棉桃阿舒氏囊霉的酶的制作方法

专利名称：棉桃阿舒氏囊霉的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及来自棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)的新颖多核苷酸；与之杂交的寡核苷酸；包含这些多核苷酸的表达盒和载体；由该多核苷酸转化的微生物；由这些多核苷酸编码的多肽；及将该新颖多肽和多核苷酸用作调节阿舒氏囊霉属微生物的代谢，且尤其是提高维生素B2的产量的靶点。
背景技术：
维生素B2(核黄素，乳黄素)是一种碱敏感和光敏感的维生素，其在溶液中显示黄绿色荧光。维生素B2的缺乏可以导致外胚层的损害，尤其是白内障、角膜炎、角膜血管化，或导致自主泌尿生殖系统紊乱。维生素B2是FAD和FMN分子的前体，这两种分子与NAD+和NADP+在生物学上对氢传递具有重要意义。维生素B2通过磷酸化(FMN)和随后的腺苷酸化(FAD)形成这两种分子。
维生素B2在植物，酵母菌以及多种微生物中由GTP和核酮酸-5-磷酸合成。该反应途径首先打开GTP的嘧唑环并消除一个磷酸残基。保留的磷酸盐经脱氨，还原，和消除形成5-氨基-6-核醇基(ribityl)氨基-2，4-嘧啶酮。该化合物与3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸反应产生双环分子6，7-二甲基-8-核醇基二氧四氢蝶啶。通过歧化反应该化合物转化成三环化合物核黄素，该反应转移了一个4-碳单位。
维生素B2存在于许多蔬菜和肉类中，在谷类产品中的含量较低。成人每日的维生素B2需要量为约1.4到2毫克。核黄素又是辅酶FMN和FAD在人体中的主要分解产物并就此被排出。
维生素B2是人类和动物的重要营养物质。因此研究人员努力使维生素B2可工业规模产生，并建议由微生物的途径合成维生素B2。可用于该目的的微生物是，例如，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，子囊菌阿舒假囊酵母菌(Eremothecium ashbyii)，棉桃阿舒氏囊霉及酵母Candida flareri和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。为此使用的营养培养基包含作为碳源的糖蜜或植物油、无机盐、氨基酸、动物或植物胨和蛋白质及维生素添加剂。在无菌有氧浸没培养方法中，产率为每升培养液在几天内生成10克以上维生素B2。所需条件为培养液良好的通风，小心搅动及设定低于约30℃的温度。去掉生物质、蒸发并干燥浓缩液得到富含维生素B2的产物。
例如，WO-A-92/01060，EP-A-0 405 370和EP-A-0 531 708中描述了维生素B2的微生物生产。
在Ullmann氏工业化学百科全书A27卷，521页及以下等中，可以找到关于维生素B2的重要性，出现，生产，生物合成和使用的调查。
活体系统获得并利用实施各种功能需要的自由焓的整个过程称为代谢。代谢途径由提供特定产物的一系列酶反应组成。代谢反应途径常分为两类。第一类途径参与降解(分解代谢)而第二类途径参与生物合成(合成代谢)。在分解代谢途径中，复杂的代谢物分解成简单的产物并释放能量。在这些过程中释放的自由焓通过合成细胞中通用的高能化合物(ATP、NADPH)的方式储存。ATP和NADPH是合成代谢途径中许多生物合成反应的自由焓的主要来源。例如，产生精细化学品(例如核黄素的合成)的许多合成步骤都需要NADPH和ATP。
在分解代谢途径中，大量不同底物(碳水化合物、脂类和蛋白质)被转化成同样的中间产物。相反的过程发生在生物合成中。相对较少的代谢物是大量不同生物合成产物的起始物质。可以通过有控制地干预或阻断已经合成的精细化学品的降解途径以额外地增加其产量。
这些天然存在的代谢过程的一些产物或副产物在工业中有广泛的用途，例如人类和动物食品工业、化妆品和药物工业。这些被泛泛地称为“精细化学品”的分子包括有机酸、蛋白原性(proteinogenic)和非蛋白原性的氨基酸、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇类、碳水化合物、芳香族化合物、维生素和辅因子以及酶。这些物质几乎都在大容积的发酵罐里产生，其中所需分子被高浓度地分泌到培养基中。对这一方法尤其有用的生物体是丝状子囊菌棉桃阿舒氏囊霉。
参与这些代谢途径的蛋白在量和/或活性上的改变，对所需精细化学品的生产或生产效率可能有直接的影响。例如，可消除与所需精细化学品直接竞争中间产物的反应或优化负责产生这种特定的中间产物的代谢途径。
目前仍无利用代谢基因产生代谢受调控的微生物，优选地为阿舒氏囊霉属，尤其是棉桃阿舒氏囊霉株的描述。
发明概述本发明的目的是提供一种可用于影响阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉的代谢过程的新颖靶点。具体目的为特别地优化这种微生物的特定代谢途径。进一步的目的是通过这种微生物提高维生素B2的产量。
我们发现尤其可以通过提供在棉桃阿舒氏囊霉的维生素B2生产过程中被向上或下调节的编码核酸序列实现该目的(基于试验部分详细描述的MPSS分析法发现的结果)a)优选被下调的核酸序列，其编码具有C1-四氢叶酸合成酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 72”。
在再一优选的实施方案中，根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 72v”。
本发明第一方面涉及包含SEQ ID NO1所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO4所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 72”和“Oligo 72v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Ade3”有显著的同源性。这些插入序列具有SEQ ID NO1或SEQ IDNO4所示的核酸序列。来自SEQ ID NO1或4所示的编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母C1-四氢叶酸合成酶具有显著的序列同源性。
b)优选被上调的核酸序列，其编码具有精氨基琥珀酸合成酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 81”。
在另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 81v”。
本发明第一方面涉及包含SEQ ID NO6所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO9所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 81”和“Oligo 81v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Arg1”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO6或SEQ IDNO9所示的核酸序列。来自SEQ ID NO6的相应互补序列或来自SEQ IDNO9所示的编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母精氨基琥珀酸合成酶具有显著的序列同源性。
c)优选被上调的核酸序列，其编码具有氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺核苷酸合成酶(phosphoribosyl aminoimidazole-succinocarboxamide synthase)的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 86”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 86v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO12所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO14所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。该多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 86”和“Oligo 86v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Ade1”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO12或SEQ IDNO14所示的核酸序列。来自SEQ ID NO12的相应互补链或来自SEQ IDNO14的编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺核苷酸合成酶具有显著的序列同源性。
d)优选被下调的核酸序列，其编码具有延胡索酸还原酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 162”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 162v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO16所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO18所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 162”和“Oligo 162v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“FRDS1(2)”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO16或SEQ ID NO18所示的核酸序列。来自该编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母延胡索酸还原酶具有显著的序列同源性。
e)优选被上调的核酸序列，其编码具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 178”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 178v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO20所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO22所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 178和“Oligo 178v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“PCK1”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO20或SEQID NO22所示的核酸序列。来自SEQ ID NO20的相应互补链或来自SEQID NO22所示的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母烯醇丙酮酸磷酸羧激酶具有显著的序列同源性。
f)优选被上调的核酸序列，其编码具有尿卟啉原脱羧酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 64”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 64v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO24所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO26所示的核酸序列或其片断的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 64和“Oligo 64v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Hem12”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO24或SEQ IDNO26所示的核酸序列。来自该编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母尿卟啉原脱羧酶具有显著的序列同源性。
g)优选被上调的核酸序列，其编码具有siroheme合成酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 125”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 125v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO28所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO30所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 125”和“Oligo 125v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Met1”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO28或SEQID NO30所示的核酸序列。来自SEQ ID NO28的互补序列或来自SEQ IDNO30所示的编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母的siroheme合成酶具有显著的序列同源性。
h)优选被上调的核酸序列，其编码具有尿卟啉原III合成酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 107”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 107v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO32所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO34所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 107”和“Oligo 107v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Hem4”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO32或SEQID NO34所示的核酸序列。来自该编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与酿酒酵母的尿卟啉原III合成酶具有显著的序列同源性。
i)优选被下调的核酸序列，其编码具有磷酸甘油酸激酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 136”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 136v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO36所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO38所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 136”和“Oligo 136v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“Pgk1”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO36或SEQID NO38所示的核酸序列。来自两个序列的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母的磷酸甘油酸激酶具有显著的序列同源性。
k)优选被下调的核酸序列，其编码具有蛋白酶B抑制剂2的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 157”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 157v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO40所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO42所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 157”和“Oligo 157v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“PBI2”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO40或SEQID NO42所示的核酸序列。来自SEQ ID NO40的相应互补序列或来自SEQ ID NO42的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母蛋白酶B抑制剂2具有显著的序列同源性。
l)优选被上调的核酸序列，其编码具有半胱氨酸合成酶的功能的蛋白。
本发明此方面的一个优选实施方案中，分离了编码本发明核酸序列的特征性部分序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 108”。
本发明另一优选的实施方案中根据本发明分离了编码本发明的核酸的完全序列的DNA克隆，其内部名称为“Oligo 108v”。
本发明一方面涉及包含SEQ ID NO44所示的核酸序列的多核苷酸。本发明另一方面涉及包含SEQ ID NO47所示的核酸序列或其片段的多核苷酸。这些多核苷酸优选地自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是棉桃阿舒氏囊霉中分离。本发明还涉及与这些多核苷酸互补的多核苷酸，以及这些多核苷酸经遗传密码简并性衍生而成的序列。
“Oligo 108”和“Oligo 108v”的插入序列与来自酿酒酵母的MIPS标签“CYSK”有显著的同源性，这些插入序列具有SEQ ID NO44或SEQID NO47所示的核酸序列。来自SEQ ID NO44的相应互补序列或来自SEQ ID NO47所示的编码链的氨基酸序列或氨基酸部分序列与构巢曲霉(A.nidulans)半胱氨酸合成酶具有显著的序列同源性。
本发明再一方面涉及尤其是在严格的条件下与以上多核苷酸之一杂交的寡核苷酸。
本发明还涉及可以与本发明的寡核苷酸之一杂交并编码来自阿舒氏囊霉属微生物的基因产物或该基因产物的功能等价物的多核苷酸。
本发明进一步涉及由上述多核苷酸编码的多肽或蛋白质；及其具有如下氨基酸序列的肽片段，该氨基酸序列包含SEQ ID NO2，3，5，7，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，46或SEQ IDNO48中显示的至少10个连续的氨基酸残基；以及本发明的多肽或蛋白质的功能等价物。
在这方面，功能等价物与本发明中具体公开的产物相比在氨基酸序列上于至少一个，例如1到30或1到20或1到10个序列位置由于添加，插入，替代，缺失或倒位而不同(这可以经与其他蛋白质进行序列比对推断)，但功能等价物不丧失最初观察到的蛋白功能。因此，与天然蛋白相比较功能等价物可能具有基本相同的、较高或较低的活性。
本发明其它方面涉及用于重组产生本发明蛋白的表达盒，其包含可操作地与至少一个调节核酸序列连接的上述核酸序列之一；并涉及包含至少一个这样的本发明表达盒的重组载体。
本发明还提供了由至少一个上述类型的载体转化的原核或真核宿主。一个优选的实施方案提供了原核或真核宿主，在宿主中至少一种编码上述本发明多肽的基因的功能性表达受到调节(例如被抑制或被过量表达)；或上述定义的多肽的生物活性被降低或增加。优选的宿主选自子囊菌，尤其是阿舒氏囊霉属，优选地为棉桃阿舒氏囊霉株。
上述意义的基因表达调节包括对表达的抑制(如通过阻断表达的某一阶段(尤其是转录或翻译)抑制表达)以及基因的特异过量表达(例如通过修饰调节序列或增加编码序列的拷贝数)。
本发明另一方面涉及本发明的表达盒、本发明的载体或本发明的宿主在维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产中的应用。
本发明另一方面涉及本发明表达盒、本发明的载体或本发明的宿主在上述本发明多肽的重组生产中的应用。
本发明还提供了一种检测或验证可以用于调节维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产的效应物靶点的方法。该方法涉及使用能够与选自上述本发明多肽或其编码核酸序列的靶点相互作用(例如非共价结合)的效应物处理能够以微生物学方式生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物，验证该效应物对微生物生产的维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的量的影响，以及在适当时分离靶点。在此优选地通过与在缺乏该效应物而其他条件相同时微生物的维生素B2产生直接比较来进行验证。
本发明另一方面涉及调节维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产(涉及产生的量和/或速率)的方法，其中用效应物处理能够以微生物学方式产生维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物，该效应物可以与选自上面定义的本发明多肽或编码该多肽的核酸序列的靶点相互作用。
应提及的上述效应物的优选例子为a)抗体或其抗原结合片段；b)与a)不同并可以与本发明的多肽相互作用的多肽配体；c)可以调节本发明多肽的生物活性的低分子量效应物；d)可以与本发明的核酸序列相互作用的反义核酸序列。
本发明还涉及对至少一个以上定义的本发明靶点具有特异性的上述效应物。
本发明另一方面涉及微生物生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的方法，其中在有利产生维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的条件下培养以上定义的宿主，所需的产物自培养混合物中分离。在这方面，优选地用以上定义的效应物在培养前和/或培养过程中处理该宿主。在此优选的宿主选自阿舒氏囊霉属微生物，尤其是上述转化的宿主。
本发明最后的方面涉及利用本发明的多核苷酸或多肽作为调节阿舒氏囊霉属微生物生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的靶点。


图1显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO1第1位至第144位的链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Ade3的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图2A显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO6第862位至第551位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Arg1的部分序列(下面的序列)的比对。图2B显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO6第912位至第859位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Arg1的部分序列(下面的序列)的比对。在每一情况下相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图3显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO12第117位至第1位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Ade1的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图4显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO16第1位至第882位的链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签FRDS1(2)的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图5显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO20第783位至第1位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签PCK1的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图6显示本发明的氨基酸部分序列(中间的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Hem12的部分序列(下面的序列)的比对。在这两个序列上描绘了共有序列。缺乏同源性的位置由黑色长方形标志。
图7显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO28第964位至第529位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Met1的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图8显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO32第107位至第313位的链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签“Hem4”的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图9显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO36第2位至第91位的链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签Pgk1的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图10显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO40第713位至第513位的互补链)(上面的序列)和来自酿酒酵母的MIPS标签“PBI2”的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列之间标出。相似的序列位置以“+”标出。
图11A显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO44第1596位至第1459位的互补链)(上面的序列)和来自构巢曲霉的MIPS标签CYSK的部分序列(下面的序列)的比对。图11B显示本发明的氨基酸部分序列(相应于SEQ ID NO44第1441位至第971位的互补链)(上面的序列)和来自构巢曲霉的MIPS标签CYSK的部分序列(下面的序列)的比对。相同的序列位置在两个序列中间标出。相似的序列位置以“+”标出。
发明详述本发明的核酸分子编码的多肽或蛋白在此被称为代谢蛋白(例如具有与至少一种所需生物产品或其中间产物的生物合成或副产品的分解相关的活性)或简称为“ME蛋白”。这些ME蛋白具有例如调节活体系统能量平衡的功能。由于已掌握了可用于棉桃阿舒氏囊霉的克隆载体(例如Wright和Philipsen(1991)基因(Gene)，109，99-105中公开)以及棉桃阿舒氏囊霉和相关的酵母物种的遗传操作技术，本发明的核酸分子可以用于这些生物体，尤其是棉桃阿舒氏囊霉的遗传操作，从而使其更好并更有效的生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物。产量或生产效率的提高可以由操作本发明的基因的直接效应或该操作的间接效应导致。
