专利名称：心血管安全测定方法
技术领域：
本发明涉及心血管安全测定领域，和提供筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法与试剂盒。所述测定方法与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中预计化合物的潜在心脏毒性。在化合物库的高通量筛选中，本发明尤其有利。
背景技术：
证据表明数种药物可延长心脏的复极化(因此以表面心电图的QT间期形式测量)到潜在地威胁生命的心室心律不齐的程度，例如可出现尖端扭转(TdP)(torsades de pointes)，尤其在过剂量或药代动力学相互作用的情况下。
在有或无TdP情况下，所报道的诱发QT间期延长的药物数量持续增加(W.Haverkamp等(2000)Cardiovascular Research 47，219-233)。已经牵涉到多至50种临床可获得的或仍在研究的非-心血管药物和心血管非-抗-心律不齐药物。许多药物，既有老的，也有新的，已从市场上撤回或具有它们的销售限制。关心的是从这些药物上市到最初意识到它们与QT间期延长和/或TdP有关的时间间隔，通常以年为单位来测量。因此，在新的治疗剂和/或其它试剂开发的早期阶段，在人类中初次使用之前，研究任何新的化学物质的这一潜在副作用将是有益的。
本发明开发的新型治疗剂的关键组分由化合物库的高通量筛选(HTS)组成。药物公司已建立了结构不同的化合物的大型集合，它充当药物靶向先导鉴定程序的起始点。典型的公司化合物集合现包括100000至1000000种不同的化学物质。尽管数年前，认为每天和每次测定数千种化合物的用量是足够的，但当今药物公司旨在具有每周测试数以十万计的化合物的超高通量的筛选技术。在涉及筛选形式的典型HTS中，在多-孔微量滴定板，如96、384或1536个孔的板中进行测定。使用这些板有助于自动化，如自动的试剂分配器和自动虹吸仪的使用。此外，为了降低周期时间、成本和生物化学物质的原料如重组蛋白质，对于在测定方法中测试的各化合物，优选在室温下，使用单一的测量，进行HTS有关的筛选。
先导评价方法中的决定性标准将是早期识别它们与QT延长和/或TdP有关的可能性。然而，目前没有评价心脏毒性可获得的可靠、快速容易筛选方法，其中所述方法可对付在目前推广使用的HTS技术中鉴定的许多化合物。本发明的目的是通过提供测定和试剂盒来解决本领域的该问题，其中所述测定与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以预计在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中化合物的心脏毒性。
目前可获得的体外模型包括异源表达系统、解聚的细胞、分离的组织和分离的完整(兰根朵夫灌注的)心脏。在所有模型中，通过使用双电极电压钳记录，测量离子电流(DasscalN.(1987)Crit.Rev.Biochem.22，341-356)，或使用微电极或共焦显微镜(Dall`Asta V.等(1997)Exp.Cell Research 231，260-268)，测量膜电势的膜片钳记录(Zhou Z等(1998)Biophysical Journal74，230-241)，从而评价钾电流受阻的效果。鉴于实验程序的复杂性、慢的周期时间、原料的性质(即分离的组织及其解聚细胞)和试验结果的可靠性，在HTS筛选中不能使用前述方法。
本发明者令人惊奇地发现，可使用利用标记的阿司咪唑作为HERG通道的特异配体的结合测定方法，来预计化合物与QT延长和/或TdP的潜在关系。这一结合测定方法解决了前述问题，并且可在HTS有关的筛选形式中推广使用。
Chadwick C.等已描述了类似的测定方法(Chadwick C等，(1993)Circulation Research 72，707-714)，其中已鉴定[3H]-多非利特作为心脏延迟整流器K+-通道的特异放射配体。这篇文章进一步证明了多非利特的置换与许多抗心律不齐化合物的钾通道阻断活性之间具有良好的关联。这一结合测定有助于在分子水平上表征药物-通道的相互作用。
在这一测定中，已由二溴前体，通过3H-交换制备标记的多非利特，从而在每个分子上掺入2个3H-标记。每个分子上3H-标记的数量与结合测定的敏感性之间存在直接的关联。本发明提供相对以上方法的改进结合测定，因为在与[33H]-碘化甲烷反应中使用去甲阿司咪唑前体导致在每分子的阿司咪唑中掺入3个3H-标记。由此获得的放射配体的比活性比[3H]-多非利特的比活性高1.5-2倍。
此外，在HTS有关的筛选形式中不可能使用多非利特测定，因为从成年雄性豚鼠中分离的心室肌细胞必须在分离的6小时内使用。另外，仅36％分离的细胞是能存活的和可在结合测定中使用。为了在HTS有关的筛选中使用，起始材料应当可容易且足量地获得。本发明解决了该问题，因为使用了稳定表达HERG钾通道的HEK293细胞的膜制备物。所述细胞可足量地维持在温育物中，从而避免了需要并供应动物模型，并且由于在结合测定中使用细胞膜，所以可在-80℃下，在结合测定现成的等分试样中储存后者，用于随后使用。Chadwick等所述的多非利特结合测定的进一步的缺点是与温育程序有关。由于使用可存活的肌细胞，所以必须在34℃的生理温度下进行温育。若要在HTS有关的筛选形式中进行的话，后者毫无疑问增加了测定的成本、可能的周期时间和复杂性。本发明解决该问题，因为令人惊奇地证明，可在室温下温育膜制备物。特别地鉴于Zhoe Z.等，Zhou Z.等(1998)Biophysical Journal 74，230-241的研究，其中得出结论，对于HERG，所测量的动力学特性显著依赖于温度，当在生理温度，即35℃下进行研究时，在数个报告中观察到的差别减少。
