治疗焦虑症的化合物及其配制和使用方法

专利名称：治疗焦虑症的化合物及其配制和使用方法
技术领域：
本发明涉及用汉黄芩素(Wogonin)治疗与苯二氮卓位点有关联的焦虑症的方法。
背景技术：
苯二氮卓(BZDs)类药物是非常有效的抗焦虑药，也是目前广泛应用于治疗精神疾患的处方药。然而，BZDs类药物显示有不希望有的副作用，包括镇静和肌肉松弛。
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi或即日文的Ougon)是一种非常重要的传统中草药。它能抗菌、有镇静作用和能用来治疗不少疾病，包括腹泻(Kubo，M.，etal，Planta Medica 43194-20，1981)和肝炎(Kimuya，Y.，et al，Chem Pharm Bull292610-2617，1981)。
几种不同的化合物，包括汉黄芩素、黄芩素、黄岑甙、野黄芩黄素和黄芩属黄酮已从此草药提取并进行了对GABAA受体的苯二氮卓位点(BZD-S)的亲和力试验，去确定适于作进一步研究的强结合配体。关于黄岑提取物结合能力的报告是相互有矛盾的(Hui，KM，et al.，Planta Med 56 91-93，2000)。

发明内容
本发明至少部分是基于未预料到的发现具化学式 的化合物(通常叫做汉黄芩素，Wogonin)提供非常有效的抗焦虑作用而不会引起镇静和肌肉松弛的不良作用。在活体上试验，其功效是未曾意料的，这是由于汉黄芩素对GABAA受体的BZD-S的亲和力，按已有的报告或是弱或是中等，而未曾将之定为是对其受体的强配体。然而，我们用业界普遍接受的模型进行研究，获得了意外的正面结果，显示了其抗焦虑的功效。用汉黄芩素作为抗焦虑药物有许多优点。此化合物含于黄芩草药根部，是天然产生的，且已知其毒性很低。此化合物在此草药中含量丰富，能有效率地和经济地提取。还提供了高收取率和高纯度的提取该化合物的方法。
在一个实例中，本发明提供了一种配制具有上述化学式化合物的方法，包括用溶剂过滤、浓缩以及从浓缩了的析出物形成该化合物的结晶体。特别的实例，黄芩根是粉剂。溶剂可以是二氯甲烷或乙醇。产品提取过程可在标准温度和气压下进行。该结晶体的纯度可达85-99％。成品收取率0.2％-0.8％。
在另一个实例中，本发明提供了一种从上述配制方法所获得该产品。该产品是在药学上可接受的一种配方。
在另一个实例中，本发明提供了一种用汉黄芩素制造的，治疗焦虑症的药剂。特别的实例，汉黄芩素是用来制造无镇静和/或肌肉松弛作用的治疗焦虑症的药剂。
在另一个实例中，本发明提出用药剂治疗焦虑症。该药剂主要是由上述化学式的化合物所组成。
又在另一个实例中，本发明提供了给病人服用具有上述化学式的化合物的有效无毒剂量来治疗焦虑症，此剂量提供抗焦虑作用而又没有镇静和肌肉松弛不良作用。
在一个特别的实例中，病人服用的剂量是从0.15mg/kg到约1.0mg/kg。剂量可以是一等分剂量，也可以是多于一个等分剂量。
另一方面，本发明提供了一种药包，该药包含有一个或多个充满该化合物的容器。此药包还可装有用此化合物治疗焦虑症的说明书。
又在另一个实例中，本发明提供了一种治疗焦虑症的方法，此方法是给病人服用有效无毒剂量的汉黄芩素。


图1是汉黄芩素的显微照片，显示其针状晶体。
图2是利用膜片钳(whole-cell patch clamp)技术从背根神经节(DRG)神经元获得的典型电流迹线(n＝6)。
图3表示，小鼠口服赋形剂或药物，在高架迷宫中在给定5分钟中作试验，服药1小时后，急性或慢性，的试验结果，包括对照组、安定(Diazepam)组和汉黄芩素(Wogonin)组。
图4表示，小鼠口服赋形剂或药物，在高架迷宫中在给定5分钟中作试验，服药1小时后，急性或慢性，的试验结果，包括对照组、Wogonin组和Wogonin+Ro15-1788组。
图5表示，小鼠口服赋形剂或药物，在高架迷宫中在给定5分钟中作试验，服药1小时后，急性或慢性的试验结果，包括对照组、Diazepam和Wogonin组。
