免疫增强剂的制作方法

专利名称：免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有特定的肽构成的免疫增强剂。
背景技术：
牛乳本身是营养源，被广泛饮用。另外，牛乳中存在的蛋白质酪蛋白由于其消化性和由其中摄取的必需氨基酸平衡性良好，一直被作为育儿用配制乳和特殊配制乳的蛋白质源利用。
酪蛋白大多含有磷酸丝氨酸这样的氨基酸残基，该残基具有通常的蛋白质中较少存在的磷酸基。用酶消化酪蛋白，将富含该磷酸丝氨酸残基的部分分离、纯化后的产物是酪蛋白磷酸肽(以下简称为“CPP”)。
已知CPP可以保持在小肠中不溶解的钙处于可溶解状态，具有促进钙的吸收的作用，作为各种食品或饲料原料已得到应用。另外已知CPP在培养细胞系或动物的消化道中具有促进产生免疫球蛋白A的作用(例如Milk Science vol.49(2000)，pp73-79和Food and AgriculturalImmunology，12(2000)，pp165-173)。
CPP是酶分解酪蛋白的产物，因此其抗原性与酪蛋白相比较为低，但并未完全消失。因此，对牛乳酪蛋白有变应性者如果为了增强免疫而摄取CPP，则可能会引发变态反应。
另外CPP例如已在WO96/29340号公报中记载。其中公开了CPP促进小肠中的矿物质吸收，但并未就其免疫增强活性有任何阐述。
发明概述本发明人发现来源于酪蛋白的肽中，具有含多个磷酸丝氨酸的特定氨基酸序列的肽显示了优异的免疫增强作用。这样的肽即使是比较小的分子量，也显示出优异的免疫增强作用。本发明基于该认识而完成。
因而，本发明的目的在于提供具有特定的氨基酸序列、且免疫增强活性优异的肽，和含有这样的肽而构成的免疫增强剂。
本发明的免疫增强剂含有由下述氨基酸序列(I)构成的肽。
Q1-SerP-X-SerP-Q2 (I)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1和Q2其中一方或双方不存在、或者分别独立表示1个以上任意的氨基酸残基]。
另外，本发明的肽由下述氨基酸序列(Ia)构成。
Q1-SerP-X-SerP-Q2 (Ia)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1表示0～14个任意的氨基酸残基，Q2表示0～8个任意的氨基酸残基，(Q1的氨基酸残基数为14，且Q2的氨基酸残基数为8的情形除外)]。
由本发明的氨基酸序列(I)构成的上述肽优选具有免疫增强活性。
本发明的免疫增强剂具有优异的如脾细胞的促细胞分裂原活性和增强免疫球蛋白产生活性的免疫激活作用。另外，由本发明的免疫增强剂中含有的氨基酸序列(I)构成的肽是具有包含多个磷酸丝氨酸的小分子量的有免疫增强作用的肽。这与现有的、被认为有免疫增强活性的分子量为3000～5000左右的CPP相比，明显地是不同的物质。因此，由本发明的氨基酸序列(I)构成的肽具有优异的免疫增强作用，同时与使用酪蛋白和CPP的情形相比，引起的牛乳过敏反应会大幅降低，或者不引起变应反应。即本发明的免疫增强剂在安全性上是优异的。
本发明的免疫增强剂作为提供免疫增强作用的食品原材料或药物原材料，对免疫机能较弱者有效。例如，通过将本发明的免疫增强剂给予婴儿，可以增强免疫。出生后不久的婴儿是通过来自母乳的转移抗体来避免感染的。母乳中的转移抗体主要是免疫球蛋白A。因此不能给予母乳的母亲如果给予婴儿本发明的免疫增强剂，则可以期待具有与给予母乳相同的效果。另外，本发明的免疫增强剂可由不具抗原性的小分子量的肽构成，因此，也可以放心地给予牛乳过敏性婴儿。并且，对于高龄、疾病和疲劳等导致的免疫力低下的成人，估计也可以通过使用本发明的免疫增强剂，安全地增进日常的健康。
附图简述

图1显示实施例1中(1)～(8)的肽和对照对小鼠脾细胞增殖活性的影响的研究结果。该图中，(1)～(8)分别表示实施例1中的肽(1)～(8)。另外，图中上面的*号表示相对于对照组有统计学显著性差异，上面的**表示P＜0.01，上面的***表示P＜0.001。
图2显示实施例1中(1)～(8)的肽和对照对小鼠脾细胞培养系中的免疫球蛋白A产生的影响的研究结果。该图中，(1)～(8)分别表示实施例1中的肽(1)～(8)。另外，图中上面的*号表示相对于对照组有统计学显著性差异，上面的*表示P＜0.05，上面的**表示P＜0.01，上面的***表示P＜0.001。
