6个水结晶环状四糖，制造粉末状油脂、香辛料、香料、着色料等的食品、化妆品、粉末状维生素、激素等药品等也可以有效实施。
此时，具有脱水能力的环状四糖不仅作为脱水剂，而且即使转换为含5至6个水结晶环状四糖之后也起着稳定剂、保持剂、赋形剂、载体等作用。
另外，在含有巧克力、冰激凌等厌水脂溶性物质的食品中可以有效地利用具有脱水能力的环状四糖。此时，不仅作为脱水剂，还可以在加工适应性、口溶性、风味等变好的加工中利用。另外得到的制品具有其高品质可以长期稳定维持的特征。
就象上述那样，由于发现本发明的具有脱水能力的非还原性糖环状四糖可以对各种含水物进行强力脱水，而且得到的脱水物品非常稳定而获得成功的脱水剂，所以通过利用该具有脱水能力的环状四糖作为脱水剂，可以由液体状乃至浆(マスキツト)状含水物通过环状四糖特征的包接作用，有效地制造其风味、香味不劣化、挥发、水分降低的高品质食品、化妆品以及其有效成分、活性不分解降低，水分减少的高品质的药品、化妆品等。
以下叙述本发明的脱水剂的使用例。
具有脱水能力的环状四糖有低甜味，可以用作调味料，不用担心会诱发虫牙、血液中胆固醇和/或血糖值的升高等。如果需要，可以与例如粉饴、葡萄糖、异构化糖、砂糖、麦芽糖、α，α-海藻糖、蜂蜜、枫糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、氢查尔酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、ラカンカ甜味物、干草甜、thaumatin、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、乙酰氨基磺酸钾(acesulfameK)、三氯蔗糖(sucralose)、糖精、甘氨酸、丙氨酸等其它的甜味料以及糊糖、淀粉、乳糖等那样的增量剂混合后使用。
具有脱水能力的环状四糖是非还原性糖，具有环状四糖本来的上等低甜味，与酸味、来自盐的味、涩味、香味、苦味等其他味道的各种物质充分调和，因为耐酸性、耐热性强，不仅可作为一般食品的脱水剂，而且在带甜味、以及味道改良、品质改良、风味改善等中利用也可以有效实施。
例如，用作酱油、粉末酱油、大酱、粉末大酱、未过滤的酒、酱菜、 (撒在饭上)粉状食品、蛋黄酱、饰品、食用醋、三杯醋、粉末饭卷醋、中国调料、天汁、面汁、辣酱油、番茄酱、烧肉料汁、acurry roux、炖(焖)食品调料、汤料、虎杖调料、复合调味料、料酒、新料酒、餐用糖、咖啡用糖等各种调味料的甜味料、以及味道改良剂、品质改良剂等也可以有效实施。另外，用于使煎饼、小方块糯米点心、米和芝麻等加糖做的点心、皮糖样点心、饼类、馒头、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦玉、果冻、蛋糕、麦芽糖球等各种日本点心、面包、饼干、椒盐饼干、小糖饼、馅饼、布丁、加糖奶油浆、蛋奶羹、奶油填馅点心、华夫饼干、海棉状点心、炸面圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛轧糖、水果糖等各种洋点心、冰淇淋、雪糕等冰糕、果汁、冰蜜汁类、花酱、花生酱、果泥等酱类、果子酱、橘子果酱、咸果酱、糖果等果实、蔬菜的加工食品类、什锦酱菜、暴腌的咸甜萝卜、千枚渍、腌野薤等腌物类、日本罗卜咸菜调料、腌白菜调料等腌物调料、火腿、香肠等畜肉制品类、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼糕、筒状鱼卷、炸虾(鱼)等鱼肉制品、海胆、咸乌贼、醋海带、adried squid strip、料酒浸的河豚干、鳕、真鲷、虾等田麸等各种珍味类、用海苔、野菜、麻雀、小鱼、贝等制造的用调料煮的制品类、煮豆、土豆沙拉、海带卷等家常菜食品、乳制品、鱼肉、畜肉、果实、蔬菜罐头、陶装类、合成酒、增酿酒、清酒、果酒、发泡酒、啤酒等酒类、咖啡、可口可乐、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料等清凉饮料、预混合料、热饼混合料、即饮饮料、即饮咖啡、即饮年糕小豆汤、即饮汤等即饮饮料等各种食品的脱水剂，也可以作为甜味料、味道改良剂、品质改良剂、风味改良剂等使用也可以有效实施。
以下，就本发明中使用的环状四糖的制造方法以及性质进行说明。
实验1 从培养物制备环状四糖将淀粉部分水解物(商品名『PINE-DEX#1』、松谷化学株式会社制造)5w/v％、酵母提取物(商品名『AsAHIMEAST』、朝日啤酒株式会社制造)1.5w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸二氢钠12水盐0.06w/v％、硫酸镁含7水盐0.05w/v％以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌C9(FERM BP-7143)，于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养后，离心除去菌体，得到培养上清。然后将该培养上清进行高压灭菌(120℃，15分钟)，冷却后，离心除去不溶物，回收上清。
为了检查得到的上清中的糖，作为展开溶剂使用正丁醇、吡啶、水混合液(容量比6∶4∶1)，作为薄层板使用merk公司生产『硅藻胶60』(铝板，20×20cm)进行2次展开的硅胶薄层层析(以下略为「TLC」)，对上清中的糖进行分离。作为检测方法，是通过硫酸-甲醇法对分离的全糖进行发色，而在用二苯胺-苯胺法对还原糖发色进行研究，结果使用硫酸-甲醇法时的Rf值大约为0.31的位置，阳性，而用二苯胺-苯胺法时检测出阴性的非还原性糖。
将上面得到的上清约90ml调到pH5.0，温度45℃后，添加α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶「AMANO」』、AMANO株式会社制造)每1g固态物1,500单位和葡萄糖淀粉酶(NAGASE生物化学工业株式会社制造)每1g固态物75单位，处理24小时，然后用氢氧化钠将pH调到12，煮沸2小时，对残存的还原糖进行分解。将不溶物过滤除去后，用三菱化学制造的离子交换树脂『DIAIONPK218』和『DIAIONWA30』进行脱色、脱盐，再用三菱化学制造的阳离子交换树脂『DIAIONSK-1B』和オルガノ生产的阴离子交换树脂『IRA411』进行脱盐，用活性炭脱色，精密过滤后，用蒸发仪进行浓缩冷冻干燥，得到固态物形式的约0.6g的糖粉末。
通过高效液相色谱法(以下略称为HPLC)对得到的糖的组成进行研究时，结果就象图1所示那样，检测出洗脱时间10.84分钟时单一峰，纯度在99.9％以上，为极高纯度。HPLC使用『Shodex KS-801柱』(昭和电工株式会社制造)，在柱温60℃，流速0.5ml/min水的条件下进行的，用差示折射计『RI-8012』(东曹株式会社制造)进行检测。
另外用Somogyi-Nelson法测定还原力，其还原力在检测界线以下，判断本标准品实质上是非还原性糖。
实验2 环状四糖的结构解析对用实验1方法得到的非还原性糖利用高速原子轰击法进行质量分析(通称「FAB-MS」)，显著地检测出质量数649的带有质子的分子离子，判明该糖的质量数为648。
另外，按照常规方法，使用硫酸进行水解，用气相色谱法研究构成糖，结果只检测出D-葡萄糖，判明该糖的构成糖是D-葡萄糖，如果考虑到质量数，推测该糖是由4分子葡萄糖构成的环状糖。
另外用该糖进行核磁共振(通称NMR)，得到图2所示的1H-NMR谱和图3所示的13C-NMR谱，比较这些谱图与已知糖的谱图的异同，发现与『Europian Journal of Biochemistry』、641-648页(1994年)记载的非还原环状糖环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}的谱一致，所以判明该糖的结构是如图4所示的环状四糖，即环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}。
实验3 来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的生产将淀粉部分水解物(商品名『PINE-DEX#4』、松谷化学株式会社制造)4.0w/v％、酵母提取物(商品名『ASAHIMEAST』、朝日啤酒株式会社制造)1.8w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸二氢钠含12水盐0.06 w/v％、硫酸镁含7个水盐0.05w/v％以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌C9(FERM BP-7143)，将于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养的菌液作为作为种培养。
将与种培养时同样组成的培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却后温度达到27℃后，接种种培养液1v/v％，维持在27℃、pH6.0至8.0范围内进行48小时通气搅拌培养。培养后，培养液中的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.45单位/ml，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.5单位/ml，环状四糖生成活性约为0.95单位/ml，对离心分离(10,000rpm、30分钟)回收的上清约18L的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.45单位/ml(总活性约为8,110单位)，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.5单位/ml(总活性约为26,900单位)，环状四糖生成活性约为0.95单位/ml(总活性约为17,100单位)。
而酶活性象下述那样进行测定。即α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的测定如下将麦芽三糖溶解于100mM醋酸缓冲液(pH6.0)使浓度达到为2w/v％，作为底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下进行60分钟酶反应，将该反应液煮沸10分钟，使反应停止后，该反应液中主要生成异麦芽糖基麦芽糖和麦芽糖，通过用实验1记载的HPLC法对其中的麦芽糖进行定量，α-异麦芽糖基葡糖生成酶的1个活性单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔麦芽糖的酶量。
而α-异麦芽糖基转移酶活性测定如下将6-α-葡糖基麦芽糖溶解于100mM醋酸缓冲液(pH6.0)使浓度达到2w/v％，作为底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加/入0.5ml酶液，于35℃下进行30分钟酶反应，将该反应液煮沸10分钟，使反应停止后，该反应液中主要生成环状四糖和葡萄糖，通过用葡萄糖氧化酶法对其中的葡萄糖进行定量，α-异麦芽糖基转移酶的1个活性单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔葡萄糖的酶量。
环状四糖生成活性的测定如下将淀粉部分水解物(商品名『PINE-DEX#100』、松谷化学株式会社制造)溶解于50mM醋酸缓冲液(pH6.0)使浓度达到2w/v％，作为底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下进行60分钟酶反应，将该反应液在100℃煮沸10分钟，使反应停止后，再添加含有α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶L「AMANO」』、天野制药制造)70单位/ml和葡萄糖淀粉酶(NAGASE生物化学工业株式会社销售)27单位/ml的50mM的醋酸缓冲液(pH5.0)1ml，于50℃下处理60分钟，将该溶液于100℃下进行10分钟热处理，使酶失活后，通过用实验1记载的HPLC法对环状四糖进行定量，环状四糖生成活性的1个活性单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔环状四糖的酶量。