本发明基于在此被称为ME核酸和ME蛋白的新颖分子的提供，这些分子参与尤其是棉桃阿舒氏囊霉中的代谢(例如参与代谢酶的合成或调节)。本发明的ME分子在棉桃阿舒氏囊霉中的活性影响该微生物的维生素B2生产。优选对本发明的ME分子的活性进行调节，以便本发明的ME蛋白参与的棉桃阿舒氏囊霉的代谢和/或能量途径在维生素B2的产率、产量和/或生产效率方面受到调节，即直接或间接地调节棉桃阿舒氏囊霉中维生素B2的产率、产量和/或生产效率。
本发明提供的核酸序列可以自例如棉桃阿舒氏囊霉株基因组分离，所述菌株可以从美国典型培养物保藏中心(保藏号为ATCC 10895)自由获得。
维生素B2生产的改进通过改变本发明的ME蛋白的量和/或活性有多种可能的机制可以直接地影响棉桃阿舒氏囊霉株的维生素B2的产率、产量和/或生产效率。
因此，通过特异地控制代谢，可使所需产物(例如精细化学品)的生产效率较竞争产物相比得以增加或优化。也可使细胞对外界影响更具抵抗力，从而增加细胞在发酵罐中的生存力并由此提高细胞的生产率。
对本发明的一种或多种ME蛋白的诱变也可以导致ME蛋白的活性改变(增加或降低)，间接地影响棉桃阿舒氏囊霉株中所需产物的生产。例如可通过ME蛋白终止直接竞争目的化合物的中间产物的反应，或阻断负责生成该特定中间产物的代谢途径并由此优化所需目的物质的生产。可被影响的过程除所需产物的生物合成外，还包括细胞壁的构建、转录、翻译、细胞生长和分裂所需化合物(例如核苷酸、氨基酸、维生素、脂类等)的生物合成(Lengeler等(1999))。通过改善这些修饰细胞的生长和繁殖，可以增加细胞在大规模培养中的生存力并提高分裂速率，从而使相对更多的生产细胞可以在发酵培养基中生存下来。生产的产率、产量或生产效率至少可以因为存在更大量有活力的均能产生所需产物的细胞而得以提高。
多肽本发明涉及包含上述的氨基酸序列或其特征性部分序列和/或由在此描述的核酸序列编码的多肽。
本发明还包括具体公开的新颖多肽的“功能等价物”。
具体公开的多肽的“功能等价物”或类似物为本发明的目的是指与具体公开的多肽不同但仍具有所需生物活性(例如底物特异性)的多肽。
“功能等价物”在本发明中尤其指在至少一个上述序列位置中具有与具体公开所不同的氨基酸但仍具有一种上述的生物活性的突变体。“功能等价物”因此包括可由一个或多个氨基酸添加，替换，缺失和/或倒位获得的突变体，只要生成的突变体能具有本发明的性质谱，所述的修饰可发生于任何序列位置。功能等价物尤其还可以是这样的形式，即突变体和未修饰的多肽就反应模式而言在性质上是一致的，即例如对同样的底物的转化速率不同。
上述意义的“功能等价物”也可以是所述多肽的前体以及该多肽的功能衍生物和盐类。“盐类”一词指本发明蛋白分子的羧基的盐和氨基的酸加成盐。可由本领域已知方式制备羧基的盐，包括例如钠，钙，铵，铁和锌盐等无机盐以及与有机碱的盐，例如与胺类如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等的盐。本发明另一方面涉及酸加成盐，例如与无机酸(例如盐酸或硫酸)的盐和与有机酸(例如乙酸和草酸)的盐。
本发明多肽的“功能衍生物”也可由已知技术在氨基酸侧链官能团上或在多肽的N末端或C末端制备。这样的衍生物包括例如羧基的脂族酯和可通过与氨或与伯胺或仲胺反应得到的羧基的酰胺；通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等价物”自然地也包括可自其他生物体获得的多肽和自然出现的变体。例如，可以通过序列比对发现同源序列区并根据本发明的具体要求确立等价酶。
“功能等价物”还包括具有例如所需的生物学功能的片段，优选为本发明多肽的单结构域或序列基序。
“功能等价物”还可以是具有上述多肽序列之一或其功能等价物和至少一个另外的具有不同功能的异源序列的融合蛋白，该异源序列在所述多肽序列或其功能等价物的N或C末端进行功能性连接(即该融合蛋白的各部分在功能方面产生的相互损害是微不足道的)。这种异源序列的非限制性例子为例如信号肽，酶，免疫球蛋白，表面抗原，受体或受体配体。
根据本发明，“功能等价物”包括本文具体公开的蛋白的同系物。通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448.的算法计算，这些同系物与具体公开的序列之一具有至少60％，优选地至少75％，尤其至少85％，例如90％，95％，或99％的同源性。
在可能存在蛋白糖基化的情况下，本发明的等价物包括以上定义的蛋白类型的去糖基化或糖基化形式，及可通过改变糖基化模式获得的修饰形式。
诱变可产生本发明的蛋白或多肽的同系物，例如通过蛋白点突变或截短实现。这里使用的“同系物”一词涉及可以对蛋白活性产生激动剂或拮抗剂作用的蛋白的变体形式。
可以通过筛选突变体(例如截短突变体)组合文库鉴定本发明蛋白的同系物。通过核酸水平的组合诱变，例如通过合成的寡核苷酸混合物的酶促连接，可以产生一个多样化的蛋白质变体文库。大量方法可用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同系物的文库。简并基因序列的化学合成可在自动DNA合成仪中进行，然后可将合成的基因与适合的表达载体连接。利用一组简并基因可在一个混合物中提供编码一组所需的潜在蛋白质序列的所有序列。本领域技术人员已知合成简并寡核苷酸的方法(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 393；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等(1984)Science 1981056；Ike等(1983)Nucleic Acids Res.1l477)。
此外，也可以利用蛋白密码子的片段文库来生成多样的蛋白片段群用于筛选和随后选择本发明蛋白的同系物。在一个实施方案中，通过如下方法产生编码序列片段文库在每个分子只发生大约一次切割的条件下，以核酸酶处理编码序列的双链PCR片段，变性双链DNA，之后使该DNA复性，从而形成可能包含来自不同切割产物的有义/反义对的双链DNA，经S1核酸酶处理自新形成的双链体中去除单链部分，并将产生的片段文库连接到表达载体中。可由这种方法得到编码本发明蛋白的不同大小的N末端、C末端和内部片段的表达文库。
现有技术中已知一些技术可以从点突变或截短产生的组合文库中筛选基因产物和从cDNA文库中筛选具有选定性质的基因产物。这些技术经改造后可用于快速筛选由本发明同系物的组合诱变产生的基因文库。最常用的高通量大型基因文库筛选分析技术包括将该基因文库克隆入可复制的表达载体中，使用产生的载体文库转化合适的细胞，并在检测所需的活性有助于分离如下载体的条件下表达该组合基因，所述载体编码的基因的产物是活性检测中被检出的产物。递归总体诱变(Recursive ensemblemutagenesis，REM)技术增加文库中功能性突变体的频率，因而可以与筛选实验结合用于鉴定同系物。(Arkin和Yourvan(1992)PNAS897811-7815；Delgrave等(1993)蛋白质工程(Protein Engineering)6(3)327-331)。
可重组制备本发明的多肽(见以下部分)或可通过传统的生化技术自微生物，特别是阿舒氏囊霉属微生物中分离自然形式的多肽。(见Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，柏林，纽约或Scopes，R.，蛋白质纯化(Protein Purification)，施普林格，纽约，海德堡，柏林)。
核酸序列本发明还涉及编码上述多肽之一及其功能等价物的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)，该核酸序列可以利用例如人工核苷酸类似物获得。
本发明既涉及编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性部分的分离的核酸分子，又涉及可用作例如鉴定或扩增本发明的编码核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
本发明的核酸分子还可包含来自基因编码区的3’和/或5’末端的非翻译序列。
“分离的”核酸分子自存在于该核酸的天然来源中的其他核酸分子中分离出来，如果该核酸分子由重组技术产生，还可以基本不含其他细胞物质或培养基；如果由化学方法合成，则基本不含化学前体或其他化学物质。
通过分子生物学标准技术以及本发明提供的序列信息可以分离本发明的核酸分子。例如，以一种具体公开的完全序列或其一部分为杂交探针，通过标准杂交技术(如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆实验室手册，第二版，Molecular CloningA Laboratory Manual.2ndedition，美国冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，美国冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989的描述)，可以从适宜的cDNA文库中分离cDNA。使用基于一种公开序列而构建的寡核苷酸引物、通过聚合酶链反应也可以分离获得包含该序列或其一部分的核酸分子。由这种方法扩增的核酸分子可以被克隆入合适的载体中并由DNA序列分析法表征。由标准合成法，例如使用自动DNA合成仪也可以产生相应于ME核苷酸序列的本发明寡核苷酸。
本发明还包括与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其一部分。
本发明的核苷酸序列使得可产生能用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中的同源序列的探针和引物。这样的探针和引物通常包括如下核苷酸序列区域，该区域可以在严格条件下与本发明核酸序列的有义链或相应的反义链中的至少约12，优选地约25，例如约40，50或75个连续的核苷酸杂交。
本发明的其它核酸序列衍生自SEQ ID NO1，4，6，9，12，14，16，18，20，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44或SEQ ID NO47并由于添加，替代、插入或缺失一个或多个核苷酸而与所衍生自的序列不同，但仍编码具有所需性质谱的多肽。
本发明还包括含有所谓的沉默突变或经过修饰(这是根据特定来源或宿主生物的密码子使用与具体公开的序列相比而言的)的核酸序列以及它们的自然存在的变体(例如拼接变体或等位基因变体)。本发明还涉及可通过保守核苷酸替代(即相关的氨基酸被具有同样电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸替代)获得的序列。
本发明还涉及由序列多态性自具体公开的核酸衍生得到的分子。这些遗传多态性可由于自然变异存在于群体的个体中。这些自然变异通常导致基因的核苷酸序列出现1％至5％的变化。
本发明还包括与上述编码序列杂交或互补的核酸序列。对基因组或cDNA文库进行筛选可发现这些多核苷酸，适当时可以利用合适的引物通过PCR扩增这些多核苷酸，并例如使用合适的探针进行分离。另一种可能的方案是利用本发明的多核苷酸或载体转化合适的微生物，增殖该微生物并由此扩增这些多核苷酸然后分离之。再一可能方案是通过化学途径合成本发明的多核苷酸。
能与多核苷酸“杂交”的性质意味着多核苷酸或寡核苷酸在严格的条件下能与几乎互补的序列结合，而在此条件下，非互补序列之间不发生非特异的结合。为此这些序列应具有70％至100％，优选为90％至100％的互补性。互补序列能够特异性地互相结合的性质可用于例如Northern或Southern印迹杂交或在PCR或RT-PCR中用于引物的结合。为此目的通常使用长30个碱基对或以上的寡核苷酸。严格的条件指例如在Northern印迹杂交法中，在50-70℃，优选地为60-65℃下进行洗涤，如用含有0.1xSSC缓冲液和0.1％SDS(20x SSC3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)的洗涤溶液洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸。在此情况下，如上述只有高度互补的核酸互相保持结合。本领域技术人员已知这种严格条件的建立，并可参见例如Ausubel等的《Current Protocols in MolecularBiology》，John Wiley & Sons，纽约N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中的描述。
本发明另一方面涉及反义核酸。其包含与有义编码核酸互补的核苷酸序列。该反义核酸可与整个编码链互补或仅与其中一部分互补。在另一个实施方案中，该反义核酸分子与核苷酸序列编码链的非编码区反义。“非编码区”指序列中被称为5’-和3’-非翻译区的部分。
反义寡核苷酸可以是例如大约5，10，15，20，25，30，35，40，45或50个核苷酸长。可由本领域已知的方法通过化学合成和酶促连接反应构建本发明的反义核酸。反义核酸可由天然存在的核苷酸或各种修饰的、设计以增强分子的生物稳定性或增强反义和有义核酸间形成的双链体的物理稳定性的核苷酸通过化学方式合成。可以使用的例子包括硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的经修饰的核苷有例如5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，.5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基queuosine，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖基queuosine，5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，Wybutoxosine，假尿嘧啶，queuosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤等。也可利用其中以反义方向亚克隆了核酸的表达载体来生物产生反义核酸。
本发明的反义核酸分子通常被施用给细胞或在原位产生，这样它们可以与该细胞mRNA和/或编码DNA杂交或结合，通过例如抑制转录和/或翻译抑制蛋白的表达。
可以例如通过使反义核酸分子与能结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体相连接，以修饰反义分子从而使之能与在所选的细胞表面上表达的受体或抗原特异性地结合。该反义核酸分子还可通过在此描述的载体被给予细胞。为使细胞内的反义分子达到足够的浓度，优选使用的载体构建体为其中反义核酸分子处于强的细菌、病毒或真核细胞启动子的控制之下的载体。
在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是一种α-异头核酸分子。α-异头核酸分子(α-anomeric nucleic acid molecule)与互补的RNA形成特有的双链杂交体，与通常的α单元不同，这两条链的走向互相平行(Gaultier等，(1987)Nucleic Acids Res.156625-6641)。该反义核酸分子还可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等.，(1987)Nucleic Acids Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
本发明还涉及核酶。其为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割具有与其互补的区域的单链核酸例如mRNA。因此核酶(例如锤头核酶(见Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334585-591))可用于本发明转录物的催化性切割从而抑制相应核酸的翻译。对本发明的编码核酸具有特异性的核酶可以在例如本发明具体公开的cDNA的基础上形成。例如，可构建四膜虫-L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与本发明的编码mRNA中待切割的核苷酸序列互补。(参考例如US-A-4 98707l和US-A-5 116 742)。可替换地，可用mRNA自RNA分子池中选择具有特异的核糖核酸酶活性的催化性RNA(见例如Bartel，D.，和Szostak，J.W.(1993)Science 2611411-1418)。
可替换地，本发明序列的基因表达可通过与本发明核苷酸序列的调节区互补(例如与编码序列的启动子和/或增强子互补)的核苷酸序列的打靶来抑制，这种打靶可造成三股螺旋结构形成从而阻止目标细胞中相应基因的转录(Helene，C.(1991)Anticancer Drug Res.6(6)569-584；Helene，C.等，(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36；和Maher.，L.J.(1992)Bioassays 14(12)807-815)。
表达构建体和载体本发明还涉及包含在调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体；以及包含至少一个这样的表达构建体的载体。本发明的这种表达构建体优选包含位于特定编码序列5’端上游的启动子以及位于特定编码序列3’端下游的终止序列和，适当时，其他通常的调节元件，这些元件每一个都与该编码序列可操作地连接。“可操作地连接”指启动子，编码序列，终止子和适当时其他调节元件的相继排列方式，这种方式使得每个调节元件都能按预期行使其功能用于编码序列的表达。可操作连接的序列的例子为前导序列和增强子、多腺苷酸化信号等。其他调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列在例如Goeddel，基因表达技术酶学方法(Gene Expression TechnologyMethodsin Enzymology)185，Academic Press，圣地亚哥San Diego，加利福尼亚州CA(1990)中有所描述。
除了人工调节序列，天然的调节序列仍可以存在于实际的结构基因之前。这种天然调节可在适当时通过基因修饰而关闭，从而使基因的表达可被增加或降低。然而，基因构建体也可具有较为简单的结构，即在结构基因之前不插入附加的调节信号，且具有调节功能的天然启动子未被删除。可替换地，可以使天然调节序列发生突变不再具有调节作用，从而增强或降低基因的表达。核酸序列在基因构建体中可有一个或多个拷贝。
可使用的启动子的例子包括cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq，T7，T5，T3，gal，trc，ara，SP6，λ-PR或λ-PL启动子(它们优选用于革兰氏阴性细菌)；革兰氏阳性细菌启动子amy和SPO2，酵母启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH或植物启动子CaMV/35S，SSU，OCS，lib4，usp，STLS1，B33，或泛素或菜豆蛋白启动子。尤其优选使用可诱导的启动子，例如光诱导的启动子，更优选为温度诱导的启动子如PrPl启动子。原则上所有天然启动子以及它们的调节序列均可使用。此外，使用合成启动子也可能是有利的。
所述的调节序列旨在用于实现核酸序列的特异表达。这意味着例如视宿主生物不同使基因只在诱导后才表达或过量表达或立即被表达和/或过量表达。
此外优选调节序列或因子可以正面地产生影响，从而增加或减低表达。因此，调节元件的增强作用可以有利地使用强转录信号如启动子和/或增强子在转录水平上发生。然而通过例如增加mRNA的稳定性，也可加强其翻译。
融合适宜的启动子和适宜的本发明核苷酸序列以及终止信号或多腺苷酸化信号可以产生表达盒。为此目的可以使用常规的重组和克隆技术，参见T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，冷泉港Cold Spring Harbor，纽约(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合试验(Experiments with GeneFusions)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，纽约(1984)；Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)。
为在适宜的宿主生物中表达，重组核酸构建体或基因构建体可以有利地插入宿主特异的载体中实现这些基因在宿主中的最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的，并可在例如“克隆载体”(Cloning Vectors)(PouwelsP.H.等，eds，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到有关内容。载体不仅指质粒，还包括本领域技术人员已知的所有其他载体，例如噬菌体，病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，质粒，粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或随染色体复制。
可以提及的适宜表达载体的例子有常规的融合表达载体如pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 6731-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，使用这些载体可以分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和A蛋白融合至重组目标蛋白。
非融合蛋白表达载体如pTrc(Amann等(1988)Gene 69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表达技术酶学方法(Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology)185，Academic Press，圣地亚哥，加利福尼亚(1990)60-89)。
用于酿酒酵母中表达的酵母表达载体如pYepSec1(Baldari等(1987)Embo J.6229-234)，pMF(Kurjan和Herskowitz(1982)细胞(Cell)30933-943)，pJRY88(Schultz等(1987)基因(Gene)54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，圣地亚哥，加利福尼亚)。有关适用于其他真菌(如丝状真菌)的载体和载体构建方法的例子的详细描述见例如van denHondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“丝状真菌基因转移系统和载体的发展”，《真菌的应用分子遗传学》(Applied Molecular Genetics ofFungi)，J.F.Peberdy等eds，pp.1-28，Cambridge University PressCambridge。
现有用于培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中蛋白的表达的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒学(Virology)17031-39)。
植物表达载体的例子的详细描述见例如Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“紧靠左边界带有选择标记的新植物二元载体”，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“用于植物转化的农杆菌二元载体”，Nucl.Acids Res.128711-8721。
哺乳动物表达载体例如pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6187-195)。
适用于原核和真核细胞的其它表达系统在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆实验室手册(Molecular cloningA LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989.的第16和17章中描述。
重组微生物本发明的载体可用于产生重组微生物，所述微生物由例如至少一个本发明的载体转化并可用于产生本发明的多肽。有利地，可以将上述的本发明重组构建体引入适合的宿主系统中并在其中表达。本领域技术人员熟悉克隆和转染的方法，例如共沉淀，原生质体融合，电穿孔法，逆转录病毒转染法等，并优选使用这些方法引起所述的核酸在特定的表达系统中表达。适宜的表达系统在例如《Current Protocols in Molecular Biology》(F.Ausubel等，eds，Wiley Interscience，纽约1997)或Sambrook等《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)第二版(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989)中有描述。
根据本发明还可以制备同源重组微生物。这需要产生包含至少一段本发明的基因或编码序列的载体，在适当时，向其中引入至少一个氨基酸缺失、添加或替代以修饰，例如从功能上破坏本发明的序列(剔除载体)。引入的序列也可为例如来自相关微生物的同系物或来自哺乳动物、酵母或昆虫。可替代地，还可设计用于同源重组的载体以便同源重组过程中内源性基因发生突变或经过其他修饰但仍编码功能蛋白(如可以修饰位于上游的调节序列以改变内源性蛋白的表达)。ME基因的修饰部分存在于同源重组载体内。适宜的同源重组载体的构建的描述见例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51503。
原则上适宜的宿主生物体可为所有能够表达本发明的核酸的生物体，其等位基因变体，其功能等价物或衍生物。宿主生物指例如细菌，真菌，酵母，植物或动物细胞。优选的生物为细菌，例如埃希氏杆菌属(Escherichia)如大肠杆菌，链霉菌属(streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)或假单胞菌属(Pseudomonas)，真核微生物如酿酒酵母，曲霉菌(Aspergillus)，来自动物或植物的高等真核细胞，如Sf9或CHO细胞。优选的生物选自阿舒氏囊霉属，尤其是棉桃阿舒氏囊霉株。
成功转化的生物可通过同样存在于载体或表达盒中的标记基因选择。这样的标记基因为例如抗生素抗性基因和催化引起转化细胞染色的颜色形成反应的酶的基因。随后可以通过自动细胞分拣法进行选择。由载体成功转化并包含适当的抗生素抗性基因(例如G418或潮霉素)的微生物可由适当的含抗生素的培养质或营养介质选择。利用细胞表面上存在的标记蛋白可以通过亲和层析法进行选择。
宿主生物与适合该生物的载体例如质粒、病毒或噬菌体，如具有RNA聚合酶/启动子系统的质粒、λ或μ噬菌体或其他温和噬菌体或转座子和/或其他有利调节序列的结合形成表达系统。“表达系统”一词指，例如，哺乳动物细胞如CHO细胞与适合哺乳动物细胞的载体如pcDNA3neo载体的结合。
如需要，基因产物还可在转基因生物体例如转基因动物(尤其为小鼠，绵羊)或转基因植物中表达。
多肽的重组生产本发明还涉及重组产生本发明的多肽或其生物学活性功能片断的方法，该方法中培养可以产生多肽的微生物，在适当时诱导多肽的表达，并自培养物中分离多肽。如需要，该多肽可由此方法进行工业规模的生产。
可以利用已知的方法培养和发酵重组微生物。可以在例如20到40℃下，pH为6到9的TB或LB培养基中培养细菌。适合的培养条件的描述见例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
如果多肽不被分泌入培养基，则破坏细胞后，利用已知的蛋白分离法自裂解物中获得产物。备选地，可以通过高频率超声波，高压例如在弗氏细胞压碎器中，渗胀裂解(osmolysis)，变性剂的作用，裂解酶或有机溶剂，匀浆或上述多种方法的组合来破碎细胞。
多肽的纯化可以利用已知的色谱法例如分子筛色谱(凝胶过滤法)，如Q-Sepharose色谱，离子交换色谱和疏水色谱以及其他常用方法如超滤，结晶，盐析，透析和非变性凝胶电泳。对适合的方法的描述见例如Cooper，T.G.，Biochemische Arbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin。
使用如下载体系统或寡核苷酸尤其利于分离重组蛋白，所述载体系统或寡核苷酸通过特定的核苷酸序列延长cDNA，并由此编码可用于例如简化纯化过程的经修饰的多肽或融合蛋白。该类型的适当修饰包括例如所谓的标签－－其起锚的作用(例如六组氨酸锚修饰法)或能被抗体识别为抗原的表位(描述见例如Harlow，E.和Lane，D.，1988，AntibodiesALaboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)。这些锚可用于使蛋白结合在例如聚合物基质等固相载体上，该固相载体可装入例如层析柱中，或用于微量滴定板或其他载体上。
