Epf受体测定,化合物和治疗组合物的制作方法

专利名称：Epf受体测定,化合物和治疗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及测定能与早孕因子(EPF)，又被称为侣伴蛋白(chaperonin)10和EPF相关肽的受体相互作用的化合物的底物，以及它的治疗用途。
背景技术：
EPF和线粒体侣伴蛋白10具有相同的氨基酸序列(SEQ ID NO4)，尽管它们可能是由不同的基因编码的(Summers等，1998)，并且具有差别很大的生物学功能。另外，EPF是一种分泌的肽，而侣伴蛋白10随同分泌途径一起存在于细胞内小泡中。
侣伴蛋白10属于热激蛋白家族。在线粒体中，它与热激蛋白60形成侣伴蛋白复合体，该复合体对于线粒体蛋白折叠和功能来说是重要的。在缺血情况下，这两种蛋白的上调能够保护大脑组织以及心肌细胞(Lau等，1997)抗缺血/再灌注损伤(Hickey等，2000)。
到目前为止，EPF的已知主要作用是在植入前阶段和植入周围阶段作为胚胎发育中的重要因子(Athanasas-Platsis等，2000)。它在这两个阶段的重要性是基于它的生长调节和免疫调节特征。EPF的这些作用还表现在它是通过增殖原代和肿瘤细胞而产生的，在这里，它在体外和体内都起着自分泌生长因子的作用(Morton，1998)。
EPF的存在业已被反复证实为成功妊娠所不可缺少的。最近，Cheng SJ等(Am.J.Reprod.Immunol.2000 Oct；44(4)211-3)证实，在手术流产之后EPF水平迅速下降，并因此提出，监测EPF活性是正常妊娠的胚胎护理和发育的有用指数。因此，抑制EPF的活性可以具有避孕作用，而提高EPF活性具有防止流产的作用。
在受精以后6-12小时内，EPF就已经分泌到母体血清中，因此，EPF或EPF-衍生的或相关的肽可以作为诊断妊娠的有用的早期标记。所述诊断可用于人类医学以及兽医学目的。目前使用的EPF测定(例如，花结试验)麻烦而且不可靠。另外，它们不能区分各种形式的EPF。因此，基于对具有EPF活性的多肽特异的抗体的试验或能区分各种形式EPF的测定(例如，基于层析和/或质谱分析)具有显著的优点。EPF活性业已反复被证实为成功妊娠所不可缺少的。最近，Cheng SJ等(Am.J.Reprod.Immunol.2000 Oct；44(4)211-3)证实了在手术流产之后EPF水平迅速下降，并因此提出监测EPF活性是可以测定胚胎正常和正常妊娠发展的有用指数。因此，抑制EPF活性具有避孕作用，而提高生理学或纠正异常的EPF活性具有防止流产的作用。
业已发现，妊娠对多发性硬化的发展具有正面影响，因为在妊娠期间降低了复发的比例(Confavreux等，1998)。正如Morton(1998)所指出的，EPF‘被认为是在妊娠期间所观察到的多发性硬化的改变相关的主要因素之一’。对于另一种自身免疫病——类风湿关节炎来说，也观察到了EPF在妊娠期间对免疫抑制作用的正面影响(Davis和Maslow，1992)。
EPF和侣伴蛋白10在人类系统中的潜在活性使得这种肽成为鉴定能增强或减弱这种肽的生物学活性的化合物的研究的目标。不过，尽管业已证实了EPF和侣伴蛋白10的结合位点的存在，但是没有鉴定到所述肽的受体。已知受体的缺乏，妨碍测定的设计，并且阻碍了发现和研究能模拟或改变EPF或侣伴蛋白10的生物学作用的化合物的努力。
本发明解决了本领域中的这一问题，因为反相药理学业已导致了作为EPF或侣伴蛋白10的受体蛋白的人类背根受体(hDRRs)的鉴定。通过这一发现，本发明人进一步证实了EPF的免疫调节特征，因为证实了hDRR受体是在淋巴结中表达的，并且将hDRRs作图于染色体11p15上，使它们与多种成淋巴细胞白血病相联系。还提供了用于鉴定能模拟或改变EPF或侣伴蛋白10的生物学作用的化合物的测定方法，以及它的药理学用途。
HDRRs属于G蛋白偶联的受体(GPCRs)家族，它们具有共同的结构组成，其特征是一个细胞外N-末端，7个疏水性α螺旋，推测它们构成了跨膜结构域，以及一个细胞内C-末端结构域。GPCRs能结合多种配体，它能通过转导G蛋白的激活，启动细胞内信号(Caron等，Rec.Prog.Horm.Res.48277-290(1993)；Freedman等，Rec.Prog.Horm.Res.51319-353(1996))。
最近的综述(Stadel等，1997；Wilson等，1998)统计了被用作可用作商业药物的GPCRs的数量为25，它占140种业已表征的克隆的人GPCRs的18％。从完全测序的基因组(酵母，C.elegans)到预期的30.000个人类基因的外推，导致了预期在今后3年内将发现5000个人GPCRs。与现有的数字类似，这些新的孤独GPCRs中的150种在今后10年内将开发成具有商业价值的药物的目标。这一计算结果没有考虑其他表征过的GPCRs，它们目前是开发中的化合物的基础。
一般，公平地讲，孤独GPCRs的反相药理学将产生治疗各种疾病的新方法，这些方法将挑战现有的方法或可以治疗不能用现有方法治疗的症状。这一点业已得到了制药行业的认可，正如最近的有关孤独GPCR配体鉴定(orphanin FQ(Reinscheid等，1995)，orexin(Sakurai等，1998)，促乳素释放肽(Hinuma等)，apelin(Tatemoto等，1998)的文献所表明的。
在
公开日为1999年7月1日的PCT申请WO99/32519A1中披露了人类背根受体1-6的核酸和多肽序列。根据它们与大鼠背根受体的同源性，该文献披露了hDRR受体参与疼痛的传递、调节和感觉，包括其在用于鉴定麻醉和止痛的新试剂的测定中的用途。在该PCT申请中，背根神经节定位业已证实了hDRR5位于胚胎背根神经节中。不过，由于目前检查过的人类成年组织，包括背根神经节，都不能检测到hDRR特异性杂交信号，此外，由于在此申请(WO99/32519A1)中披露的hDRR受体都不能鉴定到天然配体，本发明人不能证实，根据血管紧张素II和III对这种受体的刺激作用，在上述申请(WO99/32519-A1)中将hDRR4确定为血管紧张素受体。
对另一种人类背根受体hDRR7来说，其核酸和多肽序列披露于2001年3月8日公开的PCT申请WO01/16159-A1和2001年3月22公开的WO01/19983-A1中。在上述两份文献中都没有确定hDRR7受体的配体。在PCT申请WO01/16159-A1中，hDRR7受体被称作TheAnt，并且披露了与所述多肽相关的多种状况。不过，没有提供明显的证据将该受体与任何所列出的疾病状态相联系。在PCT申请WO01/19983中，hDRR7受体通常被称为GPCR，它与抑制生长素3受体具有低的序列相似性。
因此，尚未披露采用与hDRRs的天然配体的竞争，或采用hDRRs与天然配体的相互作用的比较的测定方法。后者对于将hDRRs用作药理学工具，以便揭示受体功能和与疾病状态的关系来说是必要的。本发明解决了本领域的这一问题，并且提供了采用hDRRs和EPF或EPF相关肽的相互作用的测定，以便确定一种候选化合物是hDRRs的配体、激动剂或拮抗剂。
只是在最近，Lembo等(Nature Neuroscience 5，201-209(2002))证实了hDRR4受体，又被称作感觉神经元特异性G蛋白偶联的受体4(SNSR4)或Mas相关基因受体1(hMrgXl)有可能是通过阿片样肽前体脑啡肽原A的基因产物激活的。在基于FLIPR的钙测定方法中，特别是已知参与伤害感受的BAM22和BAM22片段被证实激活了hDRR。
在本发明中，证实了EPF和EPF相关肽能激活hDRR4和hDRR7受体。另外，证实了hDRR4主要是在背根和三叉神经节中表达的(Lembo等，Nature Neuroscience 5，201-209(2002))，而对于hDRR7来说，业已证实该受体主要是在淋巴结中表达的。这种受体特异性表达形式表明了对配体激活反应的不同功能。
因此，如果人们能够设计出可用于治疗与受体相关的疾病的受体特异性化合物，将是有利的。将EPF和EPF相关肽确定为hDRR4和hDRR7的配体，现已提供了开发体外筛选方法的基础，以便用于鉴定能够调节hDRR在疼痛传递、调节和感觉中的参与的化合物。另外，可将其用作避孕药，用于麻醉和镇痛，并且用于鉴定能够调节hDRR介导的疾病的化合物或防止移植排斥，所述疾病如类风湿关节炎，多发性硬化或需要免疫抑制作用的其他状况，如炎性肠病(IBD)。
下面将对本发明的上述及其他方面作更详细的说明。
发明概述本发明提供了用于研究EPF或EPF相关肽与hDRR受体的相互作用的测定。所述测定可用于鉴定一种测试化合物是否能在EPF或EPF相关肽可以结合所述受体的条件下结合hDRRs。所述测定还可用于确定所述测试化合物是hDRRs的激动剂还是拮抗剂。上述测定可以用多种方式进行，包括竞争性、非竞争性和比较性测定，其中，EPF或EPF相关肽与hDRRs的相互作用是作为阳性对照或阴性对照评估的，或者与用所述测试化合物获得的结果进行比较。
另一方面，本发明涉及编码具有氨基酸序列(AFRKFLPLFDRVLVERSA(SEQ ID NO8))的EPF的hDRR结合片段的分离的和纯化的多肽和多核苷酸分子，以及它的诊断和治疗用途。
因此，本发明涉及编码能够结合并且激活hDRR受体，具有氨基酸序列((LGKAFRKFLPLFDRVLVE(SEQ ID NO18))，((LGQAFRKFLPLFDRVLVE(SEQ ID NO19))，((LGKAFRKFLPLFDRVL(SEQID NO20))和((LGQAFRKFLPLFDRVL(SEQ ID NO21))的EPF相关肽的分离的和纯化的多肽和多核苷酸分子，以及它的治疗和诊断用途。
在另一种实施方案中，本发明涉及含有通过本发明提供的测定鉴定的化合物的药物组合物，以及它作为避孕药和与某些疾病的治疗相关的治疗用途，包括，癌症，如移行细胞癌，脂肉瘤，腺癌，弥散性大B-细胞淋巴瘤，淋巴细胞白血病，成淋巴细胞白血病，成髓细胞白血病，粒单核细胞白血病，骨肉瘤；难治性贫血，以及用于治疗自身免疫疾病，如类风湿关节炎，多发性硬化或如炎性肠病(IBD)那样需要免疫抑制作用的其他状况或防止移植排斥。
在另一方面，本发明提供了一种用于从含有hDRR的细胞级份中分离hDRR的方法，包括让所述细胞级份与固定在溶质基质上的EPF或它的hDRR结合片段接触，并且由其洗脱hDRR。
附图简述

图1A-示出了hDRR4的核苷酸编码序列(SEQ ID NO1)(起始密码子和终止密码子用粗体字表示)图1B-示出了hDRR4的氨基酸序列(SEQ ID NO2)图2-在与Gα16-pcDNA瞬时共转染到Hek293中之后，通过猪下丘脑提取物C18级份激活孤独GPCR hDRR4。通过用Fluo-4(MolecularProbes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞，并且在FLIPR仪器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，U.S.A.)中分析细胞的Ca2+瞬变(transients)，测定相对光单位(RFU)。
图3-在与Gα16-pcDNA瞬时共转染到Hek293中之后，EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)在150nM的测试浓度下对孤独GPCR hDRR4(SEQ ID NO2)的激活作用。通过用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞，测定相对荧光单位(RFU)。
图4-在用Gα16-pcDNA瞬时共转染到Hek293中之后，通过测试浓度为150nM的EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)激活孤独GPCRhDRR7(SEQH)NO12)。通过用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞测定相对荧光单位(RFU)。
图5-与被视作100％的淋巴结表达相比，hDRR7在多种组织中的相对表达。用实时定量PCR测定表达水平。
图6-与人亲环蛋白在评估的组织中的相对表达相比，hDRR4在多种组织中的相对表达。表达水平是通过实时定量PCR水平测定的。
图7-通过用FLIPR钙测定确定的EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)对hDRR4受体的剂量反应曲线。
图8-通过用FLIPR钙测定确定的EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)对hDRR7受体的剂量反应曲线。
图9-通过FLIPR钙测定确定的EPF相关肽EPF1-16(SEQ ID NO19)和EPF1-18(SEQ ID NO21)对hDRR4受体的剂量反应曲线。
图10-通过FLIPR钙测定确定的EPF相关肽EPF1-16(SEQ ID NO19)和EPF1-18(SEQ ID NO21)对hDRR7受体的剂量反应曲线。
详细说明本发明提供了利用EPF或EPF相关肽与hDRR受体的相互作用的测定。EPF，又称之为侣伴蛋白10和EPF相关肽，是hDRRs的高亲和力配体，它在与所述受体结合之后能激活所述受体，并且导致磷脂酶C的激活，这种酶能水解膜中的肌醇脂类，以便释放三磷酸肌醇，后者又能在细胞内转移钙。该测定提供了鉴定作为hDRR的配体或hDRR受体的激动剂或拮抗剂的化合物的方法，以及它们在治疗患者方面的用途。
在本文中，“EPF或EPF相关肽”表示早孕因子，又称之为侣伴蛋白10，它具有氨基酸序列SEQ ID NO4或EPF相关肽，其中，所述相关肽通过编码EPF的氨基酸序列上的一个或若干个氨基酸的取代、缺失和/或添加而来源于上述序列，并且，其中，所述EPF相关肽能够结合本发明的hDRR4受体蛋白。在一种优选实施方案中，所述EPF相关肽包括由SEQ ID NO8编码的hDRR结合区。在另一种实施方案中，所述EPF相关肽包括由SEQ ID NO8编码的hDRR结合区。在另一种实施方案中，EPF相关肽包括选自下组的氨基酸序列((LGKAFRKFLPLFDRVLVE(SEQ ID NO18))，((LGQAFRKFLPLFDRVLVE(SEQ ID NO19))，((LGKAFRKFLPLFDRVL(SEQ ID NO20))和((LGQAFRKFLPLFDRVL(SEQ ID NO21))。在本发明的另一方面，EPF相关肽包括具有选自(SEQ ID NO18)，(SEQ ID NO19)，(SEQ ID NO20)和(SEQ ID NO21)的氨基酸序列的肽。
在一种具体实施方案中，在本发明的测定中的hDRR受体多肽是包括氨基酸序列SEQ ID NO2或它的片段的hDRR4受体蛋白，或者是包括氨基酸序列SEQ ID NO12或它的片段的hDRR7受体蛋白。
术语“它的片段”表示其序列披露于本发明中的蛋白分子的一个片段或亚片段，以便所述片段包括5个或5个以上在亲本蛋白中连续的氨基酸。术语“它的片段”意在包括“功能性片段”，其中，所述分离的片段、部分或亚区域包括功能上独特的区域，如所述受体蛋白的活性位点，结合位点或磷酸化位点。功能性片段可以通过克隆技术生产，或作为另一种剪接技术的天然产物。
术语“源于”表示其序列披露于本发明中的蛋白分子的部分或亚区域，以便所述部分或亚区域与亲本序列具有高度的序列相关性。所述相关性可以通过测定与亲本序列的序列同一性程度定量，其中，高度的序列相关性表示通过局部比对测定与亲本序列具有至少70，80，90，95或99％同一性的分离的肽或多肽。
