专利名称：炎性肠疾病的治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物，它含有具有调节AILIM(活化诱导型淋巴细胞免疫调节分子，也称诱导型协同刺激因子(ICOS))的生物学活性的活性的物质，所述生物学活性尤其指经由AILIM介导的信号传导。
具体地，本发明涉及药物组合物，它包含具有以下活性的物质调节(例如抑制)AILIM表达细胞的增殖，细胞死亡(或凋亡)，或免疫胞解，或者调节(例如抑制)AILIM-表达细胞对细胞因子(例如，干扰素-γ，或白细胞介素-4)的生成。
更具体地，本发明包括具有以下活性的物质调节经由AILIM进行的信号传导，尤其优选所述物质能诱导AILIM-表达细胞的死亡，凋亡或耗竭。本发明涉及用于抑制、治疗或预防与肠道免疫力异常相伴的疾病的药物组合物，所述疾病例如炎性肠疾病，如大肠炎(溃疡性大肠炎等)和Crohn疾病，食物过敏反应)。
背景技术：
胃肠道粘膜持续暴露于食物来源的抗原和肠道正常菌群，以及外界各种对活体有害的抗原，如致病性微生物。因此，胃肠道粘膜具有细胞毒活性，以便与这类对活体有伤害作用的抗原进行抗衡。除了维持分泌抗体中和毒素的能力，这些粘膜还具有特有的免疫机制来抑制针对诸如食物和肠道正常菌群的过度免疫反应(这种机制被称为胃肠道粘膜免疫力或肠道免疫力)。具体地，正常粘膜免疫力是建立在针对病原体的主动免疫应答与针对非致病性抗原的被动免疫应答之间的平衡上的。当免疫内环境的这种平衡不能维持时，就出现炎症、过敏以及感染，引发通常称为炎性肠疾病(IBD)和食物过敏的肠道疾病。
最具代表性的炎性肠疾病是Crohn疾病(CD)和大肠炎(尤其溃疡性大肠炎(UC))。它们都没有特定的病原体，都为慢性病、反复出现腹部疼痛和腹泄，长期显著妨碍儿童和青少年病人的日常生活。而且，由于大肠炎(尤其溃疡性大肠炎)变成结肠癌的致病因素，目前迫切需要阐明大肠炎的致病机理并开发有效的治疗方法。
尽管针对炎性肠疾病发作机制讨论了诸如遗传和环境因素等各种可能性，但近期研究表明，极有可能是肠道免疫力(胃肠道粘膜免疫力)异常所致。更具体地，由于在肠道中针对通常不具有致病性且免疫原性较低的抗原因为某种原因而产生过度的免疫应答，在肠道粘膜中引起炎症反应或过敏反应，导致发生炎性肠疾病。
另有迹象暗示，针对外来病原体、食物中抗原、或自体抗原的异常免疫力与肠道的上述炎症和过敏密切相关。近期研究也提示，针对机体常见细菌的异常免疫应答有可能成为慢性炎症反应。
这种由于肠道免疫力异常引起肠道炎症和过敏的机制，也通过对病人T细胞的功能和分化以及病灶或血清中细胞因子产生模式的分析得到证实。对各种近期开发的炎性肠疾病动物模型的分析还表明，肠道中异常的粘膜免疫力导致慢性炎症(Gastroenterology，Vol.109，p.1344-1367，1995)。
例如，很明显T细胞与慢性肠炎的发作密切相关，因为T细胞受体(TCR)α-链敲出小鼠(TCRα-/-)中自发形成肠道的炎症(Cell，Vol.75，p.275-282，1993；J.Exp.Med.，Vol.183，p.847-856，1996)。在这些TCRα-/-小鼠的大肠炎中，肠道中IFN-γ的产生水平提高，在炎症初期，可观察到IL-1α和IL-1β水平的升高(Laboratory Investigation，Vol.76，p.385-397，1997)。具有特异性Vβ亚单位并产生IL-4的TCRβ(βdim)T细胞可见于消化道和淋巴结(Gastroenterology，Vol.112，p.1876-1886，1997)。在这一模型中，TCRαβT细胞的缺陷导致异常T细胞组分增多，后者导致对细胞因子生成的异常调节，引起炎症。
在将CD4+/CD45RBhighT细胞引入重症联合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)的模型中，诱导出伴有粘膜层增生和肠道中淋巴细胞浸润的严重肠炎。但同时引入未经分级分离的CD4+T细胞时，不出现这种肠炎(J.Exp.Med.，Vol.178，p.237-244，1993；Int.Immunol.，Vol.5，p.1461-1471，1993)。表现出肠炎的SCID小鼠的CD4+T细胞生成IFN-γ。另一方面，由于肠炎因给药抗INF-γ抗体而受到抑制，故认为是Th1型T细胞引起炎症(Immunity，Vol.1，p.553-562，1994)。
基于这些考虑，似乎没有理由怀疑肠道的CD4+T细胞及其过度活化是炎性肠疾病中的重要因素。
另外，同时罹患炎性肠疾病和HIV的病人肠炎症状减轻且CD4+T细胞减少，这也表明异常的CD4+T细胞与炎性肠疾病密切相关(J.Clin.Gastroenterology，Vol.23，p.24-28，1996)。有人基于这一发现而尝试用抗CD4抗体治疗炎性肠疾病，据报道，通过给药抗CD4抗体确实抑制了炎症病变(Gut，Vol.40，p.320-327，1997)。
另一方面，所述对T细胞的异常功能性调节是指，调节性细胞因子生成的平衡被打破。
事实上，据报道在IL-2敲出小鼠和IL-10敲出小鼠中自发产生肠炎(Cell，Vol.75，p.235-261，1993；细胞，Vol.75，p.263-274，1993)。而且，在这些模型中还可观察到IFN-γ的过度生成，这再次表明发生了过度的Th1型T细胞反应。这些模型中IFN-γ的过度生成与Crohn疾病病变部位中IFN-γ表达增加的发现是一致的。在IL-10缺陷小鼠中，肠炎可通过给药IL-10进行治疗。有报道称，在引入了CD4+/CD45RBhighT细胞的SCID小鼠中，肠炎可通过上述方法抑制(Immunity，Vol.1，p.553-562，1994)。
如上所述，对炎性肠疾病发病机制的分析已经不再限于异常胃肠道粘膜免疫力的方面，这提示通过抑制CD4+T细胞活化的增强作用以及抑制细胞因子的过度生成，有可能治疗炎性肠疾病。但炎性肠疾病的真正致病机理仍然不明，而且仍然缺乏有效的治疗方法。
当T细胞识别由诸如巨噬细胞、B细胞或树突细胞等抗原提呈细胞(APC)提呈的抗原时，T细胞被活化(获得抗原特异性)。APC对摄入的抗原进行加工，经过加工的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)结合并被提呈。T细胞通过其膜表面的T细胞受体(TCR)与抗原形成的复合物(TCR/CD3复合物)来识别由APC提呈的经过加工的抗原，导致T细胞接受细胞活化(获得特异性)的第一信号。
为了充分活化T细胞，除了所述第一信号，还必需有被称为协同刺激信号的第二信号。T细胞通过在接受第一信号后接受这种协同刺激信号而针对特异性抗原被活化。
为了传导所述第二信号，CD28、CD80、CD86之间的相互作用(尤其是，这些分子的结合所介导的细胞粘附)极其重要。CD28(也称Tp44，T44，或9.3抗原)是主要在T细胞和胸腺细胞中表达的细胞表面分子，CD80(也称B7-1，B7，BB1或B7/BB1)是由抗原提呈细胞(巨噬细胞，单核细胞，树突细胞，等)表达的细胞表面分子，CD86(也称B7-2或B70)是在抗原提呈细胞表面的细胞表面分子。
另有实验表明，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，CD80(B7-1)和CD86(B7-2)之间的相互作用(具体地，由这些分子的结合所介导的细胞粘附)也是经由第二信号调节T细胞活化时的重要角色，所述CTLA-4可基于第二信号而增强表达。更具体地，通过第二信号的传导对T细胞活化进行的调节经揭示至少包括CD28与CD80/CD86的相互作用，CTLA-4表达的增强被认为依赖于这种相互作用，以及CTLA-4与CD80/CD86之间的相互作用。
此外，在最近，类似于上述CTLA4和CD28，一种被称为活化诱导型淋巴细胞免疫调节分子(AILIM；人，小鼠和大鼠；Int.Immunol.，12(1)，p.51-55，2000；也称诱导型协同刺激因子(ICOS；人；Nature，397(6716)，p.263-266，1999)；J.Immunol.，166(1)，p.1，2001；J.Immunol.，165(9)，p.5035，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.，276(1)，p.335，2000；Immunity，13(1)，p.95，2000；J.Exp.Med.，192(1)，p.53，2000；Eur.J.Immunol.，30(4)，p.1040，2000)的分子被鉴定为传导诸如T细胞等淋巴细胞活化所必需的第二信号(协同刺激信号)的第三协同传递分子，它与所述信号结合，可调节诸如活化的T细胞等活化的淋巴细胞的功能。