以下将描述本发明的这一和其它方面。
发明概述本发明提供一种筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法。该方法包括用参考化合物和试验化合物温育含HERG或其片段的原料，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，并测量试验化合物对结合于HERG的参考化合物数量的影响。
在本发明的优选实施方案中，测定方法包括用标记的参考化合物温育细胞，优选HEK293细胞的膜制备物，其中所述细胞在其表面上表达含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段的HERG多肽通道，其中所述标记的参考化合物是在受试验者中能诱发心律不齐的药物，优选所述标记的参考化合物是[3H]-阿司咪唑。与试验化合物一起温育，并测量试验化合物对结合到HERG多肽通道上的参考化合物的数量的影响。在进一步的实施方案中，测量装置由从温育混合物中除去未结合的标记的参考化合物的分离装置；和检测标记的参考化合物用的装置组成，其中后者优选包括由使用闪烁计数的放射标记测量装置组成。
本发明进一步提供筛选化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的高通量的测定方法，该测定方法包括a)使细胞的膜制备物与标记的参考化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使细胞的膜制备物与步骤a)的标记的参考化合物以及试验化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ IDNO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)测量步骤a)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；d)测量步骤b)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；和e)比较步骤a)中测量的结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量和步骤b)中测量的结合到HERG多肽通道上的标记的参考化合物的数量。
在高通量筛选测定方法的优选实施方案中，膜制备物来自于细胞，优选HEK293细胞，该细胞在其表面上表达由SEQ ID NO2组成的氨基酸序列编码的HERG多肽通道。在高通量筛选测定方法的进一步实施方案中，标记的参考化合物是阿司咪唑，优选[3H]-阿司咪唑。
本发明也包括筛选化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的试剂盒，以及在本发明的测定方法中，包括多核苷酸、多肽和合适的参考化合物在内的试剂的用途。
附图简述
图1A示出了[3H]-阿司咪唑与用HERG通道cDNA稳定转染的HEK293细胞的细胞的膜制备物的饱和结合。TB表示所测量的总的结合，NSB表示所测量的非特异结合，SB表示所测量的特异结合。
图1B示出了饱和结合实验的斯卡查德图。根据拟合线，可用3260±900fmol/mg蛋白质(n＝11)的Bmax(最大结合)确定3.07±2.26nM(n＝11)的KD。
图2示出了与电生理膜片钳数据相比，42个参考化合物的结合亲和力。可获得0.87的Spearman秩相关系数。
详细说明本发明涉及心血管安全测定领域，并提供筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法与试剂盒。所述测定方法与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以预计在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中化合物的心脏毒性。在化合物库的高通量筛选中，本发明尤其有利。
在本发明的一个实施方案中，筛选试验化合物的测定方法包括a)用i)参考化合物，ii)试验化合物温育含HERG或其片段的原料；和b)测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物的数量。
在本发明的具体实施方案中，使用测定方法，以评价在受试验者中试验化合物诱发心律不齐的能力。
此处所使用的术语“试验化合物”是指在化学上定义的分子，其中在本发明的测定方法中评价该分子诱发心律不齐的能力。试验化合物包括，但不限于药物、配体(天然或合成)、多肽、肽、肽模拟物、多糖、糖、糖蛋白、核酸、多核苷酸和小的有机分子。在一个实施方案中，试验化合物包括已有的化合物库。在另一实施方案中，试验化合物包括新型的化合物库。
此处所使用的术语“参考化合物”是指能在受试验者中诱发心脏毒性的药物。参考化合物包括，但不限于阿司咪唑、特非那定、红霉素、斯氟沙星(sparfloxain)、普罗布考、特罗地林和舍吲哚。
此处所使用的术语“HERG”是指Human Ether-a-go-go-RelatedGene通道。它是延迟整流器(rectifier)钾通道，在许多细胞类型中，所述通道在控制作用电势复极化方面起重要作用。最初从人类海马中克隆出HERG，它在心脏中被强烈地表达。本发明的HERG多肽包括分离并纯化的蛋白质或其片段，所述蛋白质具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明的HERG多肽通道具有含SEQ ID NO2氨基酸序列的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的HERG多肽由SEQ ID NO2组成。