同时这些锚也可用于蛋白的识别。还可以单独或与锚结合使用传统的标记物例如荧光染料，与底物反应后可形成可探测的反应产物的酶标记物或放射性标记物来衍生并由此识别蛋白质。
本发明还涉及维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产方法。
如果转化是用重组微生物进行的，则优选该微生物首先在有氧的复合培养基中培养，例如在约20℃或更高的温度下，pH值约为6到9时培养直到细胞密度足够为止。为了能够更好的控制反应，优选使用可诱导的启动子。对维生素B2产生实施诱导后，接着在有氧条件下继续培养12小时到3天。
以下非限制性实施例描述了本发明具体的实施方案。
一般性实验描述a)一般克隆方法本发明利用的克隆步骤，例如限制性切割，琼脂糖凝胶电泳，DNA片段的纯化，转移核酸至硝化纤维素膜和尼龙膜上，DNA片段的连接，大肠杆菌细胞的转化，细菌的培养，噬菌体的复制，以及重组DNA的序列分析，均按照Sambrook等(1989)上述引文的描述进行。
b)聚合酶链反应(PCR)按照标准方案在下面的标准混合物中进行PCR8μl dNTP混合液(200μM)，10μl不含MgCl2的Taq聚合酶缓冲液(10x)，8μl MgCl2(25mM)，每种引物各1μl(0.1μM)，1μl DNA(待扩增)，2.5U Taq聚合酶(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)，去离子水加至100μl。
c)大肠杆菌的培养在LB-amp培养基(胰胨10.0g，氯化钠5.0g，酵母提取物5.0g，氨苄青霉素100g/ml，H2O加至1000ml)中、37℃下培养重组大肠杆菌DH5α菌株。为此每种情况下用接种环将一个菌落从琼脂平板转移至5mlLB-amp中。在220rpm下振荡培养约18小时后，将4ml培养物接种至2升摇瓶中的400ml培养基中。当OD578值到达0.8和1.0之间后在42℃下热休克3至4个小时，诱导大肠杆菌中P450的表达。
d)自培养物中纯化所需产物可以利用多种本领域已知的方法将所需的产物自微生物或培养物上清中分离出来。如果所需的产物不被细胞分泌，则可通过慢速离心将细胞从培养物中分离出来，并可以由如机械作用力或超声作用等标准技术裂解细胞。
利用离心除去细胞碎片，得到包含可溶性蛋白的上清部分用于进一步纯化所需的化合物。如果该产物被细胞分泌，则由慢速离心除去培养物中的细胞，保留的上清部分用于进一步纯化。
在适合的树脂中层析从这两种纯化方法得到的上清部分，所需的分子以大于杂质的选择性保留于层析树脂上或通过之。如有必要可用相同或不同的层析树脂重复层析步骤。本领域技术人员能够选择适宜的层析树脂，并最为有效的利用其纯化特定的分子。纯化产物可以经过滤或超滤浓缩，并在该产物最为稳定的温度下储存。
本领域已知多种纯化方法。这些纯化技术的描述见例如，Bailey，J.E.&Ollis，D.F.Biochemical Engineering Fundamentals，McGraw-HillNewYork(1986)。
可以利用现有技术确定分离的化合物的成分和纯度。这些技术包括高效液相色谱法(HPLC)、光谱学方法、染色方法、薄层色谱法、NIRS、酶分析或微生物学分析法。这些分析方法的概述见Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.1967-70；Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry(1996)Vol.A27，VCHWeinheim，pp.89-90，pp.521-540，pp.540-547，pp.559-566，pp.575-581和pp.581-587；Michal，G(1999)Biochemical PathwaysAn Atlas of Biochemistry andMolecular Biology，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化学中的应用，《Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology》，Vol.17。
e)MPSS法、克隆鉴定和同源性检索的一般描述MPSS技术(Massive Parallel Signature Sequencing，大规模平行信号测序，参考Brenner等，Nat.Biotechnol.(2000)18，630-634)被应用于产生维生素B2的丝状真菌棉桃阿舒氏囊霉。利用该技术可以获得有关大量基因在真核生物体中的表达水平的高度准确的定量信息。该技术涉及在一个特定的时间X时分离生物体的mRNA，在逆转录酶的帮助下转录成cDNA并克隆入具有特定标签序列的特定载体中。选择数目足够多(大约高1000倍)的具有不同标签序列的载体，以便在统计学上每个DNA分子均被克隆入因其标签序列而独特的载体中。
该载体的插入序列随后与标签一起被切下。通过这种方法得到的DNA分子然后与具有所述标签的分子对应物的微珠共同孵育。孵育后可认为通过特定标签或对应物每个微珠仅加载了一种类型的DNA分子。将这些微珠转移至特殊的流式处理槽(flow cell)中并固定在那里，从而可能利用以荧光染料为基础的改造的测序法和数码彩色相机对所有的微珠进行群体测序。尽管这种方法可进行高数目的分析，却受到约16到20个碱基对的阅读宽度的限制。然而对大多数生物体而言，该序列长度却足以使序列和可能的基因之间建立明确的关系(20bp序列的频率为～1×1012；与之相比，人类基因组的大小“仅”～3×109bp)。
计数相同序列的数目并相互比较频率以分析由此得到的数据。频繁出现的序列反映了高水平的表达，而只出现一次的序列反映了低水平的表达。如果在两个不同的时间点(X和Y)分离mRNA，可构建单个基因按时间顺序的表达模式。
实施例1自棉桃阿舒氏囊霉中分离mRNA根据已知的技术培养棉桃阿舒氏囊霉(营养培养基27.5g/l酵母提取物；0.5g/l硫酸镁；50ml/l大豆油；pH 7)。在发酵过程的不同时间(24h，48h和72h)取出棉桃阿舒氏囊霉的菌丝样品，根据Sambrook等(1989)的方案分离相应的RNA或mRNA。
实施例2MPSS的应用利用上述的MPSS分析法分析自棉桃阿舒氏囊霉分离的mRNA。
利用统计分析法分析得到的数据并根据表达差异的显著性进行分类。这必需要进行关于表达水平的增加和降低的检测。对表达的改变进行分类a)单调的改变(monotonic change)，b)24h后改变，和c)48h后改变。
将由MPSS分析发现的反映了表达的改变的20bp序列作为探针与来自棉桃阿舒氏囊霉的基因文库杂交，文库的插入序列的平均大小约为1kb。在此处杂交温度为约30至57℃。
实施例3自棉桃阿舒氏囊霉构建基因组文库为构建基因组DNA文库，首先通过Wright和Philippsen(Gene(1991)10999-105)及Mohr(1995，phD论文，Bio Zentrum universitt Basel，瑞士)的方法分离染色体DNA。
该DNA由Sau3A部分消化。为此，利用不同量(0.1至1U)Sau3A酶消化6μg基因组DNA。在蔗糖密度梯度中分级分离DNA片断。分离1kb区并进行QiaEx提取。最大的片段与BamHI切割的载体pRS416(Sikorski和Hieter，Genetics(1988)122；19-27)连接(90ng BamHI切割的脱磷酸化载体；198ng插入DNA；5ml水；2μl的10×连接缓冲液；1U连接酶)。该连接混合物用于转化大肠杆菌实验室菌株XL-1 blue，产生的克隆用于鉴定该插入序列。
实施例4有序基因文库的制备(芯片技术)将棉桃阿舒氏囊霉基因文库的约25,000个菌落(相当于对该基因组的约3倍覆盖)有序地转移至尼龙膜然后由Sambrook等(1989)描述的菌落杂交法处理。从Mpss分析法发现的20bp序列合成寡核苷酸并用放射性32P标记。在每种情况下组合10个标记的熔点相似的寡核苷酸并一起与该尼龙膜杂交。杂交并洗涤后，由放射自显影鉴定出阳性克隆，并直接由PCR测序法分析。
由此方法鉴定出包含内部名称为″Oligo 72″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Ade3”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO1显示的核酸序列。
由此方法鉴定出包含内部名称为″Oligo 81″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Arg1”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO6显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 86″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Ade1”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO12显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 162″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“FRDS1(2)”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQ ID NO16显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 178″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“AgPCK1”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQ ID NO20显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 64″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Hem12”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQ ID NO24显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 125″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Met1”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO28显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 107″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Hem4”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQ ID NO32显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 136″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“Pgk1”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO36显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 157″的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“PBI2”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQID NO40显示的核酸序列。
由此方法还鉴定出包含内部名称为″Oligo 108”的插入序列并与来自酿酒酵母的MIPS标签“CYSK”具有显著同源性的克隆。该插入序列具有SEQ ID NO44显示的核酸序列。
实施例5由BLASTX查询法分析序列数据对所得核酸序列的分析，即通过功能性氨基酸序列推断出其功能，由BLASTX查询法在序列数据库中进行。几乎所有发现的氨基酸序列同系物均与酿酒酵母(面包酵母)有关。由于该生物的全部序列已被测定，有关这些基因的更详细的信息可查阅http//www.mips.gsf.de/proi/yeast/search/code search.htm。
由此发现了与主要来自酿酒酵母的氨基酸片段的如下同源性。相应的比对情况见附图1至11。
a)来自SEQ ID NO1的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母C1-四氢叶酸合成酶具有显著的序列同源性。图1描绘了来自该编码链(相应于SEQ IDNO1第1位至第144位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。此外，还发现了相应于SEQ ID NO1第180位至第287位核苷酸的氨基酸部分序列的同系物。SEQ ID NO2和SEQ ID NO3各显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有C1-四氢叶酸合成酶的功能。
b)来自SEQ ID NO6的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母精氨基琥珀酸合成酶具有显著的序列同源性。图2A描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO6第862位至551位核苷酸的互补链)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。图2B描绘了来自该互补链(相当于SEQ IDNO6第912位至859位核苷酸的互补链)的另一氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO7和SEQ ID NO8各显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有精氨基琥珀酸合成酶的功能。
c)来自SEQ ID NO12的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母的氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺核苷酸合成酶具有显著的序列同源性。图3描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO12中的第117位至第1位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO13显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有氨基咪唑-琥珀酸甲酰胺核苷酸合成酶的功能。
d)来自SEQ ID NO16的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母延胡索酸还原酶具有显著的序列同源性。图4描绘了来自该编码链(相当于SEQ IDNO16的第1位至第882位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO17显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有延胡索酸还原酶的功能。
e)来自SEQ ID NO20的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母烯醇丙酮酸磷酸羧激酶具有显著的序列同源性。图5描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO20中的第783位至第1位核苷酸)的氨基酸部分序列与此酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO21显示N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的功能。
f)来自SEQ ID NO24的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母尿卟啉原脱羧酶具有显著的序列同源性。来自该链的氨基酸部分序列(SEQ ID NO25，相当于SEQ ID NO24的第441位至第1058位核苷酸)显示与来自酿酒酵母的MIPS标签Hem12的部分序列具有同源性。图6描绘了来自该链的氨基酸部分序列与此酿酒酵母酶的部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有尿卟啉原脱羧酶的功能。
g)来自SEQ ID NO28的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母siroheme合成酶具有显著的序列同源性。图7描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO28的第966位至第529位核苷酸的互补链)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO29显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有siroheme合成酶或尿卟啉III C-甲基转移酶的功能。
h)来自SEQ ID NO32的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母尿卟啉原III合成酶具有显著的序列同源性。图8描绘了来自该链(相当于SEQ IDNO32的第107位至第313位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO33显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有尿卟啉原III合成酶的功能。
i)来自SEQ ID NO36的编码链的氨基酸序列与酿酒酵母磷酸甘油酸激酶具有显著的序列同源性。图9描绘了来自该编码链(相当于SEQ IDNO36的第2位至第91位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO37表示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有磷酸甘油酸激酶的功能。
k)来自SEQ ID NO40的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母蛋白酶B抑制剂2具有显著的序列同源性。图10描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO40中的第713位至第513位核苷酸)的氨基酸部分序列与该酿酒酵母酶的部分序列。SEQ ID NO41显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有蛋白酶B抑制剂2的功能。
l)来自SEQ ID NO44的相应互补链的氨基酸序列与酿酒酵母和构巢曲霉的半胱氨酸合成酶具有显著的序列同源性。图11A描绘了来自该互补链(相当于SEQ ID NO44第1596位至1459位核苷酸)的氨基酸部分序列与该构巢曲霉酶的部分序列。图11B描绘了来自该互补链(相当于SEQID NO44第1441位至971位核苷酸)的另一氨基酸部分序列与该构巢曲霉酶的部分序列。SEQ ID NO45和SEQ ID NO46各显示一种N端延长的氨基酸部分序列。
因此可以推断出发现的该棉桃阿舒氏囊霉核酸序列具有半胱氨酸合成酶的功能。
实施例6全长DNA的分离a)构建棉桃阿舒氏囊霉基因文库从100ml在液体MA2培养基(10克葡萄糖，10克蛋白胨，1克酵母提取物，0.3g肌醇，加至1000ml)中生长两天的棉桃阿舒氏囊霉培养物制备高分子量细胞总DNA。滤出菌丝体，并用蒸馏水洗两遍，悬浮于10ml包含1M山梨糖醇、20mM EDTA和20mg酶解酶20T的溶液中，并于27℃下孵育、轻振30至60分钟。将原生质体悬液调整至包含50mMTris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，100mM EDTA和0.5％浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，并于65℃下孵育20分钟。经过两次酚/氯仿(体积比1∶1)萃取，用异丙醇沉淀DNA，悬浮于TE缓冲液中，经RNA酶的处理后再次用异丙醇沉淀并悬浮于TE缓冲液中。
根据大小选出并由Sau3A部分消化的基因组DNA与粘粒载体Super-Cosl(Stratagene)的去磷酸化臂连接产生棉桃阿舒氏囊霉粘粒基因文库。Super-Cos1载体在两个cos位点间经Xbal消化打开并用牛小肠碱性磷酸酶(Boehringer)去磷酸化，接着用BamHI打开克隆位点。该连接在20μl包含2.5μg部分消化的染色体DNA，1μg Super-Cos1载体臂，40mMTris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM二硫苏糖醇，0.5mM ATP和2Weiss单位T4-DNA连接酶(Boehringer)的混合液中、15℃下过夜进行。利用提取物和Stratagene的方案(Gigapack II Packaging Extract)在体外包装连接产物。将包装产物用于感染大肠杆菌NM554(recA13，araD139，Δ(ara，leu)7696，Δ(lac)17A，galU，galK，hsrR，rps(strr)，merA，mcrB)并涂布在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB板上。获得含有长度平均为30-45kb的棉桃阿舒氏囊霉插入片段的转化体。
b)粘粒基因文库的储存和筛选将共4×104个新鲜单菌落各自单独地接种于96孔微量滴定板(Falcon，No.3072)孔中的100μlLB培养基中，所述LB培养基补充有冻存液(36mM K2HPO4/13.2mM KH2PO4，、1.7mM柠檬酸钠、0.4mMMgSO4、6.8mM(NH4)2SO4，、4.4％(w/v)甘油)和氨苄青霉素(50μg/ml)，37℃下振摇过夜生长之后在-70℃下冷冻。快速融解滴定板并在用经酒精浴消毒随后在热板上蒸发去除酒精的96孔复制板上于新鲜培养基中进行复制。在冷冻前和解冻后(采取其它所有措施前)，在微量滴定板振荡器(Infors)中短暂振荡这些板子以保证该细胞悬液的均匀。利用能够将少量液体自96孔微量滴定板转移至尼龙膜的自动机械系统(Bio-Robotics)将单克隆置于尼龙膜上(GeneScreen Plus，New England Nuclear)。当培养物自96孔微量滴定板转移后(1920个克隆)，该膜被置于22×22厘米培养皿(Nunc)中含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂表面上并在37℃下孵育过夜。细胞汇合前，用Herrmann，B.G.，Barlow，D.P和Lehrach，H.(1987)，Cell 48，pp.813-825描述的方法处理这些膜，包括第一个变性步骤后的附加处理，即将滤膜置于沸水浴上饱含变性溶液的垫子上方暴露于蒸气5分钟。
利用随机六聚体引物标记法(Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.(1983)，Anal.Biochem.132，pp.6-13)、通过[α-32P]dCTP的摄取，得到高比活的标记双链探针。这些膜经过预杂交后在42℃下、于含有50％(vol/vol)甲酰胺、600mM磷酸钠、pH 7.2、1mM EDTA、10％硫酸葡聚糖、1％SDS和10×Denhardt氏液、鲑鱼精子DNA(50μg/ml)以及32P标记的探针(0.5-1×106cpm/ml)的溶液中杂交6至12小时。典型地，在55至65℃下、13至30mM NaCl、1.5至3mM柠檬酸钠、pH 6.3、0.1％SDS中洗涤约1小时，滤膜在-70℃用柯达增感屏放射自显影12至24小时。至今，每张膜均已被成功重复使用20次以上。在95℃下、2mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2mM EDTA，0.1％SDS中孵育2×20分钟剥离滤膜上的探针。
c)从存储的基因文库中回收阳性菌落用无菌一次性柳叶刀将微量滴定板孔中的冰冻细菌培养物刮出，并在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养皿上划线。然后将单菌落接种于液体培养基中，通过碱裂解法产生DNA(Birnboim，H.C.和Doly，J.(1979)，Nucleic Acids Res.7，pp.1513-1523)。
d)全长DNA如上述可鉴定出包含具有正确的完全序列的插入片段的克隆。这些克隆的内部名称为“Oligo 72v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO4中所示的核酸序列。
“Oligo 81v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO9.中所示的核酸序列。由该插入片段编码的蛋白优选地包含SEQ ID NO10和11中所示至少一种氨基酸序列。
“Oligo 86v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO14中所示的核酸序列。
“Oligo 162v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO18中所示的核酸序列。
“Oligo 178v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO22中所示的核酸序列。
“Oligo 64v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO26中所示的核酸序列。
“Oligo 125v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO30中所示的核酸序列。
“Oligo 107v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO34中所示的核酸序列。
“Oligo 136v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO38中所示的核酸序列。
“Oligo 157v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO42中所示的核酸序列。
“Oligo 108v”，包含完全序列的插入片断具有SEQ ID NO47中所示的核酸序列。
表1序列综览




序列表<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)<120>棉桃阿舒氏囊霉的酶<130>M/42301/PCT<160>48<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1058<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 72<400>1gatctctctc ctacggcgca aaagaagatt gccttgtaca cggcccaagg ttttgataaa 60ctacctatct gtatcgcgaa aactcagtac tccctgtccc atgatgccac ctttgaagaa 120cgtcccctcc gattttgtgt tccccataag ggatatcagg gccttccatt ggagcgggct 180acctgtacgc gctagcggca gagattcaaa ctatccccgg tctctccact aacgcaggct 240acatgaatgt tgaagtcagt gatgacggcg agattgaagg tcttttctag gtctacgatt 300acgtatgctt agccaccccc gctcatatac ataattatgt tgaacaggca tgctcaggct 360gcgttccctg tagtgcaccc gttagtgcgc atgggccccg aagccgttgc ttttagaacc 420ggcatgcgac acataccgga gacattactt tagcgtcgca gtgacagtta tgtcccgaga 480cgctggcatg caatcgatgt cgagcctagt gagtcagaaa cggagtcagt gtcttcagac 540acacaagcga aatcagggtc agctttgact aaacctaaaa accatagtgc attacgtccg 600actgtatctt cacataaagt tagggaggag aatcaaagca aggtagcata acaaagtatg 660gatttgatgg tcataaataa ggacgactgg gtatatgtac agtccgaggg cgaccacagc 720ggcgatcaca cttattttga gagcacaatc acctcatcgc ttcgagacac aaagcggcac 780gcgctattcc cgcccatagt cagggagcag ttcatccagg ggaaagatat gtgcctacca 840atctaccacg acgggataaa agagcaggca gcgctcgagt acgacggcac aggcgcgcta 900tgcggccttt gacacgctgt ggcaccacgc cgccacacag cacgcaataa acgggcaacg 960gtatattgct gatatacctc gatacttatt attagaaaaa acctgcgttt gcaggctttt1020atactacata aagacaggat gaaaaacgta gatagatc1058<210>2<211>48<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉
<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 72<400>2Asp Leu Ser Pro Thr Ala Gln Lys Lys Ile Ala Leu Tyr Thr Ala Gln1 5 10 15Gly Phe Asp Lys Leu Pro Ile Cys Ile Ala Lys Thr Gln Tyr Ser Leu2025 30Ser His Asp Ala Thr Phe Glu Glu Arg Pro Leu Arg Phe Cys Val Pro35 40 45<210>3<211>41<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 72<400>3Ser Ile Gly Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Glu Ile Gln Thr1 5 10 15Ile pro Gly Leu Ser Thr Asn Ala Gly Tyr Met Asn Val Glu Val Ser20 25 30Asp Asp Gly Glu Ile Glu Gly Leu Phe35 40<210>4<211>4474<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>CDS<222>(440)..(3253)<223>
<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 72<400>4cggcttcagt tttttttatc cccaattact ctcgttactg attccgcgat tgacgctaat 60ttaactttag ctttttatat gcttgactta gcctttacct gttgtcgact ttctttagtt120cagcatcttg tatattactt gttcacgtat aaatagatag cgatacccct ttgcgagtat180
acagttgcct tactgtgatt atgttcttcc tgttttattt gctaggtaag ttttgacctt240tttttgatgt tcacaagcac cgtcgacgct caagaaaacg atcgaagttc ctccctaacg300tctgccgttt accaagtata acgttgaact gtactatcct cctgtgcact aagttagcat360gcttcgcacc tttacggagt ggagtattct aaggagtaat actcagctcg gggctttcag420ctgcccagta cgaagacat tac cat tta att tct ggt aaa agc atc gcg aaa 472Tyr His Leu Ile Ser Gly Lys Ser Ile Ala Lys1 5 10acc att aga gac aat gct ctg aga gag gtg aaa gag att agg cag caa 520Thr Ile Arg Asp Asn Ala Leu Arg Glu Val Lys Glu Ile Arg Gln Gln15 20 25gtt cca gat ttt aat cca aaa ctg aag atc ttg cag gtt ggc tcc cgc 568Val Pro Asp Phe Asn Pro Lys Leu Lys Ile Leu Gln Val Gly Ser Arg30 35 40cct gat tca tct gca tat gtc cgg atg aag ttg aaa gca tcc acc gag 616Pro Asp Ser Ser Ala Tyr Val Arg Met Lys Leu Lys Ala Ser Thr Glu45 50 55tct ggt gta gaa tgt gac gtt gaa aag ctt cca gaa gat att acg caa 664Ser Gly Val Glu Cys Asp Val Glu Lys Leu Pro Glu Asp Ile Thr Gln60 65 70 75ctc gaa cta ctc aga aag atc gag aaa atc aac tct gac gcc gaa gtg 712Leu Glu Leu Leu Arg Lys Ile Glu Lys Ile Asn Ser Asp Ala Glu Val80 85 90cat ggg att ctg att cag ctg cca ctg cca aag cat tta gat gaa gtg 760His Gly Ile Leu Ile Gln Leu Pro Leu Pro Lys His Leu Asp Glu Val95 100 105aca gtt acc aat gct gtg gac cat gaa aag gac gtt gat ggg ttc cat 808Thr Val Thr Asn Ala Val Asp His Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His110 115 120cgc tat aat gtt ggt gag ctc gct aaa cgt ggc ggg aaa cca tac ttc 856Arg Tyr Asn Val Gly Glu Leu Ala Lys Arg Gly Gly Lys Pro Tyr Phe125 130 135ctg cca tgt aca cct aat gcg tgt ata cag ctt ttg aaa gag tgc ggt 904Leu Pro Cys Thr Pro Asn Ala Cys Ile Gln Leu Leu Lys Glu Cys Gly140 145 150 155gtt gag ata aga ggg aaa cag gca gtc gta att ggc cgc tct gac atc 952Val Glu Ile Arg Gly Lys Gln Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asp Ile160 165 170gtg ggg acc cca gtt gca acg atg ctc aaa aat ctt gat gcc acg gtg 1000Val Gly Thr Pro Val Ala Thr Met Leu Lys Asn Leu Asp Ala Thr Val175 180 185act gtt gcg cac aga cat acg aca aat ctt cca caa gtc ctc tcc act 1048Thr Val Ala His Arg His Thr Thr Asn Leu Pro Gln Val Leu Ser Thr190 195 200gcg gat att gta gtt gct gcg tgt ggc gtg cct aac tac ata aag ggc 1096Ala Asp Ile Val Val Ala Ala Cys Gly Val Pro Asn Tyr Ile Lys Gly205 210 215gaa tgg tta aaa gat ggc gcc gtg gtt att gac gtt ggc atc aat tat 1144Glu Trp Leu Lys Asp Gly Ala Val Val Ile Asp Val Gly Ile Asn Tyr
220 225 230 235gtt cag gat tcc acc aaa aaa tca ggc caa aga tta gtc ggt gat gtg 1192Val Gln Asp Ser Thr Lys Lys Ser Gly Gln Arg Leu Val Gly Asp Val240 245 250gac ttc gaa tcg gca aag gag aag gct tct cac atc acg cct gta cct 1240Asp Phe Glu Ser Ala Lys Glu Lys Ala Ser His Ile Thr Pro Val Pro255 260 265ggc ggc gtg ggt cct atg acc gtg gcc atg ctg gtg caa aat gtc ttg 1288Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Val Ala Met Leu Val Gln Asn Val Leu270 275 280act gca gca aaa aga tcg ttg cag aag gac gca gag gtg cca gtg atc 1336Thr Ala Ala Lys Arg Ser Leu Gln Lys Asp Ala Glu Val Pro Val Ile285 290 295aca cca ctg cct gtg aat ttt gag atg cct gtg cca tcg gat atc gat 1384Thr Pro Leu Pro Val Asn Phe Glu Met Pro Val Pro Ser Asp Ile Asp300 305 310 315ata tca agg aaa cag aat ccg aaa cat att tct cag gtg gca gcc gag 1432Ile Ser Arg Lys Gln Asn Pro Lys His Ile Ser Gln Val Ala Ala Glu320 325 330ttg ggt att agg gat cac gag ctg gag ttg ttt ggg cat tat aaa gcc 1480Leu Gly Ile Arg Asp His Glu Leu Glu Leu Phe Gly His Tyr Lys Ala335 340 345aag att tct cca aaa ctc ctc caa aga ttg cat gct aac caa aat gca 1528Lys Ile Ser Pro Lys Leu Leu Gln Arg Leu His Ala Asn Gln Asn Ala350 355 360aac tat gtc tta gtt gct ggg att aca ccg acc cct cta gga gag gga 1576Asn Tyr Val Leu Val Ala Gly Ile Thr Pro Thr Pro Leu Gly Glu Gly365 370 375aag tcg acc acc act atg ggg cta gtc caa gcg ctt tcc gct cac cta 1624Lys Ser Thr Thr Thr Met Gly Leu Val Gln Ala Leu Ser Ala His Leu380 385 390 395ggc aaa cgg gct att gca aac gtt cgt caa cct tca atg gga ccc acg 1672Gly Lys Arg Ala Ile Ala Asn Val Arg Gln Pro Ser Met Gly Pro Thr400 405 410ttt gga gtc aag gga ggc gcg gca ggc ggg ggt tac gcc cag gtc att 1720Phe Gly Val Lys Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Tyr Ala Gln Val Ile415 420 425cca atg gat gag ttc aac ttg cat ttg aca ggc gac atc cac gcc att 1768Pro Met Asp Glu Phe Asn Leu His Leu Thr Gly Asp Ile His Ala Ile430 435 440tca gcc gcc aac aat ctg cta gcc gca gcc ata gat aca agg atg ttt 1816Ser Ala Ala Asn ASn Leu Leu Ala Ala Ala Ile Asp Thr Arg Met Phe445 450 455cac gaa cac acg caa aag aac gat gct act ttt tat aac aga ttg gtg 1864His Glu His Thr Gln Lys Asn Asp Ala Thr Phe Tyr Asn Arg Leu Val460 465 470 475ccc aag aag ggc ggc tcg cgg aag ttc acg aaa tca atg ctg aag agg 1912Pro Lys Lys Gly Gly Ser Arg Lys Phe Thr Lys Ser Met Leu Lys Arg480 485 490ctc cag aag ctg gga att aac aaa aca gac cca gac agt ttg tct cca 1960
Leu Gln Lys Leu Gly Ile Asn Lys Thr Asp Pro Asp Ser Leu Ser Pro495 500 505aaa gaa atc aaa cga ttt gca cgc cta aac ata gac acg gat acc atc 2008Lys Glu Ile Lys Arg Phe Ala Arg Leu Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ile510 515 520act atc aaa cgg gtg gtt gat gtc aac gat aga ctt cta cgg cag att 2056Thr Ile Lys Arg Val Val Asp Val Asn Asp Arg Leu Leu Arg Gln Ile525 530 535acg atc ggc caa gct cat act gag aag ggt ttt acc aga acc acc ggg 2104Thr Ile Gly Gln Ala His Thr Glu Lys Gly Phe Thr Arg Thr Thr Gly540 545 550 555ttt gat atc act gtt gca tct gaa ttg atg gcc att ttg gca ctt tct 2152Phe Asp Ile Thr Val Ala Ser Glu Leu Met Ala Ile Leu Ala Leu Ser560 565 570aag gac ttc gct gat atg aga gaa cgt gta ggt cgc atg gtt gtc gct 2200Lys Asp Phe Ala Asp Met Arg Glu Arg Val Gly Arg Met Val Val Ala575 580 585gcg aat cta gac ggc gag ccg att aca gca gaa gat gta ggc tgt gct 2248Ala Asn Leu Asp Gly Glu Pro Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Cys Ala590 595 600gga gct gtt gct gcc ctt ctg aag gac gct atc aag cca aca cta atg 2296Gly Ala Val Ala Ala Leu Leu Lys Asp Ala Ile Lys Pro Thr Leu Met605 610 615cag tct ttg gaa ggc acc cct gtt tta gtc cat gca ggg ccg ttc gcc 2344Gln Ser Leu Glu Gly Thr Pro Val Leu Val His Ala Gly Pro Phe Ala620 625 630 635aac atc tct atc gga gcc tcc tca gta att gct gac aga att gcc ctg 2392Asn Ile Ser Ile Gly Ala Ser Ser Val Ile Ala Asp Arg Ile Ala Leu640 645 650aag ttg gtg ggc act tct cca cat tct ccg gaa ggc acc gac gcc ggc 2440Lys Leu Val Gly Thr Ser Pro His Ser Pro Glu Gly Thr Asp Ala Gly655 660 665tat gtg gtt acc gag gcc gga ttc gac ttt aca atg ggc gga gaa cga 2488Tyr Val Val Thr Glu Ala Gly Phe Asp Phe Thr Met Gly Gly Glu Arg670 675 680ttc ctg aac ata aag tgc cgc tcc tca ggc ttg aag cca aat act atc 2536Phe Leu Asn Ile Lys Cys Arg Ser Ser Gly Leu Lys Pro Asn Thr Ile685 690 695gtc atc gtg gcc act gtc cgt gcc ctg aag ctg cac ggc ggt ggc cct 2584Val Ile Val Ala Thr Val Arg Ala Leu Lys Leu His Gly Gly Gly Pro700 705 710 715gag gta aag ccg ggc cag cca ctt act ccc cac tat act gag gaa aac 2632Glu Val Lys Pro Gly Gln Pro Leu Thr Pro His Tyr Thr Glu Glu Asn720 725 730ctc gag cta gtc aca aga ggt gcg gcc aac ctg cag aag caa ata aga 2680Leu Glu Leu Val Thr Arg Gly Ala Ala Asn Leu Gln Lys Gln Ile Arg735 740 745aat gcc aag ctt ttc ggg gtc cct gtc gta gtc gct gtg aac agg ttt 2728Asn Ala Lys Leu Phe Gly Val Pro Val Val Val Ala Val Asn Arg Phe750 755 760
gag tca gac act gtc gca gaa att gag att att cag aag gcg gcg aag 2776Glu Ser Asp Thr Val Ala Glu Ile Glu Ile Ile Gln Lys Ala Ala Lys765 770 775gag gct ggt gca cat gac gcc atc gat gca aat cgc tgg gcc gaa ggc 2824Glu Ala Gly Ala His Asp Ala Ile Asp Ala Asn Arg Trp Ala Glu Gly780 785 790 795gga aaa gga gca gtc acg ctg gcc gaa gcc gtc atc aac tca tgc aaa 2872Gly Lys Gly Ala Val Thr Leu Ala Glu Ala Val Ile Asn Ser Cys Lys800 805 810caa ccc agt tct ttt aag ttc ctt tat gac gtc gat caa cct gtg aca 2920Gln Pro Ser Ser Phe Lys Phe Leu Tyr Asp Val Asp Gln Pro Val Thr815 820 825gaa aag ctc tcc acc att gtt cgg aaa atg tat ggc ggt tcc gcg ata 2968Glu Lys Leu Ser Thr Ile Val Arg Lys Met Tyr Gly Gly Ser Ala Ile830 835 840gat ctc tct cct acg gcg caa aag aag att gcc ttg tac acg gcc caa 3016Asp Leu Ser Pro Thr Ala Gln Lys Lys Ile Ala Leu Tyr Thr Ala Gln845 850 855ggt ttt gat aaa cta cct atc tgt atc gcg aaa act cag tac tcc ctg 3064Gly Phe Asp Lys Leu Pro Ile Cys Ile Ala Lys Thr Gln Tyr Ser Leu860 865 870 875tcc cat gat gcc act ttg aag aac gtc ccc tcc gat ttt gtg ttc ccc 3112Ser His Asp Ala Thr Leu Lys Asn Val Pro Ser Asp Phe Val Phe Pro880 885 890ata agg gat atc agg cct tcc att gga gcg ggc tac ctg tac gcg cta 3160Ile Arg Asp Ile Arg Pro Ser Ile Gly Ala Gly Tyr Leu Tyr Ala Leu895 900 905gcg gca gag att caa act atc ccc ggt ctc tcc act aac gca ggc tac 3208Ala Ala Glu Ile Gln Thr Ile Pro Gly Leu Ser Thr Asn Ala Gly Tyr910 915 920atg aat gtt gaa gtc agt gat gac ggc gag att gaa ggt ctt ttc 3253Met Asn Val Glu Val Ser Asp Asp Gly Glu Ile Glu Gly Leu Phe925 930 935taggtctacg attacgtatg cttagccacc cccgctcata tacataatta tgttgaacag 3313gcatgctcag gctgcgttcc ctgtagtgca cccgttagtg cgcatgggcc ccgaagccgt 3373tgcttttaga accggcatgc gacacatacc ggagacatta ctttagcgtc gcagtgacag 3433ttatgtcccg agacgctggc atgcaatcga tgtcgagcct agtgagtcag aaacggagtc 3493agtgtcttca gacacacaag cgaaatcagg gtcagctttg actaaaccta aaaaccatag 3553tgcattacgt ccgactgtat cttcacataa agttagggag gagaatcaaa gcaaggtagc 3613ataacaaagt atggatttga tggtcataaa taaggacgac tgggtatatg tacagtccga 3673gggcgaccac agcggcgatc acacttattt tgagagcaca atcacctcat cgcttcgaga 3733cacaaagcgg cacgcgctat tcccgcccat agtcagggag cagttcatcc aggggaaaga 3793tatgtgccta ccaatctacc acgacgggat aaaagagcag gcagcgctcg agtacgacgg 3853cacaggcgcg ctatgcggcc tttgacacgc tgtggcacca cgccgccaca cagcacgcaa 3913taaacgggca acggtatatt gctgatatac ctcgatactt attattagaa aaaacctgcg 3973
tttgcaggct tttatactac ataaagacag gatgaaaaac gtagatagat cagagtacgc 4033tatggtttca ggttgataat ttatacaaaa tgcgcgccat tggaggaacc ctccagtgct 4093taggcatctt cctttagcaa agcctctctc ttttcagcga ttctttgagc tcttctctct 4153ctggcagctc tgttcttcaa tcttctggcc tcagcctcct ccttcaaggg cttctcacgc 4213tgagcatcag ccttggcctg gataatgtgt tcgaccaagg atctcttgtg cttgaaggtg 4273ttacccttgg cagccttgta caaagagtgg tacaagtgtc tgtcgatctt gccggcgtct 4333ctgtacttag ccaacaatct tctcaagaca cgcaatcttc tgatccagac gacctgggat 4393ggcagtctac cctccttggt accctttcct cttaccgtaa ccgggggtga cggggcgttt 4453tcttggactc agccatggct c 4474<210>5<211>938<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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<221>misc_feature<223>Oligo 81<400>9gtgcagtact tcatctgcgt gagaaggggt tcgggcgcac atggttggta aatgaaatgc 60cgtttgttca gaggcgtatc ttctgtagtc aggaactccc gcccgtccaa cgaatgggaa 120acgacaaatt gcgggaacgc gggccttgcc gcatcagagt ttgtataaac aagatcgccc 180