另外还鉴定了一种新的被称为B7h、B7RP-1、GL50或LICOS的分子，认为它是与协同传递分子AILIM发生相互作用的配体(Nature.Vol.402，No.6763，pp.827-832，1999；Nature Medicine，Vol.5，No.12，pp.1365-1369，1999；J.Immunology，Vol.164，pp.1653-1657，2000；Curr.Biol.，Vol.10，No.6，pp.333-336，2000)。
对这两种新分子的生物学功能，以及经由这些分子的第三协同信号传导对淋巴细胞如T细胞进行功能控制的全面研究已取得进展。
另一方面，作为T细胞如CD4+T细胞活化所必需的第三系统传递分子的AILIM(ICOS)，与肠道粘膜的上述异常免疫力及炎性肠疾病(Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等))的发作之间的关系仍未有任何提示。关于通过调节这种AILIM分子的功能来尝试治疗炎性肠疾病也没有任何提示。
发明内容
具体地，本发明的目标是提供用于抑制、治疗或预防与肠道免疫力异常相伴的疾病的方法和药物组合物，所述免疫力异常例如T细胞活化的异常，异常CD4+细胞的增加，所述疾病例如炎性肠疾病，如Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等)，所述抑制、治疗或预防的手段是利用医学和药学方法(例如，药物，如小分子化合物和抗体)调节新分子AILIM的生物学功能，据认为，这种新分子能传导诸如T细胞等淋巴细胞活化所必需的第二信号(协同刺激信号)，并调节活化的淋巴细胞(如活化的T细胞)的功能。
本发明另一目标是，利用这种能调节AILIM功能的药物(例如小分子化合物和抗体等药物)，来提供增强现有广泛用于治疗炎性肠疾病的药物(肾上腺皮质激素，柳氮磺吡啶，等)的疗效的方法。
通过深入研究抑制哺乳动物AILIM(ICOS)的生物学功能的方法，以及抑制与肠道免疫力异常密切相关的食物过敏和炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等))，本发明人发现，调节AILIM功能的药物显著抑制炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等))。本发明便是如此实现的。
本发明的药物组合物可作为药物，用于体内调节与AILIM介导协同刺激信号向AILIM表达细胞的传导有关的反应(如，AILIM表达细胞的增殖，AILIM-表达细胞的细胞因子生成，AILIM-表达细胞的免疫胞解或细胞死亡，凋亡或耗竭，以及诱导对抗AILIM表达细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的活性)，和/或作为药物用于预防与经AILIM介导的信号传导有关的各种疾病的发作和/或进展，以及用于治疗或预防上述疾病。
更具体地，本发明的药物组合物能调节(抑制或促进)AILIM-表达细胞的增殖，凋亡，细胞死亡，或耗竭，或免疫胞解，或者能调节(抑制或促进)AILIM表达细胞的细胞因子生成(例如，干扰素-γ，或白细胞介素-4)，还能预防与AILIM介导的信号传导有关的各种生理现象引发的各种疾病，并能治疗或预防各种疾病。
本发明药物组合物的这种尤其优选的实施方案是包含能诱导AILIM表达细胞的细胞死亡、凋亡或耗竭的药物组合物。
因肠道免疫力异常所引起的疾病，更具体是炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等))和食物过敏，可利用本发明的药物组合物进行抑制，预防和/或治疗。
此外，本发明的药物组合物可以与现有治疗炎性肠疾病的药物联合应用而增强对这类炎性肠疾病的疗效。
更具体地，本发明如以下(1)-(10)所述(1)一种药物组合物，用于抑制、治疗或预防与肠道的异常免疫力相伴的疾病，该药物组合物包含具有调节经由AILIM进行的信号传导的活性的物质和一种可药用载体。
(2)(1)的药物组合物，其中所述物质具有诱导AILIM-表达细胞死亡的活性。
(3)(1)或(2)的药物组合物，其中所述疾病是炎性肠疾病。
(4)(3)的药物组合物，其中所述炎性肠疾病是大肠炎。
(5)(3)的药物组合物，其中所述炎性肠疾病是Crohn疾病。
(6)(1)或(2)的药物组合物，其中所述疾病是食物过敏。
(7)(1)-(6)之一的药物组合物，其中所述物质是蛋白性质的物质。
(8)(7)的药物组合物，其中所述蛋白性质的物质选自a)与AILIM结合的抗体，或其一部分；b)含有AILIM的完整胞外区的多肽，或其一部分；c)一种融合多肽，包含AILIM胞外区的全部或一部分和免疫球蛋白重链恒定区的全部或一部分；或d)与AILIM结合的多肽。
(9)(1)-(6)之一的药物组合物，其中所述物质为非蛋白性质的物质。
(10)(9)的药物组合物，其中所述非蛋白性质的物质是DNA，RNA，或经化学合成的化合物。
下文对本发明进行详细描述，包括对术语以及用于制备本发明物质的方法进行定义。
本文中术语“哺乳动物”是指人，牛，山羊，兔，小鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠；优选人，牛，大鼠，小鼠，或仓鼠，更优选人。
本发明的“AILIM”是“可经活化诱导的淋巴细胞免疫调节分子”的缩写，是指哺乳动物的一种细胞表面分子，它具有文献报道的结构和功能(J.Immunol.，166(1)，p.1，2001；J.Immunol.，165(9)，p.5035，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.，276(1)，p.335，2000；Immunity，13(1)，p.95，2000；J.Exp.Med.，192(1)，p.53，2000；Eur.J.Immunol.，30(4)，p.1040，2000；Int.Immunol.，12(1)，p.51，2000；Nature，397(6716)，p.263，1999；GenBank录入号BAA82129(人)；BAA82128(大鼠)；BAA82127(突变的大鼠)；BAA82126(小鼠))。
尤其优选该术语表示人源AILIM(例如，International Immunology，Vol.12，No.1，p.51-55，2000；GenBank录入号BAA82129)。
这种AILIM也称ICOS (Nature，Vol.397，No.6716，p.263-266，1999)或JTT-1抗原/JTT-2抗原(日本专利申请(JP-A)Hei 11-29599，国际申请WO98/38216)，这些分子都指的是同一种分子。
本发明中，“AILIM”还包括来自文献报道的各种哺乳动物的AILIM氨基酸序列，尤其优选具有与人AILIM基本相同的氨基酸序列的多肽。与在先鉴定的大鼠AILIM突变体(GenBank录入号BAA82127)类似的人AILIM突变体也包括在本发明的“AILIM”中。
本文中“具有基本相同的氨基酸序列”是指本发明的“AILIM”包括具有下述氨基酸序列的多肽，所述序列中，取代、删除、修饰、和/或添加了多个氨基酸(优选1-10个，特别优选1-5个)，但该多肽仍具有与含有文献所报道氨基酸序列的多肽基本相同的生物学活性。
这类氨基酸取代，删除，或插入可利用常规方法实现(ExperimentalMedicineSUPPLEMENT，“Handbook of Genetic Engineering”(1992)，等)。
实例有，合成性寡核苷酸定点诱变(空隙双链法)，用亚硝酸盐或亚硫酸盐随机引入点突变，用Bal31酶等制备缺失突变，盒式诱变，连接子扫描法，错插法，错配引物法，DNA分段合成法，等。
合成性寡核苷酸定点诱变(空隙双链法)可以，例如，如下进行。将需要进行突变的区域克隆至具有琥珀突变的M13噬菌体载体中，制备单链噬菌体DNA。将不含琥珀突变的M13载体的RFIDNA经限制酶处理而线性化，将该DNA与上述单链噬菌体DNA混合，变性，退火，形成“有空隙的双链DNA”。将带有突变的合成寡核苷酸与上述有空隙的双链DNA杂交，经DNA聚合酶和DNA连接酶处理，制得闭合环状双链DNA。用该DNA转染错配修复活性有缺陷的大肠杆菌(E.coli)mutS细胞。用成熟噬菌体感染无抑制物活性的大肠杆菌细胞，仅筛选到无琥珀突变的噬菌体。