图3显示实施例1中(8)～(11)的肽和(1)的对照对小鼠脾细胞增殖活性的影响的研究结果。该图中，(1)和(8)分别表示实施例1中的肽(1)和(8)，(9)～(11)分别表示实施例2中的肽(9)～(11)。另外，图中上面的*号表示相对于对照组有统计学显著性差异，上面的***表示P＜0.001。
图4显示实施例2中(8)～(11)的肽和(1)的对照对小鼠脾细胞培养系中的免疫球蛋白(IgG+IgM+IgA)产生的影响的研究结果。该图中，(1)和(8)分别表示实施例1中的肽(1)和(8)，(9)～(11)分别表示实施例2中的肽(9)～(11)。另外，图中上面的*号表示相对于对照组有统计学显著性差异，上面的*表示P＜0.05，上面的**表示P＜0.01，上面的***表示P＜0.001。
图5显示实施例2中(8)～(11)的肽和(1)的对照对小鼠脾细胞培养系中的免疫球蛋白A产生的影响的研究结果。该图中，(1)和(8)分别表示实施例1中的肽(1)和(8)，(9)～(11)分别表示实施例2中的肽(9)～(11)。另外，图中上面的*号表示相对于对照组有统计学显著性差异，上面的*表示P＜0.05，上面的**表示P＜0.01，上面的***表示P＜0.001。
发明的具体内容肽本发明的免疫增强剂含有由至少含有“SerP-X-SerP”序列作为基本骨架的氨基酸序列构成的肽。因而，本发明的免疫增强剂含有由下述氨基酸序列(I)构成的肽。
Q1-SerP-X-SerP-Q2(I)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1和Q2其中一方或双方不存在、或者分别独立表示1个以上任意的氨基酸残基]。
本发明中，“免疫增强剂”是指具有免疫增强活性的剂，其用途不只限于药物，也可以是用于食品、饲料等。
本发明中，“具有免疫增强活性”是指可以使哺乳动物，特别是人增强如脾细胞的促细胞分裂原活性和增强免疫球蛋白产生的活性的免疫增强作用，例如是指在与本说明书的实施例1中记载的测定方法相同的条件下进行测定时，根据脾细胞增殖和免疫球蛋白量的增加等指标做出免疫增强活性显著的评价。
本发明中，“氨基酸”也包括旋光异构体，即任意的D构型和L构型。另外，这里所说的氨基酸不只包括构成天然蛋白质的20种α-氨基酸，也可以包括除此之外的α-氨基酸、以及β-、γ-、δ-氨基酸和非天然的氨基酸等。
根据本发明优选的形式，在上述氨基酸序列(I)中，X由1个任意的氨基酸残基构成。
在上述的氨基酸序列(I)中的X由1个任意的氨基酸残基构成时，X优选选自Leu、Glu、Ile、Thr、Ala、Arg、Lys、Asn、His、Val和SerP，更优选X为SerP或Leu，进一步优选X为SerP。
上述氨基酸序列(I)中，Q1存在时，Q1表示1个以上任意的氨基酸残基。优选Q1中的氨基酸残基数为1～201个，更优选1～128个，进一步优选1～45个，更进一步优选1～23个，特别优选1～14个。
另外，Q2存在时，Q2表示1个以上任意的氨基酸残基。优选Q2中的氨基酸残基数为1～203个，更优选1～192个，进一步优选1～151个，更进一步优选1～76个，特别优选1～31个，最优选1～11个。
根据本发明的一个优选形式，上述氨基酸序列(I)中，Q1表示的氨基酸残基数为0～14个，且Q2表示的氨基酸残基数为0～8个。更优选Q1的氨基酸残基数为0～8个，且Q2的氨基酸残基数为0～5个。进一步优选Q1的氨基酸残基数为0～1个，且Q2的氨基酸残基数为0～2个。
在本发明的免疫增强剂所使用的肽中，优选Q1的氨基酸残基数为14、且Q2的氨基酸残基数为8的情形除外。
根据本发明的另一个形式，可提供新型的肽，该肽以下式(Ia)表示。
Q1-SerP-X-SerP-Q2(Ia)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1表示0～14个任意的氨基酸残基，
Q2表示0～8个任意的氨基酸残基，(Q1的氨基酸残基数为14，且Q2的氨基酸残基数为8的情形除外)]。
该新型的肽只要是包含在上式(Ia)所表示的肽中，可以与由上述氨基酸序列(I)构成的肽一致。
根据本发明的另一优选形式，上述氨基酸序列(I)中，Q1和Q2表示的氨基酸残基都不存在。即优选上述氨基酸序列(I)是由“SerP-X-SerP”构成的寡肽。这样，氨基酸序列(I)的氨基酸残基数少，不会显示抗原性，因而使用免疫增强剂时不会引起变应反应。因而可得到安全性高的免疫增强剂。