所定义的序列和片段的变体也形成本发明的一部分。变体包括通过保守氨基酸改变，来改变母体序列的那些，其中“保守氨基酸改变”是指基于一些氨基酸的可取代性被公认的领域，在没有影响母体分子生物活性情况下，置换母体序列中的一个或多个氨基酸残基(参见例如M.Dayhoff，In Atlas of Protein Sequence andStructure，Vol.5，Supp.3，p345-352，1987)。进一步的变体是其中以任何组合方式取代、缺失或添加数个、5-10、1-5或1-2个氨基酸的变体。
比较两种或多种序列的同一性或相似性的方法是本领域公知的。因此，可使用例如，在Winconsin序列分析软年包，9.1版本(DevreuxJ.等，Nucleic acid Res.，12，387-395，1984)中获得的程序，例如BESTFIT和GAP程序，来确定两种多核苷酸之间的同一性％以及两种多肽序列之间的同一性％和相似性％。BESTFIT利用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(J.Mol.Biol.，147，195-197，1981)，并发现在两个序列之间相似性的最好单一区域。BESTFIT更适于比较长度不同的两种多核苷酸或两种多肽，该程序假定较短的序列表示较长的部分。相比之下，根据Neddlemen和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.，48，443-453，1970)，GAP比对两个序列，结果发现“最大的相似性”。GAP更适于比对长度接近相同的序列，预期整个长度内比对。优选地，在各程序内使用的参数“空位权重”和“长度权重”，对于多核苷酸序列来说，分别为50和3，对于多肽序列来说，分别为12和4。优选地，当最佳地比对被比较的两个序列时，确定同一性％和相似性％。确定序列间同一性和/或相似性的其它程序也是本领域已知的，例如BLAST系列程序(Altschul S F等，Nucleic AcidsRes.，253389-3402，1997)。
本领域的技术人员将意识到可通过多种重组DNA技术，其中包括例如杂交、聚合物酶链反应(PCR)扩增或DNA的从头合成，获得本发明的多肽，即HERG多肽通道(参见例如T.Maniatis等，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d Ed.，Chap14(1989))。因此，本发明进一步的实施方案提供在本发明的测定方法或试剂盒中编码HERG多肽或其片段的分离并纯化的多核苷酸的应用。本发明另一实施方案提供含SEQ ID NO1的多核苷酸序列的编码HERG多肽通道或其片段的分离并纯化的多核苷酸的应用。本发明的优选实施方案提供由SEQ IDNO1的多核苷酸序列组成的编码HERG多肽通道的分离并纯化的多核苷酸的应用。
术语“其片段”描述一段或亚区域的蛋白质或多核苷酸分子，其序列在此处被公开，以便所述片段包括在母体蛋白质内相邻的5个或更多个氨基酸，或以便所述片段包括在母体多核苷酸内相邻的15个或更多个核苷酸。术语“其片段”拟包括“功能片段”，其中分离的片段、段或亚-区域包括在功能上不同的区域，如受体蛋白质的活性位点、结合位点或磷酰化位点。可通过克隆技术，或作为可供替代的剪接技术的天然产物，来生产功能片段。
此处所使用的“分离的”是指已从体内环境中分离出所讨论的多核苷酸、蛋白质和多肽或其各自的片段，以便熟练的技术人员可操作它的事实，例如，但不限于测序、限制消化、定点诱变，和亚克隆至核酸片段的表达载体，以及获得提供产生多克隆抗体、单克隆抗体、氨基酸测序和肽消化机会的大量蛋白质或蛋白质片段。因此，此处所述的核酸可以以完整细胞或以细胞溶菌液或以部分、基本上或完全纯化的形式存在。
当多肽从环境污染物中纯化而来时，认为它是“纯化的”。因此，当通过标准方法从细胞组分中纯化时，从细胞中分离的多肽被认为基本上是纯化的，而当由它的化学前体纯化时，化学合成的多肽序列被认为是基本上纯化的。“基本上纯的”蛋白质或核酸将典型地包括样品的至少85％，其中优选更大的百分数。确定蛋白质或核酸分子纯度的一种方法是在基质如聚丙烯酰胺或琼脂中电泳制备物。通过在染色之后单一条带的外观来证明纯度。评价纯度的其它方法包括色谱法和分析离心。
此处所使用的术语“足以使得结合的时间”是指产生结合到HERG多肽通道上的可检测量的标记的参考化合物所需要的时间。产生这一可检测量所需要的时间将随测定体系而变化。基于测定体系，本领域的技术人员将知道足以产生结合到HERG多肽通道上的可检测量的标记的参考化合物所需要的时间。
测定方法可按照许多形式设计本发明的测定方法，其中所述形式在筛选结合多肽通道用的化合物领域中通常是公知的。
本发明的测定方法有利地利用事实可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以预计在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中化合物的心脏毒性。
因此，本发明提供筛选试验化合物的测定方法，该测定方法包括a)用i)参考化合物，ii)试验化合物温育含HERG或其片段的原料，和b)测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物数量的影响。