用亚硝酸盐引入点突变的方法是，例如，利用以下原则。用亚硝酸盐处理DNA，可使核苷酸脱氨，从而将腺嘌呤转变为次黄嘌呤，将胞嘧啶转变为尿嘧啶，将鸟嘌呤转变为黄嘌呤。如果将脱氨后的DNA引入细胞，可使“A:T”和“G:C”分别被替换为“G:C”和“A:T”，因为次黄嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤在DNA复制中分别与胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶进行碱基配对。事实上，经亚硝酸盐处理的单链DNA片段与“有空隙的双链DNA”杂交，此后，按照与合成性寡核苷酸定点诱变(空隙双链法)相同的方式分离突变株。
本发明“AILIM表达细胞的细胞因子生成”中的术语“细胞因子”是指由AILIM表达细胞(尤其T细胞)产生的任何细胞因子。
T细胞的实例有Th1型T细胞或Th2型T细胞，本发明的细胞因子尤其指Th1型T细胞产生的细胞因子和/或Th2型T细胞产生的任何细胞因子。
Th1型T细胞产生的细胞因子包括IFN-γ，IL-2，TNF，IL-3，Th2型T细胞产生的细胞因子包括IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，和TNF(Cell，Vol.30，No.9，pp.343-346，1998)。
本文中，“物质”，“能调节AILIM介导的信号传导的物质”，“能抑制AILIM表达细胞增殖，或抑制AILIM表达细胞的细胞因子生成的物质”，或“能诱导AILIM表达细胞死亡的物质”，是指天然物质或人工制备的任何物质。
本发明“物质”的特别优选实施方案是，能诱导AILIM表达细胞死亡，凋亡或耗竭的物质。
本文中，“由AILIM介导的信号传导”是指信号传导经过了AILIM，导致AILIM表达细胞的任何表型改变，如上文所述或如以下实例所述(AILIM表达细胞在细胞增殖，细胞活化，细胞失活，凋亡，和/或产生任何细胞因子的能力等方面的改变)。
“物质”主要可分为“蛋白性质的物质”和“非蛋白性质的物质”。
“蛋白性质的物质”例如多肽，抗体(多克隆抗体，单克隆抗体，或单克隆抗体的各种部分)。
当所述物质为抗体时，优选为单克隆抗体。当所述物质为单克隆抗体时，它不仅包括非人类的源自哺乳动物的单克隆抗体，还包括下述重组嵌合单克隆抗体，重组人源化单克隆抗体，以及人的单克隆抗体。
当所述物质为多肽时，它包括下述多肽，多肽(寡肽)片段，融合多肽，以及经化学修饰的多肽。寡肽的实例包括含5-30个(优选5-20个)氨基酸的肽。化学修饰可根据不同目的进行设计，例如，在体内给药的情况下延长血中半寿期的目的，增强对抗降解作用的耐受力的目的，或者在口服给药的情况中促进消化道内吸收的目的。
多肽的实例如下(1)包含AILIM胞外区的全部或其部分的多肽；(2)融合多肽，包含AILIM胞外区的全部或其部分，以及免疫球蛋白重链恒定区的全部或其部分；或(3)与AILIM结合的多肽。
“非蛋白性质的物质”指DNA，RNA，以及经化学修饰的化合物。
这里的“DNA”是指“一种DNA，它具有根据编码上述AILIM(优选人AILIM)的DNA(包括cDNA和基因组DNA)或其化学修饰DNA的核苷酸序列而设计的反义DNA的部分核苷酸序列”，它可以用作反义DNA药物。更具体地，反义DNA能通过与编码AILIM的DNA或RNA杂交，来抑制编码AILIM的DNA转录为mRNA，或抑制该mRNA翻译为蛋白质。
本文中，“部分核苷酸序列”是指在任意区域含有任意数量的核苷酸的部分核苷酸序列。部分核苷酸序列包括5-100个连续的核苷酸，优选5-70个，更优选5-50个，还更优选5-30个连续核苷酸。
当所述DNA作为反义DNA药物来使用时，可对该DNA序列进行部分化学修饰，以便增加该DNA在给药患者时的血液半寿期(稳定性)，增加该DNA的细胞膜内透性，或增加口服给予的DNA在消化器官中的降解耐受性或吸收。化学修饰包括，例如，修饰寡核苷酸DNA结构中的磷酸键，核糖，核苷酸，糖组分，3′末端和/或5′末端。
对磷酸键的修饰包括，例如，将一或多个键转化为磷酯键(D-oligo)，硫代磷酯键，二硫代磷酯键(S-oligo)，甲基膦酸酯(MP-oligo)键，磷酰胺键，非磷酸键，或甲基硫代膦酸酯键，或它们的组合。对核糖的修饰包括，例如转变为2′-氟核糖或2′-O-甲基核糖。对核苷酸的修饰包括，例如，转变为5-丙炔基尿嘧啶或2-氨基腺嘌呤。
本文中术语“RNA”是指“一种RNA，它具有根据编码上述AILIM(优选人AILIM)的RNA或其化学修饰RNA的核苷酸序列而设计的反义RNA的部分核苷酸序列”，它可以用作反义RNA药物。反义RNA能通过与编码AILIM的DNA或RNA杂交，来抑制编码AILIM的DNA转录为mRNA，或抑制该mRNA翻译为蛋白质。
本文中，“部分核苷酸序列”是指在任意区域含有任意数量的核苷酸的部分核苷酸序列。部分核苷酸序列包括5-100个连续的核苷酸，优选5-70个，更优选5-50个，还更优选5-30个连续核苷酸。
当所述RNA作为反义RNA药物来使用时，可对该DNA序列进行部分化学修饰，以便增加该RNA在给药患者时的血液半寿期(稳定性)，增加该RNA的细胞膜内透性，或增加口服给予的RNA在消化器官中的降解耐受性或吸收。化学修饰包括应用于上述反义DNA的那些。
“经化学合成的化合物”例如除了上述DNA，RNA和蛋白性质的物质以外的、分子量约100-1000或更小的任何化合物，优选分子量约100-800的化合物，更优选分子量约100-600。
包括在上述“物质”定义中的术语“多肽”是指组成AILIM(优选人AILIM)的多肽链的一个部分(片段)，优选组成AILIM的多肽的胞外区的全部或一部分(可选择在该区域的N-末端和/或C-末端添加1-5个氨基酸)。
本发明的AILIM是穿过细胞膜的跨膜分子，它包含1或2条多肽链。
本文中，“跨膜蛋白”是指与细胞膜经由一次或多次穿过该膜脂质双层的疏水肽区相连的蛋白，其结构整体上由三个主要区域组成，即胞外区，跨膜区和胞质区，很多受体或细胞表面分子就是这样。这样的跨膜蛋白构成各种受体或细胞表面分子，其表现为单体，或者是同二聚体，异二聚体，或与一或多个具有相同或不同氨基酸序列的链发生偶联的寡聚体形式。
本文中，“胞外区”是指上述跨膜蛋白位于膜外的那一部分结构(局部区域)的全部或一部分。换而言之，它是指跨膜蛋白除了插入膜中的区域(跨膜区)以及紧接跨膜区而位于胞质内的区域(胞质区)以外的完整区域或其一部分。
包括在上述“蛋白性质的物质”中的“融合多肽”是指一种融合多肽，它包含构成AILIM(优选人AILIM)的多肽的整个胞外区或其一部分，以及“免疫球蛋白(Ig，优选人Ig)重链恒定区的全部或一部分”。优选所述融合多肽是具有AILIM胞外区以及人IgG重链恒定区的一部分的融合多肽，尤其优选AILIM胞外区与包括绞链区、CH2区和CH3区在内的人IgG重链区域(Fc)的融合多肽。IgG中优选IgG1，AILIM中优选人、小鼠、或大鼠的AILIM(优选人的)。
本文中“免疫球蛋白(Ig)重链恒定区的全部或一部分”是指人源免疫球蛋白重链(H链)的恒定区或Fc区，或其一部分。所述免疫球蛋白可以是任何类或亚类的任何免疫球蛋白。具体地，免疫球蛋白包括IgG(IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4)，IgM，IgA(IgA1和IgA2)，IgD，和IgE。优选地，免疫球蛋白是IgG(IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)，或IgM。本发明特别优选的免疫球蛋白是人源IgG(IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)。
免疫球蛋白具有Y-形结构单元，其中由两条相同的轻链(L链)和两条相同的重链(H链)组成的4条链通过二硫键(S-S键)相连。轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。
重链恒定区由具有每一类(IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE)和每一亚类(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2)所特有的氨基酸序列的多个区构成。
