Dna高速扩增的气体喷射式方法及装置的制作方法

专利名称：：Dna高速扩增的气体喷射式方法及装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及进行样品高速扩增的方法和装置。更特别地，本发明涉及进行加压的气体喷射式(gasjet)聚合酶链反应的方法和装置，其中每个循环可以在少至几秒内完成。
背景技术：
：聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)是分子生物学中最广泛应用的技术之一(Mullis的美国专利No4,683,202；Saikietal.，1985；Erlich，1989；Mullisetal.，1994)。PCR扩增的DNA可用于诊断与人遗传疾病相关的突变(Saikietal.，1985；Koganetal.，1987)，用于血液和组织分型(Saikietal.，1989a)，或者用于检测与重要的感染性疾病相关的病原体(Persingetal.，1993；Nicolletal.，2001)。在一个典型的PCR反应中，位于两个指定的寡核苷酸引物的末端之间的模板DNA序列可以在1-2个小时内扩增(图4a)。通常要进行三个相继的步骤(1)在高温下(90℃-95℃)将双链DNA变性(D)为单链形式，(2)在～45℃-65℃将所得单链DNA链与寡核苷酸引物退火(A)，(3)在～72℃使用热稳定的DNA聚合酶如水生栖热菌(Thermusaquaticus)(Taq)聚合酶将引物模板复合物延伸(E)(Saiki，1989b)。这三个步骤的一次循环(变性/退火/延伸)导致DNA片段扩增2倍，其5’和3’末端通过寡核苷酸引物与DNA模板的序列特异性退火而限定。因此，30次完全有效的PCR循环导致特定的DNA序列扩增230倍(～109倍)。由此DNA从低于一皮克数量扩增至微克数量，这可以通过标准分析方法检测，如通过凝胶电泳、DNA杂交或基于荧光的光学检测。自动PCR仪已经建造了自动化进行三步PCR扩增程序的许多机械(Oste，1989；Oste，1994；Newton，1995；Johnson，1998)。通常地，这些装置可以分为两类机器人装置，其移动DNA样品去加热；及热循环仪，其将热带给样品。机器人装置如Stratagene′sROBOCYCLER将含有PCR反应样品的试管移至一系列的热浴中并从中移出，所述热浴在不同温度是热稳定的。尽管这些装置可用于一些研究中，但它们不能进行高速PCR。它们需要＞60分钟以进行30次扩增循环，等于每次PCR循环＞2分钟。自1980年以来，热循环仪已经成为许多生物化学实验室中常见的装置。大多数可商购的PCR装置(Perkin-Elmer，MJResearch，Ericomp，Techne，Eppendorf，BioRad，Hybaid)是热循环仪(Johnson，1998)。通常应用两种类型的热循环仪可编程热模块及强制干热热循环仪。可编程热模块大多数热循环仪均是具有孔洞的热模块，在模块内在电子控制下将塑料反应管加热及冷却。一些这样的装置已经由Johnson(1998)评论。可编程热模块设计中的问题是大多数时间花费在等待大块的金属加热或冷却。例如，在MJResearchPTC-150热循环仪(Watertown，MA)中，在D，A和E温度(～94℃，～55℃和72℃)之间过渡要浪费14秒/循环。从94℃至55℃的一次加热/冷却循环要浪费28秒/循环，或者在30次PCR循环中浪费14分钟。许多常用的PCR方案花费的时间是94℃1分钟(变性)，～55℃1分钟(退火)，及72℃1分钟(延伸)。例如在Cetus研究人员使用的最初的PCR方法中(Saikietal.，1989b)，使用30次循环(在94℃1分钟，在55℃1分钟，在72℃1分钟)扩增一个536bp人β-球蛋白DNA片段。这个热循环方案的有效工作(activeduty)时间仅为3.5分钟＝210秒。这个时间是在TaqDNA聚合酶延伸速度为～80nt/秒时酶促拷贝一个536bp的模板30次所需要的时间(Inniseta1.，1988；Gelfand和White，1990)。可商购的热模块热循环仪(Perkin-Elmer，Ericomp，MJResearch，Eppendorf，Techne，BioRad，SnarkTechnologies)需要20-25秒以从94℃冷却至55℃，及另需要14-20秒以从55℃加热至94℃(Johnson，1998)。因此每次PCR循环的“死时间”是另外的40+5秒/次循环。如图4a所示，常用的热循环方案需要(220秒/循环×30次循环)＝6600秒＝110分钟(Saikietal.，1989b)。这110分钟中仅有～3.5分钟生产性地集中进行PCR程序。Sobczaketal.(1995)已经揭示了可用于热模块热循环仪中的更快的PCR方案，其中变性，退火和延伸步骤降低至1-2秒/次循环。例如通过35次循环(94℃1秒，58℃1秒，72℃1秒)扩增长度为139碱基对的人p53基因片段。然而，热循环仪的加热/冷却时间仍＞25秒/循环。因此，30次PCR循环的全部热循环时间为～30秒/循环或者～15分钟。强制干热热循环仪为克服热模块的长过渡期的死时间，已经构建了强制干热热循环仪，其使得30次PCR扩增在少如～10-30分钟的时间内进行。Wittwer及其同事进行了大量的工程化基础工作以优化在干热PCR热循环仪中进行的快速DNA扩增(Wittweretal.，1989；Wittwer和Garling，1991；Wittweretal.，1994)。三步PCR反应序列(变性/退火/延伸)中限速步骤是DNA聚合酶延伸的速度。在Taq聚合酶的80个核苷酸/秒的延伸速度(Innisetal.，1988；Gelfand和White，1990)，理论上需要1秒/循环以使用～20-mer引物扩增短于100bp的DNA片段。例如，仅需要大约5秒/循环以通过30次PCR循环拷贝一个536bp的β-球蛋白扩增子(IdahoTechnology，1995；参见图4b)。在首先由IdahoTechnology(IdahoFalls，Idaho，USA)建造的可商购干热热循环仪中，进行一次变性/退火/延伸的PCR循环需要的反应时间显著减少，因为(1)该装置具有非常低的热量质量；(2)在薄壁的毛细管中进行从热气体至水相生物化学反应样品的气相传热；(3)使PCR循环期间的变性和退火时间减至最小。例如，使用30次循环的PCR方案，一个536bp的人β-球蛋白DNA片段在9.9分钟内扩增；或者19.8秒/次循环(IdahoTechnology，1995)。因此这种强制的干热热循环方案与最初Saikietal.(1989b)使用常规热模块热循环仪的方法经PCR扩增一个536bp的β-球蛋白DNA片段相比，约快220/19.8＝11倍。在常规实验室诊断性PCR中，干热热循环仪不是如上述那样快的。例如Nicolletal.(2001)使用RocheLightCyclerTM，通过50次PCR循环扩增短的(长度为96-220bp)疱疹病毒DNA片段需要～25分钟，或者大约30秒/次循环。依赖于次最佳对流传热的干热热循环仪尽管强制干热热循环仪(Wittwer等的美国专利No.5,455,175；Wittweretal.，1990；1994；Zurek等的美国专利No.5,576,218；Tal等的美国专利No.6,200,781)的设计比模块加热器有改进，但未注意传热程序中的流体力学的重要作用。本发明人提出“送风器(blower)”(Zureketal.美国专利No.5,576,218)和周围空气(Wittwer等的美国专利No.5,455,175；Wittweretal.，1990；1994；美国专利No.5,576,218)作为对流的介质。送风器和鼓风机使空气流动(与本发明中使用的压缩气体来源相比)并因此气体速度与压缩气流相比低很多。另外，先前的发明未考虑到使用冷冻的或冷却的空气或者其它冷冻的气体以冷却部分PCR循环，仅依赖于周围空气。由于先前的发明未使用压缩气流，因此速度并未非常高(＜3m/s)，并因此与高速度的气体湍流可达到的速度相比其达到的是低对流传热速度。高速湍流包括可压缩的非等温的流体动力学。在大气压下(P＝1巴)强制空气加热和周围空气冷却是生物化学反应室的流体动力学的独特的、次最佳解决方案。Wittwer等(美国专利No.5,455，175；Wittweretal.，1990；1994)，Zurek等(美国专利No.5,576,218)或Tal等(U.S.Pat.No.6,200,781)均未使用除了空气之外的气体，大气压之外的压力，低于22℃的冷却气体，或者快于1秒的时间常数，他们未应用流动调节器(flowconditioner)以混合热气体和冷气体和/或增加气压和速度。他们未考虑到不同的气体可以在PCR程序的不同阶段应用的可能性，并且未考虑到流体力学、传热物理学或流动条件对于最佳传热的作用。例如，“空气是理想的传热介质，由于其的低密度而可以迅速改变温度”(Wittweretal.(1990))不仅事实上是错误的，而且还忽视了问题的复杂性气相对流传热依赖于多种因素(Weltyetal.，1976；Chapman，1984)。使用热/冷压缩的气流高速扩增DNA需要的气相传热条件更准确地描述为湍流非等温可压缩气流；实际上无一最佳气体参数或流动条件先前已经最佳化。