具体实施例方式
本发明上文中的以及其它目的、特性和优点将通过下述优选实例及其附图来说明。
下面，描述本发明的实例本发明至少部分是基于未预料到的发现具化学式 的化合物(通常叫做汉黄芩素(Wogonin))，它能提供非常有效的抗焦虑作用而不会引起镇静和肌肉松弛的不良作用。在活体上试验，其功效是未曾意料到的，这是由于汉黄芩素对GABAA受体的BZD-S的亲和力，按已有的报告，或是弱或是中等，而未曾将之定为是对其受体的强配体。然而，我们用业界普遍接受的模型进行研究，获得了意外的正面的结果，显示了其抗焦虑的功效。用Wogonin作为抗焦虑药物有许多优点。此化合物含于黄芩草药根部，是天然产生的，且已知其毒性很低。此化合物在此草药中含量丰富，能有效率地和经济地提取。
本发明提供了高产量和高纯度地提取该化合物的方法。该方法包括从黄芩根中提取，它含有大量的Wogonin。像其它含Wogonin的草药一样，在配制过程中，黄芩草药的其它成份亦可被利用。表1列出含有Wogonin的部分草药。
表1

在提取化合物之前，通过碾碎、研磨、或其它方法将草药制成细致粉末。提取过程可利用氯化溶剂，例如二氯甲烷、三氯甲烷，或醇，例如甲醇、乙醇、n-丁醇。乙醚、丙酮、乙酸乙酯，以及其它常用溶剂。可完成包括1、2、3、4、5、6或更多数目的提取。提取可以在标准温度和压力下进行，例如温度25℃和一个大气压。亦可在其它温度和压力下进行。在特殊的实例中，提取可以在用于提取的溶剂的沸点下进行。
提取物可以用适当的方法过滤，包括用标准滤纸。提取物亦可用任何合适的方法浓缩，包括用蒸发器。
化合物的结晶体可以通过在例如乙醇的溶剂中溶解提取物而获得，并允许它在室温下停留一段合适的时间。这些结晶体可以用合适的溶剂，例如乙醇过滤和清洗。
亦可用其它方法作为例子。
所描述的用来生产该产品的方法收取率高和纯度高。产品的纯度一般可达85-99％，平均约95％。成品收取率0.2％-0.8％，即每100g黄芩可生产0.2-0.8gWogonin。
该产品高度无毒性，小鼠的半数致死率(LD50)约为4g/kg。
所生产的Wogonin产品对治疗焦虑症非常有效。它不仅有效地减少与焦虑相关联的症状，而且下面的例子证实，即使服用高剂量也不产生不希望有的镇静和肌肉松弛效应。通常，患有焦虑症的病人以有效无毒剂量服用Wogonin。虽然服用Wogonin有多种方法，包括口服、灌肠、滴鼻、灌阴道和肠胃外注射，但建议采用口服。
此处“有效无毒剂量”是指化合物的量、或在生理学上或药学上含有的化合物成分，对提供其所欲达到的职能有效，例如能治疗焦虑症，而无毒性不良反应。其有效无毒剂量的变化取决于诸如身体尺码和年龄以至病情的严重程度。受过普通训练的人可分析上述因素去决定有效无毒剂量，而无需过度的实验。特别的例子，剂量约为0.6mg/kg至约为1.0mg/kg，建议剂量约为0.1mg/kg至约为0.7mg/kg，推荐剂量约为0.15mg/kg至约为10.35mg/kg。可以单等分剂量或2、3、4、5或更多等分剂量服用。
Wogonin对治疗急性和慢性焦虑症均有效。当需要时，它们适合于大剂量服用，亦可长期小剂量服用。例如，当病人患有一种危急的焦虑症，“惊恐发作”时，可以一次过大剂量服用。亦可以较小剂量长期服用来控制焦虑。特殊的实例是，Wogonin可在手术前服用，藉以减少焦虑和缓和情绪。此种疗法不仅减轻病人的紧张情绪，而且能使在做手术时麻醉剂用量减到最少。
服用的Wogonin可以是本发明所叙述的方法生产出的形式，亦可以是与多种在药学上和在生理学上可接受的成分混合而成的形式。此处“在药学上和在生理学上可接受”是指那些化合物、含有这些化合物的合成物、和/或配药形式，它们在合理的医学判断范畴下适合使用。
本发明的化合物可独立地，或者在适合时以盐的形式存在。当要增加溶解度时，就要制成盐的形式。在药学上和在生理学上可接受的盐和它们的制剂是专业人员所熟知的。这些在药学上可接受的化合物的盐包括从无机或有机酸或碱的化合作用得来的由钠、钙和镁或季铵盐组成的传统无毒性盐。