实验4 来自圆孢芽孢杆菌C9的酶的制备实验4-1 来自圆孢芽孢杆菌C9的酶的纯化将实验3得到的培养上清约18L用80％饱和硫铵溶液进行盐析，于4℃下放置24小时后，该盐析沉淀经离心分离(10,000rpm、30分钟)回收，溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)后，对同样缓冲液进行透析，得到大约400ml粗酶液。该粗酶液含有的α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性约为8,110单位，α-异麦芽糖基转移酶活性为24,700单位，环状四糖生成活性约为15,600单位。将该粗酶液使用三菱化学株式会社制造『Sepabeads FP-DA13』凝胶进行离子交换层析(凝胶容量1,000ml)。此时，无论α-异麦芽糖基葡糖生成酶，α-异麦芽糖基转移酶还是环状四糖都没有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝胶上，而是在非吸附级分中被洗脱出来。将该酶液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去杂质，使用Amersham pharmacia biotech株式会社制造的『Sephacryl HRS-200』凝胶进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，再继续用0mM至100mM麦芽四糖线性梯度进行洗脱，结果将α-异麦芽糖基葡糖生成酶与α-异麦芽糖基转移酶分开洗脱出来，α-异麦芽糖基转移酶活性用硫铵线性梯度洗脱时，大约在硫铵浓度为0M附近被洗脱出来，α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性用麦芽四糖线性梯度洗脱时大约在浓度为30mM附近被洗脱出来。将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分一个一个地分别回收。而环状四糖生成活性在该柱层析的任一个级分中都没有看到，而将所得的α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分混合的酶液表现出环状四糖生成活性，判明由淀粉部分水解物生成环状四糖的活性是通过α-异麦芽糖基转移酶活性与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的共同作用发挥的。
以下叙述有关对α-异麦芽糖基葡糖生成酶与α-异麦芽糖基转移酶分别进行纯化的方法。
实验4-2 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的纯化将实验4-1中得到的α-异麦芽糖基葡糖生成酶级分对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶吸附于『Butyl-Toyopearl650M』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，结果在硫铵浓度约0.3M附近，吸附的酶被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析来纯化。该纯化的各个阶段中的α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性量、比活、收率如表1所示。
表1
通过含有7.5w/v％聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的标准品。
实验4-3 α-异麦芽糖基转移酶的纯化将实验4-1中通过亲和层析使与α-异麦芽糖基葡糖生成酶级分分开的α-异麦芽糖基转移酶级分对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，在硫铵浓度约0.3M附近，吸附的酶被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析纯化。该纯化的各个阶段中的α-异麦芽糖基转移酶活性量、比活、收率如表2所示。
表2
实验5 α-异麦芽糖基葡糖生成酶与α-异麦芽糖基转移酶的性质实验5-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的性质对用实验4-2方法得到的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度为7.5w/v％)，与同时电泳的分子量标准(日本Bio-Rad laboratories株式会社制造)进行比较，测定该酶的分子量，其分子量约为140,000±20,000道尔顿。
将纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品用含有2w/v％两性电解质(Amersham pharmacia biotech公司制造)的等电点聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦电泳，对电泳后的蛋白带和凝胶的pH进行测定，求该酶的等电点，其等电点pl约为5.2±0.5。
根据活性测定方法研究温度、pH对该酶活性的影响。在没有Ca2+存在下和有1mM Ca2+存在条件下测定温度对酶的影响。结果如图5(温度的影响)和图6(pH的影响)所示。酶的最适温度在pH6.0、反应60分钟时约为40℃(没有Ca2+存在)，约为45℃(有1mM Ca2+存在)，最适pH在35℃、反应60分钟时处于约6.0至6.5范围。该酶的温度稳定性是通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)在没有Ca2+存在下或存在1mM下于各个温度下保持60分钟，水冷却后测定残存的酶活性求出的。而pH稳定性是将该酶于各个pH的50mM缓冲液中在4℃下保持24小时后，将pH调到6.0，测定残存的酶活性求出的。上述测定结果分别如图7(温度稳定性)和图8(pH稳定性)所示。该酶温度稳定性约在不大于35℃(没有Ca2+存在下)，不大于40℃(Ca2+1mM)，而pH稳定性约在4.5至9.0范围。
根据活性测定方法研究在浓度1mM的各种金属盐存在下，金属离子对该酶活性的影响。结果如表3所示。
表3
就象表3表明的那样，该酶活性受到Hg2+、Cu2+、EDTA的显著抑制，受到Ba2+、Sr2+的抑制，但受到Ca2+、Mn2+的激活。
用蛋白序列分析仪(型号473A)(Applied biosystems公司制造)对该酶的N末端氨基酸序列进行分析，结果表明该序列为序列表中序列号1所示氨基酸序列具有Tyr-Val-Ser-Ser-Leu-Gly-Asn-Leu-Ile的N末端氨基酸序列。
实验5-2 α-异麦芽糖基转移酶的性质对用实验4-3方法得到的α-异麦芽糖基转移酶标准品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度为7.5w/v％)，与同时电泳的分子量标准(日本Bio-Rad laboratories株式会社制造)进行比较，测定该酶的分子量，其分子量约为112,000±20,000道尔顿。
将纯化的α-异麦芽糖基转移酶标准品用含有2w/v％两性电解质(Amersham pharmacia biotech公司制造)的等电点聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦电泳，对电泳后的蛋白带和凝胶的pH进行测定，求该酶的等电点，其等电点pl约为5.5±0.5。
根据活性测定方法研究温度、pH对该酶活性的影响。结果如图9(温度的影响)和图10(pH的影响)所示。酶的最适温度在pH6.0、反应30分钟时约为45℃，最适pH在35℃、反应30分钟时约为6.0。该酶的温度稳定性是通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)于各个温度下保持60分钟，水冷却后测定残存的酶活性求出的。而pH稳定性是将该酶于各个pH的50mM缓冲液中在4℃下保持24小时后，将pH调到6.0，测定残存的酶活性求出的。上述测定结果分别如图11(温度稳定性)和图12(pH稳定性)所示。该酶温度稳定性约在不大于40℃，而pH稳定性约在4.0至9.0范围。
根据活性测定方法研究在浓度1mM的各种金属盐存在下，金属离子对该酶活性的影响。结果如表4所示。
表4
就象表4表明的那样，该酶活性受到Hg2+的显著抑制，受到Cu2+的抑制。不会被Ca2+激活，也不会被EDTA抑制。
用蛋白序列分析仪(型号473A(Applyed Biosystems公司制造)对该酶的N末端氨基酸序列进行分析，结果具有序列表中序列号2所示氨基酸序列的Ile-Asp-Gly-Val-Tyr-His-Ala-Pro-Ash-Gly的N末端氨基酸序列。
实验6 来自圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的生产将淀粉部分水解物『PINE-DEX#4』4.0w/v％、酵母提取物『ASAHIMEAST』1.8w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸二氢钠含12水盐0.06w/v％、硫酸镁含7个水盐0.05w/v％以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌C11(FERM BP-7144)，将于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养的菌液作为种培养。
将与种培养时同样组成的培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却，温度达到27℃后，接种种培养液1v/v％，维持在27℃、pH6.0至8.0范围内，进行48小时通气搅拌培养。培养后，培养液中的该酶活性约为0.55单位/ml，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.8单位/ml，环状四糖生成活性约为1.1单位/ml，对离心分离(10,000rpm、30分钟)回收的约18L上清的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.51单位/ml(总活性约为9,180单位)，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.7单位/ml(总活性约为30,400单位)，环状四糖生成活性约为1.1单位/ml(总活性约为19,400单位)。
实验7 来自圆孢芽孢杆菌C11的酶的制备实验7-1 来自圆孢芽孢杆菌C11的酶的纯化将实验6得到的培养上清约18L用80％饱和硫铵溶液进行盐析，于4℃下放置24小时后，该盐析沉淀经离心分离(10,000rpm、30分钟)回收，溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)后，对同样缓冲液进行透析，得到大约416ml粗酶液。该粗酶液含有的α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性约为8,440单位，α-异麦芽糖基转移酶活性约为28,000单位，环状四糖生成活性约为17,700单位。将该粗酶液使用实验4-1记载的『Sepabeads FP-DA13』凝胶进行离子交换层析。此时，无论α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，α-异麦芽糖基转移酶活性还是环状四糖都没有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝胶上，而是在非吸附级分中被洗脱出来。将该酶液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用Amersham pharmacia biotech株式会社制造的『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephaeryl HR S-200』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，再继续用0mM至100mM麦芽四糖线性梯度进行洗脱，结果将α-异麦芽糖基转移酶与α-异麦芽糖基葡糖生成酶分开洗脱出来，α-异麦芽糖基转移酶活性用硫铵线性梯度洗脱时，大约在硫铵浓度为0.3M附近被洗脱出来，α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性用麦芽四糖线性梯度洗脱时大约在浓度为30mM附近被洗脱出来。将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分分别回收。象实验4记载的C9菌株那样，环状四糖生成活性在该柱层析的任一个级分中都没有看到，而将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分混合的酶液表现出环状四糖生成活性，判明由淀粉部分水解物生成环状四糖的活性是通过α-异麦芽糖基转移酶活性与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的共同作用发挥出来。