tcctggtaag atataactgg ggcactcatc gcacacttta cccacgcggc ttgtactgat 240ctctctgagc ttgccgacgc cctgaacttt ctgcctgttg caagccatca cgtgacaaaa 300tattacatat cacgtgttac aagcagaacc agtctgagta cggttatgca ttggtccata 360atctgcgcgt gagggtccgc ctgcccgcta ctttgtactc aatgtcccac ttgtgcactt 420ttctttcgtg tcctgcggca ggagtcaccc gccccaatag ttatgctgtc ttagccgcct 480agctacgttg gcgtacacac gtagcgagca ccaacagttt ggtagatcaa gccttaccta 540gctctgtgac tcaaccattc agtcatagtt ctgtttttct gctagtggtc tggtagtgta 600ctcttgcgag aatggctatg agtcactttt tttgattcat gtgataagct tgttcggagt 660atataaacat cccttacgcg tttcgtttgg aagatctctc acatccggaa gcaag atg 718Met1gca cgc gga aag gtt tgc ttg gca tac tca gga ggc ctg gac act tcg 766Ala Arg Gly Lys Val Cys Leu Ala Tyr Ser Gly Gly Leu Asp Thr Ser5 10 15gtg atc ctc gcc tgg tta ctg gag cag ggt tat gaa gtt gta gcg ttt 814Val Ile Leu Ala Trp Leu Leu Glu Gln Gly Tyr Glu Val Val Ala Phe20 25 30atg gct aat gtt ggg caa gag gaa gat ttc cag gct gcg gaa gag aag 862Met Ala Asn Val Gly Gln Glu Glu Asp Phe Gln Ala Ala Glu Glu Lys35 40 45gca ttg aag ata gga gcg tcc aag ttt gtg tgc gtt gac tgc cgt gag 910Ala Leu Lys Ile Gly Ala Ser Lys Phe Val Cys Val Asp Cys Arg Glu50 55 60 65cag ttc gtg acg gat gtc ttg ttt cct gcg gtg cag gtg aac gcg gtg 958Gln Phe Val Thr Asp Val Leu Phe Pro Ala Val Gln Val Asn Ala Val70 75 80tac gaa gat gtt tat cta ctg ggg acg tcg ctt gca cgg ccc gtg att 1006Tyr Glu Asp Val Tyr Leu Leu Gly Thr Ser Leu Ala Arg Pro Val Ile85 90 95gcc aag gca cag atc gac atc gcg gag cag gag cat tgt ttt gcg gtc 1054Ala Lys Ala Gln Ile Asp Ile Ala Glu Gln Glu His Cys Phe Ala Val100 105 110gct cac gga tgc act ggg aag ggc aac gat cag atc cgg ttt gag ctt 1102Ala His Gly Cys Thr Gly Lys Gly Asn Asp Gln Ile Arg Phe Glu Leu115 120 125gcg ttc tac gcg ctg aag cca gac gtc cag gtt atc gcg cca tgg cgg 1150Ala Phe Tyr Ala Leu Lys Pro Asp Val Gln Val Ile Ala Pro Trp Arg130 135 140 145gac cct gcg ttt ttc gac cgg ttt gca ggt aga aat gac ttg cta gag 1198Asp Pro Ala Phe Phe Asp Arg Phe Ala Gly Arg Asn Asp Leu Leu Glu150 155 160tgt gcg gca gag aaa cag ata cct gtt gcg cag acc aag gcc aaa ccg 1246Cys Ala Ala Glu Lys Gln Ile Pro Val Ala Gln Thr Lys Ala Lys Pro165 170 175tgg tct acc gac gag aac gag gcg cat ata tcg tac gag gct gga att 1294Trp Ser Thr Asp Glu Asn Glu Ala His Ile Ser Tyr Glu Ala Gly Ile
180 185 190ttg gag gat ccc gat gtc aca cca ccg gca gac atg tgg aag ctc acg 1342Leu Glu Asp Pro Asp Val Thr Pro Pro Ala Asp Met Trp Lys Leu Thr195 200 205aca gac ccg ctt cga gca cca agt gag cct gag gac gtg acg ttg gtg 1390Thr Asp Pro Leu Arg Ala Pro Ser Glu Pro Glu Asp Val Thr Leu Val210 215 220 225ttc aag gag ggt gtc ccc act cag atg att tac aag gat gga gag gcg 1438Phe Lys Glu Gly Val Pro Thr Gln Met Ile Tyr Lys Asp Gly Glu Ala230 235 240agc aaa ccg ttg gat att ttt ctt gcg gct tcc aaa gtg gcg cgt aga 1486Ser Lys Pro Leu Asp Ile Phe Leu Ala Ala Ser Lys Val Ala Arg Arg245 250 255aac ggc gtt ggc aga atc gac atc gtg gaa aac cgt tac atc aac ctg 1534Asn Gly Val Gly Arg Ile Asp Ile Val Glu Asn Arg Tyr Ile Asn Leu260 265 270aag tcg cgt ggc tgc tac gaa cag gca cca ctg aca ctc ctg cgc cgg 1582Lys Ser Arg Gly Cys Tyr Glu Gln Ala Pro Leu Thr Leu Leu Arg Arg275 280 285gcc cac gtg tat ctc gag ggt ctc acc ctg gac aaa gag gtt cgg cat 1630Ala His Val Tyr Leu Glu Gly Leu Thr Leu Asp Lys Glu Val Arg His290 295 300 305ttg cgt gac caa ttt gtt acg ccg act tac tct cgc ctc ctc tac aat 1678Leu Arg Asp Gln Phe Val Thr Pro Thr Tyr Ser Arg Leu Leu Tyr Asn310 315 320ggc tcc tac ttt tct ccg gaa tgc gag tat atc cgt agc atg att aag 1726Gly Ser Tyr Phe Ser Pro Glu Cys Glu Tyr Ile Arg Ser Met Ile Lys325 330 335cca tcc caa att acg gta aat ggc cag gtt cgc ttg aga ctt tac aag 1774Pro Ser Gln Ile Thr Val Asn Gly Gln Val Arg Leu Arg Leu Tyr Lys340 345 350ggt aat gtc att gtg ttg ggc agg tcc tcg gaa act gag aac ttg tat 1822Gly Asn Val Ile Val Leu Gly Arg Ser Ser Glu Thr Glu Asn Leu Tyr355 360 365gat gcg acg gag tcc tcc atg gac gaa ttg acc gga ttc cag ccg act 1870Asp Ala Thr Glu Ser Ser Met Asp Glu Leu Thr Gly Phe Gln Pro Thr370 375 380 385gat acc act ggt ttc atc gct att caa gca att cgc atg aaa aag tac 1918Asp Thr Thr Gly Phe Ile Ala Ile Gln Ala Ile Arg Met Lys Lys Tyr390 395 400ggt caa tcc aag aag gac aaa ggt gaa tcc ctg act ttg taaattctat 1967Gly Gln Ser Lys Lys Asp Lys Gly Glu Ser Leu Thr Leu405 410ttacattccg aagtagccaa tcagatcaat agaacggcgc gtaaatcagc gactaatact2027tgcggctaga tgagtatcca tccgtcgtca tctgatggcg tgactcagtt gaggctggcg2087cagactttac ttgcctaaat taaagtagtc ttcctccccc cgaggaaacg gcgctatgaa2147atcctccaaa aaggcttttt gcaacattgg tcactaactt tgaacgtaat gcttgtacat2207aaataaggac caggaccaac tgcttcgttc gtttttat atg cta cag tcg ata ttt2263
Met Leu Gln Ser Ile Phe415 420aag cga gta tcg ata cat tcg cgt aat aca ttt agc att cta aga acg 2311Lys Arg Val Ser Ile His Ser Arg Asn Thr Phe Ser Ile Leu Arg Thr425 430 435atg gct act acg aac aac cag ctc agt cag tta tac ttg gcg gaa cgg 2359Met Ala Thr Thr Asn Asn Gln Leu Ser Gln Leu Tyr Leu Ala Glu Arg440 445 450aat gct ccc gtt att atg ctc agc gct cga aaa ttc ttt gaa cag cta 2407Asn Ala Pro Val Ile Met Leu Ser Ala Arg Lys Phe Phe Glu Gln Leu455 460 465act cag aag gag aaa cta tat gcc cac tac ctc gtt aag gcg gcc cat 2455Thr Gln Lys Glu Lys Leu Tyr Ala His Tyr Leu Val Lys Ala Ala His470 475 480tgc ggc tcg cgt gtg gta tta cgc caa gtg tct cac gaa agc gaa tcg 2503Cys Gly Ser Arg Val Val Leu Arg Gln Val Ser His Glu Ser Glu Set485 490 495 500atc ttt gat atg tta cta agt atc cat aaa gtg atg gcc ggg cgc tac 2551Ile Phe Asp Met Leu Leu Ser Ile His Lys Val Met Ala Gly Arg Tyr505 510 515cat gaa tca gaa gag aat act ctc ttc tta gag tat act tct caa ttc 2599His Glu Ser Glu Glu Asn Thr Leu Phe Leu Glu Tyr Thr Ser Gln Phe520 525 530ctt agc aac ttg ggg aac ttc aat tca ttt ggt gac act aag ttt att 2647Leu Ser Asn Leu Gly Asn Phe Asn Ser Phe Gly Asp Thr Lys Phe Ile535 540 545ccg cgc tgt acc caa ggg cac ttc ttt tcc ctt ttg aaa caa gcc ggc 2695Pro Arg Cys Thr Gln Gly His Phe Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly550 555 560ctc gac aag aaa gcg aag cct gcc act aat gga tgt cca ttt aaa acc 2743Leu Asp Lys Lys Ala Lys Pro Ala Thr Asn Gly Cys Pro Phe Lys Thr565 570 575 580tat aaa gaa tta gtg gag att ggc gtc tat gcc gtt gat gcc caa atc 2791Tyr Lys Glu Leu Val Glu Ile Gly Val Tyr Ala Val Asp Ala Gln Ile585 590 595tgc aat gct aag ttt ccc gga tct tgg tcg tac gac ggc tta tta ctt 2839Cys Asn Ala Lys Phe Pro Gly Ser Trp Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Leu600 605 610taactgcgtt agtaaagccg acatgcagtt ggttgcagaa ggaggtcttt gccgccctc 2898<210>10<211>414<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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70 75 80ttt ggt ggt cta cct gat gcg cta acg tca ccc gag tac cgc tca cag 883Phe Gly Gly Leu Pro Asp Ala Leu Thr Ser Pro Glu Tyr Arg Ser Gln85 90 95cta gag ggg cgg agc ctg ctc gtg caa cgg tac cgg ttg ara cca ctt 931Leu Glu Gly Arg Ser Leu Leu Val Gln Arg Tyr Arg Leu Ile Pro Leu100 105 110 115gag gtc atc gtg cgc ggt tac att acg ggc tct gcc tgg aag gag tac 979Glu Val Ile Val Arg Gly Tyr Ile Thr Gly Ser Ala Trp Lys Glu Tyr120 125 130cag gag cgc ggc aca gtg cat ggc ctg gct cta cct gcc ggg ctg cgt 1027Gln Glu Arg Gly Thr Val His Gly Leu Ala Leu Pro Ala Gly Leu Arg135 140 145gag tct gag gag tta ccc gag ccg atg ttc act ccg tct acc aaa gcg 1075Glu Ser Glu Glu Leu Pro Glu Pro Met Phe Thr Pro Ser Thr Lys Ala150 155 160gag cag ggt gcg cac gat gag aat ata tca cca gca cag gct gca gac 1123Glu Gln Gly Ala His Asp Glu Asn Ile Ser Pro Ala Gln Ala Ala Asp165 170 175cta att ggg cag gag ctt tgt gac cgc gtg gct gcc ttg gca att cgc 1171Leu Ile Gly Gln Glu Leu Cys Asp Arg Val Ala Ala Leu Ala Ile Arg180 185 190 195ttg tat tcg aag tgc aag aag tat gcc agg gag cgc ggc att att att 1219Leu Tyr Ser Lys Cys Lys Lys Tyr Ala Arg Glu Arg Gly Ile Ile Ile200 205 210gca gac acg aag ttt gag ttt ggc att gat gac aag tca ggc gag att 1267Ala Asp Thr Lys Phe Glu Phe Gly Ile Asp Asp Lys Set Gly Glu Ile215 220 225gtt ctt gtc gat gag gtc ttg acc cca gat tct tct cgt ttc tgg aat 1315Val Leu Val Asp Glu Val Leu Thr Pro Asp Ser Ser Arg Phe Trp Asn230 235 240gct gcg aac tac gaa gtt ggt aag cct cag gat tca tat gat aaa cag 1363Ala Ala Asn Tyr Glu Val Gly Lys Pro Gln Asp Ser Tyr Asp Lys Gln245 250 255ttt ttg cgc aat tgg ctc act agc aac aag ttg aat ggt gtc gat ggg 1411Phe Leu Arg Asn Trp Leu Thr Ser Asn Lys Leu Asn Gly Val Asp Gly260 265 270 275gtc agc atg ccc gag gag atc gtg acg cgc acg aag gag aaa tat gtt 1459Val Ser Met Pro Glu Glu Ile Val Thr Arg Thr Lys Glu Lys Tyr Val280 285 290gag gcc tac gaa gca ctt aca ggc gcg aaa tgg taaaatgatg tacttttaaa1512Glu Ala Tyr Glu Ala Leu Thr Gly Ala Lys Trp295 300atgttaaata attttaagtg ataaatggag atgtgaaatt tatgacctcc atgggttagt1572tggggtgcgc acatggtacc ttgcatggat atctggtacg tcctgaatac gtttgccact1632caccagctcc cggggccgct tttctactgc caactcaaa 1671<210>15<211>302
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<221> misc_feature<223>Oligo 162<400>17Asp Leu Glu Leu Ala Asp Asp Ala Val Gln Gly Leu Arg Tyr Met Asp1 5 10 15Lys Ala Gly Ala Gln His Ile Leu His Thr Lys Asn Val Val Phe Cys20 25 30Thr Gly Gly Phe Gly Ser Ser Lys Glu Leu Leu Gly Lys Tyr Ala Pro35 40 45His Leu Arg Asp Leu Pro Thr Thr Asn Ala Gln Gly Thr Thr Gly Asp50 55 60Gly Gln Asp Leu Met Leu Arg Val Gly Gly Gln Leu Ile Asp Met Glu65 70 75 80His Ile Gln Val His Pro Thr Ser Phe Val Asp Pro Lys Asp Lys Asp85 90 95Ser Gly Ser Lys Phe Leu Ala Ala Glu Ala Leu Arg Gly Asn Gly Gly100 105 110Val Leu Leu Asn Pro Ser Thr Gly Arg Arg Phe Thr Asn Glu Leu Ala115 120 125Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Ser Ile Gln Glu His Cys Lys Glu His130 135 140Val Ala Tyr Leu Val Leu Ser Gln Gly Ala Tyr Glu Thr Leu Gln Ser145 150 155 160Phe Val Asn Phe Tyr Ile Ser Lys Gly Leu Met Arg Ala Ser Thr Val165 170 175
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<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 162<400>18tcgtggacca tttgtcgcac tggcgtgatg tctgtaaaag gaacggttac cgggatcacg 60ccataccagc tgctcccacg gctcgaaaag tagtacaaat aggtctatag cgacggtgtg 120cggcggcatc tgctgatttc ggaattcgct gtagtcaacg gcgctggata caggggcacc 180attcaggata cccagattta caggaaagct agtcgtatgg acaacttcgc ccgtgcagca 240gtatatttat ttgcatgtga aca atg tta aga ggg cgt agc aag aca gtg ctg 293Met Leu Arg Gly Arg Ser Lys Thr Val Leu1 5 10aca ttg ata ctg tta ctt gta acg gtc aga ctc ctg ttt aat cgc cta 341Thr Leu Ile Leu Leu Leu Val Thr Val Arg Leu Leu Phe Asn Arg Leu15 20 25
cgt tcg aga ggc cca gaa agc aat cgg agg ata gac atg tct ggt aaa 389Arg Ser Arg Gly Pro Glu Ser Asn Arg Arg Ile Asp Met Ser Gly Lys30 35 40gtt cag cct gtt gtc gtc gtc gga ctg ggt ctt gcc ggt ctg tcg act 437Val Gln Pro Val Val Val Val Gly Leu Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr45 50 55ggg gcg cag cta gtc aag aat ggg gtg ccg gtg atc ttg atg gac aag 485Gly Ala Gln Leu Val Lys Asn Gly Val Pro Val Ile Leu Met Asp Lys60 65 70gtt tct gcc atc ggc gga aat tcc gtt aag gcc tcc agc ggc ata aac 533Val Ser Ala Ile Gly Gly Asn Ser Val Lys Ala Ser Ser Gly Ile Asn75 80 85 90ggc gat ggt act cag gtg cag gag ctt ctt ggt gtg tat gac tct gct 581Gly Asp Gly Thr Gln Val Gln Glu Leu Leu Gly Val Tyr Asp Ser Ala95 100 105gac tcc ttc tac aga gac acc gtt gcg tcg gcg aag ggt gcc ggc gcc 629Asp Ser Phe Tyr Arg Asp Thr Val Ala Ser Ala Lys Gly Ala Gly Ala110 115 120agc gag cta atg gac aag ctt gca agg gac tcc gca ggt gct gta tcg 677Ser Glu Leu Met Asp Lys Leu Ala Arg Asp Ser Ala Gly Ala Val Ser125 130 135tgg ctg cag aat gaa ttt gga gtt aaa ctg gac atc ctt tcg caa ctg 725Trp Leu Gln Asn Glu Phe Gly Val Lys Leu Asp Ile Leu Ser Gln Leu140 145 150gga ggg cat tcg aag gct agg aca cat cgg tcg agc agc aac ata ccc 773Gly Gly His Ser Lys Ala Arg Thr His Arg Ser Ser Ser Asn Ile Pro155 160 165 170cca ggg ttt gag atc ata tcg gcc atg cgc aag aga ctg gag tca gtg 821Pro Gly Phe Glu Ile Ile Ser Ala Met Arg Lys Arg Leu Glu Ser Val175 180 185cag aag gaa aac cca gct ctc gtg aac ttc cgc ttg gag agc aaa gtt 869Gln Lys Glu Asn Pro Ala Leu Val Asn Phe Arg Leu Glu Ser Lys Val190 195 200gtt gat ctc gaa ctg gcg gat gat gca gtc caa gga cta cgc tac atg 917Val Asp Leu Glu Leu Ala Asp Asp Ala Val Gln Gly Leu Arg Tyr Met205 210 215gac aag gcc ggg gca cag cac ata ttg cac acg aag aat gta gtt ttc 965Asp Lys Ala Gly Ala Gln His Ile Leu His Thr Lys Asn Val Val Phe220 225 230tgt act ggc ggg ttt ggg tcg tcc aag gag ttg ttg ggg aag tat gcc 1013Cys Thr Gly Gly Phe Gly Ser Ser Lys Glu Leu Leu Gly Lys Tyr Ala235 240 245 250ccc cat ctc cgg gac ctt cct aca aca aac gcg cag ggt act acg gga 1061Pro His Leu Arg Asp Leu Pro Thr Thr Asn Ala Gln Gly Thr Thr Gly255 260 265gat gga cag gac ctg atg ctc cgt gtt ggt ggg cag ctg att gat atg 1109Asp Gly Gln Asp Leu Met Leu Arg Val Gly Gly Gln Leu Ile Asp Met270 275 280gag cat atc cag gta cac ccc acg agt ttt gtg gat cct aaa gat aaa 1157Glu His Ile Gln Val His Pro Thr Ser Phe Val Asp Pro Lys Asp Lys285 290 295