IgG(IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4)的重链由从N-末端起依次排列的VH，CH1区，绞链区，CH2区，和CH3区组成。
类似地，IgG1重链由从N-末端起依次排列的VH，Cγ11区，绞链区，Cγ12区，和Cγ13区构成。IgG2重链由从N-末端起依次排列的VH，Cγ21区，绞链区，Cγ22区，和Cγ23区构成。IgG3重链由从N-末端起依次排列的VH，Cγ31区，绞链区，Cγ32区，和Cγ33区构成。IgG4重链由从N-末端起依次排列的VH，Cγ41区，绞链区，Cγ42区，和Cγ43区构成。
IgA的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cα1区，绞链区，Cα2区，和Cα3区构成。
类似地，IgA1的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cα11区，绞链区，Cα12区，和Cα13区构成。IgA2的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cα21区，绞链区，Cα22区，和Cα23区构成。
IgD的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cδ1区，绞链区，Cδ2区，和Cδ3区构成。
IgM的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cμl区，Cμ2区，Cμ3区，和Cμ4区构成，无在IgG，IgA，和IgD中可见的绞链区。
IgE的重链由从N-末端起依次排列的VH，Cε1区，Cε2区，Cε3区，和Cε4区构成，无在IgG，IgA，和IgD中可见的绞链区。
例如，IgG用木瓜蛋白酶处理后，在连接两条重链的绞链区二硫键的偏N-末端侧被打断，产生两个相同的Fab和一个Fc，Fab中由VH和CH1组成的重链片段与一条轻链通过一个二硫键相连，Fc中两条相同的由绞链区，CH2区，和CH3区构成的重链通过二硫键相连(参见“Immunology Illustrated”，original 2nd ed.，Nankodo，pp.65-75(1992)；和“Focus of Newest MedicalScience‘Recognition Mechanism of Immune System’”，Nankodo，pp.4-7(1991)；等)。
也就是说，上文所述“免疫球蛋白重链恒定区的一部分”是指，免疫球蛋白重链恒定区中具有上述结构特征的部分，优选是不含C1区的恒定区或Fc区。具体实例如，由IgG，IgA或IgD的绞链区，C2区，和C3区构成的区域，或者由IgM或IgE的C2区，C3区，和C4区构成的区域。特别优选的实例是人源IgG1的Fc区。
上述融合多肽具有极易于利用特异性结合免疫球蛋白片段的蛋白A通过亲和层析予以纯化的优点，因为本发明的融合多肽具有免疫球蛋白(如IgG)恒定区的一部分(例如Fc)作为融合配对体。此外，目前已有对抗不同免疫球蛋白Fc的各种抗体，因此可以用对抗Fc的抗体很容易地进行融合多肽的免疫分析。
“与AILIM结合的多肽”包含在上述“物质”定义中所包括的“多肽”中。
“与AILIM结合的多肽”的一个具体实例是，构成作为AILIM配体的B7h，B7RP-1，GL50，或LICOS等已知分子的多肽的全部或其一部分(Nature，Vol.402，No.6763，pp.827-832，1999；Nature Medicine，Vol.5，No.12，pp.1365-1369，1999；J.Immunology，Vol.164，pp.1653-1657，2000；Curr.Biol.，Vol.10，No 6，pp.333-336，2000)。
优选所述多肽是包含上述配体(B7h，B7RP-1，GL50，LICOS)胞外区的全部或一部分的多肽，或者包含该多肽以及免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)重链恒定区的全部或一部分的融合多肽。本文中，“胞外区”和“免疫球蛋白重链恒定区”具有如上所述的相同含义。
上述多肽，多肽的一部分(片段)，以及融合多肽不仅可以通过下述重组DNA技术来制备，还可以用本领域已知的方法来制备，如化学合成法，或细胞培养法，或它们的改良方法。
本发明的“抗体”可以是抗上述AILIM(尤其优选人AILIM)的多克隆抗体(抗血清)或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
具体的，所述抗体是具有下述活性的抗体通过结合AILIM而抑制AILIM表达细胞增殖，或者通过结合AILIM而抑制AILIM表达细胞产生干扰素γ或白细胞介素-4。
本发明的抗体可以是用抗原免疫哺乳动物而获得的天然抗体，所述抗原如本发明的AILIM表达细胞(天然细胞，细胞系，肿瘤细胞，等)，用重组DNA技术制备的、能在其表面过度表达AILIM的转化体，由AILIM组成的多肽，或者包含AILIM多肽或AILIM胞外区的上述融合多肽，所述哺乳动物如小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠和兔。本发明的抗体还包括能利用重组DNA技术制备的嵌合抗体和人源化抗体(CDR-移植的抗体)，以及能利用产生人抗体的转基因动物生成的人抗体。
单克隆抗体包括那些具有IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE任一种同种型的抗体。优选IgG或IgM。
多克隆抗体(抗血清)或单克隆抗体可通过已知方法制备。即，用上述抗原，必要时配以弗氏佐剂，来免疫哺乳动物，优选小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，家兔，猫，狗，猪，山羊，马，或牛，或者更优选小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，或家兔。
多克隆抗体可以从如此免疫的动物所获得的血清中得到。而单克隆抗体可如下制备从如此免疫的动物获得抗体生成细胞，与不能产生自身抗体的骨髓瘤细胞一起制备杂交瘤。对杂交瘤进行克隆，选出能产生对免疫该哺乳动物所用抗原具有特异性亲和力的单克隆抗体的克隆。
具体地，可如下制备单克隆抗体。以上述抗原作为免疫原，必要时配以弗氏佐剂，向非人哺乳动物的皮下、肌肉内、静脉、足垫或腹腔进行一次或多次注射或移植，以便完成免疫接种，所述哺乳动物尤其是指小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，或家兔，优选小鼠，大鼠或仓鼠(包括为了产生另一动物来源的抗体而制备的转基因动物，如下述产生人抗体的转基因小鼠)。一般情况下，初次免疫后，按照1-14天的间隔，再免疫1-4次。末次免疫的大约1-5天后，从被免疫的哺乳动物体内获得抗体生成细胞。免疫的频率和间隔可根据，例如所用的免疫原的特性进行适当安排。
分泌单克隆抗体的杂交瘤可采用Khler和Milstein的方法(Nature，Vol.256，pp.495-497(1975))或其改良法来制备。即，从如上所述免疫的非人哺乳动物获得脾、淋巴结、骨髓或扁桃体(优选脾)的抗体生成细胞，将这些细胞与不具有产生自身抗体的能力的骨髓瘤融合，其中所述骨髓瘤优选源自哺乳动物，如小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，家兔，或人，或者更优选小鼠，大鼠，或人。
例如，可采用小鼠骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)，P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)，P3/X63-Ag8.U1(P3U1)，SP2/0-Ag14(Sp2/0，Sp2)，PAI，F0，NSO，或BW5147，大鼠骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，或人骨髓瘤U-266AR1，GM1500-6TG-A1-2，UC729-6，CEM-AGR，D1R11，或CEM-T15作为用于细胞融合的骨髓瘤。
产生单克隆抗体的杂交瘤的筛选可以是，例如，在微滴板中培养杂交瘤，并用酶免疫分析(如RIA和ELISA)，来检测那些已经观察到杂交瘤生长的孔中的培养上清，对用于进行上述免疫的免疫原的反应性。