根据本发明的优选形式，上述氨基酸序列(I)选自Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO1)、Glu-SerP-X-SerP-SerP (SEQ ID NO2)、SerP-X-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO3)、SerP-X-SerP和Glu-SerP-X-SerP-Glu (SEQ ID NO4)，更优选SerP-X-SerP。
根据本发明进一步优选的形式，上述氨基酸序列(I)选自Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO5)Glu-SerP-Leu-SerP-SerP (SEQ ID NO6)、SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO7)、SerP-Leu-SerP、SerP-SerP-SerP和Glu-SerP-Leu-SerP-Glu (SEQ ID NO8)，更优选SerP-Leu-SerP或SerP-SerP-SerP。
根据本发明的另一优选形式，上述氨基酸序列(I)为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg (SEQ ID NO9)，更优选Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg (SEQ ID NO10)。
根据本发明的另一优选形式，上述氨基酸序列(I)为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Y-Ile-Asn-Lys (SEQ ID NO11)，(式中，Y为1个任意的氨基酸残基，优选为Arg或Cys)，更优选为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys (SEQ ID NO12)。
本发明中，称为肽的场合，也包括该肽的衍生物。这里，肽的衍生物是指具有上述免疫增强活性，且对于肽中的上述基本骨架序列“SerP-X-SerP”以外的部分，即氨基酸末端(N末端)的氨基酸或各氨基酸侧链的部分或全部氨基、和/或羧基末端(C末端)的羧基或各种氨基酸侧链的部分或全部羧基、和/或肽的各氨基酸侧链的氨基和羧基以外的部分或全部官能团(例如氢基、硫代基、酰胺基等)被其他的适当的取代基修饰。由其他适当的取代基进行的修饰是例如以保护肽中存在的官能团、提高安全性和向组织的转移性或增强活性等为目的而进行的修饰。因此，上述SEQ ID NO1～12肽的衍生物也包含在本发明中。
根据本发明的优选形式，本发明的肽含有将上述氨基酸序列(I)至少重复2次的重复序列。
本发明的肽中的氨基酸序列(I)的重复次数至少为2次，优选2～70次，更优选为2～30次，进一步优选为2～10次，更进一步优选为2～4次。从更显著地发挥上述效果的角度来看，重复次数越多越好。不过，从重复处理的繁杂引起的成本提高以及作为免疫增强剂使用时的安全性或方便性等角度来看，上述重复次数优选为2～10次，更优选为2～4次。
根据本发明的一个优选形式，本发明的肽含有将上述氨基酸序列(I)至少重复2次的重复序列时，构成该肽的氨基酸数优选为224个以下，更优选100个以下，进一步优选30个以下。
肽的制备方法本发明的肽可以利用惯用的各种合成方法制备，也可以是天然起源的肽。本发明的肽由于其氨基酸序列已确定，因此可以通过合成整个序列而获得，还可以部分利用天然起源的物质，以此为基础再进行合成而获得。
本发明的肽作为天然起源的物质获得时，可以按照例如下述的步骤获得。
首先准备αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和卵黄高磷蛋白等含有多个磷酸丝氨酸的蛋白质的牛乳酪蛋白或卵黄蛋白质作为酪蛋白。
接着将它们在惯用的条件下进行所谓的胰蛋白酶处理，水解，然后分离回收得到的上清液，由此得到酪蛋白磷酸肽(CPP)。这样的CPP制备方法的具体例子有下述(1)～(3)的方法(1)用结晶胰蛋白酶水解β-酪蛋白，使其生成CPP，接着在pH4.7使未反应的酪蛋白和部分杂质沉淀并除去，然后向上清液部分加入氯化钡和乙醇(最终浓度50％(v/v)，回收沉淀物CPP的方法(例如R.F.Peterson，L.W.Noman和T.L.McMeekin，Journal of the AmericanChemical Society，80，pp95-99(1958))；(2)用结晶胰蛋白酶水解β-酪蛋白，使其生成CPP，接着用三氯乙酸处理，除去不溶物，然后通过氢氧化钠中和(pH5.0)，之后通过凝胶过滤柱(Sephadex G-25R，Pharmacia公司制造)进行粗分级分离，再使其吸附离子交换柱(Dowex 50x2R，Dow Chemical Co.)