如图2a和2b所示，一种加压的气体喷射式(gasjet)热循环仪在气压、速度、湍流非等温流动条件及几何学下运转，这些条件先前未考虑过，更别说参与高速DNA扩增实验，如图5-12所示。关于Wittweretal.(1990)，经过一个空气的不流动层(例如边界层)传热非常不好。这种效率低下的传热解释了为什么双层窗具有极佳的绝缘性质。为什么强制的干热热循环仪比模块加热器的性能好的唯一原因是空气的流动使得DNA样品周围的绝缘边界层变薄。因此尽管空气的导热系数低，但经过边界层的热流量快于经过模块加热器。干热和加压气体热循环仪中传热对比干热热循环仪和加压气体热循环仪之间的不同通过一个简单的薄圆柱(毛细管)周围的传热分析而描述。选择圆柱是因为这两种热循环仪均使用毛细管装有DNA样品；但是针对任何其它形状的样品容器进行的分析均是相似的。do和di表示毛细管的外径和内径。自然的对流传热和反应中液体混合物的内部热梯度主要由于粘力和较小内径的主要作用而可以忽略不计。毛细管内部水溶液的热能平衡如下给出ρmCpmdTsdt=4diheff(Tg-TS),---(1)]]>其中ρm和Cpm表示混合物的密度及比热。这个等式描述了当气体在Tg温度流过毛细管时毛细管中样品温度(以Ts表示)怎样快速变化。例如假设样品处于94℃，其必须通过0℃的冷却气体流过毛细管而冷却至56℃。当冷却气体开始流动时，设定时间t＝0，毛细管内部水溶液样品冷却所需要的时间可以通过解方程式(1)获得Ts(final)-TgTs(begin)-Tg=56-094-0=exp(-4hefftρmCpmdi)---(2a)]]>时间t通过解方程式(2a)获得t=-ρmCpmdiheffln=0.043ρmCpmdiheff---(2b)]]>以相似的方式，可以描述任何生物化学反应样品的加热或冷却。从方程式(2b)中显而易见当有效的传热系数heff最大时，时间t降低。这个系数将循环仪的性能与传热和流体力学联系起来。系数heff包括通过毛细管壁的传热(hc)及通过气体与毛细管外表面之间的边界层的传热heff=hchbl(hc+hbl).---(3)]]>毛细管的传热系数依赖于毛细管材料的导热系数(kc)及其大小hc=2kc(do-di).]]>通过边界层的传热系数(hbl)通过如下相互关系给出，由(1)Hsu及(2)Douglas和Churchill提出(均参见Weltyetal.(1976)所述)。这个系数受流体力学的显著影响。但首先限定两个无量纲数。Reynolds数Re=ρgasdovμgas,]]>其中v，μgas，和ρgas表示气体平均速度，气体的动态粘度和气体密度。Nusselt数Nu限定为Nu=hbldokgas,]]>其中kgas是气体导热系数。Nusselt数阐明了两个流动方案，层流和湍流，如0下所示。层流Re＜500，Nu＝0.43+0.48Re0.5(Hsu相关性)湍流Re＞500，Nu=hbldokgas=0.46Re0.5+0.00128Re]]>(Douglas和Churchill相关性)。当气体速度低时(小Re)，则Nusselt数Nu低并且hbl也低。因此如果hbl比hc低，则有效传热系数heff≈hbl。如果气体速度增加至当hbl＞＞hc时的点时，则有效的传热系数接近限制值heff≈hbl。以下是强制干热热循环仪的典型条件P＝1巴，v＝2m/秒，密度、动态粘度和热导率分别是ρ＝0.98kg/m3，μ＝2.12×10-5kg/m.sec，kgas＝0.03W/mK。毛细管外径为do＝0,001m。Reynold′s数为Re=0.98×0.001×22.12×10-5=92.5.]]>因为Re＜500，因此使用Hsu(1963)相关性Nu＝0.43+0.48×Re0.5＝5，限速传热系数为hbl=kgasNudo=151W/m2K.---(4a)]]>通过热导率kc＝1.1W/mK及1mm外径和0.8mm内径的玻璃毛细管的传热系数是hc=2kc(do-di)=2×1.1(0.001-0.0008)=11000W/m2K---(4b)]]>因此有效传热系数是hcff=hchbl(hc+hbl)=11000×151(11000+151)=148.96W/m2K.---(4c)]]>这个结果可与使用如下值的加压空气热循环仪结果相对比P＝3巴，v＝20m/sec。加压气体密度、动态粘度和热导率分别是ρ＝2.95kg/m3，μ＝2.12×10-5kg/m.sec，kgas＝0.03W/mK。毛细管外径是相同的do＝0.001m。然后计算Reynold’s数为Re=2.95×0.001×402.12×10-5=2800]]>由于Re＞500，因此使用Douglas和Churchill相关性Nu＝0.00128Re+0.46×Re0.5＝27.92，限速传热系数为hbl=kgasNudo=838W/m2K.---(5a)]]>通过毛细管的传热是相同的，有效传热为hcff=hchbl(hc+hbl)=11000×838(11000+838)=779W/m2K.---(5b)]]>通过对比方程式(4c)(干热热循环仪)和方程式(5b)(加压空气热循环仪)，可以看出通过边界层的限速传热系数比加压空气热循环仪的大5倍。对比研究(方程式(2))的冷却时间，加压空气热循环仪与干热热循环仪相比少5倍。另外，这个比率对在PCR程序的任何其它步骤期间的加热或冷却也是正确的。将加压气体热循环仪中的运行气体改变为氦气，则性质为ρ＝0.4kg/m3，μ＝2.31×10-5kg/m.sec，kgas＝0.17W/mK。Reynold’s数为Re=0.4×0.001×202.131×10-5=693]]>且Nu＝0.00128×693+0.46×6930.5＝13.0使用加压氦气，限速传热系数因此为hbl=kgasNudo=2210W/m2K.---(6a)]]>有效传热系数为heff=hchbl(hc+hbl)=11000×2210(11000+2210)=1840W/m2K.---(6b)]]>通过对比方程式(4c)和方程式(5b)和(6b)，预期加压空气喷射与强制干热热循环仪相比有5倍改进，使用加压氦气作为运行气体有12倍以上的改进。这个例子表明优异的传热转化为更快的PCR。传热的改良通过使用加压的气体优选氦气而达到；然而，即使次最佳的气体如空气也远比未加压的装置的性能好。加压气体喷射式热循环仪的优点基于上述理论分析，预期可以在3m/sec＜v＜30m/sec(Mach0.03＜v＜Mach0.3)的速度范围将热/冷加压的气流输送至一个生物化学反应室，以将薄壁容器内酶促反应的温度从～50℃快速改变为～90℃。然而，必需的几何学、气体动力学、流动条件、热/冷气体混合的方法，及气体喷射的时间都不是微不足道的工程学问题。对流体力学领域的那些技术人员而言，解决这些问题是使用Navier-Stokes等式及计算机流体力学(CFD)建模(Anderson，1995)完成的。加压气体热循环仪与干热热循环仪在6个方面有所不同(1)使用高于大气压的压力(气体密度增加)P≥1.3巴。(2)速度更快(边界层厚度降低)v≥5m/sec。(3)可以使用除了空气之外的气体；例如可以使用氦气快速加热及可以使用CO2以良好控制热量及有效冷却。(4)应用附着一或多个气体流动调节器的反应进行气体混合。(5)使用数字式可编程电控阀(eletronicvalve)将热和冷的气流输送至反应室，通过调理室调节和混合气流。(6)可将DNA变性、引物模板退火及酶促延伸编程为间隔≤100毫秒。熟知物体的对流加热/冷却远比热传导更有效。例如，风冷温度表明风运动的额外冷却效力，即“对流”。这种认识中的效力意味着物体改变其温度一定量所用时间。对流冷却/加热速度依赖于(1)气体和物体之间的温度差；(2)物体周围边界层的厚度(物体周围由一薄层气体环绕，这对物体而言是固定的，称为“边界层”)。这个层的厚度与气体相对于物体的速度明显相关。在较高的气体速度，边界层稀薄并且传热速度(称为热流量)改善。高速度可以通过使用加压的气体达到分子通常从高压区域流至较低(大气)压力区域，通过开放/关闭电子和/或机械控制阀门而调节。热能(热)经过边界层的转移也明显受到使用的气体类型的影响。氦气对于快速加热物体而言是特别有效的。二氧化碳(CO2)气体等焓膨胀时冷却至-24℃，并因此是有效的廉价的冷却气体。这种性质依赖于气体的多变(polytropic)系数，这是每种气体或气体混合物固有的和独特的热力学性质。当气体速度接近Mach0.3(气体声速的0.3倍)时，气体成为可压缩的。这种压缩性暗示着气体温度(热内能)和动能(气体速度)之间的密切联系，并因此产生湍流。高速DNA扩增需要的快速传热更准确地描述为湍流非等温可压缩气流。一般而言，这种反应条件很少用于生物化学中。因此生物化学领域的技术人员不太了解怎样应用这种复杂的气流条件以进行温度敏感性生物化学反应。传热专家总是将宏观的对流传热性质与微观的导热性质相对比。因为模块加热器中热流量是热传导类型(微观)，速度由Fourier′s定律描述qcond=-kdTdx,]]>其中qcond是在x轴的通过热传导的热流量，k是导热系数(从中制成模块加热器的材料的性质)，是x轴的温度梯度。这个速度受如下因素的影响(1)热传导的距离(达到厘米的数量级)，(2)受限于材料性质的温度差异，(3)导热系数。