单克隆抗体可从杂交瘤来制备，具体是对杂交瘤进行体外培养，或体内培养在小鼠大鼠，仓鼠，豚鼠，或家兔(优选小鼠或大鼠，更优选小鼠)腹水中，并从所得培养上清或哺乳动物腹水中分离所述抗体。
体外培养杂交瘤可根据，例如，要培养的细胞的特性，研究的目的，以及培养方法的各种条件，利用已知的营养培养基或从已知的用于生长、维持、和贮存杂交瘤以便在培养上清中产生单克隆抗体的基本培养基衍生而来的任何应用培养基来进行。
基本培养基的实例有低钙浓度培养基和高钙浓度培养基，前者如Ham’F12培养基，MCDB153培养基，或低钙浓度MEM培养基，后者如MCDB104培养基，MEM培养基，D-MEM培养基，RPMI1640培养基，ASF104培养基，或RD培养基。基本培养基可以根据目的而包含，例如，血清，激素，细胞因子，和/或各种无机或有机物质。
单克隆抗体可以用饱和硫酸铵沉淀法，优球蛋白沉淀法，己酸法，辛酸法，离子交换层析(DEAE或DE52)，以及利用抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱进行的亲和层析，从上述培养上清或腹水中分离并纯化。
“重组嵌合单克隆抗体”是通过基因工程手段制备的单克隆抗体，尤其是指诸如鼠/人嵌合单克隆抗体之类的嵌合抗体，其可变区来自非人哺乳动物(小鼠，大鼠，仓鼠，等)的免疫球蛋白，其恒定区来自人的免疫球蛋白。
来自人免疫球蛋白的恒定区具有诸如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA，IgD，和IgE等每一同种型所特有的氨基酸序列。重组嵌合单克隆抗体的恒定区可以是属于任何同种型的人免疫球蛋白的恒定区。优选是人IgG的恒定区。
嵌合单克隆抗体可以，例如，如下制备。当然，制备方法不限于此。
小鼠/人嵌合单克隆抗体可以参照实验医学(临时增刊号)，第1.6卷，第10号(1988)；和特公平(JP-B)3-73280号公报等所述来制备。即，可以将从编码人免疫球蛋白的DNA中获得的CH基因(编码H链恒定区的C基因)，通过操作而插入从编码小鼠单克隆抗体(从产生该小鼠单克隆抗体的杂交瘤分离得到)的DNA中获得的活性VH基因(重排的VDJ基因，编码H链可变区)的下游，并将从编码人免疫球蛋白的DNA中获得的CL基因(编码L链恒定区的C基因)，通过操作而插入从编码小鼠单克隆抗体(从杂交瘤分离得到)的DNA中获得的活性VL基因(重排的VJ基因，编码L链可变区)的下游，并以能够表达的方式置于相同或不同载体上，然后用该表达载体转化宿主，再培养转化体。
具体地，先用常规方法从产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤中提取DNA，用适当的限制酶(例如，EcoRI和HindIII)消化，电泳(利用，例如，0.7％琼脂糖凝胶)，通过Southern印迹进行分析。利用，例如，溴乙锭对电泳后的凝胶染色并照相，给出该凝胶上分子量标志物的位置，用水洗2次，在0.25MHCl中浸泡15分钟。然后，将该凝胶在0.4N NaOH溶液中浸泡10分钟并轻轻摇动。用常规方法经过4个小时将DNA转移至一张膜上。将该膜用2xSSC覆盖并洗2次。将膜充分干燥后，在75℃烘烤3小时。然后，将膜用0.1×SSC/0.1％SDS在65℃处理30分钟。再将膜浸泡在3×SSC/0.1％SDS中。然后将膜用塑料袋中的预杂交液在65℃处理3-4个小时。
接下来，将32P-标记的探针DNA和杂交液加入上述袋中，在65℃反应约12小时。杂交后，膜在适当盐浓度、反应温度和时间条件(例如，2×SSC/0.1％SDS，室温，10分钟)中洗涤。将膜置于装有少量2×SSC的塑料袋中，密封后进行放射自显影。
编码小鼠单克隆抗体的H链和L链的重排型VDJ基因和VJ基因经上述Southern印迹进行分析。将包含所鉴定的DNA片段的区域通过蔗糖密度梯度离心进行分级分离，插入噬菌体载体(例如，Charon 4A，Charon 28，λEMBL3，和EMBL4)中。用该噬菌体载体转化大肠杆菌(例如LE392和NM539)，制备基因组文库。该基因组文库用适当的探针(H链J基因，L链(κ)J基因，等)经Benton-Davis法(Science，Vol.196，pp.180-182(1977))等空斑杂交技术进行筛选，获得包含重排型VDJ基因或VJ基因的阳性克隆。通过制备限制性酶谱并测定所得克隆的核苷酸序列来证实是否获得包含了所需的重排型VH(VDJ)基因或VL(VJ)基因的基因。
另外，分离出用于进行嵌合的人CH基因和人CL基因。例如，当制备与人IgG1嵌合的抗体时，分离出Cγ1基因作为CH基因，以Cκ基因作为CL基因。这些基因可以用分别对应于人Cγ1基因和人Cκ基因的小鼠Cγ1基因和小鼠Cκ基因作为探针，利用小鼠免疫球蛋白基因与人免疫球蛋白基因之间的核苷酸序列高度同源性，从人基因组文库获得。
具体地，包含人Cκ基因和增强子区的DNA片段，可以用，例如，克隆Ig146(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.75，pp.4709-4713(1978))的3kbHindIII-BamHI片段和克隆MEP10(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.78，pp.474-478(1981))的6.8kb EcoRI片段作为探针，从人λCharon 4AHaeIII-AluI基因组文库(Cell，Vol.15，pp.1157-1174(1978))中分离。还可以，例如，将人胎肝细胞DNA用HindII消化，经琼脂糖凝胶电泳分级分离，然后将5.9kb片段插入λ788，再用上述探针分离出人Cγ1基因。
利用所获得的小鼠VH基因，小鼠VL基因，人CH基因，和人CL基因，并考虑了启动子区和增强子区以后，用适当的限制酶和DNA连接酶，通过常规方法，在诸如pSV2gpt或pSV2neo等表达载体中，将人CH基因插入小鼠VH基因下游，并将人CL基因插入小鼠VL基因下游。在这种情况下，小鼠VH基因/人CH基因和小鼠VL基因/人CL基因的嵌合基因可插入相同的表达载体或分别插入不同的表达载体。
如此得到的插入了嵌合基因的表达载体可以通过原生质体融合法，DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，或电穿孔法，引入不产生抗体的骨髓瘤，例如，P3X63·Ag8·653细胞或SP210细胞中。转化体通过在含有对应于插入表达载体中的耐药基因的药物的培养基中进行培养来筛选，获得能产生所需嵌合单克隆抗体的细胞。
所需嵌合单克隆抗体可以从如此筛选得到的抗体生成细胞的培养上清中获得。
本发明的“人源化单克隆抗体(CDR-移植型抗体)”是通过基因工程制备的单克隆抗体，具体是指下述人源化单克隆抗体，其中超变区的互补决定区的一部分或全部都来自非人哺乳动物(小鼠，大鼠，仓鼠，等)单克隆抗体超变区的互补决定区，可变区的框架区来自人免疫球蛋白可变区的框架区，恒定区来自人-衍生的免疫球蛋白的恒定区。
超变区的互补决定区位于抗体可变区的超变区中，是指三个直接与抗原互补的区域(决定互补性的残基，CDR1，CDR2，和CDR3)。可变区的框架区是指在上述三个决定互补性的区域的上游、下游或之间的相对保守的区域(框架区，FR1，FR2，FR3，和FR4)。
换而言之，人源化单克隆抗体是指，除了非-人哺乳动物来源的单克隆抗体超变区的互补决定区的一部分或全部以外，所有区域被来自人免疫球蛋白的相应区域替代的抗体。
来自人免疫球蛋白的恒定区具有诸如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA，IgD，和IgE等每一同种型所特有的氨基酸序列。人源化单克隆抗体的恒定区可以是属于任何同种型的人免疫球蛋白的恒定区。优选是人IgG的恒定区。对衍生自人免疫球蛋白的恒定区框架区没有特别限制。
人源化单克隆抗体可以，例如，如下制备。当然，制备方法不限于此。
例如，衍生自小鼠单克隆抗体的重组人源化单克隆抗体可以通过诸如特表平(JP-WA)4-506458号公报和特开昭62-296890号公报所述的基因工程方法制备。即，从生成小鼠单克隆抗体的杂交瘤中分离出至少一种小鼠H链CDR基因和对应于所述小鼠H链CDR基因的至少一种小鼠L链CDR基因，从人免疫球蛋白基因中分离出编码除了对应于上述小鼠H链CDR的人H链CDR以外的全部区域的人H链基因，以及编码除了对应于上述小鼠L链CDR的人L链CDR以外的全部区域的人L链基因。