本发明也描述了药学上和生理学上的合成物，它们包含有疗效的化合物剂量和药学上的载体或赋形剂。载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和它们的组合。如有要求，其组成可以包含小量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。其组成可以是液体溶剂、悬浮液、乳剂、药片、药丸、胶囊、持续释放的配方设计或粉剂。其组成可以是具有传统粘合剂和诸如甘油三酸酯载体的栓剂。口服配方可包括诸如药级甘露醇、乳糖、淀粉、镁硬脂酸盐、钠糖精、纤维素、镁碳酸盐和其它业界已知的标准载体。药物载体可以是固体，也可以是液体。
作为例证的固体载体包括葡萄糖、白土、蔗糖、滑石、凝胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、镁硬脂酸盐、硬脂酸等。固体载体可包括一种或多种作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、填料、助流剂、浓缩补助剂、黏合剂、药片崩解剂；也可以是胶囊物质。在粉剂中，载体是精致分割的固体，它是精致分割的活性成分的混合物。在片剂中，化合物与具有必要的浓缩特性的载体以适当的比例混合，压实至所要求的形状和尺寸。
作为例证的液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、水等。液体载体用于配制溶液、悬浮液、乳状液、糖浆和甘香酒剂。合成物可以溶解或悬浮在药学上可接受的液体载体，例如水、有机溶剂或混合两者，或药学上可接受的油或脂肪。液体载体可含有其它药学上合适的添加剂，例如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、染色剂、粘度调节剂和稳定剂。
制药可以采用多种方式。若是固体载体，制剂可以做成药片、将粉剂装入硬明胶胶囊，丸剂、锭剂或药糖块。若是液体载体，制剂可以做成糖浆、乳剂或软明胶胶囊。
Wogonin可以用已为人们熟知的标准制药包装来供应。正确使用Wogonin作为药物或特别用于治疗焦虑症的药物的说明书可以与包装一并提供。
例提取和纯化汉黄芩素(Wogonin)下列方法可方便地大量配制Wogonin结晶化方法将黄岑根磨成粉，将所得500g粉用2L的二氯甲烷(DCM)在室温下榨取三次。将榨出物用Whatman 1号过滤纸过滤，于60℃在旋转的真空脱水器中浓缩至200ml。在底部的黄色沉淀物(DCM提取物)用Whatman 1号过滤纸过滤然后干燥之。在回流下将1.5g黄色沉淀物溶解在40ml乙醇中。过滤此溶液及保持室温使结晶形成。过滤Wogonin的结晶体(呈针状)及用乙醇清洗之(见图1)。
结晶化后，首先由薄膜色谱法(TLC)(流动相，DCM∶甲醇10∶1)检定Wogonin的纯度，然后用Vydac C18逆相柱(150×3.9mm)通过高性能液体色谱法(HPLC)进一步确定。流动相是由氰化甲烷和水以3∶7比例形成，以1∶0ml/min流动率流出。注射量为100μl，探测波长调整在280nm。所用HPLC系统包括一个Waters 7120WISP注射器，一个DU-65分光光度计，一个Waters 600E系统控制器和一个Waters 486可调吸光度探测器。
在TLC板上，从Wogonin配剂观察，只有一个单一迹点。基于HPLC的特性，在约95％Wogonin时，评估配剂的纯度。
渗透法磨成粉的样本100g用甲醇或二氯甲烷渗透。天然的提取物从减压蒸发获得，然后在硅胶上作柱色层分析，再用氯仿-甲醇洗提。
分馏法用乙醇分馏磨成粉的样本100g。在减压蒸发下除去乙醇后获得乙醇提取物。将该提取物溶于水中，和乙基醚和n-丁醇一起连续摇动。乙基醚层蒸发至干燥。乙基醚提取物在硅胶上作柱色谱分析，并用氯仿-甲醇洗提。
