抑制聚集蛋白聚糖酶活性的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽类似物的制作方法

专利名称：抑制聚集蛋白聚糖酶活性的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚集蛋白聚糖酶抑制剂的肽类似物，该类似物可在体内阻止聚集蛋白聚糖酶的活性。这些抑制剂可用于治疗包括如骨关节炎和类风湿性关节炎的各种人类疾病。
相关技术描述聚集蛋白聚糖酶1是两种新的引起软骨组织降解的金属蛋白酶中的一种，是从牛的鼻软骨组织经过白介素-1[1-2]刺激培养纯化得来的。该酶40-50％的序列与聚集蛋白聚糖酶2(ADAMTS-11/5)、ADAMTS-1(METH-1)和ADAMTS-8(METH-8)同源，且较低程度的与其它的血小板凝血酶敏感蛋白的裂解酶和金属蛋白酶(ADAMTS)家族(3-7)的成员同源。所有ADAMTS家族的成员由氨基末端前肽区域、需要金属锌使酶有活性的金属蛋白酶区域以及与包括裂解酶和金属蛋白酶(ADAM)还有蛇毒金属蛋白酶(8)的金属蛋白酶的再生细胞溶解酶家族结构类似的裂解区域组成。不同于典型的ADAM蛋白质膜固定且在羧基末端区域具有跨膜区域和细胞质区域，在ADAMTS蛋白的C-末端包含有不同数量的血小板凝血酶敏感蛋白1型(TSP-1)，并保存了血小板凝血酶敏感蛋白1和2(8)的序列。ADAMTS-4中的TSP-1的序列GGWGPWGPWG(序列号3)结合在聚集蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)上。这种通过TSP-1使聚集蛋白聚糖酶与聚集蛋白聚糖(9)的结合是聚集蛋白聚糖酶裂解所必需的。
聚集蛋白聚糖是一种占软骨[10，11]净重的大约10％的硫酸软骨素蛋白多糖大分子。它由三个球形区域组成G1，聚集蛋白聚糖通过它与透明质酸(HA)有交互作用，G2以及在分子C-末端的G3。G2和G3间的核心蛋白多数被糖胺聚糖(GAG)硫酸角质素和硫酸软骨素链所替代。聚集蛋白聚糖通常为每分子HA含有大约100分子蛋白多糖的HA的大量聚集物的一部分。该分子在GAGs上载有大量的不变的负电基团，使得分子具有较高组织渗透压力，可以使聚集蛋白聚糖溶胀并在软骨中形成骨胶原纤维构架，给予组织一定的可压缩性和弹性。G1和G2区域间的聚集蛋白聚糖球间区域(IGD)易在ADAMTS-4/ADAMTS-5和碎片Glu373-Ala374的区域发生蛋白水解，而不是在碎片Asn341-Phe342(12)间的MMP位置。另外，最近证实，人类重组物ADAM-TS4和ADAM-TS5都优先在位于G2和G3间的富含硫酸软骨素区域的Glu1480-Gly1481，Glu1667-Gly1668，Glu1771-Ala1772，和Glu1871-Leu1872的结合点(12)的四个位置裂解聚集蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖的缺失会导致软骨机能障碍的典型疾病，如骨关节炎和类风湿性关节炎。因此，阻止聚集蛋白聚糖的酶裂解可能会对关节炎患者的治疗有用。
在本专利申请中，我们详细描述了一种新的小分子异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽类似物，能抑制ADAMTS-4/ADAM-TS5和防止聚集蛋白聚糖酶-1对天然聚集蛋白聚糖的结合和裂解血小板凝血酶敏感蛋白。该新型抑制剂对以软骨损伤为特征的疾病的治疗有效。
有关的特定的和一般的参考文献包括1.M.D.Tortorella，et al.Purification and cloning of aggrecanase-1amember of the ADAMTS family of proteins.Science 1999；2841664-6。
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以上讨论说明存在寻找用于治疗骨关节炎和类风湿性关节炎的药剂和方法的需要。本申请正是提供了这样的解决方案。
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相关的美国专利申请包括US 6,057,336；US 6,180,334；和US5,872,209。
相关的国际或外国专利包括EP1081137；EP1041702；WO2000059874；WO2000059285；WO2000075108；WO200009485；WO2000009492；WO9965867；WO9964406；WO9951572；WO9909000；WO9905291；WO9851665；WO9740072；WO9731931；WO9718207；和WO9633166。
所有的文献、资料、专利、申请、标准等等都全文引用在此作为参考。
发明概述本发明涉及异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白-肽类似物的用于治疗以软骨降解为特征的包括骨关节炎、类风湿性关节炎、脊椎关节病和脓毒性关节炎等的疾病的用途。
本发明还涉及这些类似物的在体外和在体内抑制ADAMTS4/ADAMTS-5的用途。
这些新的肽类似物含有异羟肟酸衍生物的结构。这些类似物能够通过在单一结构中提供多样的结合和抑制活性增强其效能和选择性。异羟肟酸衍生物通过与金属锌在催化区域的螯合获得抑制ADAMTS4/ADAMTS5的活性，然而，肽序列GGWGPWGPWP(序列号3)的类似物可通过与聚集蛋白聚糖底物的糖胺聚糖链的结合产生对酶的抑制的活性。