，然后用吡啶-乙酸缓冲液(0.2N pH2.5)洗脱，纯化CPP的方法(H.Naito和H.Suzuli，Agricutural Biological Chemistry，38，pp1543-1545(1974))；以及(3)将酪蛋白在规定的温度和pH等条件(例如pH7.0-8.5、50℃)下通过胰蛋白酶水解，使其生成CPP，接着在pH5左右使未反应的酪蛋白和部分杂质沉淀并除去，然后向上清液部分加入钙盐或乙酸钙和乙醇等有机溶剂，使CPP沉淀并回收的方法(特公平2-7616号公报)。
接着，将上述得到的CPP用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等内切蛋白酶；氨肽酶、羧肽酶等各种肽酶根据需要组合而成的酶进行处理。由此可得到具有满足用途的所需长度的本发明的肽。
因此，根据本发明的另一形式，提供上述肽的制备方法，该制备方法包含下述步骤准备酪蛋白；将该酪蛋白进行胰蛋白酶处理，然后通过钙盐和乙醇进行沉淀处理，得到磷酸肽；接着，使选自氨肽酶、羧肽酶和它们的组合的酶作用于所得到的磷酸肽，得到上述肽。
另外通过惯用的各种合成方法得到本发明的肽时，例如可以按照下述步骤得到。
即，本发明的肽可以按照惯用的方法，例如Paquet等的方法(A.Paquet和M.Johns，Int.J.Pept Protein Res，36(2)，pp97-103，(1990))，应用通常的肽合成方法进行制备。具体举例有首先通过使用肽合成的常规方法活化酯法和缩合法，将氨基酸与被叔丁氧羰基(Boc)等保护的磷酸丝氨酸和各种氨基酸分阶段地延伸链长，可以制备在任意的位置含有磷酸丝氨酸基的磷酸肽。该方法用液相合成法或固相合成法均可实施。
免疫增强剂本发明的免疫增强剂可以用于药物、食品或饲料的用途。
因而，根据本发明的一个优选形式，提供作为药物使用的免疫增强剂。更优选该免疫增强剂作为用于增强免疫球蛋白产生的药物使用。
本发明的免疫增强剂作为药物使用时，免疫增强剂可以根据给药途径配制为适当的剂型。具体地说，主要可以配制为静脉注射、肌肉注射等的注射剂；胶囊剂、包衣片剂、滴剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、细粒剂、糖锭、锭剂等的口服制剂；直肠给药制剂；油脂性栓剂等任意的剂型。另外，该免疫增强剂可根据需要制成液体制剂或包封液体制剂的胶囊剂等形式。
这些制剂可以进一步使用通常使用的赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、抑菌剂、增溶剂、防腐剂、矫味剂、镇痛药、稳定剂等药学上可接受的制剂用添加剂来制备。即本发明的免疫增强剂还可以含有药学上可接受的制剂用添加剂。
可以使用的添加剂例如有乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、碳酸镁、合成硅酸镁、滑石粉、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、阿拉伯胶、聚乙二醇、糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、枸橼酸、氯化钠、亚硫酸钠、磷酸钠等。
本发明的免疫增强剂作为药物使用时，免疫增强剂的给药方式可以采用经口给药、非经口给药、吸入、经直肠给药、局部给药等各种方式。其中，非经口给药包括皮下注射、静脉给药、肌内给药、鼻腔给药或灌注等。因此例如可以是通过鼻、口腔、舌下、直肠等的粘膜给药或经皮给药、植入剂等的给药。通过上述的任意的给药途径，可以将本发明的免疫增强剂给予选自人和人以外的动物的患者。
给药量可以考虑用法、患者的年龄、性别、症状的程度等适当决定，换算为免疫增强剂的上述肽量，通常成人每天每人约为10～1000mg，优选50～500mg的给药量，可以1天1次或分为数次给予。
如上所述，以药物的形式提供的本发明的免疫增强剂可以有效地应用于各种传染病的治疗或预防、变应性疾病和自身免疫疾病等疾病的治疗等。