gac agc ggt agc aaa ttc ctg gcg gct gag gca ctg cgc ggc aat gga 1205Asp Ser Gly Ser Lys Phe Leu Ala Ala Glu Ala Leu Arg Gly Asn Gly300 305 310ggt gtg ctt tta aac ccc agc act ggc cgg cgc ttt acg aac gaa ttg 1253Gly Val Leu Leu Asn Pro Ser Thr Gly Arg Arg Phe Thr Asn Glu Leu315 320 325 330gcg aca cgt gat gta ctt acg gct agc att caa gag cac tgc aaa gag 1301Ala Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Ser Ile Gln Glu His Cys Lys Glu335 340 345cat gtg gct tac ctt gtt ctg agc caa ggg gca tat gaa act ttg caa 1349His Val Ala Tyr Leu Val Leu Ser Gln Gly Ala Tyr Glu Thr Leu Gln350 355 360agc ttt gtc aac ttc tac atc tct aaa ggg ctg atg cga gcg tcc acc 1397Ser Phe Val Asn Phe Tyr Ile Ser Lys Gly Leu Met Arg Ala Ser Thr365 370 375gtt ggc gag ctt tcc gac gag atc gga gtt ccg aaa caa cag ctg gcg 1445Val Gly Glu Leu Ser Asp Glu Ile Gly Val Pro Lys Gln Gln Leu Ala380 385 390tcg gag cta gag gcg tac tcc gcc gca gag gtg gat caa ttc cag cgt 1493Ser Glu Leu Glu Ala Tyr Ser Ala Ala Glu Val Asp Gln Phe Gln Arg395 400 405 410cgg cac att atc aat gat ttt ggc ccg agt gtt gat ggg tcg aca gca 1541Arg His Ile Ile Asn Asp Phe Gly Pro Ser Val Asp Gly Ser Thr Ala415 420 425ata tat gtt ggc ttg atc aca ccc gca gtc cat ttt acc atg ggc ggt 1589Ile Tyr Val Gly Leu Ile Thr Pro Ala Val His Phe Thr Met Gly Gly430 435 440gtt cga atc aat tcc aga gcg gaa gtg ctg agc agc gca ggg acg acc 1637Val Arg Ile Asn Ser Arg Ala Glu Val Leu Ser Ser Ala Gly Thr Thr445 450 455tat aaa ggg ctt tac gcc gct gga gag gta tcc ggc ggc gtg cac ggt 1685Tyr Lys Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Glu Val Ser Gly Gly Val His Gly460 465 470aga aac agg ctg ggt ggg tct agt ctc ctg gag tgc gtc gtt ttc ggg 1733Arg Asn Arg Leu Gly Gly Ser Ser Leu Leu Glu Cys Val Val Phe Gly475 480 485 490agg cag gca gca aca tcg att aca gaa agg ttg cag gcg tgaactctag 1782Arg Gln Ala Ala Thr Ser Ile Thr Glu Arg Leu Gln Ala495 500caaccctggc tcagtaacag acagtttttg cctgaaatgt gtcatttaaa taacagcaga1842tagtaggtag catacaaaat taattagaga cgtcaattaa tactgcaatt aggaaactag1902ggatatcaac tataattatt aaaaacgtcg agtaaaaaga attaattgga cggtccttga1962aatagagccg aagaagctga agaagaacag taaatagtga atacgatgag aaaggccttc2022aggtgccgct tttgagtggg tagacataaa gcattttggt ttcttagatc aatcgaaagg2082aatgtgcgtc cttggatatt ttgatgctct ttttaggtac aggtggactg ccaaaaaatg2142gcttgttcgc tagcctaatg ggtattattg cgtgaccaat ctgccgtagt cagttagagg2202
gattcgtcat ccacagtgtt cttagttttc ctaatcttga aaaacttcac accgctctgg2262tgccgctgag gctctgcgac aggggcctgc accgggcgca cgtcattgac gggcacagcg2322ccgccctcaa gctcggggtt cgtgtcgtac acaatcgagt ggtccatctg gccatcgctc2382ccgtgcttgg tgccctggta cttgagcgcc tgctccttgt agtgctgcat ctcaacgtac2442tccttgtgtg cggtccacgc gcggcggatg aaggagatcc cgctgaagaa gaagaccagc2502agcgagcacg ccacactggc ccacgcaatc cccatcagct ccggcccgat cttcgcctcg2562cgcccgtcgt cgcggaacac gttgcgcgcc atcacaacaa ccgccgtctg gcacgccact2622gtcgctacgt tgaacacgca cccgatcagc accatggtga aaccaccttg gtgaacgagt2682tcgagcacca cgtgaacaca cagaacaaaa aacgcaattc gcaatgaaac gacagcgcga2742tccagaagag ca2754<210>19<211>503<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>O1igo 162<400>19Met Leu Arg Gly Arg Ser Lys Thr Val Leu Thr Leu Ile Leu Leu Leu1 5 10 15Val Thr Val Arg Leu Leu Phe Asn Arg Leu Arg Ser Arg Gly Pro Glu20 25 30Ser Asn Arg Arg Ile Asp Met Ser Gly Lys Val Gln Pro Val Val Val35 40 45Val Gly Leu Gly Leu Ala Gly Leu Ser Thr Gly Ala Gln Leu Val Lys50 55 60Asn Gly Val Pro Val Ile Leu Met Asp Lys Val Ser Ala Ile Gly Gly65 70 75 80Asn Ser Val Lys Ala Ser Ser Gly Ile Asn Gly Asp Gly Thr Gln Val85 90 95Gln Glu Leu Leu Gly Val Tyr Asp Ser Ala Asp Ser Phe Tyr Arg Asp100 105 110Thr Val Ala Ser Ala Lys Gly Ala Gly Ala Ser Glu Leu Met Asp Lys115 120 125Leu Ala Arg Asp Ser Ala Gly Ala Val Ser Trp Leu Gln Asn Glu Phe130 135 140
Gly Val Lys Leu Asp Ile Leu Ser Gln Leu Gly Gly His Ser Lys Ala145 150 155 160Arg Thr His Arg Ser Ser Ser Asn Ile Pro Pro Gly Phe Glu Ile Ile165 170 175Ser Ala Met Arg Lys Arg Leu Glu Ser Val Gln Lys Glu Asn Pro Ala180 185 190Leu Val Asn Phe Arg Leu Glu Ser Lys Val Val Asp Leu Glu Leu Ala195 200 205Asp Asp Ala Val Gln Gly Leu Arg Tyr Met Asp Lys Ala Gly Ala Gln210 215 220His Ile Leu His Thr Lys Asn Val Val Phe Cys Thr Gly Gly Phe Gly225 230 235 240Ser Ser Lys Glu Leu Leu Gly Lys Tyr Ala Pro His Leu Arg Asp Leu245 250 255Pro Thr Thr Asn Ala Gln Gly Thr Thr Gly Asp Gly Gln Asp Leu Met260 265 270Leu Arg Val Gly Gly Gln Leu Ile Asp Met Glu His Ile Gln Val His275 280 285Pro Thr Ser Phe Val Asp Pro Lys Asp Lys Asp Ser Gly Ser Lys Phe290 295 300Leu Ala Ala Glu Ala Leu Arg Gly Asn Gly Gly Val Leu Leu Asn Pro305 310 315 320Ser Thr Gly Arg Arg Phe Thr Asn Glu Leu Ala Thr Arg Asp Val Leu325 330 335Thr Ala Ser Ile Gln Glu His Cys Lys Glu His Val Ala Tyr Leu Val340 345 350Leu Ser Gln Gly Ala Tyr Glu Thr Leu Gln Ser Phe Val Asn Phe Tyr355 360 365Ile Ser Lys Gly Leu Met Arg Ala Ser Thr Val Gly Glu Leu Ser Asp370 375 380Glu Ile Gly Val Pro Lys Gln Gln Leu Ala Ser Glu Leu Glu Ala Tyr385 390 395 400Ser Ala Ala Glu Val Asp Gln Phe Gln Arg Arg His Ile Ile Asn Asp
405 410 415Phe Gly Pro Ser Val Asp Gly Ser Thr Ala Ile Tyr Val Gly Leu Ile420 425 430Thr Pro Ala Val His Phe Thr Met Gly Gly Val Arg Ile Asn Ser Arg435 440 445Ala Glu Val Leu Ser Ser Ala Gly Thr Thr Tyr Lys Gly Leu Tyr Ala450 455 460Ala Gly Glu Val Ser Gly Gly Val His Gly Arg Asn Arg Leu Gly Gly465 470 475 480Ser Ser Leu Leu Glu Cys Val Val Phe Gly Arg Gln Ala Ala Thr Ser485 490 495Ile Thr Glu Arg Leu Gln Ala500<210>20<211>1060<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 178<400>20gatcaatttc cggtgctggt ccgcagacaa ggtcgtctta ccagtgccgc tcaagccgaa 60gaagagcgtc acatcgttgt tggggccctg gttggcggag gagtgcaatg tcaagacgtt 120gtggttgata ggcatcaagt agaacatcac cgtgaagata cccttcttca tctcaccagc 180gtactccgtg ccaaggatga ccatctccat cgccctgaag ttgatttcga cagtggtctt 240cgaggacata ccctcagtgt gcgtgttcgc tgggaactgg cccgcgttcc acacggtgaa 300gtctggctcg ccgaactccg caagctcctc ttcggtcggc ctgatcaaca tgttggtcat 360gaacaacgcg tggtatgcgc ggcagcacac aatccggatc ttgatgcggt agcgggggtc 420ccagcccgcg tacgcatcca cgatgtatag gtgctcgcgg gtacgcaaga agtctgcggc 480acgctcgcgg ttgatcaacc acgtcttctc cgacgccttg cggttcactg gaccccacca 540aatattgtca gacgacgtgg gctcgtccac gatccgcttg tccttaggcg accgacccgt 600cttttcccca gagtacgcaa tcaacgcgcc agtgctggag attgctgtct tgcgctccgc 660tagcgcatct tcgtacaaca ccgcggccgg cgcattgcgc cgaatcgtca aaacgcccga 720gctgagccca agctcagcgc ggatcttctc ctctggtgtt tggtatacct ttgatggcga 780catagtgaac ttattggcct gctagctctc ctctgtgtag ctgaagcttg tccacttgag 840
acatgccatc tactacgcta gatgcctcta tttatacacg ccgaagcaca aggactgaaa 900attacgtcta cttggctgtt tgccgcagcg cccagtctct ggccgttcca ctgtgttcta 960cgcggcctgc aacagcgctg tcgctagcac aaactacgtc gcggacctat ggatgaagca1020agtacagcgg tttcgctgtg ctatccgttt ttcgccgatc 1060<210>21<211>261<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 178<400>21Met Ser Pro Ser Lys Val Tyr Gln Thr Pro Glu Glu Lys Ile Arg Ala1 5 10 15Glu Leu Gly Leu Ser Ser Gly Val Leu Thr Ile Arg Arg Asn Ala Pro20 25 30Ala Ala Val Leu Tyr Glu Asp Ala Leu Ala Glu Arg Lys Thr Ala Ile35 40 45Ser Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Thr Gly Arg50 55 60Ser Pro Lys Asp Lys Arg Ile Val Asp Glu Pro Thr Ser Ser Asp Asn65 70 75 80Ile Trp Trp Gly Pro Val Asn Arg Lys Ala Ser Glu Lys Thr Trp Leu85 90 95Ile Asn Arg Glu Arg Ala Ala Asp Phe Leu Arg Thr Arg Glu His Leu100 105 110Tyr Ile Val Asp Ala Tyr Ala Gly Trp Asp Pro Arg Tyr Arg Ile Lys115 120 125Ile Arg Ile Val Cys Cys Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met Thr Asn130 135 140Met Leu Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Ala Glu Phe Gly Glu Pro145 150 155 160Asp Phe Thr Val Trp Asn Ala Gly Gln Phe Pro Ala Asn Thr His Thr165 170 175Glu Gly Met Ser Ser Lys Thr Thr Val Glu Ile Asn Phe Arg Ala Met
180 185 190Glu Met Val Ile Leu Gly Thr Glu Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly195 200 205Ile Phe Thr Val Met Phe Tyr Leu Met Pro Ile Asn His Asn Val Leu210 215 220Thr Leu His Ser Ser Ala Asn Gln Gly Pro Asn Asn Asp Val Thr Leu225 230 235 240Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Gln245 250 255His Arg Lys Leu Ile260<210>22<211>2240<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>CDS<222>(394)..(2016)<223>
<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 178<400>22ccagcacaaa aaagagccgc gctgctccgg gcagccgccg gcagacggag ccgagcactt 60accgaaaggc ctttccaaca gctgctaaat gtgggggatt gattcgcatg cttccggatc 120ggcgaaaaac ggatagcaca gcgaaaccgc tgtacttgct tcatccatag gtccgcgacg 180tagtttgtgc tagcgacagc gctgttgcag gccgcgtaga acacagtgga acggccagag 240actgggcgct gcggcaaaca gccaagtaga cgtaattttc agtccttgtg cttcggcgtg 300tataaataga ggcatctagc gtagtagatg gcatgtctca agtggacaag cttcagctac 360acagaggaga gctagcaggc caataagttc act atg tcg cca tca aag gta tac 414Met Ser Pro Ser Lys Val Tyr1 5caa aca cca gag gag aag atc cgc gct gag ctt ggg ctc agc tcg ggc 462Gln Thr Pro Glu Glu Lys Ile Arg Ala Glu Leu Gly Leu Ser Ser Gly10 15 20gtt ttg acg att cgg cgc aat gcg ccg gcc gcg gtg ttg tac gaa gat 510Val Leu Thr Ile Arg Arg Asn Ala Pro Ala Ala Val Leu Tyr Glu Asp25 30 35gcg cta gcg gag cgc aag aca gca atc tcc agc act ggc gcg ttg att 558Ala Leu Ala Glu Arg Lys Thr Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Ile
40 45 50 55gcg tac tct ggg gaa aag acg ggt cgg tcg cct aag gac aag cgg atc 606Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Thr Gly Arg Ser Pro Lys Asp Lys Arg Ile60 65 70gtg gac gag ccc acg tcg tct gac aat att tgg tgg ggt cca gtg aac 654Val Asp Glu Pro Thr Ser Ser Asp Asn Ile Trp Trp Gly Pro Val Asn75 80 85cgc aag gcg tcg gag aag acg tgg ttg atc aac cgc gag cgt gcc gca 702Arg Lys Ala Ser Glu Lys Thr Trp Leu Ile Asn Arg Glu Arg Ala Ala90 95 100gac ttc ttg cgt acc cgc gag cac cta tac atc gtg gat gcg tac gcg 750Asp Phe Leu Arg Thr Arg Glu His Leu Tyr Ile Val Asp Ala Tyr Ala105 110 115ggc tgg gac ccc cgc tac cgc atc aag atc cgg att gtg tgc tgc cgc 798Gly Trp Asp Pro Arg Tyr Arg Ile Lys Ile Arg Ile Val Cys Cys Arg120 125 130 135gca tac cac gcg ttg ttc atg acc aac atg ttg atc agg ccg acc gaa 846Ala Tyr His Ala Leu Phe Met Thr Asn Met Leu Ile Arg Pro Thr Glu140 145 150gag gag ctt gcg gag ttc ggc gag cca gac ttc acc gtg tgg aac gcg 894Glu Glu Leu Ala Glu Phe Gly Glu Pro Asp Phe Thr Val Trp Asn Ala155 160 165ggc cag ttc cca gcg aac acg cac act gag ggt atg tcc tcg aag acc 942Gly Gln Phe Pro Ala Asn Thr His Thr Glu Gly Met Ser Ser Lys Thr170 175 180act gtc gaa atc aac ttc agg gcg atg gag atg gtc atc ctt ggc acg 990Thr Val Glu Ile Asn Phe Arg Ala Met Glu Met Val Ile Leu Gly Thr185 190 195gag tac gct ggt gag atg aag aag ggt atc ttc acg gtg atg ttc tac 1038Glu Tyr Ala G1y Glu Met Lys Lys Gly Ile Phe Thr Val Met Phe Tyr200 205 210 215ttg atg cct atc aac cac aac gtc ttg aca ttg cac tcc tcc gcc aac 1086Leu Met Pro Ile Asn His Asn Val Leu Thr Leu His Ser Ser Ala Asn220 225 230cag ggc ccc aac agc gat gtg acg ctc ttc ttc ggc ttg agc ggc act 1134Gln Gly Pro Asn Ser Asp Val Thr Leu Phe Phe Gly Leu Ser Gly Thr235 240 245ggt aag acg acc ttg tct gcg gac cag cac cgg aaa ttg atc ggc gac 1182Gly Lys Thr Thr Leu Set Ala Asp Gln His Arg Lys Leu Ile Gly Asp250 255 260gac gag cac tgc tgg tct gac tac ggt gtg ttc aac ata gaa ggt ggg 1230Asp Glu His Cys Trp Ser Asp Tyr Gly Val Phe Asn Ile Glu Gly Gly265 270 275tgc tac gcc aag tgt atc ggc cta agc ggg gag aag gag ccg gaa atc 1278Cys Tyr Ala Lys Cys Ile Gly Leu Ser Gly Glu Lys Glu Pro Glu Ile280 285 290 295ttc aat gca atc aag tac ggc tct gtt ttg gag aac gtg gtc tac gac 1326Phe Asn Ala Ile Lys Tyr Gly Ser Val Leu Glu Asn Val Val Tyr Asp300 305 310cca gta acg cgt gtc gtg gac tat gag gac tct tcg atc acc gag aac 1374
Pro Val Thr Arg Val Val Asp Tyr Glu Asp Set Ser Ile Thr Glu Asn315 320 325aca cgt tgc gcg tac cca att gag tac atc cca agc gcg cag att cca 1422Thr Arg Cys Ala Tyr Pro Ile Glu Tyr Ile Pro Ser Ala Gln Ile Pro330 335 340tgc ttg tcc gag aac cat cct tct aac atc gtt cta ttg acc tgc gat 1470Cys Leu Ser Glu Asn His Pro Ser Asn Ile Val Leu Leu Thr Cys Asp345 350 355gcc tca ggt gtg ttg cca cct gtg tcc cgt ttg acg ccg gag cag gtg 1518Ala Ser Gly Val Leu Pro Pro Val Ser Arg Leu Thr Pro Glu Gln Val360 365 370 375atg tac cac ttc atc tcg ggc tac acc tcc aag atg gcc ggt act gag 1566Met Tyr His Phe Ile Ser Gly Tyr Thr Ser Lys Met Ala Gly Thr Glu380 385 390cag gga gtc act gag cct gag gct acc ttc tct tcc tgc ttc ggc cag 1614Gln Gly Val Thr Glu Pro Glu Ala Thr Phe Set Ser Cys Phe Gly Gln395 400 405cca ttc cta gcc cta cat cca atg aaa tac gct acg atg ttg gct gaa 1662Pro Phe Leu Ala Leu His Pro Met Lys Tyr Ala Thr Met Leu Ala Glu410 415 420aag atg tcg cag cat aac gct agc gcc tgg ttg att aac acg ggc tgg 1710Lys Met Ser Gln His Asn Ala Ser Ala Trp Leu Ile Asn Thr Gly Trp425 430 435act ggc tcc tcg tat acg gcc ggc ggt aag cgc tgt cca ttg aag tac 1758Thr Gly Ser Ser Tyr Thr Ala Gly Gly Lys Arg Cys Pro Leu Lys Tyr440 445 450 455acc cgt gct atc ttg gac tcg atc cat gac gga acc ttg gcc cag gct 1806Thr Arg Ala Ile Leu Asp Ser Ile His Asp Gly Thr Leu Ala Gln Ala460 465 470gaa tac gag acc cta ccc gtc ttt ggt ttg tcc att cca aaa gcg gtc 1854Glu Tyr Glu Thr Leu Pro Val Phe Gly Leu Ser Ile Pro Lys Ala Val475 480 485gag ggc gtg cca gct gag ttg cta aac cct gcc aag aac tgg gtc gag 1902Glu Gly Val Pro Ala Glu Leu Leu Asn Pro Ala Lys Asn Trp Val Glu490 495 500ggc gaa ggc aag tac gct agc gcc gtg tcg gct ttg gcc tcg aag ttc 1950Gly Glu Gly Lys Tyr Ala Ser Ala Val Ser Ala Leu Ala Ser Lys Phe505 510 515aca gag aac ttt aag atc tat cag gac cag gcc aca gag gag gtt gtc 1998Thr Glu Asn Phe Lys Ile Tyr Gln Asp Gln Ala Thr Glu Glu Val Val520 525 530 535cgc gct ggc cca caa ata tgagatgcga ccatatagtg gtttcaggga 2046Arg Ala Gly Pro Gln Ile540tctgagtctt ccggacccta tttataaggt aaaatactat atgtaataaa taacatattc2106ttgagaaact gcctgcctca tcggcgcggt gtcactaggc gcccgagggg gccgtaacca2166cagtttgcag tcatgcgggg tggtggcatc gtagtcgtag tggtgtgtgc tgttccagca2226gcaggcttct cact 2240