特定的异羟肟酸类似物包括但不限于如下物质HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH2CH(CH3)2)-(C＝O)-V-“-SQAGGWGPWGPWGDSSAT；(～11’A)(序列号9)AS323“SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT；(～22’A)(序列号10)AS324“-LQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT；(～33’A)(序列号11)AS325“MDQLQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT；(44’A)(序列号12)上述结构中的缬氨酸可以被任何其它氨基酸替代，如苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸等。优选的可以替代缬氨酸的氨基酸见附图的1A-1J。
本发明还涉及治疗骨关节炎和类风湿性关节炎的方法，是给哺乳动物(manmal)，特别是人，提供治疗有效量的肽。


以下附图描述了异羟肟酸类似物的结构。
图1A为JWC-95.
图1B为JWD-52.
图1C为JWD-97.
图1D为JWD-48.
图1E为JWD-40.
图1F为JWD-39.
图1G为JWD-100.
图1H为XN908.
图1I为XS309.
图1J为JWC-96.
图2说明了JSD40对人的患骨关节炎的软骨的聚集蛋白聚糖降解的抑制效果。
图3是证实肽GGWGPWGPWGDCSRTCGGG(序列号14)对聚集蛋白聚糖的酶降解的抑制效果示例的概述。其中第1行表示完整的聚集蛋白聚糖软骨；第2行表示聚集蛋白聚糖软骨和聚集蛋白聚糖酶；第3行表示聚集蛋白聚糖软骨、聚集蛋白聚糖酶和肽。
图4描述了结合于聚集蛋白聚糖的糖胺聚糖链的血小板凝血酶敏感蛋白肽类似物的结构。
图5是聚集蛋白聚糖酶抑制剂的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白-肽的一个实施例的简要说明。
图6是通过异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白-肽类似物的对ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)的抑制作用的概述。
发明详述和优选的具体实施方案定义在这里“氨基酸”指的是天然及合成的氨基酸。标准命名A、D、S等及gly、ala、cys在这里都指的是天然氨基酸。
化学试剂等的定义都是按现有技术中常规定义。
异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白-肽类似物为一特定的将异羟肟酸释放至具有交互作用的酶和其底物之间的新系统。
对一系列最新合成的异羟肟酸(附图1)抑制ADAMTS-4/ADAM-TS5以及若干基质金属蛋白酶(MMPs)重组的能力进行了测定。在该研究中，聚集蛋白聚糖在浓度为500nM时，在37、ADAMTS-4/ADAM-TS5的浓度为5nM、含或不含浓度范围在0.1-1000nM的异羟肟酸的条件下孵化2小时。随即，在Glu1480-1481Gly位点上，通过Western Blot分析仪，应用能够识别新的C末端的GELE1480的抗体分析聚集蛋白聚糖的裂解。对裂解的抑制是通过显微测密扫描法测定并计算出相应的Ki值(见表1)。JWD40显示出最大的抑制能力，其Ki值为17nM。同样的物质显示出对MMP-3较小的影响，以及对MMP-1和MMP-2近两倍的影响力。
同样的物质还检测其阻断在体外软骨降解模型中的聚集蛋白聚糖裂解的能力。猪的关节软骨分离物在存在IL-α、含或不含浓度范围在0.1-10μM的一种抑制剂的条件下培养72小时。培养基通过二甲基亚甲基蓝(DMMB)测定评估其糖胺聚糖(GAG)水平，作为度量聚集蛋白聚糖障碍，并计算其IC50值(见表1)。发现JWD40对IL-1诱导的聚集蛋白聚糖的降解有显著的抑制作用。因此，我们测试JWD40的预防骨关节炎(OA)的软骨的聚集蛋白聚糖的降解的能力。人类的OA软骨分离物在含或不含0.1-10μM浓度的JWD40的条件下培养。48小时后，分析培养基中包含新的氨基末端374ARGSV的聚集蛋白聚糖酶裂解产物的存在。该物质能在浓度依赖方式下(附图2)阻断该片段的释放。
聚集蛋白聚糖结合了由聚集蛋白聚糖酶-1的血小板凝血酶敏感蛋白得到的肽链，对这种聚集蛋白聚糖通过聚集蛋白聚糖酶使聚集蛋白聚糖降解的抑制能力进行了测试。完整的聚集蛋白聚糖酶-1(ADAMTS4)5nM，和天然的500nM聚集蛋白聚糖在37下在含有血小板凝血酶敏感蛋白-肽GGWGPWGPWGDCSRTCGGG100μM(序列号14)的条件下培养5小时。通过Western blot分析仪，应用单克隆抗体MAB2035检测聚集蛋白聚糖的裂解产物。
聚集蛋白聚糖酶的活性是通过高分子量的聚集蛋白聚糖的减少或消失，以及低分子量的片段的出现来证明的。既没有高分子量的聚集蛋白聚糖的缺失，也没有低分子量的聚集蛋白聚糖片段的出现，表明培养物中含有血小板凝血酶敏感蛋白肽。因此该肽能够通过防止聚集蛋白聚糖酶与聚集蛋白聚糖结合(附图3)来保护聚集蛋白聚糖不被聚集蛋白聚糖酶裂解。
新的肽类似物通过异羟肟酸衍生物，如JWD40，与新型的如附图4所描述的肽结合的聚集蛋白聚糖通过共轭作用得到。