超声震动法磨成粉的样本100g，用2000ml的溶剂通过超声震动30分钟，分三次提取。用各种不同的提取溶剂70％甲醇、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯。然后在硅胶上作柱色谱分析，并用氯仿-甲醇洗提。
超临界液体提取(SFE)法将研磨成粉的样本(100g)放进容积1000ml的样本筒中。用甲醇或70％甲醇(分别加入100ml，200ml和300ml)，和2000ml液体二氧化碳作为提取溶剂。提取温度分别是40、50、60和70℃。让高压下(200、300和400巴)的液体二氧化碳流入样本筒。当压力达200、300和400巴时，马上小心打开出口阀，通过管道收集溶液至装有1000ml甲醇的试管中。提取过程是10-15分钟，重复三次。通过减压蒸发得到未加工的提取物，然后在硅胶上作柱色谱分析，并用氯仿-甲醇洗提。
表2从黄芩提取Wogonin的收取率

背根神经节(DRG)神经元的电生理作用像上文中所描述的一样(Hu，et al.，Neurosci 77535-541，1997)，准备新鲜分离出来的2-3个月大的Sprague-Dawley成年大鼠背根神经节(DRG)。斩去大鼠头，并将从胸部到腰部的脊柱节快速切碎。马上隔离DRG并转移它们到含有Dulbecco改良了的Eagle介质(DMEM，Sigma)，pH 7.4，349mosmol/L，的皮氏培养皿中。除去附着的神经及周围连接组织后，将DRG切碎，然后转移到含有5ml DMEM的烧瓶中，在其中胰岛素(0.5mg/ml，type III，Sigma)、胶原(1mg/ml，type IA，Sigma)和]脱氧核糖核酸(Dnase)(0.1mg/ml，type IV，Sigma)已溶解并在35℃在摇动的水缸中培育35-40分钟。在培育完结时，加入大豆胰岛素抑制剂(1.25mg/ml，type II-S，Sigma)去阻止被胰岛素浸提。将隔离了的神经元(直径15-60μM)放入35mm的培育盘中，在进行电生理纪录前，最少保持静止30分钟。
用一个CEZ-2400膜片/全细胞放大器(Nihon Kohden，Japan)，在室温(22-25℃)下，通过膜片钳技术对DRG神经元作记录。千兆奥姆密封(Gigaohm seal)由具有2-4兆欧触点阻抗的硼硅酸盐玻璃微电极制成。除非特别指出，膜的电位通常保持在-60Mv。神经元放在细胞外的介质中，它含有(以Mm计)NaCl 150、KCL 5、CaCl22.5、MgCl22、2，4-(2-氢氧基)-1对二氮己环-乙烷磺酸(HEPES)10、D-葡萄糖10；pH用NaOH调至7.3和摩尔渗透压浓度用蔗糖调至340mosmol/L。膜-吸液管装满细胞内溶剂，包含(以Mm计)CsCl 140、MgCl22.5、HEPES 10、乙烯基双(氧络次氮基)四乙酸盐(EGTA)11、Mg-ATP 5；pH用CsOH调至7.3和摩尔渗透压浓度用蔗糖调至310mosmol/L。膜片电流在1KHz(-3dB)滤波，通过探测软件和硬件系统(华中科技大学，武汉)，在实验室计算机中储存和分析数据，或由描笔记录器(Nihon Kohden)记录。
将伽马氨基丁酸(GABA)，汉黄芩素(Wogonin)和安定(Diazepam)在细胞外的溶剂中溶解，通过重力经由熔融石英管(外径/内径＝500/200μM)制成的线状管数组与这些神经元接触，而石英管与一系列独立的蓄液器连接。这些管放在这些100μM的神经元内。神经元持续地浸在从一个管流入的细胞外的介质中，并打开相应的阀施加药物溶剂，用显微操纵器横向快速移动吸液管。为了使GABAA受体从减敏现象中完全恢复，每隔四分钟施药一次。图2的电流记录图像显示Diazepam和Wogonin増强了GABA对神经元的作用。记录图显示利用膜片钳技术从DRG神经元获得的有代表性的电流迹线(n＝6)。Wogonin像Diazepam以同样方式増强了GABA-启动电流。