用于比较两种或两种以上序列的同一性和相似性的方法为本领域所熟知。因此，举例来说，可以使用在Winconsin序列分析软件包，9.1版中所提供的程序(Devreux J.等，Nucleic Acid Res.，12，387-395，1984)，例如，程序BESTFIT和GAP测定两种多核苷酸之间的百分同一性，和两种肽或多肽序列之间的百分同一性和百分相似性。BESTFTT使用Smith和Waterman(J.Mol.Biol.，147，195-197，1981)的“局部同源性”算法，并且寻找两个序列之间的相似性的最佳单一区。BESTFTT更适合比较在长度方面不同的两种多核苷酸或两种肽或多肽序列，该程序假设，较短的序列表示较长序列的一部分。在比较时，根据Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.，48，443-453，1970)，GAP比对两个序列，寻找“最大相似性”。GAP更适合比较长度大致相同的序列，并且，预计比对是在整个长度上进行的。对于多核苷酸序列来说，在每一种程序中使用的参数“空位权重”和“长度权重”优选为50和3，而对于多核苷酸和多肽序列来说分别为12和4。百分同一性和相似性优选是在对两种要比较的序列被最佳比对时确定的。用于测定序列之间的同一性和/或相似性的其他程序在本领域中也是已知的，例如，BLAST程序族(Altschul SF等，NucleicAcids Res.，253389-3402，1997)。
在本文中，“化合物”是任何大小的有机或无机原子组合体，并且包括小分子(小于大约2500道尔顿)或较大分子，例如肽，多肽，完整蛋白和多核苷酸。
在本文中，“测试”化合物是用于实验的化合物，以便评估所述测试化合物是否是hDRR受体多肽的配体。测试化合物还可以是hDRR受体的激动剂或拮抗剂。无论所述测试化合物是否是实际配体，都在本发明的测定中确定hDRR多肽的激动剂或拮抗剂。
在本文中，“配体”是一种能够结合hDRR受体的化合物，其中，在与所述受体结合之后，配体-受体复合体的构像的可能的变化会通过第二信使导致所述生物学反应的转导。所述配体可以是所述受体的激动剂或拮抗剂。
在本文中，“激动剂”是能与hDRR受体的多肽相互作用并且激活它的化合物。被激活的hDRR受体多肽诱导了与所述受体关联的生物化学途径的改变，例如，可以通过G蛋白刺激GTP的清除，激活腺苷酸环化酶途径或激活磷脂酶C途径。
在本文中，“拮抗剂”是能与hDRR受体的多肽相互作用，并且抑制或阻止它的激活的化合物。
多核苷酸因此，本发明的第一种实施方案涉及将编码hDRR或它的片段的分离的和纯化的核酸分子用于一种测定方法中的用途，其中，所述核酸是RNA，DNA，cDNA或基因组DNA，所述测定方法利用了EPF和相关肽与hDRR受体之间的相互作用。
在第二种实施方案中，本发明涉及编码EPF或相关肽的分离的和纯化的核酸分子在利用EPF和相关肽与hDRR受体之间的相互作用的测定中的用途，其中，所述核酸分子是RNA，DNA，cDNA或基因组DNA。
在本文中，“分离的”表示相关的多核苷酸、蛋白和多肽或它的相应的片段业已离开它们的体内环境这一事实，以便本领域技术人员可以对它们进行操作，例如，但不局限于测序，限制消化，定点诱变和亚克隆到一个核酸片段的表达载体上，以及获得足够提供产生多克隆抗体、单克隆抗体，氨基酸测序和肽消化的机会的量的蛋白或蛋白片段。因此，本发明要求保护的核酸可存在于完整细胞中或以部分，基本上或完全纯化的形式存在于细胞裂解物中。
当一种多核苷酸从环境污染物中纯化时，就认为它是“纯化的”。因此，当通过标准方法从细胞成分中纯化时，就认为从细胞分离的多核苷酸是基本上纯化的；而当从化学前体中纯化时，就认为化学合成的核酸序列是基本上纯化的。“基本上纯的”蛋白或核酸通常包括至少85％的样品，优选具有更高的百分比。用于测定蛋白或核酸分子纯度的一种方法是，在诸如聚丙烯酰胺或琼脂糖的基质中对一种制剂进行电泳。纯度是通过在染色之后单一带的出现证实的。用于评估纯度的其他方法包括层析、质谱法和分析离心。
术语“它的片段”表示其序列披露于本发明中的核酸分子的部分或亚区域，以便所述片段包括在亲本核酸分子中连续的15或更多个核苷酸。术语“它的片段”意在包括“功能性片段”，其中，分离的片段、部分或亚区域包括功能上独特的区域，如一种受体的活性位点，结合位点或磷酸化位点。功能性片段可以通过克隆技术产生，或者作为其他剪接技术的天然产物产生。
具体地讲，本发明包括编码hDRR4的分离的和纯化的核酸分子或它的片段在本发明测定中的用途，所述核酸分子包括选自下组的成员(a)编码包括SEQ ID NO2的氨基酸序列的hDRR4的核酸分子；(b)编码hDRR4的包括SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子；(c)互补于(a)或(b)的多核苷酸的核酸分子；(d)包括(a)，(b)或(c)的多核苷酸的至少15个连续碱基的核酸分子；(e)在严格条件下与(a)，(b)或(c)的多核苷酸分子杂交的核酸分子；或(f)编码hDRR4蛋白的核酸分子，它包括由于遗传密码而简并成(a)-(e)中任意一项的多核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一种更优选的实施方案中，所述hDRR4编码核酸分子由SEQ ID NO1组成。
因此，本发明包括编码hDRR7的分离的和纯化的核酸分子或它的片段在本发明测定方法中的用途，所述核酸分子包括选自下组的成员(a)编码包括SEQ ID NO12的氨基酸序列的hDRR7的核酸分子；(b)编码hDRR7的包括SEQ ID NO11的核苷酸序列的核酸分子；(c)互补于(a)或(b)的多核苷酸的核酸分子；(d)包括(a)，(b)或(c)的多核苷酸的至少15个连续碱基的核酸分子；(e)在严格条件下与(a)，(b)或(c)的多核苷酸分子杂交的核酸分子；或(f)编码hDRR7蛋白的核酸分子，它包括由于遗传密码而简并成(a)-(e)中任意一项的多核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一种更优选的实施方案中，hDRR7编码核酸分子由SEQID NO11组成。
在另一种实施方案中，本发明涉及编码EPF或EPF相关肽的分离的和纯化的核酸分子在本发明测定方法中的用途，包括选自下组的成员(a)编码包括SEQ ID NO4的氨基酸序列的EPF的核酸分子；(b)互补于(a)的多核苷酸的核酸分子；(c)包括(a)或(b)的多核苷酸的至少15个连续碱基的核酸分子；(d)在严格条件下与(a)或(b)的多核苷酸杂交的核酸分子；或(e)编码EPF相关肽的核酸分子，所述肽与由(a)或(b)的多核苷酸分子所编码的氨基酸序列具有70，80，90，95或99％的序列同一性；(f)编码EPF多肽的核酸分子，它包括由于遗传密码而简并成(a)-(d)中任意一项的多核苷酸的核苷酸序列的核苷酸序列。
在本发明的一种更优选的实施方案中，所述EPF编码核酸分子由SEQ ID NO3组成，而EPF相关肽由具有选自下组的氨基酸序列的多肽组成SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21，或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段的氨基酸序列。
本领域技术人员应当理解的是，由于遗传密码的简并性，可以将核苷酸碱基对的多种“沉默”取代导入SEQ ID NO1，SEQ ID NO11或SEQ ID NO3所示的序列中，而不改变所编码的氨基酸或蛋白产物的性质。所有这样的取代都被认为属于本发明的范围。
本文所使用的术语“互补的”或“互补性”表示嘌呤和嘧啶核苷通过氢键缔合以便形成双链核酸分子的能力。以下碱基对通过互补性相关联鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。在本文中，“互补的”表示上述关系适用于基本上所有的碱基对，包括在所述分子的整个长度上的两个单链核酸分子。“部分互补的”表示在上述关系中，两个单链核酸分子中的一个长度比另一个短，以便一个分子的一部分保持是单链的。
本文所使用的术语“杂交”表示单链核酸分子通过核苷酸碱基配对与互补链结合的过程。
术语“严格性”表示杂交条件。高严格性条件不利于非同源碱基配对，低严格性条件具有相反的作用。例如，严格性可以通过温度和盐浓度加以改变。“严格条件”表示在42℃下，在含有50％甲酰胺，5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml变性的、剪切的鲑鱼精子DNA的溶液中温育过夜，然后在大约65℃下，在0.1×SSC中洗涤滤膜。其他合适的杂交条件披露于实施例中。
编码hDRRs的核酸序列优先在背根神经节中表达(PCT公开号WO99/32519-A1)，并且所述神经节可以用作分离编码所述受体的核酸的来源。其他细胞和细胞系可能也适用于分离hDRR核酸。合适细胞的选择可以通过在本文所披露的细胞提取物或全细胞测定中筛选hDRR活性而完成。在上述任一种测定中具有背根受体活性的细胞都适合分离hDRR核酸。
本领域已知的多种方法中的任意一种都适用于hDRR核酸的分子克隆。在一种方法中，分离mRNA，并且合成第一条cDNA链。可以进行第二轮DNA合成，以便生产第二条链。然后通过根据纯化的hDRR蛋白的氨基酸序列设计简并寡核苷酸引物或通过用源于基因组DNA序列的序列特异性引物进行的DNA合成，进行hDRR DNA片段的特异性PCR扩增，可以获得分离的cDNA。
优选的一组引物由hDRR4正向引物(CAGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAAC)(SEQ ID NO5)或它的由SEQID NO5的15-34号核苷酸组成的片段、hDRR4反向引物(GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC)(SEQ ID NO6)或它的由SEQ IDNO6的9-30号核苷酸组成的片段、hDRR7正向引物(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(SEQ ID NO13)、和hDRR7反向引物(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(SEQ ID NO14)组成。如果需要，可以将双链cDNA克隆到任何合适的载体上，例如，质粒，以便形成cDNA文库。另一种方法是使用针对SEQ ID NO1或SEQ ID NO11的任何合适区域的标记过的寡核苷酸探针筛选用噬菌体或质粒穿梭载体构建的cDNA文库，例如，参见PCR ProtocolsAGuide to Method and Application，Ed.M.Innis等，Academic Press(1990)。
用于在诸如质粒或噬菌体的合适载体中构建cDNA文库，以便在原核或真核细胞中繁殖的方法为本领域技术人员所熟知[例如，参见Maniatis等，同上]。合适的克隆载体是众所周知的，并且可以广泛获得。
本领域技术人员显而易见的是，可以将其他类型的文库以及通过其他细胞或细胞类型构建的文库用于分离本发明的核酸序列。其他类型的文库包括，但不局限于源于其他细胞，人类和小鼠以外的生物体的cDNA文库，和基因组DNA文库，包括YAC(酵母人工染色体)和粘粒文库。基因组DNA文库的构建可以通过本领域众所周知的标准技术进行。众所周知的基因组DNA文库构建技术，可以在以下文献中查阅到T.Maniatis等Molecular CloningA Laboratory Manual，2d Ed.Chap.14(1989)。
技术人员可以理解的是，在很多场合下，分离的cDNA序列是不完整的，因为编码所述多肽的区域在cDNA的5’末端缩短。这是逆转录酶作用的结果，逆转录酶是一种固有低‘持续合成能力’(在聚合反应期间所述酶保持与模板连接能力的指标)的酶，在第一链cDNA合成期间不能完成mRNA模板的DNA拷贝。
有若干种用于获得全长cDNAs或延长短cDNAs的方法为本领域技术人员所熟知，例如，基于cDNA末端快速扩增的方法(RACE)(Frohman等，1988，PNAS USA 85，8998-9002)，或该技术的最新的改进形式。
多肽本发明还涉及hDRR受体蛋白或它的片段在利用了EPF和相关肽与hDRR受体的相互作用的测定中的用途，其中，所述多肽是由本发明的分离的和纯化的核酸分子编码的。
在本发明的另一方面，hDRR受体蛋白是选自下组的hDRR4受体i)编码具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的分离的和纯化的蛋白；ii)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的受体蛋白的细胞；或iii)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞的膜制备物。
在一种优选实施方案中，hDRR4受体蛋白包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段。在在一种更优选实施方案中，hDRR7受体蛋白包括SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段。
在本发明的另一方面，hDRR受体蛋白是选自下组的hDRR7受体i)编码具有SEQ ID NO12或它的片段的氨基酸序列的分离的和纯化的蛋白；ii)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的受体蛋白的细胞；或iii)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞的膜制备物。
在一种优选实施方案中，hDRR7受体蛋白包括SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段。在一种更优选实施方案中，hDRR7受体蛋白由SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段组成。
术语“它的片段”表示其序列披露于本发明中的蛋白分子的部分或亚区域，以便所述片段包括亲本蛋白中的5个或5个以上连续的氨基酸。术语“它的片段”意在包括“功能性片段”，其中，所述分离的片段、部分或亚区域包括功能上独特的区，如所述受体蛋白的活性位点、结合位点或磷酸化位点。功能性片段可以通过克隆技术生产，或作为其他剪接技术的天然产物生产。
在另一方面，本发明涉及EPF和相关肽在本发明的测定中的用途。在一种优选实施方案中，EPF或EPF相关肽选自下组i)一种编码EPF的分离的多肽，包括SEQ ID NO4的氨基酸序列；ii)一种源于EPF并且能够结合hDRR4的分离的多肽；iii)一种编码EPF相关肽的分离的多肽，它包括选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21的氨基酸序列；或iv)一种分离的多肽，它包括由SEQ ID NO8的氨基酸序列编码的hDRR4结合片段。
在本发明的一种更优选的实施方案中，EPF由SEQ ID NO4编码的氨基酸序列组成，而EPF相关肽由选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段的氨基酸序列组成。
本发明的受体蛋白和肽包括所有可能的保守性氨基酸改变，其中，“保守性氨基酸改变”表示取代亲本受体蛋白或肽中的一个或多个氨基酸残基，而又不影响亲本分子的生物学活性，这种取代是基于本领域所认可的某些氨基酸的可取代性(例如，参见M.Dayhoff，InAtlas of Protein Sequence and Structure，Vol.5，Supp.3，pgs345-352，1978)。