自Fourier(1822)和Navier(1856)以来已知气相物理原理中控制传热的基本定律，在标准的机械工程学教材中也有教导(Bosworth，1952；Azbel，1984；Chapman，1984)。然而，湍流非等温可压缩气流的流体动力学，如本发明描述的新程序和装置中所应用的，对生物化学领域中的技术人员而言还是非熟知的一个专业问题。氦的导热系数由Ubbink(1947)测定并由Johnston和Grilly(1946)，Bosworth(1952)，Azbel(1984)和Chapman(1984)公布，以表格形式列出。如图1所示，氦的导热系数是空气的7倍。氖的传热速度是空气的大约2倍。因此，干热热循环仪使用了错误的气体进行快速传热。在非易燃的气体中，空气是可利用的；氦是最佳的；特别是氦的同位素3He。Wittwer等的美国专利No.5,455,175采取了同样的气体(空气)用于加热反应室，冷却反应室或将其温度保持在固定值。事实上，如图8b和9b中温度对时间图示中所示，具有高热导率的气体(高k气体)如氦对加热/冷却反应室而言是上好的，而在～72℃酶促延伸期间当将温度保持几秒时，低k气体如空气或CO2提供较好的热度控制(见图5b，9b，10b)。换句话说，不同的气体对PCR程序的不同阶段是最佳的。其次，Wittwer等的美国专利No.5,455,175，Zurek等的美国专利No.5,576,218及Tal等的美国专利No.6,200,781阐明了使用空气(但无其它气体)在大气压力(但无其它压力)下进行热循环。空气不仅是一种相对廉价的气相传热介质，而且不需要在大气压力下应用。使用空气在大气压力(P＝1巴)下进行DNA的PCR扩增是常规的。然而，在提高的压力(P≥1.3巴)和速度(v≥5m/s)下，PCR程序确实加快(见图4，5b，7b，8b，9b和12b)。在Zurek等的美国专利No.5,576,218中描述的强制干热热循环程序中，“样品可以在12-15秒内从50℃加热至85℃，…通过注入明显低于靶定温度的冷却的空气，例如22℃的空气，样品可以在大约60-75秒内从85℃冷却至50℃”。因此，Zurek等在美国专利No.5,576,218中描述的方法要求至少(12+60)＝72秒/次循环以加热和冷却气体(空气)，不管任何有效的生物化学是否已经发生。Zurek等没有提供其程序或装置可真正用于扩增DNA的证据。另外，Zurek等未考虑应用高于大气压的气压(P＞1巴)的可能性，因为在他们的机器中从未测定气压。在本发明中，使用～2.5巴的加压气体进行30次PCR扩增可以在少如78秒的时间内完成，这个时间是使用Zurek的方法(美国专利No.5,576,218)进行一次循环所需的时间。第三，Wittwer等(美国专利No.5,455,175；Wittweretal.1990；1994)采取加热室和反应室是一个室(见图2)。事实上，如果反应室与热气体来源通过一或多个电控阀及一个流动调节器和/或气体蓄积室而隔开，则对流传热可能更快。第四，Wittwer等(美国专利No.5,455,175)，Zurek等(美国专利No.5,576,218)和Tal等(美国专利No.6,200,781)采取在环境温度的空气是最佳的冷却介质。事实上，生物化学反应室可以使用除了低于25℃的空气之外的气体更快速地冷却。图5b，7b，8b和9b中温度对时间图示清晰表明加压的CO2气体(P≥2.3巴，T＝5℃)与周围空气(P＝1巴，T＝23℃)相比是更好的气相冷却介质。理论上，可以使用通过涡流管提供的加压气体包括空气在相对高压(P＞5巴)下快速冷却生物化学样品，如Ranque(1934)和Hilsch(1947)所描述。然而，Wittwer等(美国专利No.5,455,175)或Zurek等(美国专利No.5,576,218)均未考虑使用加压气体或Ranque-Hilsch涡流管进行冷却。第五，Wittwer等(美国专利No.5,455,175；Wittweretal.1990；1994)，Zurek等(美国专利No.5,576,218)和Tal等(美国专利No.6,200,781)采取了程序化加热/冷却DNA反应样品的相对时间常数是间隔为0，1，2，3…秒。他们没有考虑到这样一种可能性，即当装置以一秒钟的分数为时程进行程序化时，PCR可以进行得更快。本发明使得变性、退火和延伸时间更快，因为时间参数可以按照1/10秒进行程序化(图13)。总之，就有效的气相传热而言，强制干热热循环仪利用了错误的气体进行加热和冷却，错误的气压及错误的加热室和反应室构造。应用的时间常数(≥1秒)对高速热循环而言太慢(见图2)，强制干热热循环仪气体缺少最佳的CFD-建模的气体动力学及未利用流动调节器。可以使用加压的气体特别是氦/空气/CO2组合设计更快的热循环仪，将所述气体组合使用流动调节器(图3c)和电动阀门输送至恒温反应室。为了正确地陈述本发明的速度和性能，MassachusettsInstituteofTechnology的Chiou等(2001)最近描述了热循环仪的“技术发展水平”。他们指出“本项研究的目的是制造一种PCR机器，以利用尽可能少的时间扩增样品…”(p.2018)。Chiou等(2001)描述的装置使得可以在23分钟内通过30次PCR循环扩增长度为500碱基对的噬菌体λDNA片段，从～1纳克(10-9g)DNA开始；效力为78％。对于进行30次PCR循环，扩增倍数是1.5830＝6.0×105或者600,000倍。本发明使得可以在比Chiou等(2001)所述方法快一个数量级的时间量程高速扩增病毒、细菌和单拷贝的人基因片段。另外，如图8a所示，气体喷射式PCR的效力更高，为～93％。本发明提供了一个DNA扩增倍数1.8630＝1.35×108倍或135百万倍。因此，气体喷射式PCR比Chiou等(2001)所述方法更加敏感[1.35×108/6.0×105]＝225倍。加压的气体热循环仪在1.3-10.3分钟(78-617秒)内通过30次PCR循环常规扩增长度为85-2331bp的病毒和细菌DNA片段。这个大小范围内的单拷贝人基因片段可以通过35次PCR循环在3.5-6.5分钟内扩增至可检测数量(图5a，9a和13)。因此，根据上述现有技术的限制，本发明揭示了一种新的使用加压气体和电控阀自动控制的气体喷射式扩增程序和装置。发明概述本发明包括一种高速扩增DNA的方法。本发明提供了含有生物学样品、DNA聚合酶、寡核苷酸引物和脱氧核苷酸前体的反应室。该反应室接受一或多种传热气体流。第一种传热气体在与反应室物理性分开的加热室中加热。加热的气体在高于或等于1.3巴(P≥20p.s.i.)的压力下输送至反应室。利用来自加热的气体(≥95℃)的热量使DNA变性。将与第一种传热气体同种或不同种的第二种传热气体输送至反应室。第二种传热气体(≤20℃)将反应室冷却至足够低的温度以使得变性的DNA与寡核苷酸引物退火。最后，使用第一种热的(≥95℃)传热气体将反应室的温度升高至足够高的温度(典型为68-75℃)以使得引物模板复合物酶促延伸。当热的(≥95℃)和冷的(≤20℃)气体在两通、三通电控阀或多通电控阀控制下输送至一个生物化学反应室中时，可以非常快速地热循环。通过一个流动调节器(或一系列流动调节器)输送至恒温反应室中，或者喷射热和冷气体至恒温反应室中，可以在几十毫秒的时程内控制酶催化反应的温度。理想地，选择的气体是氦气，但为进行对流也可以使用其它气体。本发明的一个实施方案还包括一种高速扩增DNA的装置。这种装置包括一个反应室，压缩的热(≥95℃)和冷(≤20℃)气流在一秒的分数时程内输送至其中。这种装置的整体构造由6部分组成(1)一个加热器，以将加热气体的温度升高至预定值(≥95℃)，(2)一或多个流动调理室，以混和冷和热的气体并调节流动及减弱压力变动，(3)一个入口，与附着的混合室同时运行以混和热/冷气体，(4)一个气体反应室，(5)一个排气口，及(6)热交换器，以从反应器出口和旁路热气中回收热量。在某些方面，加压的气体热循环仪因此与气体喷射式和/或火箭引擎相似。然而，代替混和燃料和氧化剂(如在喷气机或火箭中)，将热的和冷的非易燃气体在电控阀的控制下混和，无燃烧发生。本发明中描述的基本过程因此准确地称为“气体喷射式PCR”，装置适当地称作“PCR气体喷射机”。快速、精确、可靠的热控制酶催化反应是PCR气体喷射机的目的。加热室与反应室物理性分离，其与反应室流体连通。第一个容器具有压力高于反应室压力的一种加热气体，该容器与加热室流体连通。这种连通可包括一个流动调理室以调节流动和抑制压力变动。第二个容器具有冷却的气体(其与加热气体可以是相同或不同种类的)，其与反应室流体连通。这种连通可包括一个流动调理室以调节流动和抑制压力变动。一或多个冷却气体入口阀门位于第二个容器和反应室之间，一或多个加热气体入口阀门位于第一个容器和反应室之间。一个可编程控制器具有电子输入端和输出端，用于控制入口阀门的开放。位于反应室内的温度传感器规定了控制器的输出。控制器打开和关闭入口阀门以达到或保持反应室内所需的温度。如果与反应室物理性分离的室中最佳传热气体如氦的温度升高至≥95℃，则输送至反应室电控打开阀门，可以进行极快的热循环。如果冷却的气体(≤20℃)输送至该室中，甚至可以达到更快的传热。为进行反应室的自动加热和冷却，优选应用至少两个电控阀(热气体和冷气体阀门)及一或多个机械安全阀。实际上，不需要也不必优化应用压缩的氦气以加热和冷却反应室。