JWD40是有活性的半选择性的ADAMTS-4/ADAMTS-5的抑制剂，能够阻断IL-1诱导的猪关节软骨的聚集蛋白聚糖的降解和促使的人类OA软骨的聚集蛋白聚糖软骨损伤。
1.异羟肟酸的合成异羟肟酸的制备如以下方案所述。
方案1其中A1和A2可以是相同或不同的氨基酸。
某些情况下，A2可以不存在。
Boc保护的酸基团与甲胺结合形成N-甲酰胺。随后去除Boc基团，而且TFA盐与单琥珀酸结合。去除叔丁基基团，而且羧酸与邻苄基羟胺结合形成保护的异羟肟酸。在承载于碳上的钯催化下进行氢化反应，得到相应的异羟肟酸。
2.包含JWD40和合成的含有GAG-结合序列GGWGPWGPWG(序列号3的)的肽类似物的新型抑制剂的制备 方案2异羟肟酸类似物的主要结合物，如JWD40和合成的肽类似物的结合可以通过制备在以上方案2中所描述的一种类似的中间体而完成。单琥珀酸与盐酸甲氧缬氨酸(ValOMe.HCl)结合形成酰胺去除丁基基团。所形成的酸与叔丁基保护的羟胺盐结合得到保护的异羟肟酸。甲酯水解得到相应的酸，可与合成的肽类似物应用标准的固相肽结合技术结合。
附图5表明一种聚集蛋白聚糖酶抑制剂的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的结构。
实验以下制备和实施例是用于说明本发明的。它们并不以任何方式限定或缩小本发明的保护范围。
这里所述的起始化合物、溶剂、反应试剂等是可商购得到的，或是可容易地被本领域技术人员参考一般文献即可制备出的。参见ChemSources USA，由Directories Publications，Inc.of Boca Raton，Florida年度出版。还可参见威斯康星州密尔沃基的The Aldrich ChemicalCompany的商品目录。除非另有说明，所用起始原料均为可得到的。
实施例13-(叔丁氧羰基)-2’-(异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-O-甲基酯的制备单琥珀酸(3.0g，13.0mmol)、盐酸甲氧基缬氨酸(ValOMe.HCl)(1.71g，13.0mmol)、HOBT(1.76g，13.0mmol)、HBTU(4.95g，13.0mmol)溶解于DMF(20ml)中。加入DIEA(6.8ml，39mmol)，搅拌一小时。加入乙酸乙酯(100ml)，用水、饱和NaHCO3、NaCl洗涤，MgSO4干燥，去除溶剂。所得残渣在有硅胶层析纯化(用50％的乙酸乙酯的己烷溶液洗脱)。收率3.5g(87.5％)。MS(EI)MH+＝307。TLC的Rf值(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.56。
实施例23-(叔丁氧氨基羰基)-2’-(异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-O-甲基酯的制备3-(叔丁氧羰基)-2’-(异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-O-甲基酯(2.0g，6.5mmol)溶解于95％的TFA(20ml)中，搅拌一小时。用己烷洗脱，真空干燥，加入DMF(10ml)，盐酸叔丁氧胺(tBuONH2.HCl)(819mg，6.5mmol)，HOBT(877mg，6.5mmol)，HBTU(2.46g，6.5mmol)，DIEA(3.4ml，6.5mmol)。搅拌一小时。加入乙酸乙酯(100ml)。用水、饱和NaHCO3、NaCl洗涤，MgSO4干燥。去除溶剂。所得残渣在有硅胶层析纯化(用50％的乙酸乙酯的己烷溶液洗脱)。收率1.5g(72％)。MS(EI)MH+＝322。TLC的Rf值(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.45。
实施例33-(叔丁氧氨基羰基)-2’-(异丁基丙酰基)-L-缬氨酸的制备3-(叔丁氧氨基羰基)-2’-(异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-O-甲基酯(1.5g，4.67mmol)溶解于甲醇(20ml)中，加入NaOH(1N，6.5ml)，并在室温下搅拌反应一小时。去除甲醇，水洗(20ml)。所得水溶液用乙酸乙酯(30ml)洗涤，水层用1N的HCl酸化，所得混和物用乙酸乙酯(2×30ml)提取。MgSO4干燥。去除溶剂，得到相应的酸。收率1.2g(83％)。MS(EI)MH+＝308。
实施例4一般步骤ABOC氨基酸N-甲基酰胺的制备BOC保护的氨基酸(1.0份)溶解于CH2Cl2中。加入CDI(1.33份)。搅拌0.5小时后，加入盐酸甲胺(1.33份)，随后加入三乙基胺(1.33份)。在0下搅拌一小时，室温下放置过夜。用1N的HCl、饱和NaHCO3、NaCl洗涤。MgSO4干燥。过滤，并浓缩所得酰胺。
实施例5一般步骤B氨基酸N-甲基酰胺-琥珀酸加合物的制备BOC氨基酸N-甲基酰胺(1份)溶解于95％的TFA中搅拌一小时。用己烷洗脱。真空干燥。加入DMF、取代的琥珀酸单-丁基酯(根据参考文献已公开的方法制备)(1份)、HOBT(1份)、HBTU(1份)、DIEA(3份)。搅拌一小时。加入乙酸乙酯。用水、饱和NaHCO3、NaCl洗涤。MgSO4干燥。去除溶剂。残渣用硅胶层析纯化(50％的乙酸乙酯的己烷溶液)。
实施例6一般步骤C异羟肟酸的制备氨基酸N-甲基酰胺-琥珀酸加合物(1份)溶解于95％的TFA中，搅拌一小时。用己烷洗脱，真空干燥。加入DMF、BzONH2.HCl(1份)、HOBT(1份)、HBTU(1份)、DIEA(3份)，搅拌一小时。加入乙酸乙酯，用水、饱和NaHCO3、NaCl洗涤，MgSO4干燥，去除溶剂。残渣用硅胶层析纯化(50％的乙酸乙酯的己烷溶液)。