在本发明的第一个实施方案中，含HERG的原料是分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段。
在本发明的第二个实施方案中，含HERG的原料是分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG或其片段。
在本发明进一步的实施方案中，含HERG的原料是在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞。
在本发明的又一实施方案中，含HERG的原料是在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物。
在本发明可供替代的实施方案中，参考化合物是能在受试验者诱发心脏毒性的化合物，它优选选自阿司咪唑、特非那定、红霉素、斯氟沙星、普罗布考、特罗地林和舍吲哚。在优选的实施方案中，参考化合物是阿司咪唑。本发明进一步的目的是提供测定方法，其中标记，优选放射性标记参考化合物。
在优选的实施方案中，筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力的测定方法包括a)用i)[3H]阿司咪唑，ii)待测试的化合物，温育在其表面上表达由SEQ ID NO2组成的氨基酸序列编码的HERG多肽通道的细胞的膜制备物；并测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物的数量的影响。使用参考化合物的标记，来测量这一效果，其中尤其可使用闪烁计数法测量所述标记。
本发明的测定方法的具体实施方案包括筛选试验化合物的高产量测定方法，所述测定方法包括a)使细胞的膜制备物与标记的参考化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使细胞的膜制备物与步骤a)的标记的参考化合物以及试验化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)测量步骤a)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；d)测量步骤b)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；和e)比较步骤a)中测量的结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量和步骤b)中测量的结合到HERG多肽通道上的标记的参考化合物的数量。
在进一步的实施方案中，高通量筛选测定方法的膜制备物由在其表面上表达含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物组成。
在本发明的优选实施方案中，高通量筛选测定方法的膜制备物由细胞，优选HEK293细胞的膜制备物组成，所述细胞在其表面上表达由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的HERG多肽通道。
在进一步优选的实施方案中，在高通量筛选测定方法中的标记的参考化合物由[3H]-标记的阿司咪唑组成。可尤其使用闪烁计数测量所述标记。
在本发明的另一具体实施方案中，提供了一种筛选试验化合物的高通量亲近检测(proximity detection)测定方法，该测定方法包括i)能参与亲近检测测定方法的用第一种标记进行标记的HERG；ii)能参与亲近检测测定方法的用第二种标记进行标记的参考化合物；iii)使步骤i)的HERG和步骤ii)的参考化合物与试验化合物一起接触，其时间足以使参考化合物与HERG结合以及试验化合物与HERG结合；和iv)当HERG和参考化合物相互作用时，通过第一种标记与第二种标记的亲近，来检测步骤i)的HERG和步骤ii)的参考化合物之间的相互作用。
由HERG与参考化合物的相互作用引起的第一种标记与第二种标记的亲近导致产生可检测的信号。这可例如通过闪烁亲近测定(SPA)体系来实现，在该体系中，标记之一是适用于SPA的放射性标记，而另一标记是包含在固相内的荧光增白剂。当标记的HERG蛋白质与标记的参考化合物相互作用时，可检测的信号是发射出的光能，这引起放射性标记足够接近荧光增白剂。在US4568649中公开了闪烁亲近测定技术。
或者，可检测的信号可以是在已有的信号输出，例如荧光中的变量。荧光共振能量传递(FRET)是基于这一原理工作的方法，且Tsien R.等(Tsien R.等(1993)Trends Cell Biol.3242-245)描述过它。它使用两种不同的荧光分子、供体和受体，以便当这些彼此足够接近时，供体分子的荧光被受体分子吸收，并发射出另一波长的光。因此，当在两个分子如HERG和参考化合物之间存在相互作用时，它们各自用这些荧光分子之一标记，产生可检测的信号。
通过以上所述的这种亲近测定方法，可以以单一的步骤进行本发明的筛选测定方法，即不需分离步骤，以便使用分离方法如过滤，从温育混合物中除去过量的标记的参考化合物。
在高通量的亲近检测测定方法的优选实施方案中，用包含在固相内的荧光增白剂，如包被的闪烁亲近测定珠来标记HERG，和用放射性标记来标记参考化合物，优选地，参考化合物是放射性标记的式(III)的阿司咪唑。