本领域技术人员可以理解的是，本发明的多肽，即hDRR4受体蛋白，hDRR7受体蛋白和EPF或EPF相关肽，可以通过多种重组DNA技术获得，例如，包括杂交、聚合酶链反应(PCR)扩增，或从头开始的DNA合成(例如，参见T.Maniatis等Molecular CloningA LaboratoryManual，2d Ed.Chap.14(1989))。
本发明的肽和衍生物可以按照业已完善的标准液相或优选固相肽合成方法方便地制备，有关所述方法的一般性说明可广泛获得，或者可以在溶液中制备，采用液相方法或固相、液相和溶液化学的任意组合。
作为一种例子，本发明的多肽可以通过采用N-a-9-芴基甲氧基羰基或Fmoc固相肽化学合成方法合成，使用RaininSymphonyMultiplex肽合成仪。
用于将氨基酸偶联在肽-树脂生长链上的标准循环通常包括(1)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤所述肽-树脂3次，每次30秒；(2)通过用溶解在DMF中的20％的哌啶洗涤2次进行脱保护，除去氨基末端的Fmoc保护基团，每次洗涤15分钟，在此过程中，通过每隔10秒向反应容器中吹送氮气1秒钟实现混合，以便防止肽-树脂沉降；(3)用DMF洗涤肽-树脂3次，每次30秒；(4)通过添加等体积的250mM合适氨基酸的Fmoc衍生物的溶液和包括400mMN-甲基吗啉和250mM(2-(1H-苯并三唑-1-4))-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸酯(HHTU)在DMF中的激活剂混合物，将所述氨基酸连接在所述肽-树脂上；(5)让所述溶液混合45分钟；和(6)用DMF洗涤所述肽-树脂3次，每次30秒。
必要时按顺序用合适的氨基酸重复上述循环，以便生产需要的肽。该循环的例外，是推测难以通过其疏水性的性质而进行的氨基酸偶联或推测的在合成期间包括螺旋形成。对这种情况来说，可以通过在第一个45分钟的偶联步骤结束之后马上第二次重复步骤4而改变上述循环，以便对感兴趣的氨基酸进行“双偶联”。在肽合成的第一个偶联步骤中，让所述树脂膨胀，以便通过将在起始DMF洗涤中混合次数增加到3次15分钟的洗涤而不是3次30秒的洗涤而实现更有效的偶联。
在合成之后，可以按以下方法将所述肽从树脂上裂解下来(1)用DMF洗涤肽-树脂3次，每次30秒；(2)通过用DMF配制的20％的哌啶洗涤2次，每次15分钟除去氨基末端的Fmoc保护基团；(3)用DMF洗涤肽-树脂3次，每次30秒；和(4)将由95％三氟乙酸(TFA)，2.4％水，2.4％苯酚和0.2％trisopropysilane组成的裂解混合物与肽-树脂混合2小时，然后从树脂过滤出所述裂解混合物中的肽，并且通过添加2倍体积的乙醚将肽从溶液中沉淀出来。
为了分离肽，将乙醚-肽溶液在-20℃下放置20分钟，然后以6,000×G的速度离心5分钟，以便使肽沉淀。用乙醚洗涤所述肽，以便除去残余的裂解混合物成分。最终的肽产物可以通过反向高压液相层析(RP-HPLC)纯化，原始溶剂由0.1％TFA组成，而洗脱缓冲液由80％乙腈和0.1％TFA组成。然后可以将纯化的肽冷冻干燥成粉末。
纯化的生物学活性的hDRR蛋白可能具有若干种不同的物理形式。本发明的多肽能够以全长的新生或未加工过的多肽形式存在，或作为部分加工过的多肽或加工过的多肽的组合存在。全长的新生多肽可以是翻译后修饰过的等，所述修饰是通过导致全长新生多肽片段形成的特殊蛋白水解裂解事件。一种片段，或片段的物理缔合可能具有与hDRR4或hDRR7相关的完整的生物学活性；不过，受体活性的程度可以在各个受体片段和物理缔合的受体多肽片段之间有所差别。
因此，在另一方面，本发明提供了修饰过的hDRR多肽，它具有氨基酸缺失、添加或取代，但仍然基本上保留了相同的生物学活性，即像天然hDRR多肽那样结合EPF或EPF相关肽。如果hDRR多肽所具有的由SEQ ID NO8的氨基酸序列所编码的EPF相关肽的EC50值不超过相同配体的野生型hDRR受体多肽的EC50-值的10倍，优选不超过5倍，就认为这种多肽与其野生型具有“基本上相同的生物学活性”。对于hDRR4受体来说，业已测定了包括SEQ ID No8的EPF相关肽的EC50值为10.6-12nM。对于hDRR7受体来说，业已测定了包括SEQ IDNo8的EPF相关肽的EC50值为345-82，9nM。
本发明还提供了抗本发明EPF和EPF相关肽的抗体，包括抗血清和所述抗体的多克隆和单克隆方案，以及能产生所述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。所制备的抗本发明多肽的抗体可以通过使用常规方案给动物，优选非人动物施用所述多肽或具有表位的片段或细胞而获得。
可通过亲和层析将上述抗体用于纯化本发明的多肽，或治疗本发明的疾病。本发明的另一个目的是提供上述抗体在诊断与hDRR活性相关疾病相关的受试者的病理学状况的方法中的用途，所述方法包括让所述抗体与测试样品接触，其中，所述测试优选由体液，如血液、唾液、精液、脑脊液、血浆或淋巴组成；并且测定所述抗体在所述测试样品上的反应性。
可以通过任何合适的方法测定抗体在样品上的反应性。用各个报道分子进行标记是可行的。所述报道分子可以直接或间接产生可检测的，并且优选可测定的信号。
因此，在另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，它包括i)本发明的多肽，优选选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20和SEQ ID NO21的多肽，或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段；或ii)本发明多肽，优选选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20和SEQ ID NO21的多肽，或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段的抗体。
应当理解的是，在任何这样的试剂盒中，i)或ii)可以构成主要成分。所述试剂盒可用于诊断疾病或对一种疾病的易感性，特别是本发明的疾病。
HDRR受体多肽的重组表达很多测定的一个重要特征是提供一种在其表面上表达重组hDRR受体的宿主细胞的步骤。因此，在另一方面，本发明涉及可用于本发明测定的hDRR表达载体。
表达载体在本发明中被定义为基因的克隆拷贝的转录，以及它们的mRNAs在合适宿主中的翻译所必需的DNA序列。所述载体可用于在多种宿主中表达真核基因，所述宿主如包括大肠杆菌，蓝细菌的细菌，植物细胞，昆虫细胞，包括酵母细胞的真菌细胞，和包括人类细胞的动物细胞。
特别设计的载体允许在宿主之间穿梭DNA，所述宿主如细菌-酵母或细菌-动物细胞或细菌-真菌细胞或细菌-无脊椎动物细胞。一种适当构建的表达载体可以包括用于在宿主细胞中自主复制的复制起点，可选择标记，有限数量的有用的限制酶位点，高拷贝数量的潜力，和活性启动子。启动子被定义为能指导RNA聚合酶结合在DNA上并且启动RNA合成的DNA序列。强启动子是这样一种启动子，它导致mRNAs以高的频率启动。表达载体可以包括，但不局限于克隆载体，修饰过的克隆载体，专门设计的质粒或病毒。
本发明的编码hDRR4或hDRR7的分离的和纯化的核酸分子可以克隆到一种表达载体上，以便在重组宿主细胞中表达。重组宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括，但不局限于诸如大肠杆菌的细菌，诸如酵母的真菌细胞，哺乳动物细胞，包括，但不局限于来源人、牛、猪、猴和啮齿类动物的细胞系，以及昆虫细胞，包括，但不局限于果蝇和蚕来源的细胞系。源于哺乳动物物种的可能是合适的并且可以通过商业渠道获得的细胞系包括，但不局限于CV-1(ATCC CCL 70)，COS-1(ATCC CRL 1650)，COS-7(ATCC CRL 1651)，CHO-K1(ATCC CCL 61)，3T3(ATCC CCL 92)，NIH/3T3(ATCC CRL 1658)，HeLa(ATCC CCL 2)，C127I(ATCC CRL1616)；BS-C-1(ATCC CCL 26)，MRC-5(ATCC CCL 171)，L-细胞，神经母细胞瘤，胶质细胞和HEK-293(ATCC CRL1573)。
因此，在另一种实施方案中，本发明涉及含有编码hDRR蛋白的重组克隆的核酸分子或它的片段的重组宿主细胞在本发明的测定中的用途。在另一方面，所述重组宿主细胞包含一种核酸分子，这种核酸分子或者是基因组DNA，或者具有SEQ ID NO1的核酸序列和它的片段。
在本发明的一种更优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为HEK293细胞，这种细胞包含存在于哺乳动物表达载体pcDNA3中的由SEQ ID NO1或它的片段组成的核酸序列。
可以通过多种方法中的任意一种，将所述表达载体导入宿主细胞，所述方法包括，但不局限于转化，转染，原生质体融合，脂感染，和电穿孔。无性繁殖含有所述表达载体的细胞，并且分析，以便确定它们是否能产生hDRR4蛋白。受体表达宿主细胞克隆的鉴定可以通过若干种方式进行，包括，但不局限于与抗本发明多肽的抗体的免疫学反应性，以及宿主细胞相关的hDRR4活性的存在。
本发明的蛋白可以通过直接表达合成或者作为含有感兴趣的蛋白的融合蛋白以与另一种蛋白或肽的翻译融合体形式合成，所述蛋白或肽可以通过酶促或化学裂解而自我去除。因此，在一种具体实施方案中，本发明提供了本发明的蛋白，其中，所述多肽是一种融合蛋白的一部分。
另外，举例来说，人们可以使用在它的基因组中业已包含如上文所述的编码hDRR多肽的核酸分子的哺乳动物细胞，但是，由于例如具有弱启动子，而不能够表达所述多肽或者不能以适当的方式表达所述多肽，并且将诸如强启动子的调控序列导入所述哺乳动物细胞编码所述受体多肽的内源核酸分子的邻近处，以便诱导所述多肽的表达。
由于这种重组宿主细胞包含受异源转录和/或调控序列或蛋白的控制的编码hDRR多肽的多核苷酸，它是本发明的另一种实施方案。
在这种场合下，术语“调控序列”表示因为它整合到细胞基因组中DRR受体编码基因的紧邻处而能用于增强DRR受体多肽表达的核酸分子。所述调控序列包括启动子，增强子，灭活的沉默内含子，3’UTR和/或5’UTR编码区，蛋白和/或RNA稳定元件，编码调控蛋白的核酸分子，例如，能诱导或启动DRR受体基因的表达的转录因子，或其他已知能激活基因表达和/或提高所述基因产物量的表达控制元件。所述调控序列的导入，导致了DRR受体多肽表达的增强和/或诱导，导致了DRR受体多肽在细胞中的量增加的结束。因此，本发明的目的是提供DRR受体多肽的从头开始的和/或增强的表达。
可以通过磷酸钙转染，DEAE葡聚糖介导的转染，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，感染，或其他方法实现将所述构建体导入宿主细胞。所述方法披露于多种标准实验室手册中，如Davis，BasicMethods In Molecular Biology(1986)。
另外，本发明多核苷酸的表达还可以利用体外生产的合成mRNA进行。合成的mRNA或从hDRR生产细胞中分离的mRNA可以在各种无细胞系统中有效翻译，包括，但不局限于小麦胚乳提取物和网织红细胞提取物，并且能在基于细胞的系统中有效翻译，包括，但不局限于显微注射到蛙或蟾蜍卵母细胞(爪蟾)中，一般优选显微注射到蟾蜍卵母细胞中。
测定本发明的测定能够以多种形式设计，这些形式是筛选化合物的生物学活性或结合受体的化合物领域所普遍公知的。
本发明的多肽负责一种或多种生物学功能，包括一种或多种疾病状态，特别是前面所提到过的疾病。因此，需要设计鉴定能刺激或抑制hDRR受体功能的化合物的筛选方法。
本发明的测定方法有利地利用以下事实EPF或EPF相关肽是hDRR受体多肽的高亲和力配体，并且在与它结合之后激活hDRR受体。
因此，本发明包括鉴定能特异性结合hDRR受体多肽的化合物的方法，其中，所述化合物可以是hDRR受体多肽的配体，激动剂或拮抗剂。本发明的测定方法与现有技术中所公开的方法不同，因为本发明的测定方法采用了至少一个步骤，其中，将EPF或EPF相关肽与hDRR受体的相互作用结合在该测定方法中。通过测定所述化合物对在其表面上表达hDRR受体多肽的细胞的亲和力或对所述细胞膜的亲和力，可以证实结合的特异性。
因此，本发明提供了鉴定和获得能够结合hDRR受体的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR或它的片段的来源与
i)EPF或EPF相关肽ii)所述测试化合物一起温育；和b)测定所述测试化合物对与所述受体结合的EPF或EPF相关肽的量的影响。
在一种优选实施方案中，本发明提供了鉴定和获得能够结合hDRR4受体的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR4或它的片段的来源与i)EPF或EPF相关肽ii)所述测试化合物一起温育；和b)测定所述测试化合物对与所述受体结合的EPF或EPF相关肽的量的影响。
在本发明的另一种优选实施方案中，含有hDRR4的来源选自下组i)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的分离的和纯化的蛋白；ii)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞；或iii)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞的膜制备物。
在另一种实施方案中，本发明提供了鉴定和获得能够结合hDRR7受体的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR7或它的片段的来源与i)EPF或EPF相关肽ii)所述测试化合物一起温育；和b)测定所述测试化合物对与所述受体结合的EPF或EPF相关肽的量的影响。
在本发明的另一种优选实施方案中，含有hDRR7的来源选自下组i)具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的分离的和纯化的蛋白；ii)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞；或
iii)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的多肽受体的细胞的膜制备物。
所述筛选方法可以简单地通过一种直接或间接与所述候选化合物缔合的标记测定候选化合物与多肽或与具有多肽的细胞或膜，或它的融合蛋白的结合。另外，所述筛选方法可以涉及与一种标记竞争剂的竞争。在一种优选实施方案中，该标记竞争剂是已知能结合hDRRs，如EPF，又称之为侣伴蛋白10或EPF相关肽的配体。在另一种实施方案中，所述EPF相关肽由SEQ ID NO8编码的hDRR结合片段，或SEQID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQ ID NO21编码的EPF相关肽组成。
因此，在一种更优选的实施方案中，所述筛选方法包括标记过的EPF或标记过的EPF相关肽，其中，所述标记被用于测定所述测试化合物对结合在所述受体上的EPF或EPF相关肽的量的影响。