将如此分离的小鼠H链CDR基因和人H链基因通过操作引入适当载体中，使它们能被表达。类似地，将小鼠L链CDR基因和人L链基因引入适当载体中表达。或者，可以将小鼠H链CDR基因/人H链基因和小鼠L链CDR基因/人 L链基因以能够表达的方式引入同一载体中。用如此制备的表达载体转化宿主细胞，获得产生人源化单克隆抗体的转化体。通过培养所述转化体，从培养上清中获得所需人源化单克隆抗体。
“人单克隆抗体”是下述免疫球蛋白，其中包含组成免疫球蛋白的H链可变区和恒定区以及L链可变区和恒定区的整个区域都来自编码人免疫球蛋白的基因。
人抗体(优选人单克隆抗体)可以用已知的方法制备，例如，按照上述制备多克隆或单克隆抗体的相同方法，将至少一种人免疫球蛋白基因整合到非人哺乳动物如小鼠的基因座位中，产生转基因动物，然后用抗原免疫该转基因动物。
例如，生成人抗体的转基因小鼠可以按照Nature Genetics，Vol.7，pp.13-21(1994)；Nature Genetics，Vol.15，pp.146-156(1997)；特表平4-504365；特表平7-509137；Nikkei Science，No.6，pp.40-50(1995)；WO94/25585；Nature，Vol.368，pp.856-859(1994)；和特表平6-500233所述来制备。
此外，也可以采用最近开发的一种从转基因牛或猪的奶中制备人-源蛋白的技术(Nikkei Science，pp.78-84(April，1997))。
本文中表述“抗体的一部分”是指上述单克隆抗体的一部分区域。尤其指F(ab’)2，Fab’，Fab，Fv(抗体的可变片段)，sFv，dsFv(二硫键稳定型Fv)，或dAb(单区抗体)(Exp.Opin.Ther.Patents，Vol.6，No.5，pp.441-456(1996))。
“F(ab’)2”和“Fab’”可以通过将免疫球蛋白(单克隆抗体)用诸如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶进行处理来制备，它们指在免疫球蛋白中靠近两条H链之间绞链区二硫键的位置进行消化而产生的抗体片段。例如，木瓜蛋白酶在IgG的两条H链之间绞链区二硫键的上游进行切割，产生两个相同的抗体片段，其中由VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)组成的L链，由VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区)组成的H链片段在它们的C末端通过二硫键相连。上述两个相同的抗体片段都称Fab’。胃蛋白酶在IgG的两条H链之间绞链区二硫键的下游进行切割，产生一个略大的抗体片段和一个略小的片段，在该大片段中，两个如上所述的Fab’在绞链区相连。这种抗体片段称F(ab’)2。
本文中表述“肠道免疫力”，“胃肠道免疫力”，和“粘膜免疫力”表示几乎相同的含义。
本发明中“与肠道免疫力异常相伴的疾病”的优选实例有炎性肠疾病或食物过敏。
本发明中“炎性肠疾病”的代表性实例包括大肠炎(尤其溃疡性大肠炎(UC))或Crohn疾病(CD)，它们各自具有以下特征
炎性肠疾病(IBD)可以分为大肠炎(尤其溃疡性大肠炎)和Crohn疾病。这些疾病常见于青少年，一般认为是反复缓解和复发并且病因不明、难于治疗的慢性炎症疾病。
Crohn疾病是这样一种疾病，其中在从食道到肛门的整个消化道，主要是在小肠和大肠中，出现慢性肉芽肿性炎症和溃疡，症状诸如腹部疼痛，腹泄，发热，肛门异常(包括痔疮)，和/或体重下降。组织学检查可见淋巴细胞严重浸润和非干酪样的上皮样肉芽肿，提示有T细胞和抗原提呈细胞的异常反应。
大肠炎(尤其溃疡性大肠炎)是局限于大肠中的慢性炎症。它主要影响粘膜，形成痛点和溃疡。组织学检查发现，在粘膜和粘膜固有层出现淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、以及肥大细胞的显著浸润，以及与中性粒细胞浸润和杯细胞消失相伴的隐窝溃疡。
现有用于治疗本发明所述炎性肠疾病的药物是指临床处方用于治疗大肠炎(溃疡性大肠炎)和Crohn疾病的任意一或多种药物，实例有肾上腺皮质激素和柳氮磺吡啶。
本发明中的表述“可药用载体”包括赋形剂，稀释剂，填充剂，崩解剂，稳定剂，保存剂，缓冲剂，乳化剂，芳香剂，着色剂，甜味剂，增稠剂，调味剂，增溶剂，或其它添加剂。可以利用一或多种这类载体将药物组合物配制成片剂，丸剂，粉剂，粒剂，注射剂，溶液剂，胶囊剂，锭剂，酏剂，悬浮剂，乳剂，糖浆等。
药物组合物可以通过口服或非胃肠道途径给药。非胃肠道给药的其它形式包括常规开出处方的外用溶液，直肠用栓剂，以及阴道栓剂，它们可包含一或多种活性成分。
用药量可根据患者的年龄、性别、体重和症状，治疗效果，给药途径，治疗周期，药物组合物中所含活性成分(本发明上文所述的“物质”)的类型等进行改变。一般情况下，所述药物组合物的成人用药量为每次10μg-1000mg(或10μg-500mg)。根据不同情况，在有些病例中，低于上述的用药量就足够了，在另一些病例中，必需高于上述用药量。
在注射的情况下，可将抗体溶于或悬浮于无毒的可药用载体如生理盐水或市售注射用蒸馏水中，将浓度调整到0.1μg抗体/ml载体-10mg抗体/ml载体。如此制备的注射液可给予需要治疗的病人，用药量为1μg-100mg/kg体重，优选50μg-50mg/kg体重，一天一或多次。给药途径的实例是医疗上适当的给药途径，如静脉注射，皮下注射，皮内注射，肌肉注射，腹腔注射等，优选静脉注射。
注射剂也可以配制成无水稀释剂(例如，聚乙二醇，植物油如橄榄油，醇如乙醇)，悬浮剂或乳剂。
注射剂可达到无菌，方法是滤过除菌滤膜，与杀细菌剂混合，或经辐射。注射剂也可以被制成临用前才配制的形式。即，先将它冻干成无菌固体组合物，临用前将它溶于注射用的无菌蒸馏水或另一溶剂中。
利用本发明的药物组合物可以抑制、预防和/或治疗由于肠道的异常免疫力所引起的疾病，更具体是炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和大肠炎(尤其溃疡性大肠炎))和食物过敏。
而且，利用本发明的药物组合物，可以增强现有用于治疗这类炎症疾病的药物的疗效。
图1显示抗-AILIM抗体连续给药(炎性肠疾病发作前或疾病进展后)对炎性肠疾病发作的抑制效应，以及通过给药抗-AILIM抗体对炎性肠疾病的治疗效应，以作为肠炎特征的体重减轻为指标进行判定。
图2分别图示无炎性肠疾病的正常小鼠、受炎性肠疾病影响的小鼠、以及通过给药抗-AILIM抗体发现炎性肠疾病的发作受到抑制的小鼠的大肠的状态。
图3显示抗-AILIM抗体连续给药对炎性肠疾病发作的抑制效应，以作为肠炎特征的体重减轻为指标进行判定。
●阴性对照抗体(n＝20)○抗-AILIM/ICOS抗体(n＝20)□抗-B7RP-1抗体(n＝7)■将阴性对照抗体给药BALB/c scid/scid小鼠，该小鼠引入了CD4+CD45RBlowT细胞而不是CD4+CD45RBhighT细胞(n＝7)。
图4显示以组织学评分表示的肠炎严重程度。
图5显示浸润到结肠粘膜层(lamina propria)的CD4+细胞数目。
图6显示结肠组织中细胞凋亡的程度。
图7显示疾病进展后给药抗-AILIM抗体对炎性肠疾病的治疗效应，以作为肠炎特征的体重减轻为指标进行判定。
●阴性对照抗体○抗-AILIM/ICOS抗体图8显示以组织学评分表示的肠炎严重程度。
图9显示浸润到结肠粘膜层(lamina propria)的CD4+细胞数目。
图10显示抗-AILIM抗体连续给药对炎性肠疾病发作的抑制效应，以作为肠炎特征的体重减轻为指标进行判定。
●阴性对照抗体(n＝7)○抗-AILIM/ICOS抗体(n＝7)图11显示以组织学评分表示的肠炎严重程度。
图12显示浸润到结肠粘膜层(lamina propria)的CD4+细胞数目。
实施本发明的最佳模式后文中，本发明参照实施例进行具体的举例说明，但不应理解为仅限于此。
对小鼠肠炎模型中肠炎的治疗效应<试验1>
<1-1>动物使用BALB/c scid/scid小鼠，重症免疫缺陷小鼠(6-8周龄，雌性；CLEAJapan)，和正常BALB/c小鼠(6-8周龄，雄性；CLEA Japan)。
<1-2>制备抗-小鼠AILIM单克隆抗体制备过程如下。