本领域的技术人员容易理解，阿司咪唑与HERG的结合也可用于基于结构或合理设计影响前述结合的化合物的方法，这是通过a)用阿司咪唑探测HERG多肽通道的结合位点的结构；b)鉴定在HERG多肽通道的结合位点内的接触原子，其中所述HERG多肽通道在结合过程中与阿司咪唑相互作用；c)设计与(b)中鉴定的原子相互作用，从而影响HERG-阿司咪唑相互作用的试验化合物；和d)使所述设计的试验化合物与含HERG或其片段的原料接触，以测量所述化合物影响结合到HERG上的标记的阿司咪唑数量的能力。
将进一步理解这通常是一种叠接(iterative)方法。
试剂盒本发明也提供可在上述测定方法中使用的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括a)含HERG的原料；b)参考化合物。
在第一个实施方案中，试剂盒包括含HERG的原料，所述原料选自i)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码含SEQ ID NO2氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞；或iv)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物。
在进一步的实施方案中，试剂盒包括参考化合物，所述参考化合物选自阿司咪唑、特非那定、红霉素、斯氟沙星、普罗布考、特罗地林和舍吲哚。在优选的实施方案中，参考化合物是阿司咪唑。本发明进一步的目的是提供试剂盒，其中标记，优选放射性标记参考化合物。
在具体的实施方案中，分离并纯化的HERG多肽通道结合到固体载体上，优选结合到含固体支持物的荧光增白剂，如涂布的闪烁亲近珠上。
因此，在具体的实施方案中，试剂盒包括a)结合到固体支持物上的分离并纯化的HERG多肽通道或其片段，和b)标记的参考化合物。优选地，这一具体实施方案由试剂盒组成，该试剂盒包括a)由SEQ IDNO2的氨基酸序列组成的分离并纯化的HERG多肽通道，所述HERG多肽通道被结合到含固体支持物的荧光增白剂上；和b)放射性标记的参考化合物，优选[3H]-标记的阿司咪唑。
在另一具体实施方案中，试剂盒包括；a)细胞，优选HEK293细胞的膜制备物，所述细胞在其表面上表达由SEQ ID NO2的氨基酸序列组成的HERG多肽通道；b)[3H]-标记的阿司咪唑；和c)测量结合到HERG上的标记的参考化合物数量的装置。
测量装置由分离装置和检测标记的参考化合物的装置组成，其中分离装置用于从温育混合物中除去过量未结合的标记参考化合物。本领域的技术人员知道从温育混合物中除去过量未结合的标记参考化合物用的分离装置。所述分离装置包括，但不限于磁珠、离心技术和过滤技术。检测标记的参考化合物的装置将取决于所使用的标记。所述标记可以是荧光或放射性标记。本领域的技术人员知道根据所使用的标记而变化的检测装置。
在具体的实施方案中，分离装置由GF/B过滤器(WhatmanInc.，Clifton，N.J.)组成。在另一具体的实施方案中，检测装置由在Topcount内的闪烁计数(Packard，Meriden，CT)组成。
在进一步的实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括进行测定用的仪器和/或多孔板。
参考下述实验细节将更好地理解本发明，但本领域的技术人员容易理解，这些仅仅是本发明的例举，在随后的权利要求中更充分地描述本发明的范围。另外，在整个说明书中，引用各种公开出版物。这些公开出版物披露的内容在此通过参考引入本申请中，以便更充分地描述本发明所属领域的状态。
实施例1DNA构建体和HEK293细胞的稳定转染将HERG cDNA(Genbank Accession No.U04270(SEQ ID NOI1))亚克隆至pcDNA3载体(Invitrogen)的bamHI/EcoRI位点。这一载体含有CMV启动子和SV40启动子，它们分别驱动插入的cDNA(HERG)和抗新霉素基因的表达。通过磷酸钙沉淀方法(Gibco)或脂质转染胺方法(Gibco)，用这一构建体转染HEK293细胞。在800μg/ml遗传霉素(G418；Gibco)中选择15-20天之后，用克隆量筒收集单一的集落，并测试HERG电流。在补加有10％胎牛血清和400μg/ml遗传霉素的最小基本温育基(MEM)中温育稳定转染的细胞。
为了电生理研究，通过胰蛋白酶消化，从温育皿中采集细胞，用标准的MEM温育基洗涤两次，并在用聚-L-赖氨酸涂布的小温育皿中播种。在板上1-2天之后，在细胞上进行实验。
实施例2用HERG钾通道稳定地转染的HEK293细胞的膜制备物使用HERG通道cDNA稳定地转染的HEK293细胞在富含10％胎牛血清和抗生素的DMEM温育基内生长。使用Ultraturrax均化器，在Tris-HCl 50mM pH7.4中均化收集的细胞，并在Sorvall离心机内，在23500×g下离心均化物。通过再-均化和再-离心洗涤细胞膜一次。将膜悬浮在Tris-HCl 50mM pH7.4中，等分试样，并在-80℃下储存。
实施例3放射性标记阿司咪唑
搅拌在48％氢溴酸水溶液(80ml)内的4.6g阿司咪唑(I)(10mmol)的溶液，并回流2小时。使反应混合物冷却到室温，过滤所形成的沉淀，并用水洗涤。将固体溶解在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和水(20ml)的混合物中，在搅拌下，通过缓慢引入浓氢氧化铵的水溶液使混合物成碱性。然后加入水(100ml)和搅拌混合物1小时。过滤掉沉淀并在空气中干燥18小时，得到去甲阿司咪唑(II)。