<210>23<211>541<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 178<400>23Met Ser Pro Ser Lys Val Tyr Gln Thr Pro Glu Glu Lys Ile Arg Ala1 5 10 15Glu Leu Gly Leu Ser Ser Gly Val Leu Thr Ile Arg Arg Asn Ala Pro20 25 30Ala Ala Val Leu Tyr Glu Asp Ala Leu Ala Glu Arg Lys Thr Ala Ile35 40 45Ser Ser Thr Gly Ala Leu Ile Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Thr Gly Arg50 55 60Ser Pro Lys Asp Lys Arg Ile Val Asp Glu Pro Thr Ser Ser Asp Asn65 70 75 80Ile Trp Trp Gly Pro Val Asn Arg Lys Ala Ser Glu Lys Thr Trp Leu85 90 95Ile Asn Arg Glu Arg Ala Ala Asp Phe Leu Arg Thr Arg Glu His Leu100 105 110Tyr Ile Val Asp Ala Tyr Ala Gly Trp Asp Pro Arg Tyr Arg Ile Lys115 120 125Ile Arg Ile Val Cys Cys Arg Ala Tyr His Ala Leu Phe Met Thr Asn130 135 140Met Leu Ile Arg Pro Thr Glu Glu Glu Leu Ala Glu Phe Gly Glu Pro145 150 155 160Asp Phe Thr Val Trp Asn Ala Gly Gln Phe Pro Ala Asn Thr His Thr165 170 175Glu Gly Met Ser Ser Lys Thr Thr Val Glu Ile Asn Phe Arg Ala Met180 185 190Glu Met Val Ile Leu Gly Thr Glu Tyr Ala Gly Glu Met Lys Lys Gly195 200 205Ile Phe Thr Val Met Phe Tyr Leu Met Pro Ile Asn His Asn Val Leu210 215 220
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485 490 495Pro Ala Lys Asn Trp Val Glu Gly Glu Gly Lys Tyr Ala Ser Ala Val500 505 510Ser Ala Leu Ala Ser Lys Phe Thr Glu Asn Phe Lys Ile Tyr Gln Asp515 520 525Gln Ala Thr Glu Glu Val Val Arg Ala Gly Pro Gln Ile530 535 540<210>24<211>1058<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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245 250 255Leu Ser Glu Leu Ala Asp Val Ser Val Asp Lys Leu Leu Asp Glu Gln260 265 270Thr Gly Ala Ala Cys Ser Gly Thr Thr Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ser275 280 285Val Thr Gly Ala Thr Glu Asp Thr Ala Ala Glu Pro Ala Glu Gly Val290 295 300Ala Ser Asp Ser Ser Gly Ala Arg Asp Leu Ala Arg Ser Ala Ala Gly305 310 315 320Ser Ile Ala Leu Val Gly Ser Gly Pro Gly Ser Leu Ser Met Leu Thr325 330 335Leu Gly Ala Leu Ser Glu Ile Lys Ser Ala Asp Leu Val Leu Ala Asp340 345 350Lys Leu Val Pro Gln Glu Val Met Asn Thr Ile Pro Ala Gly Thr Glu355 360 365Thr Phe Ile Ala Arg Lys Phe Pro Gly Asn Ala Glu Arg Ala Gln Glu370 375 380Glu Leu Ala Glu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Arg Glu Gly Lys Arg Val385 390 395 400Val Arg Leu Lys Gln Gly Asp Pro Tyr Ile Phe Gly Arg Gly Gly Glu405 410 415Glu Tyr Leu Leu Phe Lys Arg His Gly Phe Glu Pro Arg Val Val Pro420 425 430Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Ala Thr Thr Val Ala His Ile Pro Ala435 440 445Thr Gln Arg Asp Val Ala Glu Gln Val Leu Ile Cys Thr Gly Thr Gly450 455 460Arg Arg Gly Val Leu Pro Pro Ala Pro Glu Phe Val Ala Ala Arg Thr465 470 475 480Thr Ile Phe Leu Met Ala Leu His Arg Val Gly Asp Leu Val Gln Ala485 490 495Leu Leu Glu Gln Gln Trp Asp Pro Gln Val Pro Ala Ala Ile Val Glu500 505 510
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<221>misc_feature<223>Oligo 107<400>32gccgcgatat aattaagaaa cggttggaat cggcagaact agaggttgaa gagataatca 60cagtatcagt accagcccac ctccatgata ttagtgagca gcctttgaac gtgtgttcac 120cgataactct tgggtcgtgc tatttagtcc tcagggcacc aatgaactgc ttcccctact 180gagacagggg gctgccaaga ttgcagctat tggaccaaca actgcgcaat atctacttga 240caatgccact ccaccaatat taacgagccc taaacctgag ccctcgagct tgtacaatgc 300aataaaagat tatttggcag cgtctcctat gggcaattag ttggagggca ctatgtatgt 360atagctttat acttatgaaa tggtgcagaa cacgcatgtg ttcacgttac cagtttatgg 420agtctatgat caaataacaa atatttt 447<210>33<211>69<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 107<400>33Glu Arg Val Phe Thr Asp Asn Ser Trp Val Val Leu Phe Ser Pro Gln1 5 10 15Gly Thr Asn Glu Leu Leu Pro Leu Leu Arg Gln Gly Ala Ala Lys Ile20 25 30
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<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 107<400>34tcacccttgg gatccgctga ctggctactg taattctatg tagtggatta gtacgataag 60ttacttttgt atgatagatg taatcacatc tggctattaa aatgactcag ccgaggtaaa 120tctaacgtcc cttcacaagg gtgttcctgt gtggacttcc gcctgaattt ttatagatat 180atagatactc tactcatgaa caacctgcaa ccgaataagc attagtgcca ggagaagaga 240accgtggaa atg ggg caa gta gaa aaa atc ata ttc ctt aag aat aag aca 291Met Gly Gln Val Glu Lys Ile Ile Phe Leu Lys Asn Lys Thr1 5 10gta cca gag gac cat tac gag acg att ttt gaa tcg aat ggc ttc cag 339Val Pro Glu Asp His Tyr Glu Thr Ile Phe Glu Ser Asn Gly Phe Gln15 20 25 30act cac ttt gta ccc ata ata acc cat gaa cac ctg cca gat gag gtt 387Thr His Phe Val Pro Ile Ile Thr His Glu His Leu Pro Asp Glu Val35 40 45cgc ggt cga cta tcc gac gcg aat tac atg aaa agg ttg aat tgt ttg 435Arg Gly Arg Leu Ser Asp Ala Asn Tyr Met Lys Arg Leu Asn Cys Leu50 55 60gtg gta acc tct cag agg act gtg gag tgt ctc tat gag gac gtt ctg 483Val Val Thr Ser Gln Arg Thr Val Glu Cys Leu Tyr Glu Asp Val Leu65 70 75ccc tct ctt cca gct gaa gca cgc aaa tct ctt ctc aat acg cca gta 531Pro Ser Leu Pro Ala Glu Ala Arg Lys Ser Leu Leu Asn Thr Pro Val80 85 90ttc gtg gtt ggg cgt gcc act cag gaa ttt atg gag aga tgc ggc ttt 579Phe Val Val Gly Arg Ala Thr Gln Glu Phe Met Glu Arg Cys Gly Phe95 100 105 110
acg gac gtg aga ggg gga tct gag act ggt aat ggc gtt ttg cta gcg 627Thr Asp Val Arg Gly Gly Ser Glu Thr Gly Asn Gly Val Leu Leu Ala115 120 125gag tta atg tta aat atg atc cag aag ggc gat atc agc tcc tcg gga 675Glu Leu Met Leu Asn Met Ile Gln Lys Gly Asp Ile Ser Ser Ser Gly130 135 140act ttt ctg ctg ctc gtg ggc gag atc cgc cgc gat ata att aag aaa 723Thr Phe Leu Leu Leu Val Gly Glu Ile Arg Arg Asp Ile Ile Lys Lys145 150 155cgg ttg gaa tcg gca gaa cta gag gtt gaa gag ata atc acg tat cgt 771Arg Leu Glu Ser Ala Glu Leu Glu Val Glu Glu Ile Ile Thr Tyr Arg160 165 170acc agc cca ctc cat gat att agt gag cgc ttt gaa cgt gtg ttc acc 819Thr Ser Pro Leu His Asp Ile Ser Glu Arg Phe Glu Arg Val Phe Thr175 180 185 190gat aac tct tgg gtc gtg cta ttt agt cct cag ggc acc aat gaa ctg 867Asp Asn Ser Trp Val Val Leu Phe Ser Pro Gln Gly Thr Asn Glu Leu195 200 205ctt ccc cta ctg aga cag ggg gct gcc aag att gca gct att gga cca 915Leu Pro Leu Leu Arg Gln Gly Ala Ala Lys Ile Ala Ala Ile Gly Pro210 215 220aca act gcg caa tat cta ctt gac aat gcc act cca cca ata tta acg 963Thr Thr Ala Gln Tyr Leu Leu Asp Asn Ala Thr Pro Pro Ile Leu Thr225 230 235agc cct aaa cct gag ccc tcg agc ttg tac aat gca ata aaa gat tat 1011Ser Pro Lys Pro Glu Pro Ser Ser Leu Tyr Asn Ala Ile Lys Asp Tyr240 245 250ttg gca gcg tct cct atg ggc aat tagttggagg gcactatgta tgtatagctt 1065Leu Ala Ala Ser Pro Met Gly Asn255 260tatacttatg aaatggtgca gaacacgcat gtgttcacgt taccagttta tggagtctat1125gatcaaataa caaatatttt atcgcgctgg tatatgtgca caacttccac cactttgtcc1185ttctcgttgc tatagatctc tgcctttgga tatattaaat agccgcgccg caaagagatc1245aactgaatcg agaatactaa atggtcgcct actattacag aacggcgcct gccgttaatt1305gaccagtcag ggctgttgct gaactcgaca atatatgtca atggttccct ttccatcacc1365cactgcgtag acaagttgca cacttctaca tcaattgtga ccgcatcccc cacatgtaat1425acttcgtggc ttgtggcaga caagcgaaca ctgaatagct gtttgatgga tggaagatgc1485actgggacaa ttaacgtatt gggttggata ctaaaccgtg tttgtcggga gagaactcta1545tgccagaagc taataacttg agatagctac caaaccgggt caagatctca gaatcactaa1605tgggacgagg agaggtcatt c 1626<210>35<211>262<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉
<220>
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Lys Pro Glu Pro Ser Ser Leu Tyr Asn Ala Ile Lys Asp Tyr Leu Ala245 250 255Ala Ser Pro Met Gly Asn260<210>36<211>368<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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<221>misc_feature<223>Oligo 136<400>37Ile Ser His Val Ser Thr Gly Gly Gly Ala Ser Leu Glu Leu Leu Glu1 5 10 15Gly Lys Asp Leu Pro Gly Val Thr Phe Leu Ser Ser Lys Gln20 25 30<210>38<211>2000<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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<220>
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tcg ctc gcg gac gtc tac gtc aac gac gcc ttc ggc acc gcg cac aga 1049Ser Leu Ala Asp Val Tyr Val Asn Asp Ala Phe Gly Thr Ala His Arg190 195 200gcg cac tcc tcg atg gtc ggc ttc gag ctg cct gag agg gcc ggc ggc 1097Ala His Ser Ser Met Val Gly Phe Glu Leu Pro Glu Arg Ala Gly Gly205 210 215ttc ttg ttg tcg cgc gag ctg gag tac ttc agc aag gcg ttg gag aac 1145Phe Leu Leu Ser Arg Glu Leu Glu Tyr Phe Ser Lys Ala Leu Glu Asn220 225 230cct acg aga ccc ttc ttg gcg atc ctg ggc ggt gcc aag gtt gcc gac 1193Pro Thr Arg Pro Phe Leu Ala Ile Leu Gly Gly Ala Lys Val Ala Asp235 240 245aag atc cag ttg atc gac aac ttg ttg gac aag gtc gac tcg att gtg 1241Lys Ile Gln Leu Ile Asp Asn Leu Leu Asp Lys Val Asp Ser Ile Val250 255 260 265atc ggc ggt ggc atg gcc ttc acc ttc aag aag gtg ctt gag aac atg 1289Ile Gly Gly GIy Met Ala Phe Thr Phe Lys Lys Val Leu Glu Asn Met270 275 280gag atc ggt aac tcc atc tac gac aag gcg ggt gcc gag atc gtt cct 1337Glu Ile Gly Asn Ser Ile Tyr Asp Lys Ala Gly Ala Glu Ile Val Pro285 290 295aag cta gcg gag aag gcc aag aag aac ggc gtc aag atc gtg ttg cct 1385Lys Leu Ala Glu Lys Ala Lys Lys Asn Gly Val Lys Ile Val Leu Pro300 305 310gtg gac ttc gtg atc ggc gac gac ttc tcc cag gac gcc aac acc aag 1433Val Asp Phe Val Ile Gly Asp Asp Phe Ser Gln Asp Ala Asn Thr Lys315 320 325att gtc tct gcc tcc gag ggc att cca tcc ggc tgg gag ggt cta gac 1481Ile Val Ser Ala Ser Glu Gly Ile Pro Ser Gly Trp Glu Gly Leu Asp330 335 340 345tgt ggt cct gag tcc aga aag ctg ttc agc gag acc atc gcg agc gcg 1529Cys Gly Pro Glu Ser Arg Lys Leu Phe Ser Glu Thr Ile Ala Ser Ala350 355 360aag acc atc gtg tgg aac ggc cca cca ggt gtc ttt gag att cca aag 1577Lys Thr Ile Val Trp Asn Gly Pro Pro Gly Val Phe Glu Ile Pro Lys365 370 375ttc tcc gag ggt acc cag gcc atg ctt gcg gcc gct gtc aag gcc tcc 1625Phe Ser Glu Gly Thr Gln Ala Met Leu Ala Ala Ala Val Lys Ala Ser380 385 390gag gct ggc agc acc gtc atc atc ggc ggt ggt gac acc gct acc gtg 1673Glu Ala Gly Ser Thr Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Ala Thr Val395 400 405gcc aag aag tac ggt gtg gtc gag aag atc tcc cat gtg tcc acc ggt 1721Ala Lys Lys Tyr Gly Val Val Glu Lys Ile Ser His Val Ser Thr Gly410 415 420 425ggt ggt gcc tcc cta gag cta ttg gag ggt aag gac cta cca ggt gtc 1769Gly Gly Ala Ser Leu Glu Leu Leu Glu Gly Lys Asp Leu Pro Gly Val430 435 440acc ttc ttg tcc agc aag cag tagatgcgtc cgcgcgcctg ccggcttgaa 1820Thr Phe Leu Ser Ser Lys Gln445
tagataataa actatatacg caacgtaatg gaaagttgag aaactactat atgcgcctgt1880tgcgctgctc gtccgtgggc tccagccgcg ggaacccgag cagctccatg atgcagtact1940cgtccgggct ctcgacgcac gcgccgctcg acttgtcaaa caggccgtgc tgattcagcg2000<210>39<211>448<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
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<221>misc_feature<223>Oligo 157<400>42gttatgatga gccccgccag ccccgcggga aatagagcag aatgtacatg ccgtgttttc 60gtccggacgt cctttcgtgc agttgtgtgc gactttttca gactttccgc ggagccggca 120gcgcaacctc ttcccccact atcgcaatga tccgccatac cgcccccgtt gcgcgccgta 180tcctgctcag taggccttct gcactcctgg cgcgccccgc cgtacgcatc gccgcgaggc 240cggccgcgtg gcgcgccatg tcatccttct ccggcggcat gcgcgctccc ccggagctgg 300cccagctcac gccgcaggcc taccacaagc aggccgacga gttcctgaac gacctgctgg 360accgtctcga agcgctgggc gacgagcgcc ccgacatcat cgcagactcc gagtactccc 420agggtgtgct cacgctgtcc gtacctgctc tgggcaccta tgtcattaac aaacagcccc 480caaacaagca gatatggctc tcgtcgccag tatccggccc caaccgctag tggctctgat 540tgacggcgag tgggtctcgc tacgcgacgg ttcccgcctg atggccgttc tgtcacgtga 600gctggggcgt gcgctcgaca atcctgatta cagcacctct gaccgcacag cccagagcaa 660tctargtaca gtagcaccta agtaagtagc cagcaacagt ggcctgcgca agcgaaacgg 720gggcctaggg gccccttgcc gggctcggcc gtatataaaa gggcacgcga acgcgggtag 780atgactacca tcagtcccag caccaagc atg tct gaa tca tct tat atc atc832
Met Ser Glu Ser Ser Tyr Ile Ile1 5acg ttg aag aag ggg gcc gac ctc gcc aag gtc aga gag tcc atc gag 880Thr Leu Lys Lys Gly Ala Asp Leu Ala Lys Val Arg Glu Ser Ile Glu10 15 20cag atc ggc ggg agt atc ctg cac gag cac tcg ctc atc aac ggc ctc 928Gln Ile Gly Gly Ser Ile Leu His Glu His Ser Leu Ile Asn Gly Leu25 30 35 40agt gtg aag ttg ccc gag gtc acg gcc ttg gag cag att aag tcg cag 976Ser Val Lys Leu Pro Glu Val Thr Ala Leu Glu Gln Ile Lys Ser Gln45 50 55cac gac gac ttg atc cag cac atc gag aag gac cag gag atg cac att 1024His Asp Asp Leu Ile Gln His Ile Glu Lys Asp Gln Glu Met His Ile60 65 70ttg gac aac tagagtatat ataatcagta tagctgaata atcaacgtgc 1073Leu Asp Asn75cccggaggca gacaacaggc cggcagcagc aggtttcatg gcgcgccctg cggggaagcg1133ttttccggga ggtttcggtg actgcggccg acgcagcgaa actgcatacg aaaccgcgcg1193gtaggatata aaggtgcgag cggcaggcga gactacggac caaggcagga aggagcagcg1253ctatgagcag cgatatcgtc aactgggacc cgcagttcaa gcccgtcaag ggcatctacg1313aagaccggct tcgccaattt atcgacaacg gaggggacta ccgggacctc aatttgccca1373agttctatga ccggcagcgc aagcggatcg acagcacgcg tgtgaaggtg cagtactacc1433aggtgcctgt acgaccgcca caagcctcct gttgcgccgg agaagcggcc gccgtgggag1493gaggtggtgc ggcgcgatcg tgctggagaa atcgaatgga agatgtgtac ctcgaccccg1553tcgggccgag ctggtccact acgaggttct aggtgagttg gacatcccgg aatcgtggag1613cagctctggg gaacagataa tattctagtg ggactgcgag aacaa1658<210>43<211>75<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 157<400>43Met Ser Glu Ser Ser Tyr Ile Ile Thr Leu Lys Lys Gly Ala Asp Leu1 5 10 15Ala Lys Val Arg Glu Ser Ile Glu Gln Ile Gly Gly Ser Ile Leu His20 25 30Glu His Ser Leu Ile Asn Gly Leu Ser Val Lys Leu Pro Glu Val Thr35 40 45