以下叙述有关对α-异麦芽糖基葡糖生成酶与α-异麦芽糖基转移酶分别进行纯化的方法。
实验7-2 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的纯化将α-异麦芽糖基葡糖生成酶级分对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，结果在硫铵浓度约0.3M附近，吸附的酶被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析纯化。该纯化的各个阶段中的α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性量、比活、收率如表5所示。
表5
通过含有7.5w/v％聚丙烯酰胺的凝胶电泳检验纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准样品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的标准样品。
实验7-3 α-异麦芽糖基转移酶的纯化将实验7-1中记载的通过亲和层析将与α-异麦芽糖基葡糖生成酶级分分开的α-异麦芽糖基转移酶级分对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用1M至0M硫铵线性梯度进行洗脱，结果在硫铵浓度约0.3M附近，吸附的酶被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析纯化。该纯化的各个阶段中的α-异麦芽糖基转移酶活性量、比活、收率如表6所示。
表6
实验8 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的制备实验8-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的性质对用实验7-2方法得到的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度为7.5w/v％)，与同时电泳的分子量标准(日本Bio-Rad laboratories株式会社制造)进行比较，对该酶的分子量进行测定，分子量约为137,000±20,000道尔顿。
将纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品用含有2w/v％两性电解质(Amersham pharmacia biotech公司制造)的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦电泳，对电泳后的蛋白带和凝胶的pH进行测定，求该酶的等电点，其等电点pl约为5.2±0.5。
根据活性测定方法研究温度、pH对该酶活性的影响。在没有Ca2+存在下和有1mM Ca2+存在条件下测定温度对酶的影响。结果如图13(温度的影响)和图14(pH的影响)所示。酶的最适温度在pH6.0、反应60分钟时约为45℃(没有Ca2+存在)，50℃(存在1mM Ca2+)，最适pH在35℃、反应60分钟时约为6.0。该酶的温度稳定性是通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)在没有Ca2+存在下或存在1mM Ca2+条件下于各个温度下保持60分钟，冷却后测定残存的酶活性求出的。而pH稳定性是将该酶于各个pH的50mM缓冲液中于4℃下保持24小时后，将pH调到6.0，测定残存的酶活性求出的。上述测定结果分别如图15(温度稳定性)和图16(pH稳定性)所示。该酶温度稳定性约在不大于40℃(没有Ca2+存在下)，不大于45℃(1mM Ca2+)，而pH稳定性约在5.0至10.0范围。
根据活性测定方法研究在浓度1mM的各种金属盐存在下金属离子对该酶活性的影响。结果如表7所示。
表7
就象表7表明的那样，该酶活性受到Hg2+、Cu2+、EDTA的显著抑制，受到Ba2+、Sr2+的抑制，但受到Ca2+、Mn2+的激活。
用『蛋白序列分析仪，型号473A』(Applied biosystems公司制造)对该酶的N末端氨基酸序列进行分析，结果表明具有序列表中序列号1所示氨基酸序列N末端Tyr-Val-Ser-Ser-Leu-Gly-Asn-Leu-Ile的N末端氨基酸序列。
判明该N末端氨基酸序列结果与来自实验5-1圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡萄糖生成酶的N末端序列进行比较相同，α-异麦芽糖基葡萄糖生成酶的共同N末端氨基酸序列是序列表中序列号1所示氨基酸序列Tyr-Val-Ser-Ser-Leu-Gly-Asn-Leu-Ile的N末端氨基酸序列。
实验8-2 α-异麦芽糖基转移酶的性质对用实验7-3方法得到的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度为7.5w/v％)，与同时电泳的分子量标准(日本Bio-Rad laboratories株式会社制造)进行比较，对该酶的分子量进行测定，其分子量约为102,000±20,000道尔顿。
将纯化的α-异麦芽糖基转移酶标准样品用含有2w/v％两性电解质(Amersham pharmacia biotech公司制造)的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦电泳，对电泳后的蛋白带和凝胶的pH进行测定，求该酶的等电点，其等电点pl约为5.6±0.5。
根据活性测定方法研究温度、pH对该酶活性的影响。结果如图17(温度的影响)和图18(pH的影响)所示。酶的最适温度在pH6.0、反应30分钟时约为50℃，最适pH在35℃、反应30分钟时约为5.5至6.0。该酶的温度稳定性是通过将酶溶液(20mM醋酸缓冲液、pH6.0)于各个温度下保持60分钟，冷却后测定残存的酶活性求出的。而pH稳定性是将该酶于各个pH的50mM缓冲液中于4℃下保持24小时后，将pH调到6.0，测定残存的酶活性求出的。上述测定结果分别如图19(温度稳定性)和图20(pH稳定性)所示。该酶温度稳定性约在不大于40℃，而pH稳定性约在4.5至9.0。
根据活性测定方法研究在浓度1mM的各种金属盐存在下金属离子对该酶活性的影响。结果如表8所示。
表8
就象表8表明的那样，该酶活性受到Hg2+的显著抑制，受到Cu2+的抑制。既不会被Ca2+激活，也不会被EDTA抑制。
用『蛋白序列分析仪，型号473A 』(Applyed Biosystem公司制造)对该酶的N末端氨基酸序列进行分析，结果表明具有序列表中序列号3所示氨基酸序列Ile-Asp-Gly-Val-Tyr-His-Ala-Pro-Tyr-Gly的N末端氨基酸序列。将该N末端氨基酸序列结果与实验5-2的来自圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的N末端序列进行比较，α-异麦芽糖基转移酶的共同的N末端氨基酸序列是序列表中序列号4所示的氨基酸序列Ile-Asp-Gly-Val-Tyr-His-Ala-Pro的N末端氨基酸序列。
实验9 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的氨基酸序列实验9-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的内部部分氨基酸序列将用实验7-2方法得到的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品一部分对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析后，用同一缓冲液将浓度稀释到1mg/ml。通过向该样品液(1ml)中加入10μg的胰蛋白酶(和光纯药株式会社销售)，于30℃下反应22小时进行肽化。为了分离生成的肽，进行反相HPLC。使用microbondpack C18柱(直径2.1mm×长150mm、waters公司制造)，流速0.9ml/分，于室温下，在从0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈溶液的120分钟的线性梯度的条件下进行洗脱。从柱子上洗脱下来的肽通过测定波长210nm的吸光度进行检测。分别收集了与其他肽充分分离的3个肽[P64(保留时间约64分钟)、P88(保留时间约88分钟)、P99(保留时间约99分钟)]，将他们分别进行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中。对这些肽样品进行蛋白测序，对到各自8个残基的氨基酸序列进行分析，得到了序列表中序列号5至7所示的氨基酸序列。得到的内部部分氨基酸序列如表9所示。
表9
实验9-2 α-异麦芽糖基转移酶的内部部分氨基酸序列将用实验7-3方法得到的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品一部分对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)进行透析后，用同一缓冲液将浓度稀释到1mg/ml。通过向该样品液(1ml)加入10μg的赖氨酰肽链内切酶lysyl endopeptidase(和光纯药株式会社销售)，于30℃下反应22小时进行肽化。为了分离生成的肽，进行反相HPLC。使用microbondpack C18柱(直径2.1mm×长150mm、waters公司制造)，流速0.9ml/分，于室温下，在从0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈溶液的120分钟的线性梯度的条件下进行洗脱。从柱子上洗脱下来的肽通过测定波长210nm吸光度进行检测。分别收集了与其他肽充分分离的3个肽[P22(保留时间约22分钟)、P63(保留时间约63分钟)、P71(保留时间约7 1分钟)]，将他们分别进行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中。对这些肽样品进行蛋白测序，对到各自8个残基的氨基酸序列进行分析，得到了序列表中序列号8至10所示的氨基酸序列。得到的内部部分氨基酸序列如表10所示。
表10
实验10 对各种糖的作用使用各种糖进行能否作为α-异麦芽糖基葡糖生成酶的底物的试验。制备含有麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、6-α-葡糖基麦芽糖、异6-α-葡糖基麦芽糖、α，α-海藻糖、曲二糖、黑曲糖、新海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、麦芽糖醇、麦芽三糖醇、乳糖、蔗糖、吡喃葡糖基蔗糖、selaginose、麦芽糖基葡糖苷、异麦芽糖基葡糖苷的溶液。
向这些溶液中分别每1g底物固态物2单位加入用实验4-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C9的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，或用实验7-2方法得到来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，将底物浓度调整到2w/v％，然后于30℃、pH6.0条件下使酶作用24小时。用实验1记载的TLC法对酶反应前后的反应液进行分析，确认酶对各个糖有无作用。结果如表11所示。
表11
注)「-」表示没有变化。
「+」表示底物的点稍有减少，确认有其他产物生成。
「++」表示底物的点减少很多，确认有其他产物生成。
「+++」表示底物的点几乎消失，确认有其他产物生成。
就象表11所表明的那样，α-异麦芽糖基葡糖生成酶在试验的多种糖中，对葡萄糖聚合度3以上，非还原末端具有麦芽糖结构的糖作用最好。而葡萄糖聚合度为2的糖中，仅对麦芽糖、曲二糖、黑曲糖、新海藻糖、麦芽三糖醇、6-α-葡糖基麦芽糖稍有作用。
实验11 来自麦芽寡糖的产物实验11-1 产物的制备向浓度为1％的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖的各个水溶液分别加入实验7-2的方法制得的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶，加入的量分别为每1g固态物2单位(麦芽糖和麦芽三糖)、0.2单位(麦芽四糖)、0.1单位(麦芽五糖)，然后于35℃、pH6.0条件下使酶作用8小时，于100℃下保持10分钟，停止反应。用HPLC对该酶反应液的糖组成进行测定。HPLC使用『YMC Pack ODS-AQ303』柱(株式会社YMC-制造)，柱温40℃、流速0.5ml/min水的条件下进行，用差示折射计『RI-8012』(东曹株式会社制造)进行检测。检测结果如表12所示。