瓶装的压缩二氧化碳(CO2)气体在离开其贮存器后膨胀并冷却(等焓冷却)。因此便利地使用加压的氦气(或压缩的空气)以加热反应室，及使用瓶装的CO2气体以冷却该室。例如，使用热的(～170℃)加压的氦气和冷却的(～5℃)加压的CO2气体，将其使用6V或24V电控阀和数字和/或模拟信号输送至恒温反应室，可以在少于4秒的时间内循环改变温度从92℃(DNA变性温度)至55℃(引物退火温度)至72℃(DNA聚合酶延伸温度)。根据扩增的DNA片段的长度，当使用最少的变性、退火和延伸时间(0-2秒)时，30次92℃/55℃/72℃循环可以在～2.0-4.0分钟内进行(图12)。因此本发明的一个目的是提供一种扩增DNA的方法，由此聚合酶链反应(PCR)可以使用预热和/或预冷却的气体快速进行，所述气体使用电控阀输送至恒温的反应室中。在这种方法中，将热的(≥95℃)或冷的(≤20℃)加压的气体输送至含有生物学样品的物理性分离的反应室中，以控制用于DNA变性、引物模板退火及聚合酶催化的延伸的温度。本发明的另一个目的是提供了对生物学样品进行快速热循环的一种方法，通过调节热或冷的加压气体(P≥1.3巴)流动至这些样品而进行。本发明的再一个目的是提供了一种装置以进行DNA扩增，使用电控阀调节热和冷的加压的气体流入恒温的生物化学反应室。本发明的另一目的是在反应室之前使用一或多个室调节热和冷气体流动以减少压力变动。本发明的再一个目的是在反应室之前使用一个混和室以达到均一温度流入反应室。本发明的另一个目的是提供了一种装置，其可将生物学样品进行快速热循环，使用一或多种气体在高于或等于l.3巴的压力下进行。本发明的另一个目的是提供了一种装置，其可以将生物学样品进行快速热循环，其中使用加压的空气、氦、二氧化碳、氮、氩、或这些气体的混合物作为气相传热介质。加热和冷却不需要使用相同的气体或气体混合物。本发明的再一目的是提供了一种装置，其可以将生物学样品进行快速热循环，其中DNA变性、引物退火和延伸的时间参数以一秒钟的分数为时程进行编程。最后，本发明的一个目的是提供了一种装置，其中使用物理性分离的气体加热室、冷却室和反应室。参考如下图表，描述和所附权利要求可以更好地了解本发明的这些及其它特点、方面和优势。附图简述为了更好地理解本发明的上述及其它优势和目的，通过参考在附图中例证的特异性实施方案可以清楚上文简要描述的本发明的更详细的描述。应理解这些附图仅仅是本发明的一个典型的实施方案，并因此不认为限制本发明的范围。本发明通过附图得以描述和阐述额外的特征和详情。图1是气体热导率的表，热导率的单位(k-值)以瓦/米-℃表示。图2a是对比干热热循环仪与加压气体热循环仪的示意图。图2b是对比干热热循环仪与加压气体喷射式热循环仪的性质的表。图3a是本发明的一个扩增DNA的装置的实施方案透视图。图3b是反应室38、流动调节器30和34及热电偶44、46、48和50的透视图。图3c是图3a的反应室38中使用的流动调节器图示。图3d示出图3c中示出的流动调节器的计算机流体动力学网图。图3e示出图3a所示反应室38的透视图。图4示出不同类型热循环仪的温度对时间图。注意加压气体热循环仪比干热热循环仪快～10倍，比常规的热模块热循环仪快～100倍。图5a是凝胶电泳图，示出4种不同的DNA模板的高速气体喷射式PCR扩增，包括(a)一个91bp的大肠杆菌(E.coli)O157H7Stx2扩增子，(b)一个333bp的噬菌体λ“D”基因片段，(c)一个364bp的人血小板抗原HPA-4等位基因片段，及(d)一个人β-球蛋白536bp基因片段。图5b是图5a所示4种DNA片段的气体喷射式扩增的温度对时间图。图6是凝胶电泳图，示出使用2.8巴加压的空气及用2.9巴CO2冷却，对85bp的大肠杆菌O157H7StxDNA片段进行高速气体喷射式PCR扩增的反应产物。图7a是凝胶电泳图，示出通过30次高速PCR循环在85秒(泳道a)、81秒(泳道b)或78秒(泳道c)内对85bp的大肠杆菌O157H7StxDNA扩增子的He/CO2气体喷射式PCR扩增。图7b是图7a(泳道c)所示实验的温度对时间图。这个实验代表了已经进行的最快的DNA扩增实验。图8a是凝胶电泳图，示出来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的一个368bp的DNA片段的高速气体喷射式PCR扩增的反应产物。图8b是图8a(泳道e)所示368bp的炭疽芽孢杆菌DNA片段的PCR气体喷射式扩增的温度对时间图。30次高速PCR循环的总时间是233秒。图9a是凝胶电泳图，示出如下片段的高速气体喷射式PCR扩增(a)191bp的人急性间歇性卟啉病(AIP)扩增子，(b)147bp人ABO血型“A-转移酶”基因片段，(c)486bp的大肠杆菌uidA基因片段，(d)297bp的大肠杆菌uidA基因片段，(e)145bp的大肠杆菌uidA基因片段。图9b是用于扩增图9a所示147bp的人ABO血型A-转移酶基因片段的气体喷射式PCR反应的温度对时间图。35次PCR循环在228秒内进行。图10a是凝胶电泳图，示出外部486bp及内部嵌套的186bp的大肠杆菌uidADNA片段的嵌套式PCR扩增。图10b是示出图10a所示嵌套的PCR实验中使用的DNA序列和引物位置。图11a是凝胶电泳图，示出来自噬菌体λ的一个长度为2206bp的DNA片段的气体喷射式PCR扩增。图11b是凝胶电泳图，示出来自噬菌体λ的一个长度为2331bp的DNA片段的气体喷射式PCR扩增。图12a是凝胶电泳图，示出来自大肠杆菌uidA(β-葡糖醛酸酶)基因的一个长度为297bp的DNA片段的气体喷射式PCR扩增。图12b是用于扩增来自大肠杆菌uidA(β-葡糖醛酸酶)基因的一个长度为297bp的DNA片段的气体喷射式PCR的温度对时间图。图13是使用加压气体喷射式热循环仪进行高速PCR实验的概括表。图14是本发明所用专业术语表。发明详述本发明以其优选的实施方案加以描述。这不意味着本发明限于所述实施方案。应理解本发明覆盖了如使用两通或三通阀的所有修改和变化，这些可包括在本发明的精神和范围内。这种加压气体热循环仪的5个重要特征是(1)其在78秒内对85碱基对(bp)的DNA片段进行30次高速PCR扩增循环。较长的(145-2331bp)病毒和细菌DNA片段在大约2-10分钟内扩增～108倍(图5-12)。(2)在加压气体喷射式热循环仪中DNA扩增期间，用于DNA变性、引物模板退火及酶促延伸的时间间隔可以一秒钟的分数为时程进行编程。(3)DNA扩增的整体速度受生物化学而不是装置加热/冷却时间的限制。特别地，Taq聚合酶延伸的速度(～80个核苷酸/秒，72℃)是限速的。如果更快(＞200nt/秒)，可以发现热稳定的DNA聚合酶，然后30次PCR循环在少于30秒的热循环时间是可能的。(4)高速加压的气体PCR通常比较慢的方法更准确，可能是因为错误反应产物很少有时间退火和/或延伸。(5)加压的气体喷射式热循环仪与现有的基于荧光染料的DNA检测光学装置兼容。加压的气体喷射式PCR方法和热循环仪应在危及生命的疾病的诊断中特别有益，在这种诊断中速度是必需的。本发明可(已经)熟练进行快速(大约2-10分钟)基于DNA的测试，用于生物医学研究、遗传学、分子医学、农业学、兽医学、法医学及检测生物战制剂中。本发明的一个优选实施方案是一种加压的气体热循环仪，其在快速(＜20msec/循环)电控阀、接受数字和/或模拟信号的制动器和一个微处理器控制器的控制下，通过将热或冷的气体注入恒温反应室中进行DNA的高速PCR扩增。理想地，这个装置含有最少量运动部件并还与用于检测荧光染料标记的DNA光学装置兼容(Higuchietal.，1992；Haugland，1996；Spearsetal.，1997)。应意识到在这个实施方案中，温度可以通过使用电子可编程的“热气体”和“冷气体”阀门在电子控制下将热和冷的加压气体注入反应室而快速改变。反应室中的压力利用机械安全阀保持在相对恒定值，但温度可以根据需要而改变。将反应样品(体积10-25μl)密封在Wittwer和Garling(1991)所述薄壁玻璃毛细管中，或者密封在Tret′yakovetal.(1994)所述相似薄壁塑料管中。因此，尽管反应室内部的压力随着气体温度的改变而在1.3-6.0巴(20-90p.s.i.)范围变化，但毛细管内的压力保持不变，接近1.0巴(14.7p.s.i.)。加压的气体热循环仪与干热热循环仪(Wittwer等的美国专利No.5,455,175)在几个重要方面有所不同，如图2所示。在干热热循环仪中(图2a)，使用具有加热灯的单个反应室用于加热空气并进行PCR反应(加热室＝反应室)。在加压的气体热循环仪中(图2b)，使用最多6个单独的室一个加热室，一个冷却气体供应室，一个热气体流动调节器，一个冷气体流动调节器，一个混和室，及一个反应室。为了加热反应室中的样品，将来自加热室的预热气体(≥95℃)在一定压力下通过电控阀VH(热气体阀门28)经过热气体流动调节器及混和室输送至反应室。为了冷却反应室中的样品，将冷气体(≤20℃)在一定压力下通过电控阀VC(冷气体阀门36)经过冷气体装置和混合室输送至反应室。机械安全阀VR(图3a中40)可以使得加压气体从反应室中排出。通过从排出气流回收热量，以及当电控阀VH设定为绕过(by-pass)流动调节器时自电控阀VH回收热量，可提高效率。