从这一用量中取出一部分，并通过制备型HPLC，在HypersylODS(5μm)结合相的不锈钢柱(7.1mmID×300mm)上分批彻底纯化，得到不含阿司咪唑的去甲阿司咪唑。在282nm处检测，并在4.0ml/min的流速下，用乙腈-水-二异丙胺(56∶44∶0.2，v/v)进行洗脱。
将HPLC纯化的去甲阿司咪唑(II)(26.7mg，60μmol)级分溶解在N，N-二甲基甲酰胺(1.0ml)中。向该溶液中加入1N氢氧化钠水溶液(60μl，60μmol)。在室温下搅拌混合物25分钟，并逐滴加入到[33H]-碘代甲烷(370MBq)在甲苯内的预冷却溶液(-78℃)中。旋流反应混合物，然后在没有冷却的情况下静置3小时。在40℃的水浴中，在吸气压力下，将甲苯从反应混合物中蒸发掉，并如上所述通过制备型HPLC，分批纯化残留物。合并含级分的产品，并用甲醇提取到70ml，得到总放射性为198MBq和比活性为3.14TBq/mmol(85Ci/mmol)的[3H]-阿司咪唑(III)。
实施例4放射配体结合测定方法解冻膜，并在温育缓冲液(Hepes 10nM pH7.4，40mM KCl，20mMKH2PO4，5mM MgCl2，0.5mm KHCO3，10mM葡萄糖，50mM谷氨酸盐，20mM天冬氨酸盐，14mM庚酸，1mM EGTA，0.1％BSA)中再-均化，并且在有或无竞争剂下，在25℃下，用[3H]-阿司咪唑温育20-100μg蛋白质，接着使用Filtermatel96采集器(Packard，Meriden，CT)，在GF/B过滤器上快速过滤。用冰冷的漂洗缓冲液(Tris-HCl 25mMpH7.4，130mM NaCl，5.5mM KCl，5mM葡萄糖，0.8mM MgCl2，50μm CaCl2，0.1％BSA)彻底漂洗过滤器。通过在Topcount(Packard，Meriden，CT)内的闪烁计数测定过滤器结合的放射性，以每分钟的计数(cpm)表达结果。
最初，研究包括缓冲液、放射配体和要测定非特异结合的化合物在内的各种参数，以便选择最佳的条件。
在饱和结合实验中，用膜来温育浓度增加的[3H]-阿司咪唑，再-悬浮在缓冲液中。在10μM R66204存在下测量非特异结合(图1)。
通过比较22种参考化合物的结合亲和力和电生理数据，研究在温育缓冲液内存在的BSA和/或环糊精的影响，以及在实验之前化合物的各种添加方式的影响。将化合物溶解在DMSO中，并使用MultiprobeII移液器(Pachard，Meriden，CT)，进一步在相同的溶剂中稀释。在所有的实验中，最终的DMSO浓度为1％。根据这一分析得出，可直接从由DMSO储液添加化合物。通过添加BSA和/或环糊精试图增加化合物的溶解度没有显著改进相关性。
实施例5完整细胞的电压钳技术(膜片钳)溶液浴液包含150NaCl，4KCl，5葡萄糖，10HEPES，1.8CaCl2和1MgCl2(使用NaOH，pH7.4)(单位mM)。移取的溶液包含120KCl，5EGTA，10HEPES，4MgATP，0.5CaCl2和2MgCl2(使用KOH，pH7.2)(单位mM)。将化合物溶解在DMSO中，获得10-2M或10-1M的储液。对照(＝浴液+DMSO)和实验溶液(＝浴液+DMSO+待测试的化合物)包含0.3％，0.1％或0.03％的DMSO。使用Y-管体系，将试验和对照溶液施加到研究的细胞上，从而使得在研究的细胞附近可快速改变溶液(小于0.5秒)。
电生理测量将含表达HERG的附着HEK293细胞的温育皿固定在膜片钳塔(Patch Clamp Tower)的台面上。使用反相显微镜观察细胞。在室温下用浴液持续灌注温育皿。
使用水平的Flaming/Brown微型移液管拉制器，在没有进一步的火焰-抛光情况下，从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制膜片移液管。当用移液填充时，所使用的微电极的输入电阻为1.5至3MΩ。
使用膜片箝术，通过EPC-9膜片钳放大器，在不同的膜电势下测量细胞的膜电流。使用程序Pulse和Pulsefit(HEKA)，DataAccess(Bruxton)和Igor(Wavemetrics)获得并分析数据。电流信号被低通过滤和随后数字化。在密封之前，电校正液体接界电势。在膜破裂之后，使用EPC-9膜片钳放大器，补偿细胞的电容和串联电阻。
保持电势为-80mV。HERG电流(K+-选择的外向电流)测定为在-40mV到2秒的去极化之后的+60mV下的最大尾电流。脉冲周期速度为15秒。在各试验脉冲之前，得到从保持电势到-60mV的短脉冲(0.5秒)，以测定漏泄电流。在确定完整细胞的结构之后，允许5分钟的平衡时间段，用移取的溶液内部灌注细胞。之后，给出5分钟的试验脉冲，在控制条件下定量确定HERG电流。在持续脉冲程序的同时，将灌注由对照溶液变化为含药物的溶液。在施加药物5分钟之后测量药物的效果。对于每个细胞测试药物的1-3种浓度(累积施加)。
测量的参数分析HERG电流测定为从-80mV的保持电势开始，在-40mV到2秒的去极化之后的+60mV下的最大尾电流。
在对照溶液存在下测量的最初5分钟内，HERG-介导的膜K+电流的振幅随时间逐渐降低(减少)。为了精确地定量化合物的阻断程度，必须考虑到这种K+电流的持续减少。因此，在对照溶液内，在最初的5分钟的时间段内，K+电流的时间曲线(在-40mV下测量)按指数拟合，并外推实验的其余部分。若没有给定药物，这些外推得到电流的估计振幅。为了测定化合物的阻断程度，通过用各次测量的电流振幅除以在同一时间点处拟合的电流值，来计算测量的电流比。