表12
表中葡糖基麦芽糖为α-异麦芽糖基葡萄糖(别名62-O-α-葡糖基麦芽糖、6-α-葡糖基麦芽糖)葡糖基麦芽三糖为α-异麦芽糖基葡萄糖(别名63-O-α-葡糖基麦芽三糖)
X为实验11-2记载的α-异麦芽糖基葡萄三糖(别名64-O-α-葡糖基麦芽四糖)Y为实验11-2记载的α-异麦芽糖基葡萄四糖(别名65-O-α-葡糖基麦芽五糖)Z为未鉴定的糖。
就象表12的结果所表明的那样，该酶作用的结果表明由底物麦芽糖主要生成葡萄糖和α-异麦芽糖基葡萄糖(别名62-O-α-葡糖基麦芽糖、6-α-葡糖基麦芽糖)，由底物麦芽三糖主要生成麦芽糖和α-异麦芽糖基葡萄糖(别名63-O-α-葡糖基麦芽三糖)，少量的葡萄糖、麦芽四糖、α-异麦芽糖基葡萄糖(别名62-O-α-葡糖基麦芽糖、6-α-葡糖基麦芽糖)、产物X。由底物麦芽四糖主要生成麦芽三糖和产物X，少量的麦芽糖、麦芽五糖、α-异麦芽糖基葡萄糖(别名63-O-α-葡糖基麦芽三糖)、产物Y。由底物麦芽五糖主要生成麦芽四糖和产物Y，少量的麦芽三糖、麦芽六糖、产物X和产物Z。
对底物麦芽四糖主要产物-产物X、以及底物麦芽五糖主要产物-产物Y进行分离纯化。使用制备用HPLC柱『YMC Pack ODS-AR355-15S-15 12A』(株式会社YMC制造)进行纯化，分别从来自上述麦芽四糖的反应物、来自麦芽五糖的反应物分离出固态物回收率约8.3％，纯度99.9％以上的产物X标准品，以及固态物回收率约11.5％，纯度为99.9％以上的产物Y标准品。
实验11-2 产物的结构解析用通过实验11-1方法得到的产物X标准品和产物Y标准品，按照常规方法进行甲基化和NMR分析。甲基化的结果归纳在表13中。而NMR分析的结果，1H-NMR谱分别表示在图21(产物X)、图22(产物Y)中，13C-NMR谱及其归属归纳在图23(产物X)、图24(产物Y)和表14中。
表13
从这些结果判明麦芽四糖经α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用生成的产物X是麦芽四糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基通过α糖苷键结合了葡萄糖基的5糖，是结构式1表示的α-异麦芽糖基麦芽三糖(别名64-O-α-葡糖基麦芽四糖)。
结构式1α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp而麦芽五糖的产物Y是麦芽五糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基通过α糖苷键结合了葡萄糖基的6糖，是结构式2表示的α-异麦芽糖基麦芽四糖(别名65-O-α-葡糖基麦芽五糖)。
结构式2α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
表14
从以上实验可以象下面那样判断α-异麦芽糖基葡糖生成酶对麦芽寡糖的作用。
(1)该酶作用于作为底物由α-1，4糖苷键连接的葡萄糖聚合度在2以上的麦芽寡糖，催化具有将底物的非还原末端的葡萄糖残基转移到其他分子的非还原末端的葡萄糖残基的6位作用的分子间的6-葡萄糖基转移，生成葡萄糖聚合度增加1个的在非还原末端含有6-O-α-葡糖基的α-异麦芽糖基葡萄糖(别名6-O-α-葡糖基麦芽寡糖)和葡萄糖聚合度减少1个的麦芽寡糖。
(2)该酶也微弱催化4-葡萄糖基转移，由麦芽寡糖生成很少量葡萄糖聚合度增加1个的麦芽寡糖和葡萄糖聚合度减少1个的麦芽寡糖。
实验12 还原力生成试验为了研究α-异麦芽糖基葡糖生成酶是否具有生成还原力的能力，进行了以下试验。向浓度为1％的麦芽四糖水溶液中分别按照每1g底物固态物0.25单位加入用实验4-2方法得到来自圆孢芽孢杆菌C9的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶以及用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶，然后于35℃、pH6.0条件下使酶作用，随时采集一部分反应液，于100℃下保持10分钟之后停止反应，对反应液的还原力进行测定。即，用Somogyi-Nelson法测定该酶反应前后溶液的还原糖量，另外同时用蒽酮(アントロン)硫酸法测定该酶反应前后溶液的全糖量，还原力产率(％)用以下计算式算出。
数1计算式
结果如表15所示。
表15
就象表15结果所表明的那样，如果使α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用于底物麦芽四糖，判明实质上没有增加反应物的还原力，即，该α-异麦芽糖基葡糖生成酶没有表现出水解作用，或者生成不能检测程度的很少产物。
实验13 葡聚糖生成试验为了研究α-异麦芽糖基葡糖生成酶是否具有生成葡聚糖作用，根据『Bioscience Biotechnology and Biochemistry』第56卷，169至173(1992)记载的方法进行试验。向浓度为1％的麦芽四糖水溶液中分别按照每1g底物固态物0.25单位加入用实验4-2方法得到的来自C9株的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶以及用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶，然后于35℃、pH6.0条件下作用4小时和8小时后，于100℃下保持15分钟之后停止反应。将该酶反应液50μl加入到离心管中，然后加入3倍量的乙醇，充分搅拌后，于4℃下静置30分钟。然后进行离心分离(15,000rpm，5分钟)，除去上清后，加1ml的75％乙醇，搅拌清洗。再次进行离心分离，除去上清，进行真空干燥后，加1ml的去离子水，进行充分搅拌。用酚硫酸法对该溶液中的全糖量(换算成葡萄糖)进行测定，作为试验的全糖量。作为反应的对照，使用于100℃下进行10分钟热处理失活的来自圆孢芽孢杆菌C9或来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶进行同样的试验，作为对照的全糖量。葡聚糖的生产量用以下计算式计算。
计算式葡聚糖生产量(mg/ml)＝[(试验的全糖量)-(对照的全糖量)]×20结果如表16所示。
表16
就象表16结果所表明的那样，既便使α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用于麦芽四糖，也不生成葡聚糖，就是说，该α-异麦芽糖基葡糖生成酶实质上没有生成葡聚糖作用，或其生成量在检测界线以下。
实验14 转移受体特异性使用各种糖进行是否能够成为该酶的转移受体的试验。制备D-葡萄糖、D-木糖、L-木糖、D-半乳糖、D-果糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-岩藻糖、L-山梨糖、L-鼠李糖、甲基-α-葡萄糖苷、甲基-β葡萄糖苷、N-乙酰-氨基葡萄糖、山梨糖醇、α，α-海藻糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、纤维二糖、龙胆二糖、麦芽糖醇、乳糖、蔗糖、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精溶液。
向这些受体溶液(浓度1.6％)中加入作为糖供体的淀粉部分水解物『PINE-DEX#100』(浓度4％)，然后分别按照每1g底物固态物各1单位加入用实验4-2方法得到来自圆孢芽孢杆菌C9的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，或用实验7-2方法得到来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，于30℃、pH6.0条件下作用24小时。对酶反应后的反应液进行分析，受体是单糖或二糖时用气相色谱法(以下略为「GLC」)分析，受体为三糖以上的糖时用HPLC法进行分析，确认各个糖能否成为该酶的转移受体。而在GLC中，GLC仪器为『GC-16A』(株式会社岛津制作所制造)，柱子是充填了GL Sciences株式会社制造的『2％硅OV-17/CHROMOSOLV W』不锈钢柱(3mmφ×2m)、载气氮气流量为40ml/分，以7.5℃/分速度使温度从160℃升高到320℃，检测用氢焰离子化检测器进行分析。在HPLC分析中，HPLC仪器是东曹株式会社制造『CCPD』、柱子为『ODS-AQ-303』(株式会社ワイェムシイ-公司制造)，洗脱液为水，流速0.5ml/分，检测用差示折射计进行分析。结果如表17所示。
表17
表中「-」表示没有检测出向受体的糖转移物。
「±」表示检测出向受体的糖转移物，但其生成量不到1％。
「+」表示向受体的糖转移物在1％以上，10％以下。
「++」表示向受体的糖转移物在10％以上。
就象表17所表明的那样，α-异麦芽糖基葡糖生成酶可以利用各种糖作为转移受体，特别是能很好地向D-/L-木糖、甲基-α-葡萄糖苷、甲基-β-葡萄糖苷、α，α-海藻糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、纤维二糖、麦芽糖醇、乳糖和蔗糖转移，其次也可以向D-葡萄糖、D-果糖、D-岩藻糖、L-山梨糖和N-乙酰-氨基葡萄糖转移，还可以向D-阿拉伯糖转移。
有关以上叙述的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的性质，与以前报道的具有6-葡糖基转移作用的酶、『Bioscience Biotechnology andBiochemistry』、第56卷、第169至173页(1992)记载的糊精·葡聚糖酶(dextrin dextranase)和『日本农艺化学会誌』、第37卷、第668至672页(1963)记载的转葡糖苷酶进行比较。其结果归纳在表18中。
表18
就象表18表明的那样，α-异麦芽糖基葡糖生成酶具有与已知的糊精·葡聚糖酶或转葡糖苷酶完全不同的新的理化性质。
实验15 环状四糖的生成使用各种糖进行由于α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用生成环状四糖试验。制备麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、直链淀粉、可溶性淀粉、淀粉部分分解物(商品名『PINE-DEX#100』、松谷化学株式会社制造)或糖原(来自カキ、和光纯药株式会社销售)溶液。
向这些水溶液(浓度0.5％)中按照每1g固态物1单位加入用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，和按照每1g底物固态物10单位加入用实验7-3方法得到来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，然后于30℃、pH6.0条件下作用。作用条件按照以下4种方式进行。
(1)使α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用24小时后，加热使酶失活，再继续使α-异麦芽糖基转移酶作用24小时后，加热使酶失活。
(2)使α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶同时作用24小时后，加热使酶失活。
(3)只使α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用24小时后，加热使酶失活。
(4)只使α-异麦芽糖基转移酶作用24小时后，加热使酶失活。
为了研究这些热失活后的反应液中的环状四糖的生产量，象实验1那样进行α-葡糖苷酶·葡萄糖淀粉酶处理，对残存的还原性寡糖进行水解，通过HPLC法对环状四糖进行定量。其结果如表19所示。
表19
就象表19表明的那样，在进行试验的任一个糖在只有α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用和只有α-异麦芽糖基转移酶作用时，都没有生成环状四糖，相反，通过同时合用α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶时生成环状四糖。其产量当在α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用后，α-异麦芽糖基转移酶再作用时约为11％以下，比较低，但若α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶同时作用，无论哪一种糖的环状四糖产量都提高，特别是用糖原时，增加到约87％，用淀粉部分分解物，增加到约64％。