利用编码文献报道的小鼠AILIM(Int.Immunol.，Vol.12，No.1，p.51-55，2000)全长氨基酸序列的cDNA，按照标准方法经基因重组技术制备出表达小鼠AILIM的转化细胞。
将转化细胞匀浆并超速离心(100,000xg)，收集离心后包含细胞膜级分的残渣，悬浮在PBS中。将所得细胞膜级分与完全弗氏佐剂一起注射到Wistar大鼠的足垫中，作为初次免疫(第0天)。另外，将细胞膜级分作为抗原，在第7、14和28天给药至足垫。末次免疫的2天后，收集淋巴结的细胞。
将淋巴结细胞和小鼠骨髓瘤细胞PAI(JCR No.B0113；Res.Disclosure，Vol.217，p.155，1982)按照5∶1的比例混合，以聚乙二醇4000(BoehringerMannheim)作为融合剂，使所述细胞融合，制得能产生单克隆抗体的杂交瘤。。杂交瘤通过在含有HAT、10％胎牛血清以及氨基喋呤的ASF104培养基(Ajinomoto)中培养来进行筛选。
将每一杂交瘤的培养上清与表达重组小鼠AILIM的经转染的细胞反应，然后与经FITC标记的抗大鼠IgG(Cappel)反应，用EPICS-ELITE流式细胞仪检测被染色的细胞的荧光强度，以此证实每一杂交瘤的培养上清中产生的抗小鼠AILIM的单克隆抗体的反应性。结果获得数株能产生具有对抗小鼠AILIM的反应性的单克隆抗体的杂交瘤。
将其中一种杂交瘤命名为“B10.5”。将该杂交瘤(106-107细胞/0.5mL/小鼠)注射到ICR nu/nu小鼠(雌性，7-8周龄)的腹腔中。10-20天后，将小鼠在麻醉状态下行剖腹术，按照标准方法从腹水中获得大量的大鼠抗小鼠AILIM单克隆抗体(IgG2a)。后文中，将该抗体简称为“抗AILIM抗体”。
<1-3>诱导炎性肠疾病如下所述，利用以前报道过的方法将CD45RBhigh引入BALB/c scid/scid小鼠，以此诱导炎性肠疾病(大肠炎)。已知在将CD45RBhighT细胞引入这种炎性肠疾病模型中的3-5周后，伴随着炎性肠疾病的发生和进展，会出现显著的体重下降。
利用MACS磁分离系统(Miltenyi Biotec)以及抗CD4抗体(L3T4)，从健康BALB/c小鼠脾脏来源的单核细胞中分离并获得CD4+T细胞。更具体地，将从所述小鼠分离的脾细胞与结合了抗CD4抗体的磁珠在4℃培养30min，然后洗涤这些细胞，通过磁性流过柱富集这些细胞。
将所得CD4+T细胞(用流式细胞仪证实纯度为96-97％)用带有藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠CD4抗体(RM4-5；PharMingen)和带有异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD4抗体(16A；PharMingen)标记以后，用FACS Vantage(Becton Dickinson)分选细胞，经分级分离，获得高表达CD45RB(CD45RBhigh)的T细胞和低表达CD45RB(CD45RBlow)的T细胞。
接下来，为了在BALB/c scid/scid小鼠中诱导大肠炎，将所得CD45RBhighT细胞(5×105细胞/200μL PBS)腹腔给药(i.p.)至所述小鼠。
<1-4>给药抗AILIM抗体上述每一组引入了CD45RBhighT细胞的SCID小鼠如下进行处理。
组1将抗AILIM抗体(250μg/250μL PBS)在刚刚引入CD45RBhighT细胞之后迅速腹腔给药(第一次给药)，然后以3次/周的频率连续给药。
组2将阴性对照抗体(大鼠IgG，Sigma，250μg/250μl PBS)在刚刚引入CD45RBhighT细胞之后迅速腹腔给药(第一次给药)，然后以3次/周的频率连续给药。同时，从引入CD45RBhighT细胞(第一次给药)开始计算的第8周及以后，除了给药阴性对照抗体，还以每周类似的频率连续腹腔给药抗AILIM抗体(250μg250μL PBS)。
组3将阴性对照抗体(大鼠IgG，Sigma，250μg/250μl PBS)在刚刚引入CD45RBhighT细胞之后迅速腹腔给药(第一次给药)，然后以3次/周的频率连续给药。
炎性肠疾病的进展程度，抗AILIM抗体对该疾病的发生和进展进行抑制和治疗的程度，都通过测定每一组自即将引入T细胞之前开始的一个时间段内的体重而予以分析。
结果见图1。
正如预计的那样，在仅给药阴性对照抗体的组(组3)中，伴随着炎性肠疾病的进展，体重显著下降。但在自刚刚引入CD45RBhighT细胞之后就连续给药抗AILIM抗体的组(组1)中，没有观察到任何体重下降，且炎性肠疾病的发作被彻底抑制。
而且，在自刚刚引入CD45RBhighT细胞后仅给药阴性对照抗体直至第7周、并自第8周开始除了阴性对照抗体还给药抗AILIM抗体的组(组2)中，与第8周及以后都仅给药阴性对照抗体的组(组3)相比，自抗AILIM抗体给药一开始，就观察到体重的显著增加(恢复)。可见，抗AILIM抗体能治愈炎性肠疾病。
另外，炎性肠疾病的进展程度，以及抗AILIM抗体对该疾病的发生和进展进行抑制和治疗的程度，都通过在引入T细胞的6周后，收集组1和组3的一些小鼠的大肠，用肉眼检查它们的状态来进行分析。作为正常对照，从来引入CD45RBhighT细胞且未给药抗体的BALB/c scid/scid小鼠收集大肠进行类似的观察。
结果见图2。
结果在给药阴性对照抗体的组(组3)中，观察到伴随着炎性肠疾病的进展有大肠的卷绕(肠道的增厚和缩短)，并且有未经处理的粪便。但是，抗AILIM抗体给药组(组1)的大肠状态与正常对照的大肠状态类似，表明抗AILIM抗体显著抑制炎性肠疾病的发作和进展。
对小鼠大肠炎模型中炎性肠疾病的疗效<试验2>
<2-1>动物使用免疫缺陷的BALB/c scid/scid小鼠，C57BL/6 scid/scid小鼠，和正常的BALB/c小鼠(全部为雄性，6-8周龄，CLEA Japan)。
<2-2>单克隆抗体使用抗小鼠AILIM(ICOS)单克隆抗体，抗小鼠B7RP-1(小鼠AILIM(ICOS)的配体)单克隆抗体，和阴性对照抗体。
用如上所述制备的B10.5作为抗小鼠AILIM/ICOS单克隆抗体。
抗小鼠B7RP-1单克隆抗体如下制备。用按照常规方法制备的表达小鼠B7RP-1的重组L细胞免疫SD大鼠。从经过免疫的大鼠获得脾细胞，按照标准程序与骨髓瘤细胞进行细胞融合，产生杂交瘤。用每一杂交瘤的培养上清经EIA测定其中抗小鼠B7RP-1单克隆抗体与表达小鼠B7RP-1的重组细胞(NRK细胞)结合的程度，选出产生与小鼠B7RP-1结合的抗体的杂交瘤。用于检测的抗小鼠B7RP-1单克隆抗体从所选出的杂交瘤的上清中制备。另外还证实，抗小鼠B7RP-1单克隆抗体具有抑制小鼠AILIM-Ig(含有小鼠AILIM/ICOS的可溶区和免疫球蛋白的Fc区的融合多肽)与表达小鼠B7RP-1的重组细胞结合的活性。
用不与小鼠AILIM/ICOS或B7RP-1反应的IgG(Sigma)作为阴性对照抗体。
<2-3>诱导大肠炎(炎性肠疾病)利用以前报道过的方法(J.Immunol.，Vol.164，p.4878-4882，2000)将CD4+CD45RBhighT细胞引入BALB/c scid/scid小鼠，以此诱导炎性肠疾病(大肠炎)。
利用抗CD4抗体(L3T4)MACS磁分离系统(Miltenyi Biotec)，按照说明书，从健康BALB/c小鼠脾脏细胞中分离CD4+T细胞。将CD4+T细胞(经FACS证实纯度为96-97％)用PE标记的抗小鼠CD4抗体(RM4-5；PharMingen)和FITC标记的抗CD45RB抗体(16A；PharMingen)标记以后，用FACS Vantage(Becton Dickinson)分选出CD45RBhighT细胞和CD45RBlowT细胞。
将CD45RBhighT细胞(5×105细胞/200μL PBS)腹腔给药(i.p.)至BALB/cscid/scid小鼠，以诱导大肠炎。
<2-4>用抗AILIM抗体治疗炎性大肠炎从引入CD45RBhighT细胞(第0周)开始，将抗小鼠AILIM/ICOS单克隆抗体(250μg/250μL PBS)，抗小鼠B7RP-1单克隆抗体(250μg/250μLPBS)，或对照抗体(250μg/25μL PBS)以每周3次的频率对按照上述制备的诱导了炎性大肠炎的小鼠腹腔给药7周。
另一方面，为了调查抗AILIM/ICOS抗体在进展性大肠炎情况中的疗效，从引入CD45RBhighT细胞开始，在类似于上述的条件下，将抗AILIM/ICOS单克隆抗体(浓度250μg/机体；3次/周；i.p.)对按照上述制备并诱导了炎性大肠炎的小鼠给药3周。自引入CD45RBhighT细胞开始计算的7周后，处死实验动物，分析大肠中的炎症状态。