苄基保护的异羟肟酸(1份)溶于甲醇中。加入10％的碳钯催化剂(10％重量的苄基保护的异羟肟酸)。通入氢气进行氢化3小时。用CELITE过滤。浓缩得固体粗产物。用乙酸乙酯重结晶得到异羟肟酸。
实施例7N-BOC-L-缬氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为90％。MS(EI)MH+＝231。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.42。
实施例8N-BOC-L-亮氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为62％。MS(EI)MH+＝244。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.40。
实施例9N-BOC-L-苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为95％。MS(EI)MH+＝279。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.46。
实施例10N-BOC-L-高苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为95％。MS(EI)MH+＝293。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.45。
实施例11N-BOC-L-酪氨酸(bzl)-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为97％。MS(EI)MH+＝385。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.32。
实施例12N-BOC-L-4-氟苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为90％。MS(EI)MH+＝297。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.43。
实施例13N-BOC-L-丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤A的方法制备。收率为38％。MS(EI)MH+＝203。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.42。
实施例143-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为73％。MS(EI)MH+＝343。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.31。
实施例153-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-亮氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为94％。MS(EI)MH+＝356。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.30。
实施例163-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为64％。MS(EI)MH+＝390。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.30。
实施例173-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-酪氨酸(bzl)-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为60％。MS(EI)MH+＝497。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.29。
实施例183-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-4-氟苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为73％。MS(EI)MH+＝409。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.31。
实施例193-(叔丁氧基羰基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤B的方法制备。收率为50％。MS(EI)MH+＝315。TLCRf(乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)＝0.31。
实施例203-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-缬氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为58％。MS(EI)MH+＝302。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.54。