α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶同时合用的环状四糖的生成机制从两个酶的反应特性推测如下。
(1)α-异麦芽糖基葡糖生成酶作用于糖原或淀粉部分分解物等的α-1，4葡聚糖链的非还原末端葡萄糖基，将该葡萄糖基经分子间转移到另外的α-1，4葡聚糖链的非还原末端葡萄糖基的6位羟基，生成非还原末端含有α-异麦芽糖基的α-1，4葡聚糖链。
(2)α-异麦芽糖基转移酶作用于非还原末端含有异麦芽糖基的α-1，4葡聚糖链，该异麦芽糖基经分子间转移到其他的非还原末端含有异麦芽糖基的α-1，4葡聚糖链的非还原末端葡萄糖基的3位羟基上，生成非还原末端含有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基的α-1，4葡聚糖链。
(3)接下来，α-异麦芽糖基转移酶作用于该非还原末端含有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基的α-1，4葡聚糖链，通过分子内转移作用从α-1，4葡聚糖链切开异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基，进行环化，生成环状四糖。
(4)被切开的α-1，4葡聚糖链再次通过接受(1)至(3)的反应，再生成环状四糖。通过α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶同时合用，上述两酶反复作用，推测环状四糖的生成量增加。
实验16 淀粉液化程度的影响将玉米淀粉做成浓度15％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸钙，将pH调到6.0，按照每100g淀粉加0.2g至2.0g的比例加α-淀粉酶(商品名『タ-マミ-ル60L』)(ノボ公司生产)，于95℃反应10分钟，然后于120℃下进行高压蒸气灭菌20分钟，急剧冷却至约35℃之后，得到DE3.2至20.5的液化溶液，向该溶液中按照每1g固态物2单位比例加入用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，和按照1g固态物20单位比例加入用实验7-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，然后于35℃反应24小时。于100℃下进行15分钟热处理，使酶失活。然后象实验1那样用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶处理，对残存的还原性寡糖进行水解，通过HPLC法对环状四糖进行定量。其结果如表20所示。
表20
就象表20的结果所表明的那样，在α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶催化下环状四糖的生成受到淀粉液化程度影响，液化程度越低，即DE值越低，由淀粉生成的环状四糖的产率越高，相反，液化程度越高，即DE值越高，由淀粉生成的环状四糖的产率越低。具体来说，淀粉部分分解的程度约在20以下，希望DE约12以下，更理想的是DE约为5以下合适。
实验17 淀粉部分分解物浓度的影响制备最终浓度为0.5％至40％的淀粉部分分解物『PINE-DEX#100』(DE约2至5)水溶液，分别向各溶液中按照每g固态物1单位比例加入用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，和按照每1g固态物10单位比例加入用实验7-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，两酶同时作用，于30℃、pH6.0反应48小时后，于100℃下进行15分钟热处理，使酶失活。然后象实验1那样用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶进行处理，对残存的还原性寡糖进行水解，通过HPLC法对环状四糖进行定量。其结果如表21所示。
表21
就象表21的结果所表明的那样，淀粉部分分解物的浓度在0.5％的低浓度下，环状四糖的生成量约为64％，而在浓度为40％的高浓度下，环状四糖的生成量约为40％，表明环状四糖生成量的变化依赖于底物淀粉部分分解物的浓度。从该结果可以判明淀粉部分分解物浓度越低，环状四糖的产量有越高的倾向。
实验18 环糊精葡聚糖基转移酶添加效果制备淀粉部分分解物『PINE-DEX#100』水溶液(浓度15％)，向该溶液中按照1g固态物1单位比例加入用实验7-2方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，按照1g固态物10单位比例加入用实验7-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，和按照1g固态物0至0.5单位比例加入来自嗜热脂肪芽孢杆菌的环糊精葡聚糖基转移酶(CGTase)，然后于30℃、pH6.0反应48小时后，于100℃下进行15分钟热处理，使酶失活。然后象实验1那样用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶进行处理，对残存的还原性寡糖进行水解，通过HPLC法对环状四糖进行定量。其结果如表22所示。
表22
就象表22的结果所表明的那样，由于添加CGTase，环状四糖的生成量增加。
实验19 环状四糖的制备将来自玉米的植物糖原(キュ-ピ-株式会社生产)的水溶液(约100L)调整到浓度4w/v％、pH6.0、30℃后，向该溶液中按照每1g固态物1单位比例加入用实验7-2方法得到的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶标准品，和按照每1g固态物10单位比例加入用实验7-3方法得到的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，作用48小时后，于100℃下进行10分钟热处理，使酶失活。取一部分该反应液，用HPLC研究环状四糖生成量，结果作为糖组成为约84％。将该反应液调到pH5.0、45℃后，象实验1那样用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶进行处理，对残存的还原性寡糖进行水解，再用氢氧化钠将pH调到5.8，温度调到90℃，保持1小时，使酶失活，通过过滤除去不溶物。使用逆渗透膜将该滤液浓缩到固态成分浓度约为16％后，然后用常规方法进行脱色、脱盐、过滤、浓缩，结果得到含有固态成分约3,700g的糖液约6.2kg。
将得到的糖液加到充填了オルガノ制造的离子交换树脂『アンバ-ライトCR-1310(Na柱)』的柱子(凝胶量约225L)，柱温60℃，流速45L/h的条件下进行层析分离。用实验1记载的HPLC法检测洗脱液的糖组成，回收纯度在98％以上的环状四糖级分，按照常规方法进行脱盐、脱色、过滤、浓缩之后，得到含有固态成分约2,500g的糖液约7.5kg。用HPLC法测定得到的糖液的糖组成，环状四糖的纯度约为99.5％。
实验20 由环状四糖水溶液进行结晶用蒸发仪将用实验19方法得到的纯度约为98％以上的环状四糖级分浓缩到固态物浓度约50％后，将该浓缩糖液约5kg装入圆筒状塑料容器中，通过一边慢慢旋转，一边经过约20小时将温度由65℃降到20℃，使晶体析出，得到白色的结晶状粉末。图25给出了1例该显微镜照片。然后用离心过滤器回收净制结晶状物，湿重为1,360g。再于60℃下干燥3小时，得到环状四糖结晶状粉末1,170g，用HPLC法测定得到的结晶粉末的糖组成，环状四糖的纯度约为99.9％以上的极高纯度。
用粉末X线衍射法对该环状四糖的结晶状粉末进行解析，就象如图26所示，得到特征为主要衍射角(2θ)为10.1°、15.2°、20.3°和25.5°的衍射谱。对于该结晶状粉末的水分用KarlFischer法进行测定，水分为13.0％，判明相当于1分子环状四糖含有5至6个分子水的结晶。
另外对该环状四糖的结晶粉末进行热重量测定，结果得到了图27所示的热重量曲线，由该重量变化和温度的关系，确认在温度上升至150℃时减少了相当于4至5分子水的重量，继续升温至250℃左右，减少了相当于1分子水的重量，另外从280℃左右可以观察到可认为是环状四糖本身的热分解导致的重量减少。由此可以判明含有5至6个水的结晶环状四糖通过在常压下，使其温度上升至150℃，每一结晶分子可以脱去4至5分子的水，变成含有1分子水的结晶，再进一步升温至250℃从结晶中又脱去1分子水，变成了无水结晶。
实验21 向含1个水的结晶环状四糖的转换将利用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖粉末装入玻璃容器中，将该玻璃容器于预先在140℃下保温的油浴中保持30分钟。用粉末X线衍射法对得到的环状四糖的粉末进行解析，与热处理前的含有5至6个水的结晶粉末X衍射完全不同，就象图28所示，得到特征为主要衍射角(2θ)为8.3°、16.6°、17.0°和18.2°的衍射谱。对于该结晶状粉末的水分用Karl Fischer法进行测定，水分约为2.7％，判明相当于1分子环状四糖含有1分子水的结晶。另外对该结晶粉末进行热重量测定后，得到了图29所示的热重量曲线，由该重量变化和温度的关系，可以确认在温度上升至270℃左右减少了相当于1分子水的重量，另外可以观察到从290℃左右开始认为是环状四糖本身的热分解的重量减少。由此可以判明该环状四糖结晶状物是含有1个水的结晶。
实验22 向无水结晶的转换将利用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖粉末在40℃乃至120℃分别进行16小时的真空干燥。对得到的结晶状粉末的水分用Karl Fischer法进行测定，真空干燥温度为40℃时，水分约为4.2％，真空干燥温度为120℃时，水分约为0.2％，判明实质上是无水的。用粉末X线衍射法对这些真空干燥的环状四糖的粉末进行解析，与真空干燥前的含有5至6个水的结晶粉末X衍射和含有1个水的结晶粉末X衍射完全不同，就象图30(真空干燥温度为40℃)、图31(真空干燥温度为120℃)所示那样，得到特征为主要衍射角(2θ)为10.8°、14.7°、15.0°、15.7°和21.5°的衍射谱。虽然能够看到两个衍射谱之间的峰强弱，但峰的衍射角基本上是同一的，从结晶学角度可以推测是同一无水结晶。另外，衍射谱的基线呈山状，与真空干燥前含有5至6个水的结晶环状四糖的谱图和含有1个水的结晶环状四糖的谱图相比结晶化程度低，判明存在着非结晶状态的环状四糖。由此推测，40℃真空干燥时含有约4.2％水分的环状四糖粉末是含有该水分的无水非结晶环状四糖和无水结晶环状四糖混合的粉末。由以上事实可知，通过对含有5至6个水的结晶环状四糖粉末进行真空干燥，含有5至6个水的结晶失去水分子，转换为无水非结晶和无水结晶。另外象实验20那样对水分为0.2％无水结晶环状四糖粉末进行热重量分析。就象图32所示那样，观察到认为从2 70℃左右开始的环状四糖本身热分解的重量减少。
实验23 环状四糖对水的饱和浓度为了研究环状四糖对10℃到90℃的水的饱和浓度，在带有密封栓的玻璃容器中加入10ml水，向其中加入用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖，加的量为在各个温度下完全溶解的量以上的量，然后将玻璃容器密封，于10℃至90℃下边保温，边搅拌2天，直至达到饱和。对各个温度下的环状四糖饱和溶液进行精密过滤，除去不溶的环状四糖后，用干燥减量法研究该滤液的水分，求各个温度下的饱和浓度。结果如表23所示。
表23
实验24 热稳定性将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖溶解于水，制备浓度为10w/v％的环状四糖水溶液，将其中的8ml溶液装入到玻璃试管中，密封后，于120℃加热30分钟至90分钟。放冷后，对这些溶液进行着色度的测定和用HPLC法的纯度测定。着色度通过1cm比色杯于480nm的吸光度进行评价。结果如表24所示。
表24
就象表24结果所表明的那样，环状四糖水溶液即使在120℃的高温加热下，也没有着色，糖组成的纯度也没有下降，判明环状四糖是对热稳定的糖。
实验25 pH稳定性将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖溶解于各种缓冲液(20mM)中，制备浓度为4w/v％、pH调到2至10的环状四糖溶液。分别将各个溶液8ml装入到玻璃试管中，密封后，于100℃加热24小时。放冷后，对这些溶液进行着色度的测定和用HPLC法的纯度测定。着色度通过1cm比色杯于480nm的吸光度进行评价。结果如表25所示。
表25
就象表25结果所表明的那样，环状四糖水溶液即使在120℃的高温加热24小时下，在pH2至10的广泛范围内也没有着色，在pH2糖组成的纯度虽然稍微有降低，但在pH3至10的范围内糖组成的纯度没有降低，判明环状四糖即使在很宽的pH范围内，换言之，即使在pH3至5的酸性区、pH6至8的中性区、pH9至10的碱性区也是非常稳定的糖。