因此，本发明提供了一种鉴定和获得能结合hDRR4受体的测试化合物的方法，包括i)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的受体多肽的细胞，优选HEK293细胞的膜制备物；ii)将所述膜与标记过的EPF相关肽一起温育，所述肽包括由SEQID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQID NO21编码的氨基酸序列，优选与包括SEQ ID NO8的碘化EPF相关肽一起温育；iii)将所述测试化合物添加到温育混合物中；和iv)测定所述测试化合物对结合于hDRR4受体的标记过的EPF相关肽的量的影响。
相应地，本发明提供了一种鉴定和获得能够结合hDRR7受体的测试化合物的方法，包括i)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列的受体多肽的细胞，优选HEK293细胞的膜制备物；ii)将所述膜与标记过的EPF相关肽一起温育，所述肽包括由SEQID NO8，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQID NO21编码的氨基酸序列，优选与包括SEQ ID NO8的碘化EPF相关肽一起温育；
iii)将所述测试化合物添加到温育混合物中；和iv)测定所述测试化合物对结合于hDRR7受体的标记过的EPF相关肽的量的影响。
另外，采用适合具有所述多肽的细胞的检测系统，所述筛选方法可以检测候选化合物是否导致了通过激活或抑制所述多肽产生的信号。激活的抑制剂通常是在存在已知激动剂的条件下测定的，并且通过所述候选化合物的存在观察所述激动剂对激活的影响。可以将组成型活性受体多肽用于在没有激动剂或抑制剂的条件下通过测试所述候选化合物是否导致了所述多肽的抑制或激活而筛选反向激动剂或抑制剂的方法。
因此，本发明提供了鉴定和获得能够调节hDRR受体活性的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR或它的功能性片段的来源与所述测试化合物一起温育；b)测定所述测试化合物对hDRR受体活性的影响；和c)将所述影响与在结合EPF配体或EPF相关肽之后hDRR受体的活性进行比较。
在本发明的另一种实施方案中，用于鉴定和获得能够调节hDRR受体活性的测试化合物的方法中的含有hDRR的来源是在其表面上表达具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO12的氨基酸序列的多肽受体。在一种优选实施方案中，所述细胞可以是含有在上述方法中所提供的编码hDRR4或hDRR7蛋白或它的片段的重组克隆的核酸分子的重组宿主细胞。所述调节剂对hDRR受体的作用可能是调节细胞内第二信使形成，它是通过hDRR受体介导的，所述第二信使如细胞内钙，cAMP和报道基因产物。hDRR属于被称为G蛋白偶联受体(GPCRs)的类型的蛋白。GPCRs在与配体结合之后能够通过细胞膜传递信号。配体结合的GPCR能激活由异三聚体G蛋白介导的细胞内信号传递事件，如激活腺苷酸环化酶途径或激活磷脂酶C-β途径。评估上述细胞内信号传递事件激活的测定方法为本领域技术人员普遍公知，并且包括用于包括嵌合配体诱导型转录因子的信号传递的基于细胞的测定，采用荧光强度分布分析的G蛋白偶联受体的结合测定，采用与发光团偶联的环状核苷酸的细胞信号传递测定或利用多种反应元件测定来自G蛋白偶联受体的反应，或cAMP反应元件指导的报道分子测定。
因此，本发明提供了一种鉴定和获得能够调节hDRR4受体活性的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR4或它的功能性片段的来源与所述测试化合物一起温育；b)测定所述测试化合物对hDRR4受体活性的影响；和c)将该影响与EPF或EPF相关肽结合之后hDRR4受体的活性进行比较。
在一种优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定和获得能够调节hDRR4受体活性的测试化合物的方法，由以下步骤组成a)用哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO2组成的hDRR4受体蛋白的pcDNA3和哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO10组成的Gα16的pcDNA3共转染宿主细胞，优选HEK293细胞；b)用钙敏感型荧光染料，如Fura-2，FLUO-3或FLUO-4，优选FLUO-3或FLUO-4加载所述细胞；c)将所述细胞与测试化合物一起温育；d)将所述测试化合物对hDRR4受体活性的影响测定为钙敏感型荧光染料的相对荧光单位的改变；和e)将所述影响与在结合EPF或EPF相关肽之后hDRR4受体的活性进行比较。
在另一种优选实施方案中，所述鉴定和获得能够调节hDRR4受体活性的化合物的方法，由以下步骤组成a)用哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO2组成的hDRR4受体蛋白的pcDNA3转染宿主细胞，优选HEK293细胞；b)用钙敏感型荧光染料，如Fura-2，FLUO-3或FLUO-4，优选FLUO-3或FLUO-4，优选FLUO-4加载所述细胞；c)将所述细胞与测试化合物一起温育；d)将所述测试化合物对hDRR4受体活性的影响测定为钙敏感型荧光染料的相对荧光单位的改变；和e)将所述影响与在结合EPF或EPF相关肽之后hDRR4受体的活性进行比较。
因此，本发明提供了一种鉴定和获得能够调节hDRR7受体活性的方法，包括a)将含有hDRR7或它的功能性片段的来源与所述测试化合物一起温育；b)测定所述测试化合物对hDRR7受体活性的影响；和c)将该影响与EPF或EPF相关肽结合之后hDRR7受体的活性进行比较。
在一种优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定和获得能够调节hDRR7受体活性的测试化合物的方法，由以下步骤组成a)用哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO12组成的hDRR7受体蛋白的pcDNA3和哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO10组成的Gα16的pcDNA3共转染宿主细胞，优选HEK293细胞；b)用钙敏感型荧光染料，优选FLUO-4加载所述细胞；c)将所述细胞与测试化合物一起温育；d)将所述测试化合物对hDRR7受体活性的影响测定为钙敏感型荧光染料的相对荧光单位的改变；和e)将所述影响与在结合EPF或EPF相关肽之后hDRR7受体的活性进行比较。
在另一种优选实施方案中，所述鉴定和获得能够调节hDRR7受体活性的化合物的方法，由以下步骤组成a)用哺乳动物表达载体，优选编码由SEQ ID NO12组成的hDRR7受体蛋白的pcDNA3转染宿主细胞，优选HEK293细胞；b)用钙敏感型荧光染料，优选FLUO-4加载所述细胞；c)将所述细胞与测试化合物一起温育；d)将所述测试化合物对hDRR7受体活性的影响测定为钙敏感型荧光染料的相对荧光单位的改变；和e)将所述影响与在结合EPF或EPF相关肽之后hDRR7受体的活性进行比较。
本领域技术人员可以理解的是，EPF或EPF相关肽与hDRR相互作用的发现还可用于基于结构或用于多肽激动剂或拮抗剂的合理设计的方法，包括a)用EPF或EPF相关肽探测hDRR上的配体结合位点的结构；b)鉴定在结合期间hDRR受体的配体结合位点中与EPF配体相互作用的接触原子；c)设计与在(b)中确定的与原子相互作用的测试化合物，以便调节hDRR受体的活性；和d)让所设计的测试化合物与含有hDRR或它的功能性片段的来源接触，以便测定所述化合物调节hDRR活性的能力。
还可以理解的是，这通常是一种重复的过程。
治疗用途一般，激动剂或拮抗剂可用于如上文所提到过的途径的治疗和预防目的。化合物可以从多种来源中鉴定，例如，细胞，无细胞制剂，化合物库，和天然产品混合物。由此鉴定的所述激动剂或拮抗剂可以是天然的或修饰过的肽、配体、酶等，例如，可以是受体多肽；或者可以是它的结构或功能性模拟物(参见Coligan等，Current Protocolsin Immunology 1(2)Chapter 5(1991))。
因此，本发明涉及EPF，EPF片段或EPF相关肽用作药物的用途，并且，其中，所述EPF，EPF片段或EPF相关肽是hDRR受体的激动剂，以便用于治疗疼痛或用于治疗自身免疫疾病，如类风湿关节炎，多发性硬化或其他如IBD那样需要免疫抑制作用的状况或防止移植排斥。在一种优选实施方案中，所述EPF，EPF片段或EPF相关肽包括由SEQ IDNO8编码的hDRR结合片段或本发明的EPF相关肽，即由选自SEQ IDNO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的多肽组成。
因此，本发明还涉及一种通过本发明测定方法鉴定的化合物，其中，所述化合物能够结合和/或调节hDRR受体活性，并且，其中，所述化合物是按上述任一种测定方法确定的受体的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及将所述化合物用作药物的用途，并且，其中，所述化合物是一种激动剂，用于治疗疼痛或自身免疫疾病，如类风湿关节炎，多发性硬化或如IBD那样需要免疫抑制作用的其他状况或防止移植排斥。当所述化合物是hDRR受体多肽的拮抗剂时，可以将所述化合物用作避孕药，用于预防流产或用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症。
还提供了用本发明测定方法鉴定的化合物的用途，其中，所述化合物能够结合和/或调节hDRR4受体活性，并且，其中，所述化合物是按上述任一种测定方法确定的受体的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及将所述hDRR4特异性化合物用作药物的用途，并且，其中，所述化合物是用于治疗疼痛的激动剂。
因此，本发明还涉及一种通过本发明测定方法鉴定的化合物，其中，所述化合物能够结合和/或调节hDRR7受体活性，并且，其中，所述化合物是按上述任一种测定方法确定的受体的激动剂或拮抗剂。本发明还涉及将所述化合物用作药物的用途，并且，其中，所述化合物是一种激动剂，用于治疗疼痛或自身免疫疾病，如类风湿关节炎，多发性硬化或如IBD那样需要免疫抑制作用的其他状况或防止移植排斥。当所述化合物是hDRR7受体多肽的拮抗剂时，可以将所述化合物用作避孕药，用于预防流产或用于治疗细胞增殖性疾病，如癌症。
因此，在另一方面，本发明提供了一种用于预防、治疗或缓解与hDRR活性的疾病相关的医学状况的方法，该方法包括给哺乳动物受试者施用治疗有效量的由上文所述的hDRR调节化合物，包括EPF相关肽，并选择性地与能有效调节hDRR受体活性的量的可以药用的载体组合。所述载体包括，但不局限于盐水，缓冲的盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的组合。本发明还涉及包含一个或多个容器的药物包和试剂盒，在所述容器中装有一种或多种本发明的上述组合物的成分。本发明的多肽和其他化合物可以单独使用，或与诸如治疗化合物的其他化合物组合使用。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防、治疗或缓解诸如类风湿关节炎，多发性硬化的自身免疫疾病或如IBD那样需要免疫抑制作用的其他状况或防止移植排斥的方法，包括给哺乳动物受试者施用有效量的用上述测定方法之一鉴定的hDRR7受体激动剂。因此，本发明提供一种用于预防、治疗或缓解诸如癌症的细胞增殖疾病的方法，包括给哺乳动物受试者施用有效量的用上述测定方法之一鉴定的hDRR7受体拮抗剂。本发明的另一个目的是提供一种用于预防、治疗或缓解疼痛的传递、调节和感觉的方法，包括包括给哺乳动物受试者施用有效量的用上述测定方法之一鉴定的hDRR7受体激动剂。
所述化合物可以适合施用途径，例如，全身性或口服途径。优选的全身施用形式包括注射，通常是静脉内注射。其他注射途径，如皮下、肌内、或腹膜内注射都可以使用。全身施用的其他方式包括经粘膜和经皮施用，使用诸如胆酸盐或羧链孢酸或其他去污剂的穿透剂。另外，如果本发明的多肽或其他化合物可以制备成肠衣或胶囊化制剂，口服也是可行的。所述化合物的施用还能够以贴剂、软膏、糊剂、和凝胶等形式表面和/或局部施用。
所需要的剂量范围取决于本发明肽或其他化合物的选择，施用途径，制剂的性质，受试者状况的性质，以及主治医生的判断。不过，合适的剂量在0.1-100微克/千克受试者范围内。不过，由于有多种化合物可以利用，并且各种施用途径的效力不同，预计所需要的剂量有很大的变化。例如，预计口服比通过静脉注射需要更高的剂量。正如本领域所公知的，可以利用标准经验途径对剂量水平的变化进行调整，以便优化。
通过阅读下面的实验细节可以更好地理解本发明，不过，本领域技术人员可以理解的是，这些实验细节只是对本发明的说明，正如在后面的权利要求书中所更全面的披露的。另外，在本申请中，引用了各种文献。这些文献所披露的内容被收作本申请的参考，以便更全面地说明本发明所属领域的现状。
实施例1GPCR HDRR4的克隆和功能鉴定材料和方法材料扩增用高保真聚合酶，PCR缓冲液，T4 DNA连接酶，和限制性内切核酸酶是从Boehringer公司(Mannheim，Germany)获得的。寡核苷酸是从Eurogentec(Seraing，Belgium)购买的。质粒制备试剂盒和Qiaquick PCR扩增试剂盒是从Qiagen(Hilden，Germany)购买的。PRISM Ready Reaction Dye Terminator循环测序试剂盒和ABI 377或373A测序仪是从Applied Biosystems(Foster City，CA，U.S.A.)购买的。Geneamp PCR System 9600是从Perkin-Elmer(Norwalk，CT，U.S.A.)购买的。哺乳动物表达载体pcDNA3是从Invitrogen(Carlsbad，CA，U.S.A.)购买的。Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)，胎牛血清，以及透析过的胎牛血清是从Life Technologies(Gaithersburg，MD，U.S.A.)购买的。
DNA测序DNA是用来自ABI PRISM BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒(PE Biosystems)的试剂，在PTC-200 PCR仪(MJResearch)上进行的。在SEQueaky Kleen96孔Terminator Removal试剂盒柱(BioRad)上纯化反应产物，并且在ABI377 DNA测序仪上分辨。为了进行序列分析，我们使用了来自GeneCodes(Ann Harbor，MI)的Sequencher软件。
hDRR4的克隆使用正向引物(GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG)和反向引物(GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC)对人基因组粘粒文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)进行PCR。利用TOPOTMTA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)对所得到的PCR产物进行克隆。将全长的读框插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中，并且用于随后的筛选实验。