实施例213-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-亮氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为32％。MS(EI)MH+＝315。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.55。
实施例223-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为46％。MS(EI)MH+＝350。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.55。
实施例233-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-高苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为62％。MS(EI)MH+＝364。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.55。
实施例243-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-酪氨酸(bzl)-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为37％。MS(EI)MH+＝456。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.54。
实施例25
3-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-4-氟苯丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为45％。MS(EI)MH+＝368。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.55。
实施例263-(叔羟基甲酰氨基)-2(R)-异丁基丙酰基)-L-丙氨酸-N-甲基酰胺该物质是按照一般步骤C的方法制备。收率为67％。MS(EI)MH+＝274。TLCRf(MeOH；CH2Cl2＝1∶9)＝0.54。
实施例27在纯化的牛聚集蛋白聚糖软骨模型上的抑制活性的测定消化在100μl的50mM的Tris/HCl缓冲液中进行，pH值为7.5，内含有100mM的NaCl和10mM的CaCl2。人重组ADAMTS4/ADAMTS-5按(1，2)所述获得。纯化的牛聚集蛋白聚糖(12)(500nM)与5nM的ADAMTS-4/ADAMTS-5在37下，在含或不含以上所述的浓度为0.1-100nM的异羟肟酸物质的情况下，共同培养2小时。之后，在Glu1480-1481Gly结合点的聚集蛋白聚糖的裂解通过Western Blot分析仪，应用如前所述(12)的能够识别新的羧基末端GELE1480的新表面抗原抗体进行检测。
实施例28在猪关节软骨培养物上的抑制活性的测定从幼猪膝关节经解剖获得关节软骨。软骨在补充有10％FCS、青霉素(100U/ml)、和链霉素(100μg/ml)的DMEM中放置3天。随后，软骨切成3×3mm片段，重量大约为每段10-20mg，置于96孔平板中和可控介质(不含DMEM的血清)、IL-1α(100ng/ml)或IL-1α加上一系列浓度为0.1μM-10μM范围的异羟肟酸培养72小时。在培养的末期，在培养介质中糖胺聚糖(GAG)水平按照Farndale等(13)描述的方法通过分析二甲基亚甲基蓝(DMMB)而得到。
实施例29可抑制聚集蛋白聚糖酶活性的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的类似物在关节复位时从骨关节炎患者的髋部取得关节软骨。软骨在补充有青霉素(100U/ml)、和链霉素(100μg/ml)的DMEM中放置3天。随后，软骨切成3×3mm片段，重量大约为每段10-20mg，置于96孔平板中在含或不含浓度为0.1-10μM的JWD40的情况下培养48小时。在培养的末期，在培养介质中应用能够识别新的氨基末端1480ARGS(14)的新表面抗原分析由聚集蛋白聚糖酶裂解聚集蛋白聚糖而产生的聚集蛋白聚糖碎片。
实施例30肽抑制剂的聚集蛋白聚糖的ADAMT-4裂解的抑制作用制备几种不同的带有不同异羟肟酸片段长度的血小板凝血酶敏感蛋白肽。对所得的物质的ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)的抑制能力进行分析。参见附图6。25微微摩尔的ADAMTS4和500纳摩尔的牛的聚集蛋白聚糖单体，在含或不含浓度范围在1000-1纳摩尔的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的条件下共同孵化4小时。孵化后，用50微摩尔EDTA结束反应，聚集蛋白聚糖用ELISA分析含有氨基酸序列373ARGS的使ADAMTS4裂解牛聚集蛋白聚糖发生在Glu373/Ala374残基上的片段。附图6的数据显示异羟肟酸是通过6个与GAG结合基团分离的氨基酸(11)与血小板凝血酶敏感蛋白肽SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT(AS324)(序列号10)连接，并且异羟肟酸具有最大的效能，其Ki值为8.8纳摩尔。如果GAG结合基团与异羟肟酸之间增加到12个残基(33)，如同肽MDQLQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT(AS325)(序列号12)一样，物质的效能将下降，其Ki值在1064纳摩尔。因此，这证明分离GAG结合基团与异羟肟酸的氨基酸的数量是该物质的抑制作用的决定因素。