参考附图，其中相同的结构用相同的参考号来表示。加压的气体热循环仪、流动调节器及其反应室的示意图示于图3a，3b，3c，3d和3e。加压气体热循环仪的构成和优化如图3a所示，热循环装置10包括一个绝缘(低k)材料的反应室，一般称作38。优选地，反应室38的k值小于0.5瓦/厘米-度K。反应室38可以由许多不同材料如不锈钢或钛构成。具有陶瓷接头的聚氨基甲酸酯或聚酰亚胺塑料，商品名为VESPEL，TORLON和BUTTERBOARD(由GoldenWestofCalifornia生产)，也可以用作反应室38材料。冷气体供应室14与反应室38之间有一个压力调节装置16、一个单向阀18(得自LinweldofLincoln，NE)及一个双通电控阀34(由PeterPaulElectronicsofNewBritain，CT生产的38VDC阀门)，其由控制器42操纵的一个数字继电器制动。控制器42可以是一个多功能数据板，如KeithleyofCleveland，OH生产的KPCI-3107。热气体供应室12与预热器20通过一个压力调节装置16和一个单向阀18连接。预热器20是一个热交换器，其冷却来自反应室38的废气并加热来自气体供应室12的引入气体。预热的气体从预热器22中排出，然后进入预热器20，再进入过程加热器26(500瓦过程加热器，由HotwattofDanvers，MA生产)。过程加热器26由控制器42操纵的重型继电器制动。热气体从加热器26排出流入三通电控阀28(由控制器42操纵)。当反应室38在冷却时，过程加热器需要气体的持续流动，因此电控阀28将气体排入预热器22并最后到达消声器24(由ExairofCincinnati，OH生产)。当反应室38在加热时，热气体从电控阀28流入流动调节器30。流动调节器30使气流波动被平抑，从而成为更稳地流动的热气体。经调节的热气体然后进入混和室32。来自电控阀36的冷气体也经过流动调节器34流入混合室32。混和的气体然后流入反应室38。反应室38通过机械安全阀40保持在升高的压力下。机械安全阀40的开启压力为1.3巴(20p.s.i.)。从机械安全阀40排出的气体在预热器20中冷却并通过消声器24排出。如图3b所示，电控阀28和36可以根据需要而使用控制器42打开或关闭，基于分别通过热电偶44、46和48测定的混合室32、热气体流动调节器30及冷气体流动调节器34中的温度而进行。通过控制器42使用的热电偶50使过程加热器26保持在恒定温度。如图3e所示，反应室38含有一个椭圆形腔52，其含有密封在薄壁毛细管内的反应样品。这些管通过交叉排列的密封孔54插入。用不同热和冷的供应气体组合测试加压气体热循环仪。加压的空气是可利用的廉价气体，并易于控制。另一方面，加压的氦气是良好的传热气体(图1)，但就热控制而言较困难(参见图7b)。加压气体热循环仪的运转需要三种运行模式，由与阀门以电线相连的致动继电器控制。这三个运行模式是1)加热反应室，(2)冷却反应室，(3)保持反应室的温度。为了提高反应室38的温度，热气体阀门28向流动调节器30打开，以便热的加压气体输送至该室。冷气体阀门36保持关闭。为了降低该室的温度，热气体阀门28向流动调节器30关闭，冷气体阀门36打开。在PCR程序的延伸步骤期间，当温度接近72℃时，冷气体阀门36和热气体阀门28根据需要摆动开放与关闭，基于通过位于混和室32内的热传感器测定的温度而进行。这个阀门结构提供了良好的热控制以将温度保持在预设值。热和冷气体阀门的打开和关闭是由从系统控制器至驱动阀门的电子继电器的电子信号控制的。系统控制软件决定了这些阀门的打开与关闭。当应用不同的“热”或“冷”供应气体时，根据选择的气体混合物利用修改的软件，因为室内的气体流动和混和发生变化。便利的是使用加压的空气或氦气作为“热”气体，使用空气或CO2作为“冷”气体，但也可以应用多种不同的气体。不需要也非最佳使用同样的气体以加热、冷却或保持该室的温度。如图(5a，6，7a，8a，9a，11a，b和12a)所示，可以使用加压的空气(或氦气)作为“热”气体，及加压的“冷”气体(CO2或空气)进行高速气体喷射式DNA扩增。依赖于选择的传热气体、热度梯度的大小和扩增的DNA片段的长度，30次PCR扩增可以在78-617秒内完成。在以下的实施例中，扩增的DNA使用相对慢(～1小时)的程序检测凝胶电泳，随后溴化乙啶(EtBr)染色，这是本领域技术人员已知的标准DNA检测方法。然而，加压气体喷射式PCR与现有的基于荧光的检测(Higuchietal.，1992)兼容，使用染料如SYBRGreen进行，其选择性结合双链DNA(Haugland，1996)。原则上，高速气相PCR的双链DNA反应产物可以使用报道染料如SYBRGreen和廉价的光电二极管检测器迅速检测。例如，加压的气体热循环仪可配有光电二极管检测器及发光二极管(LED)或激光二极管染料激发源。这种光学装置或相等的廉价荧光偏振检测光学装置(Spearsetal.，1997)及荧光素标记的引物使得可以在空前的时间量程上扩增/检测DNA。实施例以下实施例更好地例证了本发明，但无任何限制本发明之意。本领域技术人员意识到使用常规实验对一些不同的参数可以加以改变，这也在本发明范围内。使用三个阀门加压气体热循环仪的高速扩增DNA用压缩空气作为“热”气体(～170℃)及CO2作为“冷”气体(～5℃)在三个阀门的气体喷射式热循环仪中进行最初的高速PCR实验。这个配置不是最快的，但是便利及不需要“冷”气体的主动冷却。实施例1在5分35秒(335秒)内进行30次PCR循环使用加压的空气(214巴＝36p.s.i.)作为“热”气体及加压的CO2(2.6巴＝40p.s.i.)作为“冷”气体在三个阀门的装置中进行气体喷射式DNA扩增实验(图3a)。将不同长度的4个模型DNA模板在单独的10μl反应中PCR扩增，在薄壁的玻璃毛细管中进行(a)一个91bp大肠杆菌O157H7Stx扩增子，(b)一个333bpλ“D”基因扩增子，(c)一个364bp人血小板抗原HPA-4扩增子，及(d)一个人β-球蛋白536bp扩增子，使用加压的空气为热气体及CO2冷却，使用30次循环进行扩增。气体喷射式PCR反应(10μl)在薄壁玻璃毛细管中进行，管中含有50mMTris(pH8.5，25℃)，250μg/mlBSA，3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，50pmol正向和反向引物，20pg模板DNA，及5UTaq聚合酶(Promega，Madison，WI)。在扩增后，将反应产物在用EtBr染色的3％MetaPhor琼脂糖凝胶上分离。分子量标记是长度为67-501bp(pUC19/MspIDNA片段)。如图5a所示，所有4个扩增子使用加压气体喷射式PCR均高产量扩增。从100pg的DNA开始，使用2.5UTaqPol在15μl反应体积中，30次PCR循环在335秒内进行。将期望的536bp的β-球蛋白基因，364bpHPA-4等位基因，333bp噬菌体λ“D”基因及91bp大肠杆菌O157H7Stx2扩增子通过30次循环扩增。在所有4个反应中均观测到低背景的非特异性扩增产物。在λ“D”基因扩增子的情况中，还观测到非常高的产量(泳道b)。这个335秒的气相PCR实验的温度对时间图示出性能与任何先前报道的热循环仪或热循环方法相比显著改善(图4和5b)。实施例2软件改进(Refinements)，在2分48秒(168秒)内30次PCR循环所述三个阀门的装置是一种功能性热循环仪。其不仅非常快速，而且还呈现良好的热度控制(±1℃)。然而，该装置的性能受其以BASIC代码编成的软件的限制。每次均需要执行应答反应室或过程加热器内热度变化的命令，需要从BASIC(解释程序)翻译为汇编码(汇编程序)。由于这个软件的限制，浪费了一些时间(～1秒/循环)。特别地，在30次气相PCR扩增循环期间，非生产性浪费超过30秒以上的时间(＞1秒/循环)。因此，以汇编码重写系统控制软件以更快运行。这个修改产生更快速的气体喷射式PCR。在Taq聚合酶延伸速度≥80nt/秒时，期望在A-E+E-D过渡期间花费的～1秒/循环(图4a)足以使用一个30-merPCR引物复制一个短的85bp的DNA模板(Tm～65℃)。因此，用加压的空气加热/CO2冷却，使用相对短(85bp)的大肠杆菌O157H7志贺毒素(Shigatoxin)基因(Stx)扩增子进行实验。用2.4巴(36p.s.i.)加压空气和2.6巴(～40p.s.i.)CO2冷却，在含有50mMTris(pH8.5，25℃)，250μg/mlBSA，3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，50pmol正向和反向引物，20pg模板大肠杆菌O157H7DNA及5UTaq聚合酶(Promega)的薄壁玻璃毛细管中进行气体喷射式PCR反应(10μl)。在扩增30次循环后，将DNA片段在3％MetaPhorTM琼脂糖上分离，随后EtBr染色。分子量标记是长度为67-501bp的pUC19/MspI消化物。图6示出一个短的85bp的大肠杆菌O157H7Stx扩增子可以通过30次PCR循环在＜2分钟的时间内高产量扩增，通过以汇编码改写工具命令达到性能的显著改善。基于氦气的高导热系数(Ubbink，1947；Bosworth，1952；图1)，推测如果使用氦气而不是空气作为“热”气体，可以使热循环更快。