实施例6结合测定的药理学评价为了进行结合测定的药理学评价，在8种浓度下测试322种化合物抑制[3H]-阿司咪唑结合到HERG通道上的能力，和通过非线性回归分析计算pIC50-值。若获得pIC50-值，则比较结合和膜片钳的效力的秩(Spearman)。
若在膜片钳分析中，仅在＜4种浓度下测试了化合物，则根据下述标准对结合和膜片钳数据的分数归类分数1pIC50＜6或在10-6M或更高浓度下，阻断率＜50％分数2pIC50为6至8或在10-6和10-8M之间，阻断率＜50％分数3pIC50＞8或在10-8M或更低浓度下，阻断率＞50％42种参考化合物从HERG通道中置换[3H]-阿司咪唑结合的效力的秩与快速激活的延迟整流器K+电流的功能性阻断的电生理数据非常相关(rsp＝0.87)(图2)。
对于测试的94％化合物来说，结合数据与膜片钳数据相关。在2％的化合物中，结合测定得分高于膜片钳测定，而对于其余的4％来说，情况相反，即膜片钳测定得分高于结合测定。
根据结合数据与电生理数据的这种良好相关性，可得出结论，可使用放射配体结合测定作为主要的筛选工具，用于预测潜在的心脏毒性副作用。
序列表<110>詹森药业有限公司<120>心血管安全测定方法<130>心血管安全测定方法<140>
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Ile Pro Leu Ser Ser Pro Gly Arg Arg Pro Arg Gly Asp Val Glu Ser1025 103010351040Arg Leu Asp Ala Leu Gln Arg Gln Leu Asn Arg Leu Glu Thr Arg Leu104510501055Ser Ala Asp Met Ala Thr Val Leu Gln Leu Leu Gln Arg Gln Met Thr106010651070Leu Val Pro Pro Ala Tyr Ser Ala Val Thr Thr Pro Gly Pro Gly Pro107510801085Thr Ser Thr Ser Pro Leu Leu Pro Val Ser Pro Leu Pro Thr Leu Thr109010951100Leu Asp Ser Leu Ser Gln Val Ser Gln Phe Met Ala Cys Glu Glu Leu1105 111011151120Pro Pro Gly Ala Pro Glu Leu Pro Gln Glu Gly Pro Thr Arg Arg Leu112511301135Ser Leu Pro Gly Gln Leu Gly Ala Leu Thr Ser Gln Pro Leu His Arg114011451150His Gly Ser Asp Pro Gly Ser115权利要求
1.一种筛选试验化合物的测定方法，该测定方法包括a)用i)参考化合物，ii)试验化合物温育含HERG或其片段的原料；和b)测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物数量的影响。
2.一种用于筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力的测定方法，该测定方法包括a)用i)参考化合物，ii)试验化合物温育含HERG或其片段的原料；和b)测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物数量的影响。
3.一种用于筛选试验化合物在受试验者中诱发心律不齐的能力的测定方法，该测定方法包括a)用i)参考化合物，ii)试验化合物温育含HERG或其片段的原料；和b)测量试验化合物对结合到HERG上的参考化合物数量的影响。
4.权利要求1-3之一的测定方法，其中含HERG的原料选自i)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞；或iv)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物。
5.权利要求1-3之一的测定方法，其中含HERG的原料是在其表面上表达由SEQ ID NO2组成的HERG多肽通道的细胞的膜制备物。
6.权利要求1-3之一的测定方法，其中参考化合物能在受试验者诱发心脏毒性。
7.权利要求1-3之一的测定方法，其中参考化合物选自阿司咪唑、特非那定、红霉素、斯氟沙星、普罗布考、特罗地林和舍吲哚。
8.权利要求1-3之一的测定方法，其中参考化合物是阿司咪唑。
9.权利要求1-3之一的测定方法，其中参考化合物被标记。
10.权利要求9的测定方法，其中参考化合物被放射性标记。
11.权利要求10的测定方法，其中参考化合物是[3H]-阿司咪唑。
12.式(III)的放射性标记的阿司咪唑
13.权利要求12的放射性标记的阿司咪唑的制备方法，其特征在于a)使用合适的试剂如48％的氢溴酸水溶液，使式(I)的阿司咪唑去甲基化；和 b)任选地在反应惰性溶剂中，和在碱存在下，使式(II)的中间体与[3H]-碘代甲烷(CT3I)反应，