表1比较了JW化合物的效果和选择性。
表1JW化合物的效果和选择性明显的Ki值[nM]*聚集蛋白聚糖胶原酶 明胶酶溶基质素酶关节化合物MMP-1MMP-2MMP-3ADAM-TS4/5软骨JWC-955.9 2.3 65 982900JWC-965.6 2.9 102 381100JWC-977.4 2.3 135 621800JWC-100 1.0 ＜0.1 0.9 160 6000JWD-18995 ＞1000＞1000 ＞10,000 ＞100,000JWD-3922 2773 381888JWD-4026 36125 172048JWD-5276 59100035-----XN908 3.8 2.7 5 536300XS309 0.8 1412 ＞10,000 ＞10,000*Ki＝IC50/(1+[S]/Km)应用和给药本发明的化合物显示在体外模型和体内组织中具有聚集蛋白聚糖酶的抑制作用，并因此可以对生理现象产生影响。这些化合物在动物模型上有效果，并因此可以用于治疗哺乳动物，尤其是人类的相应疾病。
这些物质可以用作免疫抑制剂，特别是可用于治疗自身免疫性疾病，如关节炎等。
这里所述的活性化合物及其盐的给药可以通过任何抑制聚集蛋白聚糖酶的治疗试剂给药的接受的方式。这些方式包括口服、胃肠道外给药、皮下给药和其它系统给药方式。优选的给药方式为口服给药，除非患者自身不能够吞服任何药物。在那些情形下，适合于采用非胃肠道给予所述组合物的方式。
根据所需要的给药方式，本发明的组合物可以是固体形式、半固体形式或液体形式，例如，片剂、栓剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、液体制剂、悬浮剂、皮肤贴剂等等，优选是合适的精确剂量的单次给药单位剂型。组合物包括常规的药物赋形剂及符合通式I的活性物质或其药学上可接受的盐，并还可以含有其它药物试剂、载体、辅助剂、稀释剂等等。
所给药的活性物质的剂量应当取决于受治个体、疾病的严重程度、给药方式和患者的健康状况。然而，有效的剂量范围在每天0.1-100mg/kg，优选是每天0.5-5mg/kg。对于平均70kg体重的人来说，用药剂量为7-7000mg每天，优选为35-350mg每天。或者，活性物质的给药剂量按照L.C.Fritz等人在美国专利6,200,969中所描述的方案。所属领域普通技术人员可以据此获得有效的药物制剂。
由于这里所述的化合物的效果是依据相同的机理(在有生命系统中对聚集蛋白聚糖酶的抑制作用)，故其剂量(任何给药方式)都应在相同的本发明所描述的常规及优选范围内。
对于固体组合物，常规的无毒的固体物质包括，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等均可以使用。以上所定义的活性物质可以制成栓剂使用，例如，使用聚亚烷基二醇(如聚丙二醇)作载体。液体药物组合物可以通过溶解、分散等制备。以上所定义的活性物质和任选的作赋形剂的药用辅剂，如水、生理盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等等，形成溶液剂或悬浮剂。如果需要，药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。实际的制备所述制剂的方法是公知的，或对所属领域普通技术人员来说是显而易见的；如参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，第17版，1985。不管怎样，要被使用的组合物或制剂都会含有一定量的活性化合物，治疗有效量即能够有效缓解受治患者的症状的量。
对于口服给药来说，药物上接受的无毒的组合物可以用任何常规的赋形剂混和，例如，药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。所述组合物可以制成溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、持续释放制剂等。这样的组合物可含有10-95％的活性成分，优选含有1-70％的活性成分。
非胃肠道给药通常采用注射给药，皮下注射、肌肉注射或静脉注射。注射剂可制成常规形式，液体溶液或悬浮剂、适于配制成溶液或悬浮剂的固体或乳剂形式均可。合适的赋形剂有，例如水、生理盐水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等。另外，如果需要，药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。注射剂是优选的给药方式。
最新的非胃肠道给药方式为植入或贴皮方式的缓慢或持续释放给药系统，可以维持恒定的药物剂量。参见美国专利3,710,795，该文献引用于此作参考。
所有的制备和实施例都是用于说明本发明。它们不以任何方式缩小或限定本发明的范围。
结论所设计的这些新的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的类似物抑制剂用于a)可使这些化合物在局部积累在软骨细胞外基质中，特别是与聚集蛋白聚糖结合，b)可使异羟肟酸到达有效地抑制软骨的聚集蛋白聚糖酶、ADAMTS-4/ADAMTS-5的位置，及c)可治疗以软骨组织降解，如骨关节炎、类风湿性关节炎、脊椎关节病和脓毒性关节炎和其它以软骨降解为特征的疾病。