实施例3在1分18秒(78秒)内进行30次PCR循环将一个大肠杆菌O157H7Stx基因的小的(85bp)扩增子使用“热”加压的氦气及用CO2冷却进行PCR扩增。为进一步减少热循环时间，将引物长度增加至30nt，以便可以应用更高的退火温度(62℃-63℃)。另外，DNA变性温度与先前的实验中所用的温度相比略低(86℃-89℃)。应用三个不同的高速气相热循环方案(a)；(b)；及(c)。在薄壁玻璃毛细管中进行PCR反应(10μl)，毛细管中含有50mMTris(pH8.525℃)，250μg/mlBSA，3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，50pmol正向和反向引物，20pg大肠杆菌O157H7DNA，及5U的Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)。在30次；(b)；及(c)循环后，将反应产物在3％琼脂糖凝胶上分离，用EtBr染色。分子量标记为长度67-501bp(pUC19/MspI消化物)。如图7a所示，在所有三个氦/CO2气体喷射式PCR反应中，均见到高产量的预期85bpStx扩增子。图7a和7b示出了从未进行过的三个最快的DNA扩增反应。预期的85bp大肠杆菌O157H7Stx扩增子在所有三个反应中均扩增(a)1:25＝85秒；(b)1:21＝81秒；(c)1:18＝78秒。这个实验还示出当使用加压氦气而非空气时，热循环更快。高速气体喷射式PCR还产生非常低的非特异性“模糊”或假反应产物的背景。推测当使用这样快速的热循环参数时，假产物的引发或延伸是罕见的，因为简直没有时间积聚假反应产物。高速气体喷射式PCR热循环仪的进一步改进导致充分改善的软件、热度控制、气体工作压力的优化、噪音降低及从多种来源中扩增不同长度DNA片段的能力。其中这些改善得以执行的高速PCR实验的实例示于实施例4-7，如下所述。实施例4368bp的炭疽芽孢杆菌DNA片段的PCR扩增30次PCR循环＜4分钟(233秒)快速扩增危及生命的细菌病原体如炭疽芽孢杆菌(一种生物战制剂)的DNA的能力是非常重要的(Franzetal.，1997)。如图8a和8b所示，使用167℃2.9巴(44p.s.i.)的加压氦气及用3.0巴(45p.s.i.)的CO2气体冷却，对炭疽芽孢杆菌(一种生物战制剂)的一个368bpDNA片段进行高速气体喷射式PCR扩增。由USArmyMedicalResearchInstituteforInfectiousDiseases(USAMRIID)提供的炭疽芽孢杆菌Steme菌株DNA用作模板，使用引物BAN23MS1和BAN23MA1(21-mers)进行PCR气体喷射式扩增。使用24μl反应物进行30次PCR循环，所述反应物含有10pgDNA，1μM引物，5.5mMMgCl2，100mMdNTPs，500μg/mlBSA及1.25U的Taq聚合酶。将炭疽芽孢杆菌Sterne菌株DNA(10pg)与25pmol正向引物(BAN23MSl)和反向引物(BAN23MAl)加上200μMdNTPs于含有1.25单位的TaqPol(50mMTris-Cl，5.5mMMgCl2，pH8.8，500μg/mlBSA)的24μl反应体积中混和。在Model1.62Heliac加压气体热循环仪中进行高速PCR，其被编程为间隔100毫秒，随后在2％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙啶染色。样品如下[a]100bp梯度分子量标记，[b]使用2.6巴(38p.s.i.)热压缩的空气及用(3.0巴)CO2冷却进行30次PCR循环(0秒92℃，0秒55℃，4.0秒72℃)，[c]使用热氦气(2.9巴)及用3.0巴CO2冷却进行30次PCR循环(0秒92℃，0秒55℃，4.0秒72℃)，[d]使用2.9巴热氦气及用3.0巴CO2冷却进行30次PCR循环(0秒92℃，0秒55℃，3.6秒72℃)，[e]使用2.9巴热氦气及用3.0巴CO2冷却进行30次PCR循环(0秒92℃，0秒55℃，3.2秒72℃)。将PCR扩增的DNA加样于2％琼脂糖凝胶上，随后在80V电泳45分钟。30次高速PCR循环的总时间为[b]4分钟28秒，[c]4分钟20秒，[d]4分钟10秒，[e]3分钟53秒。如图8a(泳道e)所示，30次高速气体喷射式热循环导致预期的368bp的片段在少如3分钟53秒(233秒)的时间内扩增～108倍。图8b示出伴随的温度对时间图。反应产量可如下计算用10pg的炭疽芽孢杆菌DNA开始，形成大约100ng的368bp反应产物(图8a)。由于炭疽芽孢杆菌的基因组含有～5.0×106个碱基对，而且368bpDNA片段仅代表该细菌染色体的一小部分，因此可计算最初的10pg细菌DNA含有～[368/(5.0×106)×10-11g]＝0.74×10-15g的368bp扩增子。这个0.74×10-15g(＝0.74毫微微克)的模板DNA扩增为～100ng的368bp反应产物。因此，使用30次PCR循环获得(1.00×10-7g)/(0.74×10-15g)＝1.35×108倍的扩增倍数。如果聚合酶链反应是100％有效的，则预期在每次PCR循环后DNA的量倍增。理论上，在30次DNA倍增循环后，达到230＝1.07×109倍扩增。在本发明实验中，在30次高速PCR循环后观测到1.35×108倍扩增。其可以计算为1.86630＝1.34×108。因此，每次PCR循环导致细菌DNA扩增1.866倍，相应于效率为1.866-1＝0.866。换句话说，每次高速PCR循环是～86.6％有效的。这个实验表明在大约＜4分钟的时间内，从大约10pg的DNA开始，从特殊病原体如炭疽芽孢杆菌中扩增DNA片段是可能的。实施例5对长度为145-486bp的大肠杆菌和人DNA进行PCR扩增在2.4-4.1分钟(144-247秒)内进行30-35次PCR循环进行额外的实验以论证高速气体喷射式热循环仪的速度和多功能性。例如将长度为145-486bp的细菌基因片段和长度为147-191bp的单拷贝人基因片段在～2.4-4.1分钟(144-247秒)内使用20pgDNA，1μM引物，4.5-5.5mMMgCl2，100mMdNTPs，500μg/mlBSA及1.25U的TaqPol通过30-35次PCR循环扩增。图9a示出了从造成人急性间歇性卟啉病的基因(191bp)、ABO血型A转移酶基因片段(147bp)、大肠杆菌uidA基因片段(486bp)、大肠杆菌uidA基因片段(297bp)及大肠杆菌uidA基因片段(145bp)中扩增的DNA的图片。如图9a(泳道a)的温度对时间图所示(图9b)，当使用2.6巴(42p.s.i.)的加压空气作为热气体及用2.8巴(46p.s.i.)CO2气体冷却时，可以进行极佳的热度控制。实施例6486/186bp大肠杆菌uidADNA片段的嵌套PCR扩增在4.8分钟(285秒)内进行40次PCR循环当应用“嵌套PCR”方案时，可以进行更敏感的DNA扩增。特别地，Ruzickaetal.(1992)描述了一种嵌套PCR方法，其中首先在～20次PCR循环中使用一对退火温度为45-55℃的外部引物(outerprimer)；随后从一组退火温度＞60℃的内部(嵌套)引物(innerprimer)中扩增(图10b)。以这种方式可以在一个密闭的反应容器中进行外部/内部PCR的两个阶段。使用Jucketal.(1996)的引物，一个外部486bp和内部186bp的大肠杆菌uidADNA片段的嵌套PCR扩增使用如下方式进行(1)20次[200毫秒88℃，200毫秒56℃，2.8秒72℃]循环，随后(2)20次[200毫秒88℃，200毫秒65℃，1.8-2.0秒72℃]循环。第一个20次循环使得所有4个寡核苷酸引物在许可的56℃的退火温度退火，使用相对长的2.8秒TaqPol延伸时间。第二个20次循环由于较高的65℃退火温度和较短的1.8-2.0秒延伸步骤而选择性扩增内部186bpDNA片段。如图10a所示，在薄壁玻璃毛细管中进行PCR反应(15μl)，所述毛细管中含有50mMTris(pH8.5，25℃)，250μg/mlBSA，3mMMgCl2，0.2mMdNTPs，50pmol正向和反向引物，4.5pg大肠杆菌K12DNA及1.5U的Z-TaqPol(TakaraShuzoLtd)。在20次(a)[100毫秒89℃/100毫秒65℃/2.5秒72℃]循环及然后20次[100毫秒90℃/100毫秒61℃/1.8秒72℃]循环之后，将反应产物在2.0％MetaPhor琼脂糖凝胶上分离，用EtBr染色。分子量标记为pUC19/MspI消化片段。在泳道(a)和(b)中预期的186bpuidA扩增子仅在190bp分子量标记以下运行。40次高速PCR循环的总时间为4分钟45秒(285秒)。如图10a(泳道a)所示，从1pg的大肠杆菌0157H7DNA开始，当第二个20次循环是[200毫秒88℃，200毫秒65℃，2.0秒72℃]时，预期的186bp内部扩增子可以通过40次两步嵌套PCR循环在少于5分钟内扩增。如图10a(泳道b)所示，如果应用较短的1.8秒/循环TaqPol延伸步骤，40次嵌套PCR循环在4分钟45秒内完成(40次PCR循环总时间＝285秒)。