即，已知乳汁中分泌的免疫球蛋白即分泌型IgA可以阻止具有强致病性的微生物与肠道粘膜的结合以及与细菌毒素特异性结合，使其作用失活；与起变应原作用的食物性抗原结合，防止其通过消化道壁，从而抑制变态反应等。另一方面，已知用不具分泌型IgA的婴儿奶粉喂养的人工营养婴儿和IgA缺乏症患者中，高频率地出现针对食物性抗原的IgG抗体，出现变应性疾病和自身免疫疾病的频率高。本发明的免疫增强剂可以促进具有防御感染和抑制变态反应效果的IgA在体内的诱导，因此可以增强机体的免疫力。
本发明的免疫增强剂作为食品使用时，免疫增强剂可以以香口胶、饼干、巧克力、糖果、果冻、片剂糖果、奶粉和饮料等的形式提供。
如上所述，本发明的免疫增强剂以食品形式提供，可以对体质差的幼儿或老年人、病后患者等补给营养、增进健康，且对增进具有变应性疾病这样的疾病的患者的健康有效。
本发明的免疫增强剂作为饲料使用时，免疫增强剂可以以乳牛用饲料、猪用饲料、鸡用饲料等禽畜用饲料；宠物食品；各种复合饲料等的形式提供。
此时的给予量可以考虑禽畜动物的种类、年龄、体重、性别、喂食的环境等适当决定，但优选作为饲料的免疫增强剂成分相对于饲料总量含有0.01～1％重量，更优选含有0.05～0.5％重量。优选将上述量在一定期间，优选3星期以上、更优选5星期左右持续给予仔猪等禽畜动物。
以饲料形式提供的本发明的免疫增强剂可以方便地增强禽畜动物的免疫力，因此，可以治疗和预防例如牧场中牛等禽畜动物的传染病和变应性疾病等。
另外通过将本发明的免疫增强剂作为饲料使用，与使用CPP的饲料相比，可以减少使用量，提高其他饲料成分的比例。
根据本发明的另一实施形式，可以提供一种增强免疫力低下或免疫力弱的患者的免疫力的方法，该方法包括给予所述患者本发明的肽。
根据本发明的又一个实施形式，可以提供用于制造免疫增强剂的本发明的肽的应用。
实施例以下通过实施例具体说明本发明，但这些实施例并不是限定本发明的。
例1肽的制备为了鉴定β-酪蛋白1-28区活性中心，进行了以下试验。
将β-酪蛋白(纯度为90％以上)(可由Sigma Chemical Co.购入)配制为15％(w/w)浓度，向其中加入胰蛋白酶(Novo Inc.制造)，在pH7.0、60℃条件下使其反应2小时。然后调节至pH4.5，使杂质沉淀并除去。向得到的上清液中加入钙，使其为上清液的1.1％；加入乙醇，使其最终浓度为50％(v/v)，作为沉淀，得到酪蛋白磷酸肽(CPP)。这是由如下所示的肽(8)的1-28区构成的磷酸肽。
根据得到的上述磷酸肽的氨基酸序列，合成了相当于其部分结构的诸如下述肽(3)～(7)的5种合成磷酸肽。这些磷酸肽通过使用Fmoc氨基酸的固相合成法来合成。具体地说，这些合成是通过在树脂上使侧链受保护的α-氨基酸依次连接来合成。此时在α-氨基酸保护基上使用可用强碱除去的Fmoc基(9-芴基甲氧羰基)，除去该保护基之后，用接合剂连接下一个氨基酸。用强酸将如上所述得到的肽从树脂上切下，同时除去侧链的保护基，然后将得到的粗肽通过HPLC纯化，得到目标合成肽。
肽(7)委托Biologica Inc.、肽(3)～(6)委托Becks Co.分别合成。它们的纯度为80％，肽量为10mg。
除上述合成的肽(3)～(7)之外，还准备了只由磷酸丝氨酸构成的肽(肽(2))、未添加氨基酸或肽的对照(肽(1))和由1～28区构成的酪蛋白磷酸肽(肽(8))。
肽(1)对照肽(2)SerP(单独的)肽(3)SerP15-Leu-SerP17-NN2肽(4)Glu14-SerP-Leu-SerP17- Glu21
肽(5)SerP17-SerP-SerP-Glu-Glu21肽(6)Glu14-SerP-Leu-SerP-SerP18-NN2肽(7)Glu14-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu21肽(8)Arg1-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu14-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu21-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys20评价试验1将以上得到的肽(1)～(8)进行如下所述的评价试验，评价各种肽的免疫增强功能。
试验中使用的小鼠脾细胞从6周龄的C3H/HeN系雄性小鼠体内无菌采集。将其置于含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Celgrosser-P培养基中培养。