实验26 羰氨反应将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖溶解于水，然后加入市售试剂特级甘氨酸和磷酸缓冲液，制备在50mM磷酸缓冲液中pH调到7.0的含有1w/v％甘氨酸的1ow/v％环状四糖溶液。将该溶液4ml装入到玻璃试管中，密封后，于100℃加热30至90分钟。于室内放冷后，对其着色度进行测定，研究羰氨反应性。着色度通过1cm比色杯于480nm的吸光度进行评价。结果如表26所示。
表26
就象表26的结果所表明的那样，环状四糖在甘氨酸共存条件下即使加热也没有着色，没有发生与甘氨酸的褐变，换言之，环状四糖是很难引起羰氨反应(也称之为美拉德反应)的稳定的糖。
实验27 羰氨反应将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖和市售蛋白胨(日本制药制造)溶解于去离子水中，制备含有5w/v％蛋白胨的10w/v％环状四糖溶液，将该溶液4ml溶液装入到玻璃试管中，密封后，于120℃加热30分钟至90分钟。于室内放冷后，对其着色度进行测定，研究羰氨反应性。同时将只含有蛋白胨的溶液作为对照同样进行加热，着色度根据1cm比色杯于480nm的吸光度减去空白的吸光度后的值进行评价。结果如表27所示。
表27
就象表27的结果所表明的那样，环状四糖在蛋白胨共存条件下即使加热也没有发生与蛋白胨的褐变，换言之，环状四糖是很难引起羰氨反应的稳定的糖。
实验28 包合作用将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖溶解于去离子水，制备20％水溶液。每100g该水溶液加入甲醇2g、乙醇3g、醋酸4.6g，进行包合。然后通过过滤，将滤液进行冷冻干燥，除去未包合物。作为对照，用已知具有包含能力的分支环糊精(商品名『インェリ-トP』マ ルハ株式会社销售)进行同样操作。
为了测定冷冻干燥粉末中的包合物量，将各个冷冻干燥粉末1g溶解于5ml水中，然后加入5ml乙醚进行萃取，再次进行反复萃取后，用气相层析法对乙醚中的萃取物进行定量。结果如表28所示。
就象表28的结果所表明的那样，环状四糖具有包合能力，其包合能力与分支环糊精相比，每单位重量大约高2倍。
实验29 甜度将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖溶解于去离子水，制备固形物浓度为10％水溶液，以该环状四糖10％水溶液作为基准，改变蔗糖(市售白砂糖)的浓度，用健康保健医生5名进行特殊感觉试验。试验结果表明环状四糖的甜度大约是蔗糖的20％。
实验30 消化性试验用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖根据『日本营养粮食学会志』、第43卷，第23至29页(1990年)记载的冈田等人的方法，研究试管内唾液淀粉酶、合成胃液、胰液淀粉酶、小肠粘膜酶对环状四糖的可消化性。作为对照，使用已知的难消化糖麦芽糖醇。结果如表29所示。
表29
就象表29所表明的那样，环状四糖完全不能被唾液淀粉酶、合成胃液、胰液淀粉酶消化，可被小肠粘膜酶少量消化，其消化程度为0.74％低值，如果与对照的难消化糖麦芽糖醇比较，为对照的1/5以下，说明环状四糖是非常难于消化的糖。
实验31 可发酵性试验用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖根据『Journal of Nutritional Science and Vitaminology』、第37卷，第529至544页(1991年)记载的Oku等人的方法，研究大鼠盲肠内容物对环状四糖的可发酵性。盲肠内容物使用在乙醚麻醉下屠杀wister系雄性大鼠，于厌氧条件下采集，悬浮于4倍量的0.1M碳酸氢钠水溶液中的物质。每单位重量的盲肠内容物添加约7％的环状四糖，用气相层析法对刚添加后以及12小时后残存的环状四糖进行定量。结果表明，作为对照，刚添加后每g盲肠内容物的环状四糖浓度为68.0mg、12小时后每g盲肠内容物的环状四糖浓度为63.0mg，93％都没有发酵，表明环状四糖是难于发酵的糖。
实验32 可消纳性试验用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖根据『肠内フロ-ラ和食物因子』、光冈知足编、学会出版中心(1984年)记载的方法，研究各种肠内细菌的可消纳性。即，将预先培养的新鲜菌接种于添加了环状四糖0.5％的PYF培养基5ml中约107CFU，在厌氧条件下于37℃培养4天。作为对照，使用容易被消纳化的葡萄糖进行。消纳性的判定为，培养后的培养液的pH在6.0以上时，作为没有被消纳(-)，不到6.0时作为被消纳(+)。用蒽酮法测定残存在培养液中的糖，研究糖的减少量，确认消纳性的判定。结果如表30所示。
表30
就象表30结果所表明的那样，试验的肠内细菌无论哪一种都不能消纳环状四糖，但作为对照的葡萄糖无论哪-种细菌都能消纳，由此判明环状四糖是难于消纳的糖。
实验33 急性毒性试验使用小鼠，将用实验20方法得到的含有5至6个水的结晶环状四糖经口给药进行急性毒性试验。结果表明，环状四糖是低毒性物质，即使可喂入的最大量也没有看到死亡例。因此虽然不能说正确的值，但其LD50值在50g/kg小鼠体重以上。
从以上的实验30至33的结果可以看到，环状四糖即使经口摄入，由于难于消化、吸收，作为无热量乃至低热量的可食用原料有望用作减肥甜味料、高甜度甜味料的赋形剂、减肥食物的增粘剂、增量剂、赋形剂以及用作食物纤维、脂肪替代食品材料等。
实验34 非还原糖引起的脱水量的大小和脱水物品粉末化的比较实验实验用的非还原性糖是无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖、无水非结晶环状四糖、含5至6个水结晶环状四糖、无水结晶α，α-海藻糖、无水非结晶α，α-海藻糖以及含2个水的结晶α，α-海藻糖。含5至6个水的结晶环状四糖用实验20的方法制备。无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖分别用实施例A-1、实施例A-2以及实施例A-3的方法制备。含2个水的结晶α，α-海藻糖使用市售的产品(商品名『トレハ』、株式会社林原商事销售)。无水结晶α，α-海藻糖、无水非结晶α，α-海藻糖用特开平6-170221号公报参考例1和参考例3公布的方法由市售含2个水的结晶α，α-海藻糖制备。
将11重量份至16重量份的上述的糖与含水量约77％的4重量份普通酸乳混合得到的混合物装入桶里，于室内25℃静置24小时后，观察该混合物的状态变化。其判定按照充分脱水固化、经切削机切成粉末容易的情况作为○，脱水由于略微不充分，虽然固化，但用切削机加工成粉末困难情况作为△，脱水不充分而没有固化，切削机不能加工成粉末的情况作为×。结果如表31所示。
表31
由表31的结果可以判明，无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖可以固化到重量份比无水结晶α，α-海藻糖、无水非结晶α，α-海藻糖还少，利用切削机容易加工成粉末。另外得到的粉末的性状优良。从该结果可以判明无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖是具有脱水能力的环状四糖，适合作为脱水剂，特别是无水结晶环状四糖和无水非结晶环状四糖脱水能力更优越。
实验35 具有脱水能力的环状四糖的脱水作用就无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖、无水非结晶环状四糖以及含5至6个水的结晶环状四糖的脱水作用、具体来说，对糖的吸水量和其随时间的变化进行详细实验。在比较实验中作为糖使用无水结晶α，α-海藻糖、无水非结晶α，α-海藻糖以及含2个水的结晶海藻糖。实验对用实验34叙述的方法制备的各个环状四糖以及α，α-海藻糖进行分子筛分级，做成粒径约100至150μm的粉末品，各取1g放入直径5cm的塑料皿中，放入到相对湿度调整到60％或75％的干燥器内，于25℃的环境下放置1周，随时用KarlFischer法测定糖中含有的水分(％)。结果如表32所示。
表32
-没有试验。
从表32结果可以看到，在相对湿度60％下放置时，含1个水的结晶环状四糖以及含5至6个水结晶环状四糖放置1周后几乎都看不到吸水，无水结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖在第1天吸水量几乎达到饱和。如果是无水结晶环状四糖，吸水量大约是其重量的约10％，而如果是无水非结晶环状四糖大约是其重量的14％。将放置1周后的各个样品用粉末X线衍射法进行解析，结果表明主要的衍射角表现出与各自放置前的样品相同的衍射图，结晶型看不到变化。相对湿度在60％以下，虽然吸入水分，但不是以结晶水吸入的。
若是在相对湿度75％下放置时，无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖，与无水结晶α，α-海藻糖以及无水非结晶α，α-海藻糖同样在放置1天后吸水量基本达到饱和。此时的吸水量无论哪种环状四糖都大约是其重量的14％，而α，α-海藻糖的吸水量大约不到其重量的10％，由此判明环状四糖脱水能力更强。另外无论哪种样品都能维持粉末状态，看不到由于吸湿造成的粘糊，或流动的现象。进而对放置1周后的无水结晶环状四糖、含1个水的结晶环状四糖以及无水非结晶环状四糖用粉末X线衍射法进行解析，结果表明主要的衍射角表现出与各自放置前的样品不同的衍射图，无论哪一种都与含5至6个水结晶环状四糖的衍射图一致。这表明相对湿度在75％以上时，水分是以结晶水吸入，转换为含5至6个水结晶环状四糖。
象上述那样具有优良脱水能力的本发明的环状四糖作为食品、药品、化妆品、它们的原材料或加工中间物等含水物的强力脱水剂可以有效利用。
实验36 无水结晶环状四糖和含5至6个水结晶环状四糖对糊化淀粉的微生物污染的效果比较4重量份糯米粉溶于6重量份的水中，然后浇注到铺有湿抹布的木制砂箱中，然后于105℃下蒸发10分钟，做成糊化淀粉。使其与6重量份的用实验20的方法制备的含5至6个水的结晶环状四糖或实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖，通过搅拌机混合，搅拌均一后，再加2重量份糖稀，充分揉和使其成形，再于40℃的温风轻轻干燥2小时，得到皮糖样点心。
将本品于25℃的室温开放放置时，使用了含5至6个水的结晶环状四糖的点心15天后看见有黑霉菌落发生，使用无水结晶环状四糖的点心即使放置30天后也没有看到微生物污染。
将30天后的点心切开，观察其断面发现使用无水结晶环状四糖的点心虽然表层稍微有些硬化，正在析出结晶，但内部与刚制造后一样是半透明而且具有适度光泽、粘度。表层的结晶由X线衍射图判明是无水结晶环状四糖变换为含5至6个水的结晶环状四糖的结晶。
该结果表明，具有脱水能力的环状四糖起到糊化淀粉脱水剂的作用，可以防止微生物污染，还防止糊化淀粉老化。该性质在制造皮糖样点心、使用面粉面团等糊化淀粉的各种制品中可以有效利用。
以下通过实施例A和实施例B分别具体地叙述本发明的具有脱水能力的环状四糖及其用途。
实施例A-1 无水结晶环状四糖的制造方法根据实验6的方法，将圆孢芽孢杆菌C11(FERM BP-7144)于发酵灌中培养48小时。培养后，使用SF膜进行除菌过滤，回收约18L培养滤液，再用UF膜将滤液浓缩，回收含有9.0单位/ml的α-异麦芽糖基葡糖基生成酶和30.2单位/ml的α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶液约1L。将木薯淀粉做成浓度约为25％的淀粉乳，然后按照每克淀粉固态物加0.2％比例加入α-淀粉酶(商品名『ネオスピダ-ゼ』、NAGASE生物化学工业株式会社制造)，于85至90℃反应约20分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约35℃，得到DE约4的液化溶液，按照每1g淀粉固态物加0.25ml比例向液化溶液中加入用上述方法制备的含α-异麦芽糖基葡糖基生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶液，再加入环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，使每1g淀粉固态物为10单位，于pH6.0、35℃下反应48小时。将该反应液于95℃下保存30分钟后，调整到pH5.0、50℃后，按照每1g固态物300单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶「AMAN0」』、天野株式会社制造)，反应24小时，再按照每1g固态物30单位比例加入葡萄糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』NAGASE生物化学工业株式会社制造)，反应17小时，将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，利用常规方法将冷却、过滤后得到的滤液进行活性炭脱色、通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐纯化，进一步浓缩之后得到单位原料淀粉固形物含有浓度为60％的环状四糖的糖浆，收率约90％。将含有该环状四糖的糖浆按照实验19记载的方法加到充填了强酸性阳离子交换树脂的柱(凝胶量225升)(商品名『アンバ-ライトCR-1310(Na型)』、オルガノ株式会社制造)上，将柱温维持在60℃，用流速约45L/h的条件进行层析分离。用实验1记载的HPLC法对洗脱液的糖组成进行检测，收集高含有环状四糖的级分，进行纯化，得到收率相当于原料淀粉固形物收率约21％的环状四糖高含量溶液。该高含量溶液含有相当于固态物约98％的环状四糖。将该溶液浓缩到浓度约为90％后，加入到结晶罐中，作为种晶加入无水结晶环状四糖约2％，于120℃下维持16小时，进行真空干燥，得到水分约为0.2％的无水结晶环状四糖粉末。该产品具有强力脱水能力，作为脱水剂可以在含水物，例如食品、化学品、医药品和其原料、中间产品等含水物的脱水方法中有效利用。