扩增倍数可如下计算大肠杆菌基因组含有～4.5×106bp。186bp的大肠杆菌DNA片段代表(1.86×102/4.5×106)＝4.1×10-5细菌基因组。最初1pg(10-12g)的细菌DNA扩增为～50ng(5×10-8g)数量(图10a)。因此，186bp大肠杆菌uidADNA片段在共285秒的嵌套PCR中扩增(1/4.1×10-5)×(5×10-8/10-12)＝1.2×1011倍。实施例7长度为2206-2331bp的噬菌体λDNA的PCR扩增在10.3分钟(617秒)内进行30次PCR图11a示出一个2206bp噬菌体λDNA片段的图，其用20pgDNA，1μM引物，4.5mMMgCl2，100mMdNTPs，500μg/mlBSA及1.5U的Z-TaqPol(TakaraShuzoLtd)及30次[800毫秒89-91℃，800毫秒61℃，13秒72℃]循环，在气体喷射式热循环仪中使用2.6巴(42p.s.i.)压缩空气(来自气动工具用压缩机)和2.8巴(46p.s.i.)CO2冷却进行扩增。泳道(a)示出预期的2206bp反应产物，使用变性温度为91℃(总PCR时间＝10分钟49秒)。泳道(b)示出2206bp反应产物，使用变性温度为90℃(总PCR时间＝10分钟28秒)。泳道(c)示出2206bp反应产物，使用变性温度为89℃(30次PCR循环总时间为10分3秒＝603秒)。分子量标记是噬菌体λHindIII消化片段。图11b示出一个2331bp的噬菌体λDNA片段的图，其使用20pgDNA，1μM引物，4.5mMMgCl2，100mMdNTPs，500μg/mlBSA及1.5UZ-TaqPol(TakaraShuzoLtd)及30次[500毫秒91℃，500毫秒61℃，11-14秒72℃]循环，在气体喷射式热循环仪中使用2.6巴(42p.s.i.)压缩空气(来自气动工具用压缩机)和2.8巴(46p.s.i.)CO2冷却进行扩增。泳道(a)-(d)示出预期的2331bp反应产物，使用的延伸时间为(a)14秒72℃(总PCR时间＝10分钟50秒)；(b)13秒72℃(总PCR时间＝10分钟17秒)；(c)12秒72℃(总PCR时间＝9分钟42秒)；(d)11秒72℃(总PCR时间＝9分钟8秒)。当应用的延伸时间＞12秒时，反应产量明显较高，如泳道(a)和(b)所示。这个结果表明就长度为2206-2331bp的噬菌体λDNA片段而言，Z-TaqPol延伸速度显然≥194nt/秒。图11a和11b表明长度为2206-2331bp的DNA片段使用加压气体喷射式热循环仪以高产量成功扩增。图13示出使用本发明的应用三个阀门的气体喷射式热循环仪的一个实施方案进行高速DNA扩增的概述。实施例8在两阀气体喷射式热循环仪中对大肠杆菌uidADNA片段的PCR扩增图13示出一个297bp的大肠杆菌uidADNA片段的图，其使用1ngDNA，150pM引物，3mMMgSO4，200μMdNTP，400μg/mlBSA及0.625UKOD热起始聚合酶进行扩增。泳道1是35次[30秒90℃(热起始)，0秒90℃；0.2秒58℃；2秒72℃]循环，泳道2是40次[30秒90℃(热起始)，0秒90℃；0.2秒58℃；2秒72℃]循环，泳道3是30次[30秒90℃(热起始)，0秒90℃；0.2秒58℃；2秒72℃]循环，在两阀气体喷射式热循环仪中使用2.4巴(35p.s.i.)压缩空气进行。将25μl的样品置于Roche玻璃毛细管中。这个结果表明高速气体喷射式PCR可以在适于现有的基于荧光的DNA检测的反应容器中进行。另外，使用2-阶段流动调节器和CFD优化室几何学可以达到良好的热度控制(±0.7℃)。本发明的一些主要优势如下首先，本发明将使用聚合酶链反应扩增DNA所需要的时间与使用任何先前描述的方法或装置相比减少了一至两个数量级(见图12)。其次，气体喷射式方法比较慢的程序更准确，因为假反应产物实际上没有时间退火和/或延伸(见图5a，6，7a，8a，9a，11a和11b)。第三，加压气体喷射式热循环仪(图3a)与热模块或干热装置相比具有良好的时间控制；气体喷射式装置可编程为时间间隔100毫秒。第四，高速气体喷射式PCR是一种非常可靠的方法。除了电动机械继电器和阀门之外，不应用运动部件。第五，高速气体喷射式PCR方法与现有的检测光学装置完全兼容，由此可以进行及时的DNA扩增/检测。本发明因此可以在空前的时间量程上完成快速、准确及可靠的DNA扩增/检测。与“超速”PCR热循环仪对比由LawrenceLivermoreNationalLaboratory(Northrupetal.，1998)，UniversityofPittsburgh(Odaetal.，1998)，UniversityofWashington(Friedman和Meldrum，1998)和MassachusettsInstituteofTechnology(Chiouetal.，2001)建立的最快的实验性热循环仪进行30次PCR循环需要8.5-23分钟。例如，Odaetal.(1998)描述了“超速PCR”，其中“循环时间可以达到快如17秒”。不幸地，Oda等使用的红外线加热方法与使用＞450nm染料的荧光检测装置和光电二极管检测器不兼容。Chiouetal.(2001)阐述了“进行30次PCR循环，其导致来自基因组λDNA的一个500bp的靶片段在23分钟内30次PCR循环达到78％效率”(p.2021)。这个效率的30次PCR循环产生1.5630＝6.2×105倍扩增，速度为23分钟/30次循环＝46秒/次循环。图3a所示的加压气体装置需要少于2.6秒/循环，反应产量增加超过200倍(见图5a，6，7a，8a，9a，11a和11b)。例如，如图8a所示，一个长度为368bp的单拷贝细菌基因片段在总共233秒的时间内通过30次PCR循环扩增1.35×108倍。Koppetal.(1998)描述了一种微型的持续流动PCR装置，其能在3-4分钟内通过20次循环扩增一个176bpDNA片段。然而，需要～108拷贝的模板DNA作为起始物(Zorbas，1999)。根据Koppetal.(1998)的数据推断30次PCR扩增循环需要4.5-6分钟，扩增的DNA的产量比使用加压气体装置获得的产量低103-104倍，如图3a所示。与现有的商业装置对比最快的可商购的热循环仪由RocheModularSystems的Boehringer-MannheimDivision(Roche的一个公司)在IdahoTechnology(美国专利No.5,455,175，专利权人Wittweretal.)许可下生产。这个干热热循环仪需要大约9.5分钟对536碱基对的β-球蛋白DNA片段进行30次扩增循环。然而，具有现有检测光学装置的LightcyclerTM需要～30分钟进行30次PCR循环。如图7a和7b所示，可使用一种加压气体PCR方法以在少如78秒的时间内将DNA扩增至可检测数量。因此这个高速加压气体喷射式方法比Roche机器快＞15倍，并与现有的基于荧光染料的DNA检测光学装置兼容。较高产量的扩增(＞108倍)可使用较长的延伸时间(3.2秒/循环72℃)获得。例如，使用一个368bp的炭疽芽孢杆菌扩增子，30次PCR循环在少于4分钟的时间内完成(图8a和8b)。较短的(145-486bp)细菌DNA片段在144-280秒内扩增～108倍(图5a，9a和12)。上文阐述了本发明的一般性描述以及优选的实施方案。本领域技术人员意识到并能在本发明教导的范围内描述的方法和装置中加以额外的改变。因此，认为所有这种修改和添加均在本发明的范围内，本发明仅仅受到所附权利要求书的限制。引用的参考文献美国专利文献1,952,281x/1934Ranque.4,683,2027/1987Mullis.5,187,0842/1993Hallsby.5,455,17510/1995Wittweretal..5,576,21811/1996Zureketal5,779,9777/1998Haffetal..5,783,4397/1998Reichleretal..6,200,7813/2001Taletal..其它出版物Anderson，JD，Jr.(1995)ComputationalFluidDynamicsTheBasicswithApplications，McGraw-Hill，Inc.，NewYork.AzbelD(1984)FundamentalsofHeatTransferforProcessEngineering，NoyesPublications，ParkRidge，NewJersey，pp.12-20.BosworthRCL(1952)HeatTransferPhenomenatheFlowofHeatinPhysicalSystems，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，ChapterII，″TheThermalConductivityofGases.″ChapmanAJ(1984)HeatTransfer，FourthEdition，TheMacmillanCompany，NewYork.ChiouJ，MatsudairaP，SoninA，andEhrlichD(2001)“AClosed-cycleCapillaryPolymeraseChainReactionMachine.”Anal.Chem.732018-2021.ErlichHA，ed.