药理学试验雄性ICR小鼠(18-23g)，随意将他们分成实验组。同组别4-5只关在一起，自主摄食和饮水，11小时光和13小时黑循环。除急性致死活力试验(10只雄或雌性小鼠)外，每实验组有16只小鼠。
将Wogonin和Diazepam溶于pH 10的水中，试验1小时前浓缩至10ml/kg口服。对于慢性试验，试验前小鼠接受5天预处理。氟马西林(FlumazenilRo15-1788)则在试验15分钟前以12.5ml/kg作腹膜内注射(IP)。
活动行为试验ZIL-2型光电测试箱(北京医药大学)的尺寸是60×60×12cm。箱体内有四个直径25cm圆形活动测试盒，有六个红外光电感受探头均匀分布在测试盒的侧壁上。记录小鼠在5分钟内经过红外光电感受器的次数。次数的増加反应活动行为的増加。
表3记录的结果显示，服药直至30mg/kg，活动行为未显著改变，显示无任何镇静效应。
表3

n＝16(每组)*P＜0.05，**P＜0.01，明显不同于对照组，方差分析后Dunnett的t试验四孔板试验孔板仪器是一有墙围绕的木制试室(60×60×30厘米)，室内地板上有四个直径3厘米相互等距离的孔。小鼠放在室的中央。在五分钟的时间间隔内记录向孔探头的次数和探头停留的时间(File，S.E.和Pellow，S.，Br J Pharnacol 86729-735，1985)。试验在暗光下进行。小鼠随意放在任一试验组及在8am至12pm之间以任意次序喂药。每次试验后，用纸巾擦净仪器，清除先前的脚印痕。探头次数和停留时间的增加反映更多的探察活动。反之，与对照组比较，这些参数的减少显示镇静行为(Nolan N.A.和Parkes，M.W.，Psychopharmacol 29277-288，1973；File S.E.和Wardill，A.G.，Psychopharmacol 4453-59，1975；File S.E.和Pellow，S.，Psychopharmacol 881-11，1986)。
表3记录的结果显示，服药直至30mg/kg，对小鼠未诱导显著的镇静效应。
高架迷宫试验高架迷宫是由木制成的水平十字架，有两条无栏栅的悬臂(25×5厘米)(简称开臂)和两条墙高20厘米的相对着的悬臂(25×5厘米)(简称闭臂)。悬臂从中央平台(5×5厘米)伸展出来。高架迷宫离地40厘米，放在30×30×50厘米的盒子内。每只小鼠在进行5分钟的四孔板试验后，马上被放在中央平台上，面对着封闭的悬臂。在五分钟的时间间隔内记录进入悬臂的次数和在开臂和闭臂停留的时间。进入悬臂的总数估量一般的活动行为，而此数目的减少显示焦虑。实验后，进入开臂的次数和进入悬臂的总数以百分比表示，进入开臂停留的时间和进入悬臂(开臂和闭臂)停留的时间亦以百分比表示。试验在暗光下进行。小鼠随意放在任一试验组及在8am至12pm之间以任意次序喂药。每次试验后，用纸巾擦净仪器，清除先前的脚印痕。小鼠选择增加进入开臂的次数及停留时间则显示抗焦虑效应(Pellow，S.，et al.，J Neurosci Meth 14149-167，1985；Lister，R.G.，Psychopharmacol 92180-185，1987)。
从进入开臂次数(急性)，在开臂停留时间的百分比(急性)和进入开臂次数(慢性)的结果显示(概括于表4和图3)，在服药7.5、15或30mg/kg时有显著的抗焦虑作用。图3表示小鼠口服赋形剂或药物，在高架迷宫中在给定5分钟中作试验，服药1小时后，急性或慢性，的试验结果。在高架迷宫中进入开臂次数或在开臂停留时间的均值(±标准差)总百分比。在方差分析后作Dunnett的t-检验，服药组的结果明显不同于对照组，*P＜0.05，**P＜0.01，n＝16。
此外，Wogonin的抗焦虑作用被苯二氮卓受体拮抗剂氟马西林(FlumazenilRo15-1788)完全消除。图4表示小鼠口服赋形剂或药物，在高架迷宫中在给定5分钟中作试验，服药1小时后，急性或慢性，的试验结果。在高架迷宫中进入开臂次数或在开臂停留时间的均值(±标准差)总百分比。Wogonin的抗焦虑作用被Flumazenil Ro15-1788完全消除(2.5mg/kg)。在方差分析后作Dunnett的t-检验，服药组的结果明显不同于对照组，*P＜0.01，n＝16。