Ala Leu Glu Gln Ile Lys Ser Gln His Asp Asp Leu Ile Gln His Ile50 55 60Glu Lys Asp Gln Glu Met His Ile Leu Asp Asn65 70 75<210>44<211>1599<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<222>(331)..(331)<223>n＝未知核苷酸<220>
<221>misc_feature<222>(343)..(343)<223>n＝未知核苷酸<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 108<400>44gatcgatata caggttttgg ggcatttgca actcctcttg cgggatatgt caccgctgcg 60gcatccgaac aggggccctg aattactggc ggttgaccca gatctgttca gccgcatgtt 120cttcacgaag ccgtctcagg attcgctgtt cctgaagagc aagggaccat tgccgtcgcg 180gattcttccc catttgtacc ttggttcact cgagcacgcg catgacccaa acctgctccg 240cagattgggt atcagaaata ttgtgtcagt cggggagact ttatcatggc tacaatcccc 300tcactcccgg gaggctgcta aaacagaaga nagcaaacaa ganaccatca cggacgcgta 360tgtgaccgca cctgctgaaa ccgccgcggc aacgtccacg accgcatcca ctggtagtct 420taatttgttg aagcgaaaca gatcacccag cgcgcctgaa attaaaccgt taaaatcctc 480atcctgtaaa actacagtct tctcgaagga tggattcgaa atatgccaca caagcaactt 540gggagacaat ggtgcagatc cgatgctcac tcagctggac caaatgctct ctttcatcaa 600tcggtgttat gaggccggcg aaaaggtact ggttcactgc atggtcggcg tttctcgcag 660tgcgacagta tgcatagccg aatgcatgag acgtctaaac tgcgcagtga tccaggccta 720cctgtttgtc cgtgtgcgcc gcttaaacat tataatccag cccaatctca tgttcatcta 780cgagctcctc aagtggcagg agctcaagca ccctgacgtt ctcaagattg actggcatat 840catgtgtagg gccatcaacg aactcaacag taattatata aaggacatga tttgacctac 900cagttgagct tggttgccca ctctcacatt ttgtactatt tagaggattt tacgatacca 960taaactactc tagtgtaaca tatttcttca acgagtccgg aatctcatcg tagagcttct1020
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<221>misc_feature<223>Oligo 108<400>45His Ala Ala Ala Leu Asp Asn Ala Val Trp Thr Asn Gln Phe Asp Asn1 5 10 15Glu Ala Asn Trp Lys Ala His Tyr Ala Thr Thr Gly Pro Glu Ile Leu20 25 30Gln Gln Met Arg Asn Ala Gly Leu Glu Val Asp Ala Phe Thr35 40 45<210>46<211>157<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 108<400>46Gly Gly Thr Phe Ser Gly Ile Ala Arg Tyr Leu Ala Glu Ala Thr Glu1 5 10 15Arg Lys Cys Lys Leu Val Val Thr Asp Pro Pro Gly Ser Val Val Tyr20 25 30Ser Phe Val Lys Thr Gly Asn Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Phe Thr
35 40 45Glu Gly Val Gly Gln Gly Arg Ile Thr Lys Asn Leu Glu Ala Ser Val50 55 60Asp Ile Ile Asp Asp Ala Val Phe Val Pro Asp Pro Glu Ser Leu Asn65 70 75 80Met Thr Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Thr85 90 95Ser Gly Leu Asn Val Ala Gly Ala Val Arg Val Ala Arg Glu Leu Pro100 105 110Pro Gly Ser Asn Val Val Thr Ile Leu Cys Asp Thr Gly His Lys Tyr115 120 125Ala Asp Arg Val Phe Ser Lys Lys Trp Leu Gln Glu Lys Lys Leu Tyr130 135 140Asp Glu Ile Pro Asp Ser Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu145 150 155<210>47<211>2808<212>DNA<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<221>CDS<222>(450)..(1517)<223>
<220>
<221>misc_feature<223>Oligo 108<400>47ccgctgacgg tgcgcaacct ggtcaagtgg cgcacggcaa ggagctggag cagttcctgg 60cggacgtggc ggacgtgcgg cggtgttgct cgagcatcag ggcgccgcgg actcgccgga 120agaggcggag cgctttgtgg gcggcctgcg cagcgccctt gaggcgccgg cggcggcgcc 180tgcgccgcca gcgcgcaaga gatacgagtt cgctccccgg cccgcgcgca actgaaccgc 240gcacctgtat ataccgcgac atagtgaata aagaatgaga gtcccacagt gcgcctgcgc 300gcggagcgcg cggcatggtc gccgaccgct gttgtgccgc cgcacgtgat tagtgcacta 360tggctgtgga tctgtgctga tgtcgggtca ccgtccagtc gctgggtata tcagtacagc 420agtaggcagc ccggccggaa cacgttacg atg cac gcc cag ctc att agg aag 473Met His Ala Gln Leu Ile Arg Lys1 5
atg tca gcg ccc aca ctg gcc gcc gga ggc ttc ccg gat gcc att ggc 521Met Ser Ala Pro Thr Leu Ala Ala Gly Gly Phe Pro Asp Ala Ile Gly10 15 20aag acg ccg ctg atc aag ctg cag aag ttg tcg cag gaa ctg ggt cgg 569Lys Thr Pro Leu Ile Lys Leu Gln Lys Leu Ser Gln Glu Leu Gly Arg25 30 35 40aac atc tac ggg aag gcg gag ttt atg aac ccg ggc gga tcc gtc aag 617Asn Ile Tyr Gly Lys Ala Glu Phe Met Asn Pro Gly Gly Ser Val Lys45 50 55gac cgt gct gcg ctt tac ctg gtg gaa gaa gcg gaa cgg gcg ggg ctg 665Asp Arg Ala Ala Leu Tyr Leu Val Glu Glu Ala Glu Arg Ala Gly Leu60 65 70atc gac cct tcg cgg ccg ggg acc ata gta gag ggc tct gcc ggc aac 713Ile Asp Pro Ser Arg Pro Gly Thr Ile Val Glu Gly Ser Ala Gly Asn75 80 85acg gcg atc ggg ctg gca cac ata gca cgc tcc agg ggg tac aat gct 761Thr Ala Ile Gly Leu Ala His Ile Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Asn Ala90 95 100gtg ttc tac atg ccg gac acg cag tcg cgg gaa aag gtc aac ttg ctg 809Val Phe Tyr Met Pro Asp Thr Gln Ser Arg Glu Lys Val Asn Leu Leu105 110 115 120agg tac ctg ggg acc gag gtg cac ccg gta ccc gtg tgc ccc agc aca 857Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Val His Pro Val Pro Val Cys Pro Ser Thr125 130 135gac cct ctg aac ttc aac aat cgc gct cgg gat cac gcc gcg gca ttg 905Asp Pro Leu Asn Phe Asn Asn Arg Ala Arg Asp His Ala Ala Ala Leu140 145 150gac aat gct gtc tgg acc aac cag ttt gac aac gag gcc aat tgg aag 953Asp Asn Ala Val Trp Thr Asn Gln Phe Asp Asn Glu Ala Asn Trp Lys155 160 165gcg cac tat gcg acg acc ggt ccc gag atc ttg cag caa atg cgc aac 1001Ala His Tyr Ala Thr Thr Gly Pro Glu Ile Leu Gln Gln Met Arg Asn170 175 180gct ggg ctc gag gtg gat gca ttc act tgc tcc aca ggt acc gga gga 1049Ala Gly Leu Glu Val Asp Ala Phe Thr Cys Ser Thr Gly Thr Gly Gly185 190 195 200acg ttc tcc ggg atc gcg cgg tac ctg gcc gag gcc acg gag cgc aaa 1097Thr Phe Ser Gly Ile Ala Arg Tyr Leu Ala Glu Ala Thr Glu Arg Lys205 210 215tgc aaa ctg gtg gtc acg gac ccg cca ggc tcg gtc gtc tat tca ttc 1145Cys Lys Leu Val Val Thr Asp Pro Pro Gly Ser Val Val Tyr Ser Phe220 225 230gtc aag acc ggc aac ttg gag agg gag ggc agc tcg ttc act gag ggc 1193Val Lys Thr Gly Asn Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Phe Thr Glu Gly235 240 245gtg ggc caa ggg cgg att aca aag aac ctc gaa gcc agc gtt gat atc 1241Val Gly Gln Gly Arg Ile Thr Lys Asn Leu Glu Ala Ser Val Asp Ile250 255 260att gac gac gcc gtg ttt gtt ccg gac cca gag tcc ctg aac atg acc 1289Ile Asp Asp Ala Val Phe Val Pro Asp Pro Glu Ser Leu Asn Met Thr265 270 275 280
tac agg ctt ctg gac gag gaa ggt cta ttc ctc ggt ggc act tcg ggg 1337Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Thr Ser Gly285 290 295ctg aac gtc gct ggc gct gtg cgt gtg gcc agg gaa cta cca ccg gga 1385Leu Asn Val Ala Gly Ala Val Arg Val Ala Arg Glu Leu Pro Pro Gly300 305 310agc aat gtc gtc acg atc ctc tgt gac act gga cac aag tat gcc gac 1433Ser Asn Val Val Thr Ile Leu Cys Asp Thr Gly His Lys Tyr Ala Asp315 320 325cgc gta ttc tcg aag aag tgg ttg cag gaa aag aag ctc tac gat gag 1481Arg Val Phe Ser Lys Lys Trp Leu Gln Glu Lys Lys Leu Tyr Asp Glu330 335 340att ccg gac tcg ttg aag aaa tat gtt aca cta gag tagtttatgg 1527Ile Pro Asp Ser Leu Lys Lys Tyr Val Thr Leu Glu345 350 355tatcgtaaaa tcctctaaat agtacaaaat gtgagagtgg gcaaccaagc tcaactggta1587ggtcaaatca tgtcctttat ataattactg ttgagttcgt tgatggccct acacatgata1647tgccagtcaa tcttgagaac gtcagggtgc ttgagctcct gccacttgag gagctcgtag1707atgaacatga gattgggctg gattataatg tttaagcggc gcacacggac aaacaggtag1767gcctggatca ctgcgcagtt tagacgtctc atgcattcgg ctatgcatac tgtcgcactg1827cgagaaacgc cgaccatgca gtgaaccagt accttttcgc cggcctcata acaccgattg1887atgaaagaga gcatttggtc cagctgagtg agcatcggat ctgcaccatt gtctcccaag1947ttgcttgtgt ggcatatttc gaatccatcc ttcgagaaga ctgtagtttt acaggatgag2007gattttaacg gtttaatttc aggcgcgctg ggtgatctgt ttcgcttcaa caaattaaga2067ctaccagtgg atgcggtcgt ggacgttgcc gcggcggttt cagcaggtgc ggtcacatac2127gcgtccgtga tggttcttgt ttgcttcttc tgttttagca gcctcccggg agtgagggga2187ttgtagccat gataaagtct ccccgactga cacaatattt ctgataccca atctgcggag2247caggtttggg tcatgcgcgt gctcgagtga accaaggtac aaatggggaa gaatccgcga2307cggcaatggt cccttgctct tcaggaacag cgaatcctga gacggcttcg tgaagaacat2367gcggctgaac agatctgggt caaccgccag taattcaggg cccctgttcg gatgccgcag2427cggtgacata tcccgcaaga ggagttgcaa atgccccaaa acctgtatat cgatcggaaa2487taggaagtat ggacgctcga cctccgtatg caaccgcaac agaacctcat ccagaggttg2547atcccaggca aatatcagat aagccactag caaaaaggaa gtttctgtat aaccatcgga2607acagtataat agggaaagct tcttgtgtac cgcgctgaat cggtagatca ggtgacagat2667attaacacac gaagtgatgg agtccagagt gagggtcccc aggccaattg agcccgagct2727cggaaacgca atgtgtatcg gagcctccat ctgggtcaag tgatgcctga tgtcgtcgtg2787gtgtgggaag ggcgtgtgct c 2808<210>48
<211>356<212>PRT<213>棉桃阿舒氏囊霉<220>
<22l>misc_feature<223>Oligo 108<400>48Met His Ala Gln Leu Ile Arg Lys Met Ser Ala Pro Thr Leu Ala Ala1 5 10 15Gly Gly Phe Pro Asp Ala Ile Gly Lys Thr Pro Leu Ile Lys Leu Gln20 25 30Lys Leu Ser Gln Glu Leu Gly Arg Asn Ile Tyr Gly Lys Ala Glu Phe35 40 45Met Asn Pro Gly Gly Ser Val Lys Asp Arg Ala Ala Leu Tyr Leu Val50 55 60Glu Glu Ala Glu Arg Ala Gly Leu Ile Asp Pro Ser Arg Pro Gly Thr65 70 75 80Ile Val Glu Gly Ser Ala Gly Asn Thr Ala Ile Gly Leu Ala His Ile85 90 95Ala Arg Ser Arg Gly Tyr Asn Ala Val Phe Tyr Met Pro Asp Thr Gln100 105 110Ser Arg Glu Lys Val Asn Leu Leu Arg Tyr Leu Gly Thr Glu Val His115 120 125Pro Val Pro Val Cys Pro Ser Thr Asp Pro Leu Asn Phe Asn Asn Arg130 135 140Ala Arg Asp His Ala Ala Ala Leu Asp Asn Ala Val Trp Thr Asn Gln145 150 155 160Phe Asp Asn Glu Ala Asn Trp Lys Ala His Tyr Ala Thr Thr Gly Pro165 170 175Glu Ile Leu Gln Gln Met Arg Asn Ala Gly Leu Glu Val Asp Ala Phe180 185 190Thr Cys Ser Thr Gly Thr Gly Gly Thr Phe Ser Gly Ile Ala Arg Tyr195 200 205Leu Ala Glu Ala Thr Glu Arg Lys Cys Lys Leu Val Val Thr Asp Pro210 215 220
Pro Gly Ser Val Val Tyr Ser Phe Val Lys Thr Gly Asn Leu Glu Arg225 230 235 240Glu Gly Ser Ser Phe Thr Glu Gly Val Gly Gln Gly Arg Ile Thr Lys245 250 255Asn Leu Glu Ala Ser Val Asp Ile Ile Asp Asp Ala Val Phe Val Pro260 265 270Asp Pro Glu Ser Leu Asn Met Thr Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Glu Gly275 280 285Leu Phe Leu Gly Gly Thr Ser Gly Leu Asn Val Ala Gly Ala Val Arg290 295 300Val Ala Arg Glu Leu Pro Pro Gly Ser Asn Val Val Thr Ile Leu Cys305 310 315 320Asp Thr Gly His Lys Tyr Ala Asp Arg Val Phe Ser Lys Lys Trp Leu325 330 335Gln Glu Lys Lys Leu Tyr Asp Glu Ile Pro Asp Ser Leu Lys Lys Tyr340 345 350Val Thr Leu Glu35权利要求
1.可自棉桃阿舒氏囊霉分离的多核苷酸，其编码与棉桃阿舒氏囊霉的代谢相关的蛋白。
2.权利要求1的多核苷酸，其与棉桃阿舒氏囊霉的代谢相关并具有表1所示的结构和/或功能特性。
3.包含SEQ ID NO1，6，12，16，20，24，28，32，36，40或44所示的核酸序列并优选自棉桃阿舒氏囊霉中分离的权利要求1或2的多核苷酸；其互补多核苷酸；以及通过遗传密码简并性衍生自这些多核苷酸的序列。
4.权利要求3的多核苷酸，其包含SEQ ID NO4，9，14，18，22，26，30，34，38，42或47显示的核酸序列或其片段。
5.寡核苷酸，其可以与任一前述权利要求的多核苷酸杂交，且尤其是在严格的条件下杂交。
6.多核苷酸，其可以与权利要求5的寡核苷酸杂交，且尤其是在严格的条件下杂交，并编码阿舒氏囊霉属微生物的基因产物或该基因产物的功能等价物。
7.多肽及其功能等价物，特别是与具有表1所示活性的酿酒酵母、构巢曲霉或棉桃阿舒氏囊霉蛋白具有类似活性的功能等价物，其中，所述多肽由包含权利要求1至4中任意一项的核酸序列或其片段的多核苷酸编码，或由权利要求6的多核苷酸编码；或具有包含SEQ ID NO2，3，5，7，8，10，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31，33，35，37，39，41，43，45，46或SEQID NO48中所示的至少10个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
8.包含权利要求1至6中任意一项的核酸序列的表达盒，其中，所述核酸序列与至少一个调节核酸序列可操作地连接。
9.包含至少一个权利要求8的表达盒的重组载体。
10.由至少一个权利要求9的载体转化的原核或真核宿主。
11.原核或真核宿主，在该宿主中，至少一个编码权利要求7的多肽的基因的功能性表达受到调节；或权利要求7的多肽的生物活性被降低或增加。
12.权利要求10或11的宿主，其来自阿舒氏囊霉属。
13.权利要求8的表达盒、权利要求9的载体或权利要求10至12之任一项的宿主在维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产中的用途。
14.权利要求8的表达盒、权利要求9的载体或权利要求10至12之任一项的宿主在权利要求7的多肽的重组生产中的用途。
15.检测可以用于调节维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产的效应物靶点的方法，其中，用效应物处理能够通过微生物法生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物，所述效应物可以与选自权利要求7的多肽或其核酸编码序列的靶点相互作用，尤其是结合；验证效应物对微生物法生产的维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的产量的影响；并且适当时分离该靶点。
16.调节维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物生产的方法，其中，用效应物处理能够以微生物法生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的微生物，所述效应物可以与选自权利要求7的多肽或其核酸编码序列的靶点相互作用。
17.针对选自权利要求7的多肽或其核酸编码序列的靶点的效应物，其中所述效应物选自a)抗体或其抗原结合片段；b)可以与权利要求7的多肽相互作用的不同于a)的多肽配体；c)可以调节权利要求7的多肽的生物活性的低分子量效应物；d)反义核酸序列。
18.微生物生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的方法，其中在利于产生维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的条件下培养权利要求10至12之任一项的宿主，自培养混合物中分离所需的产物。
19.权利要求18的方法，其中用权利要求17的效应物在培养前和/或培养过程中处理宿主。
20.权利要求18或19的方法，其中宿主选自阿舒氏囊霉属微生物。
21.权利要求18至20之任一项的方法，其中微生物为权利要求10至12之任一项的宿主。
22.权利要求1至4和6之任一项的多核苷酸或权利要求7的多肽作为靶点在调节阿舒氏囊霉属微生物的维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的生产中的用途。
23.权利要求1至4和6之任一项的多核苷酸或权利要求7的多肽作为靶点在培养阿舒氏囊霉属微生物生产维生素B2和/或其前体和/或其衍生物的过程中的用途，用于调节阿舒氏囊霉属微生物的代谢功能。
24.权利要求12的宿主，其具有改善的代谢调节作用或改变的代谢功能。
全文摘要
本发明涉及来自棉桃阿舒氏囊霉的新颖多核苷酸；与之杂交的寡核苷酸；包含这些多核苷酸的表达盒和载体；用其转化的微生物；由这些多核苷酸编码的多肽；及该新颖多肽和多核苷酸作为靶点在调节阿舒氏囊霉属微生物的代谢反应，且尤其是改善阿舒氏囊霉属微生物的维生素B2生产中的用途。
文档编号C07K16/40GK1604964SQ02816225
公开日2005年4月6日 申请日期2002年8月23日 优先权日2001年8月23日
发明者M·考罗什, H·阿尔特赫费, B·克勒格尔, J·L·雷韦尔塔多瓦尔 申请人:巴斯福股份公司