14.筛选试验化合物的高通量测定方法，该测定方法包括a)使细胞的膜制备物与标记的参考化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ ID NO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；b)使细胞的膜制备物与步骤a)的标记的参考化合物以及试验化合物接触，其时间足以使参考化合物与HERG多肽通道结合和试验化合物与HERG多肽通道结合，其中所述细胞在其表面上表达具有与SEQ IDNO2具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段；c)测量步骤a)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；d)测量步骤b)中结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量；和e)比较步骤a)中测量的结合到HERG通道上的标记的参考化合物的数量和步骤b)中测量的结合到HERG多肽通道上的标记的参考化合物的数量。
15.一种用于筛选试验化合物的高通量亲近检测测定方法，该测定方法包括i)用能参与亲近检测测定方法的第一种标记进行标记的HERG；ii)用能参与亲近检测测定方法的第二种标记进行标记的参考化合物；iii)使步骤i)的HERG和步骤ii)的参考化合物与试验化合物一起接触，其时间足以使参考化合物与HERG结合以及试验化合物与HERG结合；和iv)当HERG和参考化合物相互作用时，通过第一种标记与第二种标记的亲近，来检测步骤i)的HERG和步骤ii)的参考化合物之间的相互作用。
16.一种试剂盒，它包括a)含HERG的原料；b)参考化合物。
17.权利要求16的试剂盒，其中含HERG的原料选自i)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码具有与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的HERG或其片段；ii)分离并纯化的蛋白质，该蛋白质编码含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段；iii)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞；或iv)在其表面上表达HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物。
18.权利要求16的试剂盒，其中含HERG的原料是结合到固体支持物上的分离并纯化的HERG多肽通道或其片段。
19.权利要求18的试剂盒，其中固体支持物是含固体支持物的荧光增白剂。
20.权利要求16的试剂盒，其中含HERG的原料由细胞的膜制备物组成，所述细胞在其表面上表达由SEQ ID NO2组成的氨基酸序列编码的HERG多肽通道。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述细胞是HEK293细胞。
22.权利要求16-21之一的试剂盒，其中参考化合物选自阿司咪唑、特非那定、红霉素、斯氟沙星、普罗布考、特罗地林和舍吲哚。
23.权利要求16-21之一的试剂盒，其中参考化合物被标记。
24.权利要求23的试剂盒，其中参考化合物被放射性标记。
25.权利要求24的试剂盒，其中参考化合物是[H3]-阿司咪唑。
26.权利要求23的试剂盒，任选地包括从温育混合物中除去过量未结合的标记的参考化合物的装置。
27.权利要求23的试剂盒，其中分离装置由GF/B过滤器组成。
28.分离并纯化的蛋白质在权利要求1-3之一的测定方法中的用途，其中所述蛋白质编码含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG或其片段。
29.分离并纯化的多核苷酸在权利要求1-3之一的测定方法中的用途，其中所述多核苷酸编码含SEQ ID NO1的核酸序列的HERG或其片段。
30.在其表面上表达含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的细胞在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
31.在其表面上表达含SEQ ID NO2的氨基酸序列的HERG多肽通道或其片段的细胞的膜制备物在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
32.在其表面上表达由SEQ ID NO2的氨基酸序列编码的HERG多肽通道的细胞的膜制备物在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
33.阿司咪唑在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
34.标记的阿司咪唑在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
35.放射性标记的阿司咪唑在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
36.[H3]-阿司咪唑在权利要求1-3之一的测定方法中的用途。
全文摘要
本发明涉及筛选试验化合物在受试验者中诱发心脏毒性能力用的测定方法与试剂盒。所述测定方法与试剂盒基于下述发现可利用阿司咪唑与HERG钾通道的相互作用，以在新的治疗剂和其它试剂的开发过程中预计化合物的潜在心脏毒性。
文档编号C07K14/435GK1541334SQ02813995
公开日2004年10月27日 申请日期2002年7月2日 优先权日2001年7月13日
发明者G·I·C·M·海伦, C·G·M·詹森, M·R·朱尔扎克, H·P·M·M·范阿索夫, G I C M 海伦, M M 范阿索夫, M 詹森, 朱尔扎克 申请人:詹森药业有限公司