hDRR7的克隆用hDRR7正向引物(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(SEQID NO13)和hDRR7反向引物(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(SEQ ID NO14)对人基因组粘粒文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)进行PCR。将所得到的PCR产物插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中，并且用于随后的筛选实验。
在哺乳动物细胞中的瞬时表达和FLIPR测定利用FuGENE 6试剂(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)将hDRR4表达质粒或hDRR7表达质粒与Gα16-pcDNA3构建体瞬时共转染到HEK293细胞中。按照供应商的推荐，用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞。然后，在FLIPR仪器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，U.S.A.)上测定所述细胞的Ca2+瞬变。
组织提取物和提取物级份的制备对5000克猪下丘脑进行匀浆，并且在甲醇/水/乙酸，90/9/1，v/v/v中提取。在离心之后，通过用正己烷提取对上清液进行脱脂，并且通过Megabondelute分级分离含水层。用50％乙腈/水洗脱的材料在HPLC C18柱上进一步分离。通过FLIPR测定检测所得到的级份的hDRR4 GPCR的激活。由0-60％乙腈洗脱的存在于含水三氟乙酸(0.1％)中的Megabondelute级份在制备DeltaPak C18柱(Waters Ass.，25×100mm，15μm，300埃)上进一步分离。通过FLIPR测定测试由此获得的级份hDRR4 GPCR的激活。随后的纯化步骤是在制备Hypersil C18，分析Symmetry C18柱(4.6×250mm)，小孔Xterra C8柱(2.1×250mm)，小孔Xterra C8柱(2.1×250mm)以及最后的小孔Symmetry C18柱(2.1×150mm)上进行，随后也要进行基于FLIPR的活性测定，以便测定激活hDRR4转染细胞的级份。
质谱分析和基于Edman降解的测序在Q-Tof系统(Micromass UK)上进行电喷射离子化(ESI)双四极(Qq)正交加速(oa)飞行时间(Tof)质谱分析。通过利用碰撞诱导的解离(CID)分析片段离子鉴定活性分子。将1微升含有活性级份的乙腈/水/甲酸(50/49.9/0.1，v，v，v)加样到金包被的毛细管中(Protana L/Q针头)。针头的电压设定为900伏，取样锥的电压设定为25伏。以大约25nl/分钟的流速喷射所述样品，提供延长的分析时间，在此期间，可以获得MS和MS/MS光谱。在MS/MS或串联质谱分析期间，通过碰撞诱导的解离(CID)由选定的前体产生了片段离子，碰撞能量通常为20-35伏，将氩气用作碰撞气体。纯化肽的N-末端氨基酸测序是在PerkinElmer/Applied Biosystems Procise 492显微测序仪上进行的，该测序仪是以脉冲模型运行的。
膜制备物所述膜是作为全颗粒状级份制备的。用145mm的陪替氏培养皿将所述细胞培养到90％的铺满度，并且在收集之前24小时，用5mM丁酸钠处理。除去培养基，并且用冰冷的磷酸缓冲的盐溶液(PBS w/oCa2+和Mg2+)洗涤细胞2次，从所述平板上刮取到50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且通过离心收集(在4℃下，以16,000RPM的速度离心10分钟)。将细胞沉淀物重新悬浮在低渗5mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且用UltraTurrax匀浆器匀浆。在4℃下以18,000RPM的速度将匀浆物离心20分钟。将最终的沉淀物重新悬浮在50mMTris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且在-70℃下以等份样品形式保存。使用牛血清白蛋白(BSA)作标准物，通过Bradford蛋白测定(Biorad)进行蛋白测定。腺嘌呤结合进行[3H]腺嘌呤结合实验，以便鉴定瞬时转染的细胞系。在冰上解冻细胞膜，并且用添加了10mM MgCl2和1mM EGTA的50mM HEPES缓冲液，pH7.4稀释。非特异性结合是在存在1μM腺嘌呤的条件下测定的，并且在25℃用[3H]腺嘌呤(比活性为30.4Ci/mmol)温育1小时，发现对竞争结合测定来说是最佳的。测定是在500μl的最终体积中进行的，对于转染过的和野生型COS细胞来说，使用20μg的膜蛋白。利用Brandel多通道细胞收集器(96孔)通过Whatman GF/B滤膜快速过滤终止所述反应。用3ml冰冷的50mM HEPES缓冲液，pH7.4洗涤所述滤膜3次，转移到液体闪烁小瓶中，并且添加3ml闪烁液(Ultima Gold MV)。在至少6小时之后在β-闪烁计数器中对样品进行计数，以便使玻璃纤维滤膜变得均匀透明。
腺嘌呤对[3H]腺嘌呤的竞争抑制作用是用15nM[3H]腺嘌呤进行的。
特异性结合计算为在有和没有1μM未标记过的腺嘌呤的条件下计数的差别。
通过实时定量PCR证实基因的表达水平来自各种组织的RNA都是从Clontech公司获得的，只有背根神经节RNA例外，它是从Analytical Biological Services获得的。hDRR4基因的SDS引物和TaqMan探针是用PrimerExpress 1.0软件(PerkinElmer，MA，USA)设计的。hDRR4基因的SDS正向和反向引物分别是5′-GCGCAGGAACGCCTTCT-3′(SEQ ID NO22)和5′CGGCCGCTGAGGAAGAG-3′(SEQ ID NO23)。hDRR4的TaqMan探针(5′-TCCTCAACTTGGCCGCAGCAGA-3′(SEQ ID NO24)是用PrimerExpress1.0软件(Perkin Elmer，MA，USA)设计的，并且可以从靶序列的上链或下链中选择。所述TagMan hDRR4的5’末端业已用报道荧光染料6-羧基荧光素(FAM)标记过。
CDNA是用Superscript II逆转录酶制备的。RT是在42℃的水浴中进行的，进行了60分钟。通过在70℃下加热10分钟终止该反应。在MicroAmp Optical 96孔反应平板上进行PCR扩增50轮，每一轮包括95℃，15秒和60℃，1分钟。所有反应都用ABI Prism 7700 SDS重复进行3次。将测试组织中的hDRR4的相对表达与环亲和素A表达进行比较。
结果hDRR4的制备和cDNA序列在对人基因组粘粒进行PCR之后，获得了单一的PCR产物。对所述PCR产物进行测序，发现了与hDRR3(97％的氨基酸同一性)和hDRR4(99％的氨基酸同一性)的序列的很高的相似性(专利W9932519)。不过，所述序列与输入EMBL数据库(AC023078)中的序列的片段相同。我们获得了在图1中示出的核苷酸和氨基酸序列。
通过BLAST(Altschul等，1997)检索分析图1中所示出的序列，以便检查是否能够发现与已知配体相关的GPCRs。这种孤独GPCR的最接近的同源物是最近获得的GPCR RC56.3.1，在我们的实验室中它被鉴定为腺嘌呤受体。还没有报道过与hDRR4相关的其他受体的配体。存在一个由背根神经节克隆的人类GPCRs家族(Derwent序列数据库编号Z10067，Z10068，Z10069，Z10070，Z10071和Z10072)，它的79％-99％的残基与GPCR hDRR4相同。另一种众所周知的同源物是mas原癌基因，它拥有hDRR4的38％的残基。
我们的第一种方法是通过基于FLIPR的细胞测定方法测试hDRR4上的腺嘌呤和其他结构上相关的化合物，特别是嘌呤。这一目的是通过在有和无嵌合G蛋白或混栖Gα16G蛋白共转染下HEK293细胞的瞬时转染而实现的。在上述测定中，没有观察到特异性反应。在使用氚化腺嘌呤的结合实验中，检测不到与hDRR4的特异性腺嘌呤结合，而RC56.1.3转染的细胞，表现出明确的特异性腺嘌呤结合。由于这一方法没有为我们提供该受体的天然配体的暗示，为了鉴定天然配体，我们采用了‘反向药理学’策略。
从猪下丘脑中纯化hDRR4的天然激动剂从已知富含分泌型肽的来源组织，如下丘脑中制备提取物，并且在纯化天然配体之后，根据孤独GPCR的激活进行细胞测定，如在材料和方法部分所披露的。
在C18柱上第一次分级分离之后，对猪下丘脑提取物的筛选产生了一系列的级份，导致了用hDRR4表达构建体瞬时转染的细胞的瞬时细胞内Ca2+释放。这是用Gα16表达构建体瞬时共转染的HEK293细胞的情况(图2)，但是，对于野生型HEK293细胞来说，情况不是这样(数据未发表)。从所述级份中选择编号为65和66的能产生最强的刺激作用的级份，作进一步的再次分级分离，并且按照在材料和方法所披露的方法进行处理。纯化是按照基于FLIPR的活性测定进行的，并且对来自最后一次过柱的具有活性的级份进行质谱分析，以便测定它所含有的化合物的纯度和结构。
通过质谱分析鉴定hDRR4激活物质来自Symmetry C18(4.6×250mm；5μm，Waters)反相柱的活性纯化级份的质谱分析，得到了一个2163Da(2164.7M+H+)的主要质量峰。所述活性级份在不同HPLC柱上的洗脱区曲线表明，所述受体激活化合物是一种肽。因此，随后通过基于Edman降解的测序分析该质量。所确定的序列为AFRKFLPLFDRVLVERSA(单字母氨基酸符号)。
hDRR4激活物质对基于细胞FLIPR测定的影响在用Gα16-pcDNA共转染的Hek293细胞中测定在150nM的测试浓度下的EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)对孤独GPCR hDRR4(SEQID NO2)的激活作用。通过用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞，测定相对荧光单位(RFU)。如图3所示，仅用Gα16-pcDNA表达载体转染的Hek 293细胞不会对hDRR结合片段作出反应。通过该FLIPR测定，在由SEQ ID NO8组成的hDRR激活肽的不同测试浓度下，确定了EC50-值为12nM(图7)。
HDRR4基因的表达实时定量PCR，发现了hDRR4在背根神经节(DRG)和三叉神经神经节中的表达。这一发现证实了该受体在疼痛的感觉或调节中的潜在作用。如图6所示，在所有测试过的组织中，几乎只能在背根神经节和三叉神经神经节中表达，将在其他组织中的表达水平与在背根神经节和三叉神经神经节中的表达水平进行比较。
实施例2GPCR HDRR7的克隆和功能鉴定材料和方法材料扩增用高保真聚合酶，PCR缓冲液，T4 DNA连接酶，和限制性内切核酸酶是从Boehringer公司(Mannheim，Germany)获得的。寡核苷酸是从Eurogentec(Seraing，Belgium)购买的。质粒制备试剂盒和Qiaquick PCR扩增试剂盒是从Qiagen(Hilden，Germany)购买的。PRISM Ready Reaction Dye Terminator循环测序试剂盒和ABI 377或373A测序仪是从Applied Biosystems(Foster City，CA，U.S.A.)购买的。Geneamp PCR System 9600是从Perkin-Elmer(Norwalk，CT，U.S.A.)购买的。哺乳动物表达载体pcDNA3是从Invitrogen(Carlsbad，CA，U.S.A.)购买的。Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)，胎牛血清，以及透析过的胎牛血清是从Life Technologies(Gaithersburg，MD，U.S.A.)购买的。
DNA测序DNA是用来自ABI PRISM BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒(PE Biosystems)的试剂，在PTC-200 PCR仪(MJResearch)上进行的。在SEQueaky Kleen96孔Terminator Removal试剂盒柱(BioRad)上纯化反应产物，并且在ABI377 DNA测序仪上分辨。为了进行序列分析，我们使用了来自GeneCodes(Ann Harbor，MI)的Sequencher软件。
hDRR7的克隆用hDRR7正向引物(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(SEQID NO13)和hDRR7反向引物(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(SEQ ID NO14)对人基因组粘粒文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)进行PCR。将所得到的PCR产物插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中，并且用于随后的筛选实验。
在哺乳动物细胞中的瞬时表达和FLIPR测定利用FuGENE 6试剂(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)将hDRR7表达质粒与Gα16-pcDNA3构建体一起瞬时共转染到HEK293细胞中。按照供应商的推荐，用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞。然后，在FLIPR仪器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA，U.S.A.)上测定所述细胞的Ca2+瞬变。
膜制备物所述膜是作为全颗粒状级份制备的。用145mm的陪替氏培养皿将所述细胞培养到90％的铺满度，并且在收集之前24小时，用5mM丁酸钠处理。除去培养基，并且用冰冷的磷酸缓冲的盐溶液(PBS w/oCa2+和Mg2+)洗涤细胞2次，从所述平板上刮取到50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且通过离心收集(在4℃下，以16,000RPM的速度离心10分钟)。将细胞沉淀物重新悬浮在低渗5mM Tris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且用UltraTurrax匀浆器匀浆。在4℃下以18,000RPM的速度将匀浆物离心20分钟。将最终的沉淀物重新悬浮在50mMTris-HCl缓冲液，pH7.4中，并且在-70℃下以等份样品形式保存。使用牛血清白蛋白(BSA)作标准物，通过Bradford蛋白测定(Biorad)进行蛋白测定。
通过实时定量PCR证实基因的表达水平来自各种组织的RNA都是从Clontech公司获得的，只有背根神经节RNA例外，它是从Analytical Biological Services获得的。HDRR7基因的SDS引物和TaqMan探针是用PrimerExpress 1.0软件(PerkinElmer，MA，USA)设计的。HDRR7基因的SDS正向和反向引物分别是5′-TGGAAATGACCAAGCCCTTCT-3′(SEQ ID NO15)和5′-GAAAAGGATCAGGAAGACCGG-3′(SEQ ID NO16)。HDRR7的TaqMan探针5′-ATCAGGGTCTCCTTGCCACAAAGCAGT-3′(SEQ ID NO17)是用PrimerExpress 1.0软件(Perkin Elmer，MA，USA)设计的，并且可以从靶序列的上链或下链中选择。所述TagMan hDRR4的5’末端业已用报道荧光染料6-羧基荧光素(FAM)标记过。