d)当与1-5、1-10、1-20、1-30或更多氨基酸，或5-30或更多氨基酸结合时，附图1A-1J的异羟肟酸可用作治疗c)所述的疾病的药物制剂。
虽然只有少数本发明的具体实施方案在此公开，但对所属领域普通技术人员来说，各种对作为聚集蛋白聚糖酶抑制剂的异羟肟酸类似物的不背离本发明的主旨和范围的修饰和改变、它们的合成和它们的药物用途都是显而易见的。所有这些修饰和改变也都在本发明的权利要求的保护范围之内。
序列表拮抗剂序列CMGGRCLHMD (Seq.No.1) QLQDFNIPQA (Seq.No.2)GGWGPWGPWG (Seq.No.3) DCSRTCGGGV (Seq.No.4)突变SMGGRSLHMD (Seq.No.5) QLQDSNISQA (Seq.No.6)GGWGPWGPWG (Seq.No.7) DSSAT (Seq.No.8)合成的异羟肟酸肽类似物对异羟肟酸的结构HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-异羟肟酸-V-SQAGGWGPWGPWGDSSAT (～11A)(Seq.No.9)异羟肟酸-V-SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～22A)(Seq.No.10)异羟肟酸-V-LQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT(～33A)(Seq.No.11)异羟肟酸-V-MDQLQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～44A)(Seq.No.12)合成可以通过在环18、21和24之后去除25％的树脂完成。异羟肟酸类似物随即通过肽的氨基末端连结。
信号1 51 潜能FT前肽 52 212FT链213837 ADAM-TS4.
FT位点 194194 半胱氨酸开关分子(潜能).
FT金属 361361 锌催化(类似的)FT活性位点 362362 类似的FT金属 365365 锌催化(类似的)FT金属 371371 锌催化(类似的)FT结构域437519 类似裂解FT结构域520576 TSP-TYPE11.
FT结构域577685 CYS-RICH.
FT结构域686837 空位FT结构域247252 多-ALA.
FTCARBOHYD 68 68N-连接(CLCNAC...)(潜能).
FTCONFLICT 77 77A-＞T(IN REF.1).
SQ序列 837 AA；90224 MW；5DF9C9AC137DF41FCRC64；(Seq.No.13.)MSQTGSHPGR GLAGRWLWGA QPCLLLPIVP LSWLVWLLLL LLASLLPSAR LASPLPREEEIVFPEKLNGS VLPGSGAPAR LLCRLQAFGE TLLLELEQDS GVQVEGLTVQ YLGQAPELLGGAEPGTYLTG TINGDPESVA SLHWDGGALL GVLQYRGAEL HLQPLEGGTP NSAGGPGAHILRRKSPASGQ GPMCNVKAPL GSPSPRPRRA KRFASLSRFV ETLVVADDKM AAFHGAGLKRYLLTVMAAAA KAFKHPSIRN PVSLVVTRLV ILGSGEEGPQ VGPSAAQTLR SPCAWQRGLNTPEDSDPDHF DTAILPTRQD LCGVSTCDTL GMADVGTVCD PARSCAIVED DGLQSAFTAAHELGHVFNML HDNSKPCISL NGPLSTSRHV MAPVMAHVDP EEPWSPCSAR FITDFLDNGYGHCLLDKPEA PLHLPVTFPG KDYDADRQCQ LTPGPDSRHC PQLPPPCAAL WCSGHLNGHAMCQTKHSPWA DGTPCGPAQA CMGGRCLHMD QLQDFNIPQA GGWGPWGPWGDCSRTCGGGVQFSSRDCTRP VPRNGGKYCE GRRTRFRSCN TEDCPTGSAL TFREEQCAAY NHRTDLFKSFPGPMDWVPRY TGVAPQDQCK LTCQARALGY YYVLEPRVVD GTPCSPDSSS VCVQGRCIHAGCDRIIGSKK KFDKCMVCGG DGSGCSKQSG SFRKFRYGYN NVVTIPAGAT GILVRQQGNPGHRSIYLALK LPDGSYALNG EYTLMPSPTD VVLPGAVSLR YSGATAASET LSGHGPLAQPLTLQVLVAGN PQDTRLRYSF FVPRPTPSTP RPTPQDWLHR RAQILEILRR RPWAGRK
权利要求
1.异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的类似物化合物用于体内治疗以选自骨关节炎、类风湿性关节炎、脊椎关节病和脓毒性关节炎的以软骨组织降解为特征的疾病的用途。
2.异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白肽的类似物化合物用于体内或体外抑制ADAMTS-4/ADAMTS-5的用途。
3.权利要求1的化合物作为在组织内通过与内源性酶底物特异相互作用的小分子酶抑制剂释放系统的用途。