(1989)PCRTechnologyPrinciplesandApplicationsforDNAAmpli-fication，StocktonPress，NewYork.FourierJBJ(1822)ThéorieAnalytiquedelaChaleur，FerminDidot，Paris.TranslatedbyA.Freeman(1988)asTheAnalyticalTheoryofHeat，DoverPaperbackBooks，NewYork.FriedmanNAandMeldrumDR(1998)“Capillarytuberesistivethermalcycling.”Anal.Chem.702997-3002.FranzDR，JahrlingPB，FriedlanderAM，McClainDJ，HooverDL，BryneRW，PavlinJA，ChristopherGW，andEitzenEE(1997)“ClinicalRecognitionandManagementofPatientsExposedtoBiologicalWarfareAgents.”J.Am.Med.Assoc.278399-411.GelfandDHandWhiteTJ(1990)“ThermostableDNAPolymerases.”InMAInnis，DHGelfand，JJSninsky，andTJWhite，eds.，PCRPrtocolsaGuidetoMethodsandApplications，AcademicPress，Inc.，SanDiego.HauglandRP(1996)“NucleicAcidStains，”inHandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，SixthEdition，MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR，pp.144-150.HiguchiR，DollingerG，WalshSP，andGriffithR(1992)“SimultaneousamplificationanddetectionofspecificDNAsequences.”Bio/Technology10413-417.HilschR(1947)“TheUseoftheExpansionofGasesinaCentrifugalFieldasCoolingProcess.”Ann.Rev.ScientificInstruments18(2)108-113.IdahoTechnology，Inc.(1995)TheRapidCyclist3(1)16，IdahoFalls，Idaho.Innis，MA，MyamboKB，GelfandDH，andBrowMAD(1988)″DNAsequencingwithThermusaquaticusDNApolymeraseanddirectsequencingofpolymerasechain-reactionamplifiedDNA.″Proc.Nat.Acad.SciencesUSA859436-9440.JohnsonB(1998)“TheCompetitionHeatsUp.Theannualreviewofthermalcyclerstakesasneakpeakatthenewproductsfor1998.”TheScientist，12(24)“ThermalBlockTable.”JohnstonHLandGrillyER(1946)“Thethermalconductivitiesofeightcommongasesbetween80°and380°K，”J.Chem.Physics14233-238.JuckD，IngramJ，PrévostM，CoallierJ，andGreerC(1996)“NestedPCRprotocolfortherapiddetectionofEscherichiacoliinpotablewater.”Can.J.Microbiol.42862-866.KerrebrockJL(1969)AircraftEnginesandTurbines，MITPress，Cambridge，MA.KoganSC，DohertyM，andGitschierJ(1987)″AnimprovedmethodforprenataldiagnosisofgeneticdiseasesbyanalysisofamplifiedDNAsequences.″NewEnglandJ.Med.317985-990.KoppMU，MelloAJ，andManzA(1998)“Chemicalamplificationcontinuous-flowPCRonachip.″Science2801046-1048.MullisK，FerréF，andGibbsRA，eds.(1994)ThePolymeraseChainReaction，Birkhauser，Boston.NavierCLMH(1856)ResumédesLeconsd’analysedonnéesa″1EcolePolytechnique，SuividenotesparM.J.Liouville，DeuxiemeéditionrevueparM.EmestLiouville，VictorDalmont，Paris.NewtonCR(1995)“PCRInstruments,”InCRNewton，EssentialPCRData，JohnWiley&Sons，Chichester，England，pp.12-23.NicollS，BrassA，andCubieHA(2001)“Detectionofherp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阀，其位于加热室和热气体流动调节器之间；(g)一个冷却气体进气阀，其位于第二容器和冷却气体流动调节器之间；(h)一个可编程控制器，其具有多个输入和输出端，其中输出端与加热气体进气阀和冷却气体进气阀连接以控制阀门的开放和关闭；以及一个与反应室相连接的第一温度传感器，所述第一温度传感器与可编程控制器的输入端连接，从而控制器应答温度传感器而开放和关闭加热气体进气阀和冷却气体进气阀，以保持反应室的温度在所需的设定值。22.权利要求21的装置，其中第一种传热气体的压力高于或等于1.3巴。23.权利要求21的装置，其中第一种传热气体是空气。24.权利要求21的装置，其中第一种传热气体和第二种传热气体是相同种类的气体。25.权利要求21的装置，其中第一种传热气体和第二种传热气体是不同的气体。26.权利要求21的装置，其中第一种传热气体是氦，第二种传热气体是二氧化碳。27.权利要求21的装置，其中第一种传热气体是空气，第二种传热气体是二氧化碳。28.权利要求21的装置，其中第一种传热气体是空气，第二种传热气体是使用Ranque-Hilsch涡流管冷却的空气。29.权利要求21的装置，其进一步包含与混合室连接的一个流动调节器以混合热气体和冷气体。30.权利要求21的装置，其进一步包含至少一个电控阀以控制压力和流入反应室的气体。31.权利要求21的装置，其进一步包含一个噪音消声器，其可操纵地与废气出口连接。32.权利要求21的装置，其中可编程控制器的至少一个输出端与加热室的加热元件连接以启动和关闭加热元件。33.权利要求21的装置，其中反应室的传热系数低于0.5瓦/厘米-度K。34.权利要求21的装置，其中反应室包含聚氨酯塑料。35.权利要求21的装置，其包含光学检测装置以便于进行基于荧光的DNA检测。36.权利要求35的装置，其中光学检测装置包含一个发光二极管、一个准直透镜、一个滤光器和一个光电二极管。37.权利要求35的装置，其中光学检测装置包含一个激光二极管、一个准直透镜、一个滤光器和一个光电二极管。38.一种高速扩增DNA的方法，包括(a)提供一个反应室，其含有具有DNA的生物学样品、DNA聚合酶、寡核苷酸引物及脱氧核苷酸前体，该反应室具有一压力；(b)加热与反应室物理性分离的加热室中的氦气；(c)将加热的氦气输送至反应室，其中热从氦气传递至DNA以使该DNA变性；(d)将冷却气体输送至反应室以将反应室冷却至变性的DNA与寡核苷酸引物退火的温度；及(e)将反应室的温度升高至足以使引物模板复合物延伸的温度。39.权利要求38的方法，其中冷却气体是二氧化碳。40.权利要求38的方法，其中第二种传热气体是空气，其在输送至反应室之前已经通过Ranque-Hilsch涡流管冷却至低于20℃的温度。全文摘要本发明揭示了使用计算机控制的多通阀将加压的气体高速输送至自动调温反应室以对样品进行快速精确且可靠的气体喷射式热循环的方法和装置。本发明还揭示了实现这些方法的装置。文档编号C07H21/04GK1720333SQ02830133公开日2006年1月11日申请日期2002年11月1日优先权日2002年11月1日发明者斯科特·E.·惠特尼,R.·迈克尔·纳尔逊,安德烈·昆塔纳尔,亨德里克·J.·维尔容,尼莎·V.·帕德海申请人:美格贝斯科研制品公司