实施例A-2 含1个水的结晶环状四糖的制造方法将玉米淀粉做成浓度约为20％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸钙，将pH调整到6.5，按照单位淀粉固态物加0.3重量％比例加入α-淀粉酶(商品名『グ-マミ-ル60L』、ノボ公司制造)，于95℃反应约15分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约35℃，得到DE约4的液化溶液，按照每g淀粉固态物0.25ml比例向液化溶液中加入含α-异麦芽糖基葡糖基生成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶液，再加入环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，使每1g淀粉固态物达到10单位比例于pH6.0、35℃下反应48小时。将该反应液于95℃下保存30分钟后，调整到pH5.0、50℃后，按照每1g固态物300单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶「AMANO」』、天野制药株式会社制造)，反应24小时，再按照每1g固态物30单位比例加入葡萄糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』NAGASE生物化学工业株式会社制造)，反应17小时，将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，利用常规方法将冷却、过滤后得到的滤液用活性炭进行脱色、通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐纯化，进一步浓缩之后得到含有浓度为60％的环状四糖的糖浆，收率相当于原材料淀粉固态物的约90％。按照实施例A-1记载的方法进行层析分离，收集环状四糖纯度在98％以上的级分。将该级分利用实验20的方法用蒸发器浓缩至浓度约为50％后，将该浓缩糖液约5kg加入到圆筒状塑料容器中，一边稳稳的旋转，大约经过20小时，通过将温度从65℃下降到20℃，使结晶析出，得到含5至6个水结晶环状四糖粉末。将该粉末加入到玻璃容器中，然后使该玻璃容器于预先在140℃下保温的油浴中保持30分钟。得到的干燥物用粉碎机粉碎，得到水分约为2.7％的含1个水结晶环状四糖粉末。该产品具有强力脱水能力，作为脱水剂可以在含水物，例如食品、化学品、医药品和其原料、中间产品等含水物的脱水方法中有效利用。
实施例A-3 无水非结晶环状四糖的制造方法将根据实施例A-1记载的方法得到的环状四糖的纯度在98％以上的级分按照常规方法进行脱盐、脱色、过滤之后，将其浓度调整到50％。然后于-80℃中急速冷冻后，对该冷冻物进行冷冻真空干燥，再于80℃下真空干燥3小时，得到的干燥物用粉碎机粉碎，得到水分约为0.3％的无水非结晶环状四糖粉末。该粉末的X线衍射图如图33所示。该产品具有强力脱水能力，作为脱水剂可以在含水物，例如食品、化学品、医药品和其原料、中间产品等含水物的脱水方法中有效利用。
实施例A-4 由6-α-葡糖基麦芽糖制造无水结晶环状四糖的制造方法将由淀粉制造的6-α-葡糖基麦芽糖(株式会社林原生物化学研究所制造)的水溶液(约100L)调整到浓度为4w/v％、pH6.0、温度为30℃后，按照每1g 6-α-葡糖基麦芽糖2单位比例加入用实验7的方法得到的纯化α-异麦芽糖基转移酶标准品，作用48小时后，于100℃下进行10分钟热处理，使酶失活。取其反应液一部分，用HPLC检测环状四糖生成量，其糖组成约为44％。将该反应液调整到pH5.0、45℃后，按照每1g固态物1500单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶「AMANO」』、天野制药株式会社制造)，再按照每1g固态物75单位比例加入葡萄糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』NAGASE生物化学工业株式会社制造)，反应24小时，对残存的还原性寡糖等进行水解，再用氢氧化钠调整到pH5.8，于90℃下保持1小时，使酶失活，通过过滤除去不溶物。使用逆渗透膜将该滤液浓缩到固态成分浓度约16％后，然后用常规方法进行脱色、脱盐、过滤、浓缩之后，得到含有固态成分约3,650g的糖液约6.1kg。用实施例A-1记载的方法对得到的糖液进行层析分离，回收环状四糖纯度在98％以上的级分，然后用常规方法进行脱色、脱盐、过滤、浓缩之后，得到含有固态成分约1,000g的糖液约3kg。用HPLC法测定得到的糖液的糖组成，环状四糖的纯度约为99.2％。用蒸发仪将得到的环状四糖水溶液浓度浓缩到约50％后，将得到的浓缩糖液约2kg装入圆筒状塑料容器中，通过一边缓慢旋转，一边经过约20小时将温度由65℃降到20℃，使晶体析出，进行干燥，得到含5至6个水的结晶环状四糖。将得到的含5至6个水的结晶环状四糖进一步于120℃下真空干燥16小时，得到水分约为0.2％的无水结晶环状四糖。该产品具有强力脱水能力，作为脱水剂可以在含水物，例如食品、化学品、医药品和其原料、中间产品等含水物的脱水方法中有效利用。
实施例B-1 脱水剂使用用实施例A-1方法得到的无水结晶环状四糖粉末，装入纸制透湿性小袋中，每袋15g，制造脱水剂。本品作为装入调味海苔、饼干等干燥食品的防湿容器内环境的脱水剂可以有效利用。另外对于各种干燥食品、油性食品等，与本脱水剂一起合用脱氧剂也可以有效实施稳定保存这些食品等。
实施例B-2 加入脱水剂的砂糖向50重量份的砂糖中添加1重量份的利用实施例A-4方法得到的无水结晶环状四糖粉末，将用高速旋转搅拌器混合后得到的混合物装入聚乙烯袋中，每袋装1kg，对脱气后的聚乙烯袋进行热封，制备加入脱水剂的砂糖。本品由于本发明的脱水剂吸收砂糖微细结晶表面的水分，防止砂糖粘合和固结，所以可以稳定地保存。另外本品作为调味料可以在各种烹调、加工食品的制造等中有效利用。
实施例B-3 加入脱水剂的食盐向100重量份的食盐中添加1重量份的利用实施例A-1方法得到的无水结晶环状四糖粉末，将用高速旋转搅拌器混合后得到的混合物装入聚乙烯袋中，每袋装1kg，对脱气后的聚乙烯袋进行热封，制造加入脱水剂的食盐。本品由于本发明的脱水剂吸收食盐微细结晶表面的水分，防止食盐粘合和固结，所以可以稳定地保存。另外本品作为调味料可以在各种烹调、加工食品的制造等中有效利用。
实施例B-4 蓬松皮糖状点心将4重量份的粘糕粉溶在6重量份的水中，然后浇注到铺有湿抹布的木制砂箱中，然后于100℃下蒸发20分钟后，揉进6重量份的利用实施例A-1得到的无水结晶环状四糖粉末和1重量份的砂糖，然后再加入2重量份的糖烯，充分揉和后进行成形，再于室内放置16小时，使本品表层的无水结晶环状四糖转换为含5至6个水的结晶环状四糖，然后轻轻地加上卷，将卷表面割开一个口，得到蓬松风味的皮糖状点心。本品风味良好，而且不容易受到微生物污染，可以长期维持高品质。
实施例B-5 甘薯点心将甘薯切成厚约1cm的片，将其蒸后放冷，然后撒满用实施例A-3方法制备的无水非结晶环状四糖粉末，使撒的糖转换为含5至6个水的结晶环状四糖，进行脱水，制造表面上粘着含5至6个水的结晶环状四糖的甘薯。
实施例B-6 奶油粉末将3重量份的用实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖粉末与1重量份鲜奶油混合后移到桶中，放置2天后，转换成含5至6个水的结晶环状四糖，制成块。用切削机将块加工成粉末，进行分级之后得到风味良好的奶油粉末。本品是风味良好的奶油粉末，对于带有咖啡、红茶味，另外作为预混合、冷糕点、蛋糕、糖果等的制点心材料、用管饮用的流食等治疗用营养剂等有效利用。
实施例B-7 白兰地粉末将10重量份的出芽短梗孢糖与2重量份白兰地混合，然后与7重量份的用实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖粉末后移到桶中，放置2天后，转换成含5至6个水的结晶环状四糖，制成块。用切削机将块加工成粉末，进行分级之后得到风味良好的白兰地粉末。本品含在口中，有适度的甜味，是白兰地香充分的粉末香料。本品作为红茶用香料，另外作为预混合、糖果类等的制点心材料等有效利用。另外将本粉末经颗粒成形机，压片机成形，作为颗粒、片剂利用也可有效实施。
实施例B-8 粉末豆酱将4重量份的用实施例A-2方法制备的含1个水结晶环状四糖粉末与2重量份红豆酱混合，浇注到设计成多个半球状凹部的金属板中，然后于室温下静置过夜，进行固化，脱模后，得到每个约4g的固体豆酱，然后经粉碎机粉碎，得到粉末豆酱。本品作为方便面、即食饮料等的调味料可以有效利用。另外，固体豆酱不仅可以用作固体调味料。而且也可以用于豆酱点心等。
实施例B-9 粉末酱油一边使3.5重量份的用实施例A-3方法制备的无水非结晶环状四糖粉末和0.02重量份的用实验20的方法得到的含5至6个水的结晶环状四糖在传送带上流动，一边喷雾淡酱油使比例为1重量份，然后移送到熟成塔，于30℃下放置过夜，使无水非结晶环状四糖变换为含5至6个水的结晶环状四糖，得到粉末酱油。本品作为方便面、即食饮料等的调味料可以有效利用。
实施例B-10 蛋黄粉将从鲜蛋制备的蛋黄用板式加热杀菌机于60至64℃下进行杀菌，对得到的1重量份的液体状蛋黄与3.5重量份的用实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖粉末混合后，与实施例B-7同样制成块，加工成粉末后，得到蛋黄粉。本品不仅作为预混合、冷糕点、乳化剂等的制点心材料，也可作为用管饮用的流食等断乳食品、治疗用营养剂等有效利用。另外，作为美肤剂、育发剂等也可有效利用。
实施例B-11 酸乳粉使3.6重量份的用实施例A-3方法制备的无水非结晶环状四糖粉末和1重量份的普通酸乳混合后，象实施例B-7那样制成块，加工成粉末后，得到酸乳粉。本品不仅风味良好，而且可以长期稳定保持乳酸菌存活的状态，另外不仅作为预混合、冷糕点、乳化剂等制点心材料，而且作为口服流食、用管饮用的流食等的断乳食、治疗用营养剂等，另外，例如在人造乳酪、掼奶油、膏、干酪饼干、果冻等含有乳酪风味的制品等的制作中可以有效利用。另外，将本粉末经颗粒成形机，压片机成形，做成乳酸菌制剂，用作整肠剂等也可有效实施。
实施例B-12 热饼混合料200重量份的小麦粉与60重量份用实施例B-10的方法得到的蛋黄粉，25重量份黄油、10重量份砂糖、12重量份的发酵粉以及0.5重量份食盐混合之后，得到热饼混合料。本品通过用水、牛奶等溶后烤制，可以很简单地制作风味良好的热饼。
实施例B-13 药用人参提取物粉末将1.2重量份的用实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖粉末与0.5重量份的药用人参提取物混揉后，象实施例B-7那样制成块、加工成粉末后得到药用人参提取物粉末。将本品与适量的维生素B1和维生素B2粉末一起加到颗粒成形机，做成含有维生素的颗粒状药用人参提取物粉末。本品作为消除疲劳剂、强壮、强精剂等可以有效利用。另外也可以作为育发剂有效利用。