<2-5>来自大肠炎小鼠的致病性CD4+T细胞引入小鼠自引入所述T细胞开始的7周后，用上述MACS磁珠，从引入(过继性转移)了CD4+CD45RBhighT细胞的BALB/c scid/scid小鼠的大肠粘膜层(LP)分离CD4+细胞(LP CD4+T细胞)。所分离的LP CD4+T细胞的纯度经FACS证实为95％或更高。
将LP CD4+T细胞(1×106细胞/200μL PBS；i.p.)给药BALB/c scid/scid小鼠。接着，将抗AILIM/ICOS抗体(250μg/250μL PBS)或阴性对照抗体(大鼠IgG；250μg/250μL PBS)以每周3次的频率给药实验小鼠。给药LP CD4+T细胞的4周后，对小鼠行安乐死，取出大肠，进行组织学分析。
<2-6>组织学检查和免疫组织化学染色从上述每一组实验动物收集大肠组织样品，将它们固定在含6％福尔马林的PBS中。经石蜡固定的大肠组织切片(5μm)用苏木精和伊红染色(HE染色)。分析每一组织切片标本。按照现有报告(Gastroenterology，Vol.119，p.715-723，2000，将大肠炎症的程度转化为分值。
另一方面，将用于免疫组织化学染色分析的大肠样品固定在OCT化合物中，于液氮中冷冻，-80℃贮存。组织切片的染色用亲和素-生物素复合体法进行。
将组织切片(6μm)与生物素化抗小鼠AILIM/ICOS单克隆抗体、生物素化抗小鼠B7RP-1单克隆抗体、生物素化抗小鼠CD4单克隆抗体(RM4-5；大鼠IgG1；PharMingen)、生物素化抗小鼠F4/80单克隆抗体(大鼠IgG2；PharMingen)，或同种型-匹配的生物素化对照抗体(PharMingen)一起保温。生物素化抗体用链霉亲和素-生物素化辣根过氧化物酶复合体(VectastainABC Kit；Vector)检测，用联苯胺显示。接着，每一切片用苏木精复染。
<2-7>检测凋亡细胞冰冻切片中的凋亡细胞用ApoTag试剂盒(Intergen)按照以前报道的TUNEL法进行检测。在显微镜下计数浸润至一张切片的5个部分的500个粘膜层单核细胞(LPMC)中TUNEL阳性细胞的量，从而定量组织切片中的TUNEL阳性细胞。以500个LPMC中TUNEL阳性细胞的百分率作为凋亡指数。
<2-8>结果结果见图3-图12。
<2-8-1>给药抗AILIM/ICOS抗体抑制大肠炎在给药阴性对照抗体(大鼠IgG)的小鼠(对照小鼠)中，引入CD45RBhighT细胞后4-7周，出现严重大肠炎，体重明显下降(图3)，大肠肠壁明显增厚，并伴有腹泄和炎症。
在对照小鼠中，以透壁炎症为特征的组织学分值(指示大肠炎的严重性)的平均值(第7周)为5.9±1.2(图4)，在所述透壁炎症中，粘膜层和粘膜下层观察到大量淋巴细胞，伴随着杯细胞的减少，出现隆起性上皮肥厚。
另一方面，经抗AILIM/ICOS抗体处理的小鼠完全健康，未见大肠炎的症状，也未见大肠壁的增厚，反而体重不断增加(图3)。而且，在这些经过抗AILIM/ICOS抗体-处理的小鼠(n＝7)中，大肠壁组织的组织学分值为0.8±0.7，未见明显的病态改变(图4)。
在出现炎症的大肠炎小鼠(对照小鼠)的大肠粘膜层中，观察到的CD4+T细胞的平均数为44±9×105细胞/大肠，而在经抗AILIM/ICOS抗体处理的小鼠中为21±3×105细胞/大肠(p＜0.01)(图5)。
<2-8-2>抗AILIM/ICOS抗体在组织浸润性单核细胞中诱导凋亡在给药抗AILIM/ICOS抗体的小鼠中，与经阴性对照抗体处理的小鼠(对照小鼠)相比，可观察到凋亡细胞明显增加(其中大多数为组织浸润性单核细胞)。
通过对大肠中凋亡细胞的定量分析得到的凋亡指数，在给药抗AILIM/ICOS抗体的小鼠(n＝5)中显著高于在给药对照抗体的小鼠(对照小鼠)中(图6)。
这些结果表明，经过抗AILIM/ICOS抗体处理导致的对大肠炎的抑制效应是由于除去了表达AILIM(ICOS)的致病性T细胞。
<2-8-3>症状进展后给药抗AILIM/ICOS抗体对大肠炎的抑制效应体重下降和淋巴细胞向大肠组织的浸润(作为上述大肠炎模型小鼠的症状之一的消耗性疾病)分别于引入CD45RBhighT细胞的大约3周后或大约2周后开始。因此，如上所述，自引入所述T细胞的3周后开始给药抗AILIM/ICOS抗体。
在抗AILIM/ICOS抗体-给药组，体重明显增加(图7)且未发现腹泄。
对每组小鼠的大肠组织切片进行组织学分析，结果表明，在抗AILIM/ICOS抗体给药组的大肠组织中比在给药阴性对照抗体的小鼠(对照小鼠)中，肉芽肿炎症、淋巴细胞浸润以及上皮肥厚症状都显著减轻。炎症的变化可见于粘膜层，一些例子中，还可见于伴有粘膜下组织的淋巴细胞中度浸润的病灶中，但未见于肌肉层。此外，上述指示大肠炎严重性的组织学分值(在第7周收集大肠)，在给药抗AILIM/ICOS抗体的小鼠中(1.62±0.81)显著低于在给药阴性对照抗体的小鼠(对照小鼠；5.93±1.23)中(p＜0.05；图8)。而且，浸润的CD4+T细胞(第7周)的量在给药抗AILIM/ICOS抗体的小鼠中(5.50±0.7×106细胞)显著低于在对照小鼠(31.3±7.7×106细胞)中(p＜0.05；图9)。
<2-8-4>抗AILIM/ICOS抗体对引入来自大肠炎供体的粘膜层CD4+T细胞所诱导的大肠炎的抑制效应为了调查抗AILIM/ICOS抗体对致病性T细胞的疗效，如上所述，将来自大肠炎小鼠的LP CD4+T细胞给药BALB/c scid/scid小鼠以诱导大肠炎，然后给药抗AILIM/ICOS抗体。
在给药抗AILIM/ICOS抗体的小鼠中，体重下降(图10)的状况得到明显改善。此外，指示大肠炎严重性的组织学分值(在第4周收集大肠；图11)和infiltration of CD4+细胞向大肠粘膜层的浸润(第4周)(图12)也显著低于给药阴性对照抗体的小鼠(对照小鼠)。
工业实用性本发明的药物组合物(特别优选包含诱导AILIM/ICOS表达细胞死亡、凋亡，或耗竭的活性)非常有用于抑制、防止、和/或治疗因肠道免疫力异常所引起的疾病，具体是炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和大肠炎(溃疡性大肠炎等))和食物过敏。
本发明的药物组合物当与现有用于治疗这类疾病和食物过敏的处方药联合应用时，能提高对炎性肠疾病的疗效。
此外，含有抗AILIM的人抗体的药物组合物也包括在本发明的药物组合物范畴内，它非常有用于作为药物，因为它不会出现诸如因将小鼠来源的抗体对人给药而过敏等任何副作用。
权利要求
1.一种药物组合物，用于抑制、治疗或预防与肠道的异常免疫力相伴的疾病，该药物组合物包含具有调节经由AILIM进行的信号传导的活性的物质和一种可药用载体。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述物质具有诱导AILIM-表达细胞死亡的活性。
3.权利要求1或2的药物组合物，其中所述疾病是炎性肠疾病。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述炎性肠疾病是大肠炎。
5.权利要求3的药物组合物，其中所述炎性肠疾病是Crohn疾病。
6.权利要求1或2的药物组合物，其中所述疾病是食物过敏。
7.权利要求1-6之一的药物组合物，其中所述物质是蛋白性质的物质。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述蛋白性质的物质选自a)与AILIM结合的抗体，或其一部分；b)含有AILIM的完整胞外区的多肽，或其一部分；c)一种融合多肽，包含AILIM胞外区的全部或一部分以及免疫球蛋白重链恒定区的全部或一部分；或d)与AILIM结合的多肽。
9.权利要求1-6之一的药物组合物，其中所述物质为非蛋白性质的物质。
10.权利要求9的药物组合物，其中所述非蛋白性质的物质是DNA，RNA，或经化学合成的化合物。
全文摘要
抗AILIM抗体(也称ICOS和8F4)被发现显著抑制炎性肠疾病(尤其Crohn疾病和肠炎(溃疡性大肠炎等))的发作，并具有针对炎性肠疾病的显著治疗效果。
文档编号C07K16/18GK1537017SQ0281074
公开日2004年10月13日 申请日期2002年2月18日 优先权日2001年3月27日
发明者渡边守 申请人:日本烟草产业株式会社