cDNA是用Superscript II逆转录酶制备的。RT是在42℃的水浴中进行的，进行了60分钟。通过在70℃下加热10分钟终止该反应。在MicroAmp Optical 96孔反应平板上进行PCR扩增50轮，每一轮包括95℃，15秒和60℃，1分钟。所有反应都用ABI Prism 7700 SDS重复进行3次。将测试组织中的hDRR7的相对表达与β-肌动蛋白表达进行比较。
结果hDRR7的制备和cDNA序列在对人基因组粘粒文库进行PCR之后，获得了单一的PCR产物。对所述PCR产物进行测序，发现所述序列与输入EMBL数据库(AX099247)中的序列的片段相同。我们获得了在SEQ ID NO11中示出的核苷酸序列。
hDRR4激活物质对基于细胞FLIPR测定的影响在用Gα16-pcDNA共转染的Hek293细胞中测定在150nM的测试浓度下的EPF的hDRR结合片段(SEQ ID NO8)对孤独GPCR hDRR7(SEQID NO12)的激活作用。通过用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞，测定相对荧光单位(RFU)。如图4所示，仅用Gα16-pcDNA表达载体转染的Hek 293细胞不会对hDRR结合片段作出反应。通过该FLIPR测定，在由SEQ ID NO8组成的hDRR激活肽的不同测试浓度下，确定了EC50-值为354nM(图8)HDRR7基因的表达实时定量PCR，发现了hDRR7在淋巴结中的表达。这一发现与作为hDRR受体的天然激动剂的早孕因子的鉴定的结合证实了在妊娠期间观察到的该受体在EPF的免疫抑制作用方面的潜在作用(Davis和Maslow，1992)。如图5所示，在测试过的所有组织中，hDRR7主要是在淋巴结中表达的，其中，在其他组织中的表达水平与在淋巴结中的表达水平进行比较。
实施例3EPF相关肽的纯化和鉴定材料和方法材料扩增用高保真聚合酶，PCR缓冲液，T4 DNA连接酶，和限制性内切核酸酶是从Boehringer公司(Mannheim，Germany)获得的。寡核苷酸是从Eurogentec(Seraing，Belgium)购买的。质粒制备试剂盒和Qiaquick PCR扩增试剂盒是从Qiagen(Hilden，Germany)购买的。PRISM Ready Reaction Dye Terminator循环测序试剂盒和ABI 377或373A测序仪是从Applied Biosystems(Foster City，CA，U.S.A.)购买的。Geneamp PCR System 9600是从Perkin-Elmer(Norwalk，CT，U.S.A.)购买的。哺乳动物表达载体pcDNA3是从Invitrogen(Carlsbad，CA，U.S.A.)购买的。Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM)，胎牛血清，以及透析过的胎牛血清是从Life Technologies(Gaithersburg，MD，U.S.A.)购买的。
DNA测序DNA是用来自ABI PRISM BigDye Terminator Cycle SequencingReady Reaction试剂盒(PE Biosystems)的试剂，在PTC-200 PCR仪(MJResearch)上进行的。在SEQueaky Kleen96孔Terminator Removal试剂盒柱(BioRad)上纯化反应产物，并且在ABI377 DNA测序仪上分辨。为了进行序列分析，我们使用了来自GeneCodes(Ann Harbor，MI)的Sequencher软件。
hDRR4的克隆使用正向引物(GGAATTCGCCACCATGGATCCAACGGTCTCAACCTTGG)和反向引物(GTCTCGAGTCACTGCTCCAATCTGCTTCCC)对人基因组粘粒文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)进行PCR。利用TOPOTM TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)对所得到的PCR产物进行克隆。将全长的读框插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中，并且用于随后的筛选实验。
hDRR7的克隆用hDRR7正向引物(CGAATTCCGCCACCATGGATCCAACCACCCCGG)(SEQID NO13)和hDRR7反向引物(GCTCTAGAGGCTGTCCATCTCTACACCAGACTGC)(SEQ ID NO14)对人基因组粘粒文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)进行PCR。将所得到的PCR产物插入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A.)中，并且用于随后的筛选实验。
在哺乳动物细胞中的瞬时表达和FLIPR测定利用FuGENE 6试剂(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)将hDRR4表达质粒或hDRR7表达质粒与Gα16-pcDNA3构建体瞬时共转染到HEK293细胞中。按照供应商的推荐，用Fluo-4(Molecular Probes，Eugene，OR，U.S.A.)加载所述细胞。然后，在FLIPR仪器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，U.S.A.)上测定所述细胞的Ca2+瞬变。
从甲状腺提取物中纯化对2500克猪甲状腺进行匀浆，并且在甲醇/水/乙酸(90/9/1，v/v/v)中提取。在离心之后，通过用正己烷提取对上清液进行脱脂，并且通过Megabondelute固相萃取分离含水层。用在含水三氟乙酸(0.1％)中的0-50％乙腈洗脱的材料在在制备DeltaPak C18柱(40×100mm)上，通过反相HPLC进一步分级分离。通过FLIPR测定测试来自该柱的级份的hDRR4 GPCR的激活。随后的纯化步骤是在制备Deltapak C4柱(25×10mm)，分析C18柱(4.6×250mm)，小孔X-terraC18柱(2.1×250mm)，小以及最后毛细Symmetry C18柱(0.32×150mm)上进行，随后也要进行基于FLIPR的活性测定，以便测定激活hDRR4转染细胞的级份。
结果从猪甲状腺中纯化hDRR4的天然激动剂从已知富含分泌型肽的来源组织，如甲状腺中制备提取物，并且在纯化天然配体之后，根据孤独GPCR的激活进行细胞测定，如在材料和方法部分所披露的。
在C18柱上第一次分级分离之后，对猪甲状腺提取物的筛选产生了一系列的级份，导致了用hDRR4表达构建体瞬时转染的细胞的瞬时细胞内Ca2+释放。将两个相邻的级份纯化至均匀，并且通过ESI-Qq-TOF MS分析。这两种级份产生了两个主要的带三价电荷的离子峰，m/z640.59相应于质量为1918.77Da，而m/z 716.63相应于质量为2146.89Da。所述峰是在串联MS实验中选择的，并且在Q-TOF系统上通过碰撞诱导的解离而片段化。获得了2146.8Da化合物的四种可能的序列LGX1AFRX2FLPLFDRVLVE，(X1和X2是K或Q)，对于1918.77Da肽来说，获得了四种可能的序列，它是第一种肽的较短的异构体，LGX1AFRX2FLPLFDRVL(X1和X2是K或Q)(SEQ ID NOs 18-21)。
所述序列的2-19和2-17号氨基酸分别相当于侣伴蛋白10(Hsp10)2-18和侣伴蛋白10(Hsp10)2-16。在迄今为止所研究过的所有脊椎动物侣伴蛋白的7号位置上的氨基酸残基都是赖氨酸(K)。在大鼠，小鼠和人，所有哺乳动物物种的3号位置上的氨基酸是Q，而在Gallus gallus(鸟类)中为K。
FLIPR测定将纯化的肽或干燥的组织级份溶解在钙缓冲液中，并且加样到规则的96孔平板上，然后用FLIPR仪器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，U.S.A.)测定所述细胞的Ca2+瞬变。对于EPF相关肽来说，测定了以下pEC50值
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<221>CDS<222>(1)..(966)<223>
<400>1atg gat cca acc atc tca acc ttg gac aca gaa ctg aca cca atc aac 48Met Asp Pro Thr Ile Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15gga act gag gag act ctt tgc tac aag cag acc ttg agc ctc acg gtg 96Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Leu Thr Val20 25 30ctg acg tgc atc gtt tcc ctt gtc ggg ctg aca gga aac gca gtt gtg 144Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45ctc tgg ctc ctg ggc tgc cgc atg cgc agg aac gcc ttc tcc atc tac 192Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr50 55 60atc ctc aac ttg gcc gca gca gac ttc ctc ttc ctc agc ggc cgc ctt 240Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu65 70 75 80ata tat tcc ctg tta agc ttc atc agt atc ccc cat acc atc tct aaa 288
Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys85 90 95atc ctc tat cct gtg atg atg ttt tcc tac ttt gca ggc ctg agc ttt 336Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Ser Phe100 105 110ctg agt gcc gtg agc acc gag cgc tgc ctg tcc gtc ctg tgg ccc atc 384Leu Ser Ala Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125tgg tac cgc tgc cac cgc ccc aca cac ctg tca gcg gtg gtg tgt gtc 432Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140ctg ctc tgg gcc ctg tcc ctg ctg cgg agc atc ctg gag tgg atg tta 480Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu145 150 155 160tgt ggc ttc ctg ttc agt ggt gct gat tct gct tgg tgt caa aca tca 528Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gln Thr Ser165 170 175gat ttc atc aca gtc gcg tgg ctg att ttt tta tgt gtg gtt ctc tgt 576Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190ggg tcc agc ctg gtc ctg ctg atc agg att ctc tgt gga tcc cgg aag 624Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205ata ccg ctg acc agg ctg tac gtg acc atc ctg ctc aca gta ctg gtc 672Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220ttc ctc ctc tgt ggc ctg ccc ttt ggc att cag ttt ttc cta ttt tta 720Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Phe Phe Leu Phe Leu225 230 235 240tgg atc cac gtg gac agg gaa gtc tta ttt tgt cat gtt cat cta gtt 768Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255tct att ttc ctg tcc gct ctt aac agc agt gcc aac ccc atc att tac 816Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270ttc ttc gtg ggc tcc ttt agg cag cgt caa aat agg cag aac ctg aag 864
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285ctg gtt ctc cag agg gct ctg cag gac gcg tct gag gtg gat gaa ggt 912Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ser Glu Val Asp Glu Gly290 295 300gga ggg cag ctt cct gag gaa atc ctg gag ctg tcg gga agc aga ttg 960Gly Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315 320gag cag tga 969Glu Gln<210>2<211>322<212>PRT<213>人<400>2Met Asp Pro Thr Ile Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Leu Thr Val20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu65 70 75 80Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Ser Phe