在微量培养板中，分别对5×106个脾细胞添加上述各种肽样品，使其浓度为2nM，再分别加入0.5μg伴刀豆凝集素A(ConA)、5μg植物凝集素(PHA)或50μg脂多糖(LPS)中的任意一种，在37℃、5％的二氧化碳下培养。
试验1A细胞的增殖活性细胞的增殖活性以48小时后的细胞数进行评价。
培养结束后，通过染料-MTT法(Mosman，T.，J.Immunol.Method，65(1983)，pp55-63)测定免疫细胞的增殖，通过以酶标仪(Bio-Rad Inc.，450型)测定570nm的吸光度，来求出甲的生成。
使用Student之t检验来判定效果的显著性差异。
结果如图1所示。
试验1B免疫球蛋白的产生通过72～120小时的培养来测定免疫球蛋白的产生。
通过夹心ELISA法(Williams，D.J.L.等，Vet.Immunol.Immunopath.，24(1990)，pp267-283)测定免疫球蛋白A的量。即，向涂了猪的抗小鼠免疫球蛋白A包被的平板中加入细胞培养液，洗净后，通过使其与标记了辣根过氧化物酶的羊抗小鼠免疫球蛋白A抗体反应来求出。
结果如图2所示。
例2肽的制备与例1同样方法得到下述的合成肽。这里，肽(11)是本发明涉及的物质。
肽(9)Glu14-Ser-Leu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glu21(SEQ ID NO13)肽(10)SerP-SerP肽(11)SerP17-SerP-SerP19肽(9)～(11)分别委托Becks Inc.合成。其纯度分别为80％，肽量为10mg。
另外，除这些合成肽(9)～(11)之外，还准备了未添加氨基酸或肽的对照(肽(1))和由1-28区构成的酪蛋白磷酸肽(肽(8))。
评价试验2将以上得到的肽(9)～(11)、肽(1)和(8)进行下述的评价试验，评价各种肽的免疫增强功能。
与上述例1同样地准备试验中使用的小鼠脾细胞，进行培养。
试验2A细胞的增殖活性与上述例1同样地，对小鼠脾细胞增殖的促进活性进行评价。
与上述例1同样地，通过570nm吸光度得出的MTT值求出细胞的增殖数。
结果如图3所示。
试验2B免疫球蛋白的产生通过72～120小时的培养来测定免疫球蛋白的产生。
通过夹心ELISA法(Williams，D.J.L.等，Vet.Immunol.Cell Biol.，74(1990).pp323-329)测定免疫球蛋白的量。即，向山羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG+IgM+IgA或IgA)包被的平板中加入细胞培养液，洗净后，通过使其与标记了辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体(IgG+IgM+IgA)或同样的羊抗小鼠免疫球蛋白抗体A反应来求出。
结果如图4和图5所示。
权利要求
1.一种免疫增强剂，所述免疫增强剂含有由下述氨基酸序列(I)构成的肽Q1-SerP-X-SerP-Q2(I)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1和Q2其中一方或双方不存在、或者分别独立表示1个以上的任意的氨基酸残基]。
2.权利要求1的免疫增强剂，其中X由1个任意的氨基酸残基构成。
3.权利要求2的免疫增强剂，其中X是SerP或Leu。
4.权利要求1～3的任意一项的免疫增强剂，其中Q1表示的氨基酸残基数是0～128个，且Q2表示的氨基酸残基数是0～192个。
5.权利要求1～3的任意一项的免疫增强剂，其中Q1表示的氨基酸残基数是0～14个，且Q2表示的氨基酸残基数是0～8个。
6.权利要求1～5的任意一项的免疫增强剂，其中Q1和Q2表示的氨基酸残基都不存在。
7.权利要求5的免疫增强剂，其中所述氨基酸序列(I)选自Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO1)、Glu-SerP-X-SerP-SerP (SEQ ID NO2)、SerP-X-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO3)、SerP-X-SerP和Glu-SerP-X-SerP-Glu (SEQ ID NO4)。
8.权利要求7的免疫增强剂，其中所述氨基酸序列(I)选自Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO5)Glu-SerP-Leu-SerP-SerP (SEQ ID NO6)、SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO7)、SerP-Leu-SerP、SerP-SerP-SerP和Glu-SerP-Leu-SerP-Glu (SEQ ID NO8)。