4.附图IA-IJ所示的具有适于用于制备血小板凝血酶敏感蛋白肽类似物化合物的结构的异羟肟酸，其结构如 其中对于异羟肟酸结构HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(-CH2-CH(CH3)2)(C＝O)-V-，V(缬氨酸)可以是另一个与约10个或更多氨基酸组成的序列连接的氨基酸。
5.如权利要求4所述的异羟肟酸结构，其中V(缬氨酸)被选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸的氨基酸所替代。
6.选自以下基团的化合物HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(-CH2-CH(CH3)2)-(C＝O)-V--QAGGWGPWGPWGDSSAT(～11’A)；HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V--SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～22’A)；HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V--LQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT(～33’A)；以及HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V-MDQLQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～44’A)。
7.一种在哺乳动物，优选是人体内抑制软骨组织降解的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的如权利要求4所述的化合物。
8.一种治疗哺乳动物，优选是人体内抑制软骨组织降解的方法，所述方法包括给予需要治疗的患者治疗有效量的如权利要求4所述的化合物。
9.根据权利要求6所述的化合物，其为HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(-CH2-CH(CH3)2)-(C＝O)-V--QAGGWGPWGPWGDSSAT (～11’A)
10.根据权利要求6所述的化合物，其为HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V--SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～22’A)
11.一种用于治疗以体内软骨组织降解为特征在疾病的药学组合物，该组合物包括选自由以下结构和药学可接受的赋形剂
12.一种治疗以体内软骨组织降解为特征在疾病的药学组合物，该组合物包括选自由以下结构和药学可接受的赋形剂HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(-CH2-CH(CH3)2)-(C＝O)-V--QAGGWGPWGPWGDSSAT(～11’A)；HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V-SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～22’A)；HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V--LQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～33’A)；以及HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V-MDQLQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～44’A)。
13.根据权利要求12所述的药学组合物，为HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(-CH2-CH(CH3)2)-(C＝O)-V--QAGGWGPWGPWGDSSAT(～11’A)。
14.根据权利要求12所述的药学组合物，为HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V-SNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～22’A)。
15.根据权利要求12所述的药学组合物，为HO-NH-(C＝O)-CH2-CH(CH(CH3)2)-(C＝O)-V--LQDSNISQAGGWGPWGPWGDSSAT (～33’A)。
16.根据权利要求11所述的药学组合物，其中所述基团以共价键形式与含有5-30个氨基酸分子的氨基酸链结合。
全文摘要
本发明涉及能够抑制聚集蛋白聚糖酶的活性的异羟肟酸血小板凝血酶敏感蛋白－肽类似物的制备。这些类似物可应用于治疗特征为软骨组织降解的疾病，如骨关节炎、类风湿性关节炎、脊椎关节病和脓毒性关节炎。本发明描述了一种新的酶及其天然酶底物结合的小分子酶抑制剂。
文档编号C07K7/08GK1568306SQ02813789
公开日2005年1月19日 申请日期2002年7月9日 优先权日2001年7月9日
发明者M·托尔托雷拉, 王进海, R·L·巴尔霍恩 申请人:酶系统产品公司/(Icn－生物医学公司)