实施例B-14 蜂胶提取物粉末用95v/v％乙醇水溶液按照常规方法对蜂胶进行萃取，然后将残渣用少量水洗净，得到的洗液和萃取液合并，得到含有蜂胶粗提取物的80v/v％乙醇(固态物约为20w/w％)水溶液，然后向该水溶液中加水使乙醇浓度降低到50v/v％之后，于50℃下保持1小时，使溶液形成含有蜂胶有效成分的上层和粘性沉淀物的下层，于室温放置过夜，分离回收上层，得到的色调、香味、抗菌作用好的液体状精制蜂胶萃取液相对于含有粗萃取物的粗萃取液其收率大约相当于固态物的48％。将1重量份的该精制蜂胶萃取液对10重量份的用实施例A-1方法制备的无水结晶环状四糖粉末进行喷雾混合，再进行干燥，得到风味良好的蜂胶提取物粉末。本品不仅作为抗菌剂、抗氧化剂、抗炎症剂、免疫调节剂、巨噬细胞激活剂等直接利用，也可以与其他适宜的材料配合，在食物、抗感染药、化妆品等中有效利用。
实施例B-15 日本植物提取物粉将蓼(タデ)科一年生草本植物アイ(学名「ポリゴナム·テインクトリウム」)的地上部分30kg破碎后，用90v/v％乙醇水溶液按照常规方法进行萃取，然后将残渣用少量水洗，得到的洗液和萃取液合并，得到含有蓼粗提取物的水溶液，然后向该水溶液中加水使乙醇浓度降低到50v/v％。将12重量份的用实施例A-2方法制备的含1个水的结晶环状四糖与1重量份的该粗萃取液混合后，移到桶中，放置2天之后转换为含5至6个水的结晶环状四糖，制成块状。该块经切削机加工成粉末，进行分级，得到蓼提取物粉。本品具有抗菌作用、抗病毒作用、抗肿瘤作用、捕获自由基作用、细胞程序死亡(アポト-シス)调节作用、细胞因子调节作用等多种生理作用，作为配合食品、化妆品以及药品的生药可以有效利用。
实施例B-16 中国芹菜提取物粉末用水将水芹科植物中国芹菜(英文名コリアンダ-，分类コェンドロ属)的地上部分用水洗，除去水后，用捣碎机细细捣碎。回收用离心分离器通过150(筛)号的捣碎的中国芹菜提取液，于121℃下处理10分钟，得到固态物含量为60mg/ml的中国芹菜提取液。将9重量份的用实施例A-4方法得到的无水结晶环状四糖与1重量份的该提取液混合后，移到桶中，放置2天之后制成转换成含5至6个水的结晶环状四糖块。该块经切削机加工成粉末，进行分级，得到中国芹菜提取液粉末。本品具有抑制铅等金属的沉积的作用，可以直接或配合食品或药品有效利用。
实施例B-17 蜂王浆粉末将7重量份的用实施例A-1方法得到的无水结晶环状四糖与1重量份的未加工的巴西产蜂王浆混合后(水分65重量％)，移到桶中，放置2天之后制成转换成含5至6个水的结晶环状四糖块。该块经切削机加工成粉末，得到蜂王浆粉末。该粉末再经通过100号(筛)进行分级，使用压片机进行压片，制造每片为300mg的片剂。本品具有强壮作用、细胞活化作用，而且可以于常温下长期保存容易劣化的冻胶。另外由于可以改善风味，表现出柔和的甜味和适度酸味，所以可以作为日常使用的健康食品有效利用。
实施例B-18 流食用固态制剂制备由400重量份的用实施例A-1方法得到的无水结晶环状四糖粉末、270重量份的用实施例B-7方法得到的蛋黄粉、209重量份的脱脂奶粉、4.4重量份的氯化钠、1.85重量份氯化钾、0.01重量份的硫胺素、0.1重量份的L-抗坏血酸钠、0.6重量份的维生素E醋酸酯和0.04重量份的烟酰胺组成的配合物，将每25g的该配合物装到防湿层压小袋中，热封之后，制造流食用固态制剂。
本固态制剂能降低小袋中气体环境的水分，不需要低温储藏，可于室温下长时间稳定。另外对水的分散、溶解良好。本固态制剂一袋可溶解于约150至300ml水中，做成流食，用于经口、或通过管向鼻腔、胃、肠等喂食。
实施例B-19 药用片状制剂向新生苍鼠注射用众所周知方法从兔制备的抗血清，在使苍鼠的免疫反应变弱后，将BALL-1细胞移植到其皮下，然后用通常的方法饲养3周。将皮下生成的肿瘤摘出，切碎，使其分散于生理盐水中，打散。将得到的细胞用没有添加血清的PRMI 1640培养基(pH7.2)洗，悬浮于同样的培养基中，使其浓度约为2×106个/ml，保持在35℃下。
然后按照200IU/ml的比例加入部分纯化的人干扰素-α，保持约2小时后，再按照约300红血球凝集效价/ml的比例添加仙台病毒，保持20小时，诱导人干扰素-α。然后于约4℃、约1,000g进行离心分离，除去沉淀物，得到的上清再经精密过滤，将该滤液按照众所周知的方法加到固定了抗人干扰素-α抗体的柱子上，除去非吸附级分后，对该吸附级分进行洗脱，得到经膜浓缩后浓度约为0.001w/v％、比活约为2×108IU/mg的蛋白质浓缩液，每只苍鼠的收率约4ml。
将用实施例A-1的方法得到的无水结晶环状四糖1kg加工成粉末，过150号(筛)，然后将先前得到的干扰素-α浓缩液0.25ml(约1×106IU)稀释到100ml蒸馏水中后，边喷雾边使他们均匀混合，按照常规方法用压片机制造每片300mg(150IU/片)的片剂。本制造方法只是通过将含有干扰素-α溶液喷雾到无水结晶环状四糖粉末，使其脱水，进而均匀混合，对干扰素-α的稳定也是有效果的。
本品由于易溶于水，可以用作抗病毒制剂、抗肿瘤制剂、抗风湿病制剂、抗免疫疾病制剂等抗敏感性疾病制剂内服剂、口腔用制剂。另外在检查用的试验药中使用也可有效实施。
实施例B-20 药用颗粒状制剂将来自人的淋巴细胞母细胞BALL-1细胞接种到补充了20％胎牛血清的Eagle的最少基本培养基(pH7.4)，在37℃按照常规方法于生物体外(in vitro)进行悬浮培养。将得到的细胞用没有添加血清的Eagle最少基本培养基(pH7.4)洗，悬浮于同样的培养基中，使其浓度约为1×107个/ml。按照每ml约1,000红血球凝集效价比例向该悬浮液添加仙台病毒，于38℃下保持1天，诱导肿瘤坏死因子-α生成。将其于4℃、约1,000g条件下进行离心分离，得到的上清用pH7.2、含有0.01M磷酸盐缓冲液的生理盐水透析15小时，再进行精密过滤，将得到的滤液按照常规方法加到抗干扰素-α抗体的柱子上，非吸附级分通过使用抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的凝胶柱进行纯化、浓缩之后，得到浓度约为0.01w/v％、比活约为2×106JRU/mg的蛋白质浓缩液。活性收率为1升诱导生成时的悬浮液约5×104JRU。
将用实施例A-1的方法得到的无水结晶环状四糖1kg加工成粉末，过150号(筛)，然后将先前得到的肿瘤坏死因子-α浓缩液0.5ml(约1×105JRU)稀释到100ml蒸馏水中后，边喷雾边使他们均匀混合，按照常规方法用颗粒成形机制造颗粒状的肿瘤坏死因子-α制剂(约100JRU/克)。本制造方法只是通过将含有肿瘤坏死因子-α溶液喷雾到无水结晶环状四糖粉末，使其脱水，再均匀混合，对肿瘤坏死因子-α的稳定也有效果。
本品由于易溶于水，可以用作抗病毒制剂、抗肿瘤制剂、抗风湿病制剂、抗免疫疾病制剂等抗敏感性疾病制剂内服剂、口腔用制剂。另外在检查用的试验药中使用也可有效实施。
实施例B-21 外伤治疗用膏药将50重量份的溶解了3重量份碘的甲醇加到400重量份的用实施例A-1的方法得到的无水结晶环状四糖后，进行混合，再加入200重量份的10％出芽短梗孢糖水溶液以及50重量份的麦芽糖含水结晶，进行混合，于室温下放置过夜，使其转换为含5至6个水的结晶环状四糖，得到表现出适度延展、粘性的外伤治疗膏药。
本品或涂于创面，或通过涂到纱布、油纸等上面后使用，可以治疗割伤、擦伤、烧伤、由于水中小虫引起的渍伤等外伤。
就象上述表明那样，本发明涉及到以非还原性环状四糖作为有效成分的脱水剂，通过使具有脱水能力的环状四糖封入例如干燥食品等的防湿容器内，使气体介质含有的水分降低情况，另外在例如使食品、药品、化妆品、工业化学品、这些原材料和加工中间物等各种含水物的水分降低情况等可以有效利用。使具有脱水能力的环状四糖转换为含5至6个水的结晶环状四糖进行脱水，实质上使水分降低的本发明的方法由于不需要加热干燥等苛刻条件，可以使各种含水物、例如风味、香味容易劣化的食品、容易随着有效成分的分解、活性降低的药品等品质不降低，而且容易制造高品质的脱水物品。另外得到的脱水物品可以防止微生物污染、水解、酸败、褐变等变质、劣化，可以长期稳定维持该商品的寿命。
本发明是具有如此显著作用效果的发明，是对该领域的贡献的确具有重大的意义的发明。
序列表<110>Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo<120>脱水剂和使用该脱水剂的含水物的脱水方法，以及利用该方法得到的脱水物品<130>WO880<150>JP 010,991/01<151>2001-1-19<160>10<210>1<211>9<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>1Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu I1e1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>2Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>3Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly1 5 10<210>4<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌
<400>4I1e Asp Gly Val Tyr His Ala Pro1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>5Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>6Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>7Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>8Gly Asn Glu Met Arg Asn Gin Tyr1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>9
Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>10Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser1 权利要求
1.一种脱水剂，其以具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖为有效成分。
2.权利要求1记载的脱水剂，其特征是具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖是从无水结晶、含1个水的结晶和无水非结晶选择出来的具有脱水能力的糖。
3.权利要求2记载的脱水剂，其特征是具有环{→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)结构的无水结晶是使水分低于15w/w％的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖的糖浆在有种晶共存情况下，维持在50℃至180℃的温度范围，使该无水结晶结晶析出，然后收集的结晶。
4.权利要求2记载的脱水剂，其特征是含1个水结晶为对具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖的糖浆或含有5至6个水的结晶进行干燥之后收集的结晶。
5.权利要求1至4中任一项记载的脱水剂，其特征是具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的糖是来自淀粉的糖。
6.含水物的脱水方法，其特征是使含水物含有、接触或共存权利要求1至5中任一项记载的脱水剂。
7.权利要求6记载的脱水方法，其特征是通过对含水物进行脱水，可以生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)结构的糖的含有5至6个水的结晶。
8.权利要求6或7记载的脱水方法，其特征是使1重量份含水物含有、接触或共存权利要求1至5中任一项记载的脱水剂0.001至200重量份范围。
9.权利要求6、7或8记载的含水物的脱水方法，其特征是含水物含有糊化淀粉、醇、油溶性物质或生理活性物质。
10.脱水物品，其是使含水物含有、接触或共存权利要求1至5中任一项记载的脱水剂得到的。
11.权利要求10记载的脱水物品，其特征是脱水物品是食品、药品、化妆品、它们的原材料或加工中间物。
全文摘要
以非还原性糖的无水物作为脱水剂，不引起品质劣化对含水物进行脱水作为课题，提供以环状四糖作为有效成分的脱水剂以及使含水物含有、接触或共存为特征的含水物的脱水方法、以及用该方法得到的脱水物品。
文档编号C07H3/06GK1487854SQ02803888
公开日2004年4月7日 申请日期2002年1月17日 优先权日2001年1月19日
发明者久保田伦夫, 之, 西本友之, 温, 阿贺创, 福田惠温, 雄, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所