9.权利要求5的免疫增强剂，其中所述氨基酸序列(I)为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg (SEQ ID NO9)。
10.权利要求1的免疫增强剂，其中所述氨基酸序列(I)为Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Y-Ile-Asn-Lys (SEQ ID NO11)，(式中，Y为1个任意的氨基酸残基)。
11.一种免疫增强剂，所述免疫增强剂含有肽，所述肽包含将权利要求1～10的任意一项中记载的氨基酸序列(I)至少重复2次的重复序列。
12.权利要求1～11的任意一项的免疫增强剂，所述免疫增强剂作为药物使用。
13.权利要求12的免疫增强剂，所述免疫增强剂还含有药学上可接受的制剂用添加剂。
14.权利要求1～11的任意一项的免疫增强剂，所述免疫增强剂作为食品使用。
15.权利要求1～11的任意一项的免疫增强剂，所述免疫增强剂作为饲料使用。
16.一种肽，所述肽由下述氨基酸序列(Ia)构成Q1-SerP-X-SerP-Q2 (Ia)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，Q1表示0～14个任意的氨基酸残基，Q2表示0～8个任意的氨基酸残基，(Q1的氨基酸残基数为14，且Q2的氨基酸残基数为8的情形除外)]。
17.权利要求16的肽，其中X由1个任意的氨基酸残基构成。
18.权利要求17的肽，其中X是SerP或Leu。
19.权利要求16～18的任意一项的肽，其中Q1和Q2表示的氨基酸残基都不存在。
20.权利要求16～18的任意一项的肽，其中所述氨基酸序列(Ia)选自Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO1)、Glu-SerP-X-SerP-SerP (SEQ ID NO2)、SerP-X-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO3)、SerP-X-SerP和Glu-SerP-X-SerP-Glu (SEQ ID NO4)。
21.权利要求20的肽，其中所述氨基酸序列(Ia)选自Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO5)Glu-SerP-Leu-SerP-SerP (SEQ ID NO6)、SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (SEQ ID NO7)、SerP-Leu-SerP、SerP-SerP-SerP和Glu-SerP-Leu-SerP-Glu (SEQ ID NO8)。
22.一种肽，所述肽含有将权利要求16～21的任意一项中记载的氨基酸序列(Ia)至少重复2次的重复序列。
23.权利要求16～22的任意一项的肽，所述肽具有免疫增强活性。
24.权利要求16～23的任意一项的肽的制备方法，所述方法包括下述步骤准备酪蛋白；将该酪蛋白用胰蛋白酶处理后，通过钙盐和乙醇进行沉淀处理，得到磷酸肽；接着，使选自氨肽酶、羧肽酶和它们的组合的酶作用于所得到的磷酸肽，得到所述肽。
25.一种使免疫力低下或免疫力弱的患者增强免疫力的方法，所述方法包括将权利要求16～23的任意一项的肽给予所述患者。
26.权利要求16～23的任意一项的肽用于制备免疫增强剂的应用。
全文摘要
本发明的目的在于提供具有特定氨基酸序列的、免疫增强活性优异的肽；以及含有该肽的免疫增强剂。本发明涉及含有由下述氨基酸序列(I)构成的肽的免疫增强剂。Q1－SerP－X－SerP－Q2(I)[式中，SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示1～3个任意的氨基酸残基，且Q1和Q2其中一方或双方不存在、或者分别独立表示1个以上的任意的氨基酸残基]。
文档编号C07K5/08GK1496368SQ0280619
公开日2004年5月12日 申请日期2002年3月11日 优先权日2001年3月9日
发明者大谷元, 田代靖人, 杉原道寿, 人, 寿 申请人:明治制果株式会社