表4

n＝每组16*P＜0.01，方差分析后作Dunnett的t-检验水平金属线试验握住小鼠的尾巴举起小鼠，让它用前脚抓住水平伸展的金属线(直径1mm，15cm长，离桌面20cm)然后放开它(Bonetti et al.，1982)。用服药前能用后脚抓住金属线的小鼠试验。记下小鼠在十次中，用前爪或在3秒内最少用一只后爪能有效地抓住金属线的次数。令肌肉松弛的药会损害小鼠抓住金属线的能力，而此肌肉松弛与镇静有关联。
图5显示服用Wogonin至30mg/kg，小鼠不会肌肉松弛。
以上已参照参考资料详细地说明和描述了本发明所推荐的实例，其形式及细节可能会有所改变，但不会偏离本发明的范畴(见所附权利要求)。
权利要求
1.一种配制下列化学式的化合物的方法， 它包括用溶剂从黄芩提取该化合物；过滤提取物；浓缩提取物；和从浓缩提取物形成该化合物的结晶体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处黄芩是粉剂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包含多个提取步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处溶剂选自二氯甲烷或乙醇属。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处提取是在标准温度和气压下进行。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处提取是在溶剂的沸点下进行。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处从浓缩提取物形成的结晶体的纯度约为85％至约为99％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处产品收取率约为0.2％至约为0.8％。9
9.一种利用权利要求1所述的方法获得的产品。
10.一各如权利要求8所述的产品，其特征在于，它包含制药学上可接受的配方。
11.一种利用汉黄芩素制造的治疗焦虑症的药剂。
12.一种用汉黄芩素制造的，不产生镇静和/或肌肉松弛作用的治疗焦虑症的药剂。
13.一种为有要求的病人治疗焦虑症的方法，它包括给病人服用有效无毒剂量的，如权利要求1所述的化学式的化合物。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，此处病人服用的剂量约是0.15mg/kg至1.0mg/kg。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，服用的剂量是单一等分剂量。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，服用的剂量是两等分或更多等分剂量。
17.一种药包，它包含装有权利要求10所述的化合物的药物用的容器。
18.如权利要求10所述的容器，其特征在于，它还包括用此化合物治疗焦虑症的说明书。
19.一种治疗焦虑症的方法，其特征在于，它包括给病人服用有效无毒剂量汉黄芩素。
全文摘要
本发明提供一种为有要求的病人预防或治疗焦虑症的方法，此处包括给病人服用有效而不引起镇静或肌肉松弛不良作用的汉黄芩素(Wogonin)。本发明还描述了从黄芩提取汉黄芩素的方法。
文档编号C07D311/30GK1671680SQ02829534
公开日2005年9月21日 申请日期2002年9月3日 优先权日2002年9月3日
发明者薛红, 许国棉, 王红燕, 郑辉 申请人:华晶基因技术有限公司