100 105 110Leu Ser Ala Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu145 150 155 160Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gln Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Phe Phe Leu Phe Leu225 230 235 240Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ser Glu Val Asp Glu Gly
290 295 300Gly Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Glu Gln<210>3<211>538<212>DNA<213>人<220>
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Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile Leu Gly Lys Tyr Val90 95 100gac tgaaataagt cactattgaa atggcatcaa catgatgctg cccattccac 397Asptgaagttctg aaatctttcg tcatgtaaat aatttccata tttctctttt ataataaact457aatgataact aatgacatcc agtgtctcca aaattgtttc cttgtactga tataaacact517tccaaataaa aatatgtaaa t 538<210>4<211>102<212>PRT<213>人<400>4Met Ala Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val1 5 10 15Leu Val Glu Arg Ser Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Gly Gly Ile Met20 25 30Leu Pro Glu Lys Ser Gln Gly Lys Val Leu Gln Ala Thr Val Val Ala35 40 45Val Gly Ser Gly Ser Lys Gly Lys Gly Gly Glu Ile Gln Pro Val Ser50 55 60Val Lys Val Gly Asp Lys Val Leu Leu Pro Glu Tyr Gly Gly Thr Lys65 70 75 80Val Val Leu Asp Asp Lys Asp Tyr Phe Leu Phe Arg Asp Gly Asp Ile85 90 95Leu Gly Lys Tyr Val Asp100
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<223>hDRR4反向引物<400>6gtctcgagtc actgctccaa tctgcttccc 30<210>7<211>54<212>DNA<213>人<220>
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<400>7gcg ttt aga aag ttt ctt cca ctc ttt gac cga gta ttg gtt gaa agg 48Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg1 5 10 15agt gct 54Ser Ala<210>8<211>18
<212>PRT<213>人<400>8Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu Val Glu Arg1 5 10 15Ser Ala<210>9<211>2060<212>DNA<213>人<220>
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<400>9tgttcccagc actcaagcct tgccaccgcc gagccgggct tcctgggtgt ttcaggcaag 60gaagtctagg tccctggggg gtgaccccca aggaaaaggc agcctccctg cgcacccggt 120tgcccggagc cctctccagg gccggctggg ctgggggttg ccctggccag caggggcccg 180ggggcgatgc cacccggtgc cgactgaggc caccgcacc atg gcc cgc tcg ctg234Met Ala Arg Ser Leu1 5acc tgg cgc tgc tgc ccc tgg tgc ctg acg gag gat gag aag gcc gcc 282Thr Trp Arg Cys Cys Pro Trp Cys Leu Thr Glu Asp Glu Lys Ala Ala10 15 20gcc cgg gtg gac cag gag atc aac agg atc ctc ttg gag cag aag aag 330Ala Arg Val Asp Gln Glu Ile Asn Arg Ile Leu Leu Glu Gln Lys Lys25 30 35cag gac cgc ggg gag ctg aag ctg ctg ctt ttg ggc cca ggc gag agc 378Gln Asp Arg Gly Glu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Gly Pro Gly Glu Ser40 45 50ggg aag agc acc ttc atc aag cag atg cgg atc atc cac ggc gcc ggc 426
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115 120 125Lys Arg Tyr Ala Ala Ala Met Gln Trp Leu Trp Arg Asp Ala Gly Ile130 135 140Arg Ala Cys Tyr Glu Arg Arg Arg Glu Phe His Leu Leu Asp Ser Ala145 150 155 160Val Tyr Tyr Leu Ser His Leu Glu Arg Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Val165 170 175Pro Thr Ala Gln Asp Val Leu Arg Ser Arg Met Pro Thr Thr Gly Ile180 185 190Asn Glu Tyr Cys Phe Ser Val Gln Lys Thr Asn Leu Arg Ile Val Asp195 200 205Val Gly Gly Gln Lys Ser Glu Arg Lys Lys Trp Ile His Cys Phe Glu210 215 220Asn Val Ile Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Leu Ser Glu Tyr Asp Gln225 230 235 240Cys Leu Glu Glu Asn Asn Gln Glu Asn Arg Met Lys Glu Ser Leu Ala245 250 255Leu Phe Gly Thr Ile Leu Glu Leu Pro Trp Phe Lys Ser Thr Ser Val260 265 270Ile Leu Phe Leu Asn Lys Thr Asp Ile Leu Glu Glu Lys Ile Pro Thr275 280 285Ser His Leu Ala Thr Tyr Phe Pro Ser Phe Gln Gly Pro Lys Gln Asp290 295 300Ala Glu Ala Ala Lys Arg Phe Ile Leu Asp Met Tyr Thr Arg Met Tyr
305 310 315 320Thr Gly Cys Val Asp Gly Pro Glu Gly Ser Lys Lys Gly Ala Arg Ser325 330 335Arg Arg Leu Phe Ser His Tyr Thr Cys Ala Thr Asp Thr Gln Asn Ile340 345 350Arg Lys Val Phe Lys Asp Val Arg Asp Ser Val Leu Ala Arg Tyr Leu355 360 365Asp Glu Ile Asn Leu Leu370<210>11<211>1176<212>DNA<213>人<220>
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Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Asn Gly Phe Val Leu Trp Leu Leu Gly45 50 55ttc cgc atg cgc agg aac gcc ttc tct gtc tac gtc ctc agc ctg gcc364Phe Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Val Tyr Val Leu Ser Leu Ala60 65 70ggg gcc gac ttc ctc ttc ctc tgc ttc cag att ata aat tgc ctg gtg412Gly Ala Asp Phe Leu Phe Leu Cys Phe Gln Ile Ile Asn Cys Leu Val75 80 85tac ctc agt aac ttc ttc tgt tcc atc tcc atc aat ttc cct agc ttc460Tyr Leu Ser Asn Phe Phe Cys Ser Ile Ser Ile Asn Phe Pro Ser Phe90 95 100ttc acc act gtg atg acc tgt gcc tac ctt gca ggc ctg agc atg ctg508Phe Thr Thr Val Met Thr Cys Ala Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Met Leu105 110 115 120agc acc gtc agc acc gag cgc tgc ctg tcc gtc ctg tgg ccc atc tgg556Ser Thr Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile Trp125 130 135tat cgc tgc cgc cgc ccc aga cac ctg tca gcg gtc gtg tgt gtc ctg604Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Arg His Leu Ser Ala Val Val Cys Val Leu140 145 150ctc tgg gcc ctg tcc cta ctg ctg agc atc ttg gaa ggg aag ttc tgt652Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Ser Ile Leu Glu Gly Lys Phe Cys155 160 165ggc ttc tta ttt agt gat ggt gac tct ggt tgg tgt cag aca ttt gat700Gly Phe Leu Phe Ser Asp Gly Asp Ser Gly Trp Cys Gln Thr Phe Asp170 175 180ttc atc act gca gcg tgg ctg att ttt tta ttc atg gtt ctc tgt ggg748Phe Ile Thr Ala Ala Trp Leu Ile Phe Leu Phe Met Val Leu Cys Gly185 190 195 200tcc agt ctg gcc ctg ctg gtc agg atc ctc tgt ggc tcc agg ggt ctg796Ser Ser Leu Ala Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Gly Leu205 210 215cca ctg acc agg ctg tac ctg acc atc ctg ctc aca gtg ctg gtg ttc844Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Leu Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val Phe220 225 230ctc ctc tgc ggc ctg ccc ttt ggc att cag tgg ttc cta ata tta tgg892
Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Trp Phe Leu Ile Leu Trp235 240 245atc tgg aag gat tct gat gtc tta ttt tgt cat att cat cca gtt tca 940Ile Trp Lys Asp Ser Asp Val Leu Phe Cys His Ile His Pro Val Ser250 255 260gtt gtc ctg tca tct ctt aac agc agt gcc aac ccc atc att tac ttc 988Val Val Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Phe265 270 275 280ttc gtg ggc tct ttt agg aag cag tgg cgg ctg cag cag ccg atc ctc 1036Phe Val Gly Ser Phe Arg Lys Gln Trp Arg Leu Gln Gln Pro Ile Leu285 290 295aag ctg gct ctc cag agg gct ctg cag gac att gct gag gtg gat cac 1084Lys Leu Ala Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Ile Ala Glu Val Asp His300 305 310agt gaa gga tgc ttc cgt cag ggc acc ccg gag atg tcg aga agc agt 1132Ser Glu Gly Cys Phe Arg Gln Gly Thr Pro Glu Met Ser Arg Ser Ser315 320 325ctg gtg tag agatggacag cctctacttc catcagatat atgtg 1176Leu Val330<210>12<211>330<212>PRT<213>人<400>12Met Asp Pro Thr Thr Pro Ala Trp Gly Thr Glu Ser Thr Thr Val Asn1 5 10 15Gly Asn Asp Gln Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Lys Glu Thr Leu Ile20 25 30Pro Val Phe Leu Ile Leu Phe Ile Ala Leu Val Gly Leu Val Gly Asn35 40 45Gly Phe Val Leu Trp Leu Leu Gly Phe Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe
50 55 60Ser Val Tyr Val Leu Ser Leu Ala Gly Ala Asp Phe Leu Phe Leu Cys65 70 75 80Phe Gln Ile Ile Asn Cys Leu Val Tyr Leu Ser Asn Phe Phe Cys Ser85 90 95Ile Ser Ile Asn Phe Pro Ser Phe Phe Thr Thr Val Met Thr Cys Ala100 105 110Tyr Leu Ala Gly Leu Ser Met Leu Ser Thr Val Ser Thr Glu Arg Cys115 120 125Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Arg His130 135 140Leu Ser Ala Val Val Cys Val Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu145 150 155 160Ser Ile Leu Glu Gly Lys Phe Cys Gly Phe Leu Phe Ser Asp Gly Asp165 170 175Ser Gly Trp Cys Gln Thr Phe Asp Phe Ile Thr Ala Ala Trp Leu Ile180 185 190Phe Leu Phe Met Val Leu Cys Gly Ser Ser Leu Ala Leu Leu Val Arg195 200 205Ile Leu Cys Gly Ser Arg Gly Leu Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Leu Thr210 215 220Ile Leu Leu Thr Val Leu Val Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly225 230 235 240Ile Gln Trp Phe Leu Ile Leu Trp Ile Trp Lys Asp Ser Asp Val Leu
245 250 255Phe Cys His Ile His Pro Val Ser Val Val Leu Ser Ser Leu Asn Ser260 265 270Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Lys Gln275 280 285Trp Arg Leu Gln Gln Pro Ile Leu Lys Leu Ala Leu Gln Arg Ala Leu290 295 300Gln Asp Ile Ala Glu Val Asp His Ser Glu Gly Cys Phe Arg Gln Gly305 310 315 320Thr Pro Glu Met Ser Arg Ser Ser Leu Val325 330<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR7正向引物<400>13cgaattccgc caccatggat ccaaccaccc cgg 33<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR7反向引物<400>14gctctagagg ctgtccatct ctacaccaga ctgc 34<210>15
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR7正向QPCR引物<400>15tggaaatgac caagcccttc t 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR7反向引物QPCR<400>16gaaaaggatc aggaagaccg g 21<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR7 FAM-探针QPCR<400>17atcagggtct ccttgccaca aagcagt 27<210>18<211>18<212>PRT<213>人<400>18Leu Gly Lys Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu1 5 10 15Val Glu
<210>19<211>18<212>PRT<213>人<400>19Leu Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu1 5 10 15Val Glu<210>20<211>16<212>PRT<213>人<400>20Leu Gly Lys Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu1 5 10 15<210>21<211>16<212>PRT<213>人<400>21Leu Gly Gln Ala Phe Arg Lys Phe Leu Pro Leu Phe Asp Arg Val Leu1 5 10 15<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR4正向引物QPCR<400>22
gcgcaggaac gccttct17<210>23<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR4反向引物QPCR<400>23cggccgctga ggaagag17<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hDRR4 FAM-探针QPCR<400>24tcctcaactt ggccgcagca ga 2权利要求
1.一种利用EPF或EPF相关肽与hDRR受体或hDRR相关受体的相互作用的测定。
2.如权利要求1的测定，其中，EPF或EPF相关肽选自下组i)编码EPF的分离的多肽，包括氨基酸序列SEQ ID NO4；ii)源于EPF并且能够结合hDRR4的分离的多肽；或iii)编码EPF相关肽的分离的多肽，所述EPF相关肽包括选自SEQID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21的氨基酸；或iv)一种分离的多肽，包括由氨基酸序列SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段。
3.如权利要求1的测定，其中，所述hDRR受体多肽选自i)编码hDR4的分离的多肽，包括氨基酸序列SEQ ID NO2或它的片段；ii)编码hDRR7的分离的多肽，包括SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段。
4.一种分离的和纯化的EPF相关肽，包括由氨基酸序列SEQ ID NO8编码的hDRR结合片段。
5.一种分离的和纯化的核酸分子，它编码包括由SEQ ID NO7编码的hDRR结合片段的EPF相关肽。
6.一种分离的和纯化的EPF相关肽，它包括选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQ ID NO 21的氨基酸序列。
7.编码EPF或EPF相关肽的分离的和纯化的核酸分子在权利要求1的测定中的用途。
8.编码hDRR4的分离的和纯化的核酸分子或它的片段在权利要求1的测定中的用途。
9.编码hDRR7的分离的和纯化的核酸分子或它的片段在权利要求1的测定中的用途。
10.一种鉴定和获得能结合hDRR受体的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR或它的片段的来源与i)EPF或EPF相关肽；ii)所述测试化合物一起温育；和b)测定所述测试化合物对与所述受体结合的EPF或EPF相关肽的量的影响。
11.如权利要求10的方法，其中，所述含有hDRR的来源选自i)分离的和纯化的蛋白，它具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段；ii)分离的和纯化的蛋白，它具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段；iii)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的hDRR4多肽受体的细胞；iv)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的hDRR7多肽受体的细胞；v)在其表面上表达具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的hDRR4多肽受体的细胞的膜制备物；或vi)在其表面上表达具有SEQ ID NO12的氨基酸序列或它的片段的hDRR7多肽受体的细胞的膜制备物。
12.如权利要求10的方法，其中，所述分离的和纯化的蛋白与一种固体支持物结合。
13.如权利要求10-12中任意一项的方法，其中，EPF或EPF相关肽是标记过的，并且，所述标记被用于测定测试化合物对与所述受体结合的EPF或EPF相关肽的量的影响。
14.如权利要求10的方法，其中，所述方法是合理的药物设计，包括以下步骤a)用EPF或EPF相关肽探测hDRR上的配体结合位点的结构；b)鉴定在结合期间hDRR受体的配体结合位点中与EPF配体相互作用的接触原子；c)设计与在(b)中确定的原子相互作用的测试化合物，以便调节hDRR受体的活性；和d)让所设计的测试化合物与含有hDRR或它的功能性片段的来源接触，以便测定所述化合物调节hDRR活性的能力。
15.一种鉴定和获得能够调节hDRR受体活性的测试化合物的方法，包括a)将含有hDRR或它的功能性片段的来源与所述测试化合物一起温育；b)测定所述测试化合物对hDRR受体活性的影响；和c)将所述影响与在结合EPF配体或EPF相关肽之后hDRR受体的活性进行比较。
16.如权利要求15的方法，其中，所述含有hDRR的来源是在其表面表达具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO12的氨基酸序列的多肽受体的细胞。
17.如权利要求15-16中任意一项的方法，其中，调节剂对hDRR受体的影响是调节由hDRR受体介导的细胞内第二信使的形成。
18.如权利要求15的方法，其中，所述细胞内第二信使是cAMP，钙或报道基因产物。
19.一种通过权利要求10，11或15的方法鉴定和获得的化合物，其中，所述化合物能够结合和/或调节hDRR受体活性。
20.一种通过权利要求10，14或15的方法鉴定和获得的化合物，其中，所述化合物是hDRR的激动剂或拮抗剂。
21.用作药物的通过权利要求10-18中任意一项的方法鉴定的化合物。
22.一种药物组合物，包括通过权利要求10-18中任意一项的方法鉴定的化合物和可以药用的赋形剂或载体。
22.用作药物的由SEQ ID NO8编码的hDRR结合片段。
23.用作药物的由选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20或SEQ ID NO21的氨基酸序列编码的EPF相关肽。
24.由SEQ ID NO8编码的hDRR结合片段或权利要求23的EPF相关肽在制备用作避孕药和与包括但不局限于癌症，如移行细胞癌，脂肉瘤，腺癌，弥散性大B-细胞淋巴瘤，淋巴细胞白血病，成淋巴细胞白血病，成髓细胞白血病，粒单核细胞白血病，骨肉瘤；难治性贫血的疾病的治疗方法相关，以及用于治疗自身免疫疾病，如类风湿关节炎，多发性硬化或如炎性肠病(IBD)那样需要免疫抑制作用的其他状况或用于防止移植排斥的组合物中的用途。
25.权利要求10-18中任意一项的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗诸如类风湿关节炎，多发性硬化的自身免疫疾病或如炎性肠病(IBD)那样需要免疫抑制作用的其他状况的组合物中的用途，其中，所述化合物是hDRR7激动剂。
26.权利要求10-18中任意一项的方法所鉴定的化合物在制备用作避孕药、用于防止流产或用于治疗癌症的组合物中的用途，其中，所述化合物是hDRR7拮抗剂。
27.权利要求10-18中任意一项的方法所鉴定的化合物在制备用于治疗疼痛的组合物中的用途，其中，所述化合物是hDRR4激动剂。
28.一种用于从含有hDRR的细胞级份中分离hDRR的方法，包括让所述细胞级份与固定在溶质基质上的EPF或它的hDRR结合片段接触，并且由其洗脱hDRR。
29.由SEQ ID NO8或权利要求23的EPF相关肽编码的hDRR结合片段的抗体。
30.权利要求29的抗体在诊断与hDRR活性相关疾病相关的受试者的病理学状况的方法中的用途，所述方法包括让所述抗体与测试样品接触，其中，所述测试优选由体液，如血液、唾液、精液、脑脊液、血浆或淋巴组成；并且测定所述抗体在所述测试样品上的反应性。
31.一种诊断试剂盒，包含i)本发明的多肽，优选选自SEQID NO18，SEQ ID NO19，SEQID NO20和SEQ ID NO21的多肽，或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段；或ii)本发明的多肽，优选选自SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20和SEQ ID NO21的多肽，或由SEQ ID NO8编码的hDRR4结合片段的抗体。
32.权利要求10-18中任意一项的方法鉴定的化合物在制备用作避孕药或用于治疗癌症的组合物中的用途，其中所述化合物是hDRR拮抗剂。
33.权利要求10-18中任意一项的方法鉴定的化合物在制备用于预防流产的组合物中的用途，其中所述化合物是hDRR激动剂。
34.由SEQ ID NO8编码的hDRR结合片段或权利要求23的EPF相关肽在制备用于防止流产的组合物中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于研究EPF及其EPF相关肽与hDRR受体的相互作用的测定。所述测定被用于鉴定一种测试化合物是否能在EPF或相关肽能结合所述受体的条件下结合hDRR受体。该测定还被用于确定测试化合物是hDRRs的激动剂或拮抗剂。上述测定可以用多种方式进行，包括竞争性、非竞争性和比较测定，其中，将EPF或EPF相关肽与hDRR的相互作用评估为阳性或阴性对照，或与用测试化合物所得到的结果进行比较。
文档编号C07K1/00GK1541335SQ02813175
公开日2004年10月27日 申请日期2002年6月26日 优先权日2001年6月27日
发明者A·布伊斯特, E·本德, T·J·L·默伊森, E·J·H·克利宁, L·A·H·肖夫斯, A 布伊斯特, H 克利宁, H 肖夫斯, L 默伊森 申请人:詹森药业有限公司