专利名称：一种高效用于纯化重组人干扰素-α单抗亲和层析柱的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及抗重组人干扰素α型单克隆抗体细胞株建立，利用单抗与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备亲和层析柱，用于重组人干扰素α大规模生产。
背景技术：
干扰素是细胞免疫的重要成分，目前广泛应用于病毒性肝炎、肿瘤和一些其他病毒感染的治疗中。干扰素的检测和重组人干扰素的纯化工艺均需要高质量的单克隆抗体，特别是在生产重组人干扰素工艺中，单克隆抗体亲和层析是生产干扰素最重要步骤，制备大剂量干扰素，需要高效单抗亲和层析柱。近几年，国内也研制成功抗人干扰素α型单克隆抗体，用于纯化干扰素的生产〖专利CN1120650A公开的4C1可纯化多种α干扰素〗。由于干扰素α型中不同亚型间存在结构差异，因此利用不同亚型干扰素作抗原制备的抗体性能存在差异。目前临床使用的国产干扰素最大剂量为每支50微克，国外生产的干扰素最大剂量为每支540微克，制约我国生产大剂量干扰素的主要原因是生产工艺，每毫升单抗亲和层析柱洗脱干扰素低，纯化后的干扰素原液蛋白含量低，内毒素含量不易控制，大剂量干扰素成品热原质试验达不到国家药典标准；为此，有必要研制结合率和回收率更高的单抗亲和层析柱。重组人α1b型干扰素是我国第一个生物技术一类新药，它是从中国人调出的基因，与干扰素其它型有大约10％差别；本发明是采用重组人α1b型干扰素为抗原免疫的，成功获得抗重组人干扰素αn型单克隆抗体4G10细胞株，单克隆抗体与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备亲和层析柱，每毫升亲和层析介质可洗脱3毫克干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，连续使用200次，其亲和力仍不下降，残余鼠IgG含量小于100ng/剂量，为我国干扰素生产，特别是大剂量干扰素生产，提供了有力的工具。同时为工业化大规模生产干扰素带来更大的经济效益。
发明内容
本发明采用的免疫抗原为纯化重组人干扰素α1b，免疫动物为6周龄雄性BALB/C小鼠。从中获得40株抗重组人α干扰素的单克隆抗体阳性细胞株。其中4G10分泌抗重组人干扰素α1b、重组人干扰素α2b、重组人干扰素α2a和重组集成干扰素的单克隆抗体细胞系；4G10腹水单克隆抗体效价为81290。体外连续传代6个月，分泌抗体能力稳定，特异性专一；单克隆抗体亚类为IgG1；4G10每毫升腹水含有6.25mgIgG；经辛酸方法提纯单抗腹水，抗体纯度为95％以上，再与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备亲和层析柱，1毫升CNBr-Act-Sepharose 4B凝胶可结合40mg抗体，利用4G10单克隆抗体制备亲和层析柱，用于提纯重组人干扰素α，每毫升亲和层析介质可洗脱3mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上；本发明适于制备重组人干扰素α1b、α2b、α2a和重组集成干扰素，特别是制备大剂量干扰素，使大剂量干扰素制品热原质试验达到中国药典标准。
四具体实施方案1杂交瘤细胞株的建立1.1抗原和动物免疫使用的抗原为纯化重组人干扰素α1b，动物为6周龄雄性BALB/C小鼠，第一次免疫每只动物用100微克抗原加完全佛氏佐剂；一个月后第二次免疫用100微克抗原加不完全佛氏佐剂；两个月后第三次免疫，方法同第二次；三次免疫均为小鼠腹股沟皮下多点注射免疫。融合前三天尾静脉注射100微克抗原加强免疫。
1.2试剂及骨髓瘤细胞株PEG 1480购自Roche；DMEM培养基、胎牛血清、HT、HAT均购自GIBCO；HRF-兔抗鼠购自DAKO；骨髓瘤细胞SP2/0由中国医学科学院基础所细胞室提供。
1.3培养基完全DMEM培养基含10％胎牛血清，100U/ml青链霉素(原浓度1×104U/ml)，0.03％谷氨酰胺(原浓度3％)，4％NaHCO2(原浓度7％)。不完全DMEM培养基为不含牛血清的完全DMEM培养基。
1.4细胞融合、筛选和腹水制备 无菌取脾脏，分散脾细胞，将SP2/0和脾细胞以1∶5～1∶10比例混合后离心。弃上清，于37℃水浴中再加入予温的50％ PEG，然后静置1.5分钟，滴加不完全DMEM培养基，然后500转/分钟离心10分钟，弃上清。加完全DMEM培养基接种在96孔细胞培养板中，共4块板，置含5％二氧化碳/37℃环境培养。第2天换含1％HAT完全DMEM培养基，14天后换1％HT培养基，挑选克隆，检测。抗体阳性细胞经扩增，腹腔接种BALB/C小鼠，14天左右收获腹水。
2抗体的筛选 采用ELISA方法检测细胞上清液、腹水中和抗体滴度，分别用重组人干扰素α1b、重组人干扰素α2b、重组人干扰素α2a和重组集成干扰素作为抗原。
细胞融合、筛选和克隆结果1次细胞融合率为100％，筛选到40个阳性孔。经克隆、扩增细胞，然后接种小鼠产生腹水；用ELISA方法检测腹水中和抗体效价，4G10细胞上清效价为1∶128，腹水单克隆抗体效价为1∶81290。
细胞分泌抗体的稳定性结果4G10单克隆抗体细胞株在细胞瓶内连续传代6个月(50代)以上，同时在BALB/C小鼠体内连续传代6个月(13代)以上，随机抽取了12份细胞培养上清液和腹水样品，测定中和抗体效价，细胞均能够稳定分泌单克隆抗体。将细胞冻存1、3、6、9、11个月后复苏，细胞生长形态和活力正常。经连续传代，细胞所分泌单克隆抗体的中和效价没有大的变化，表明杂交瘤细胞性状稳定。
3抗体特异性鉴定3.1交叉中和试验 用重组人干扰素α1b、重组人干扰素α2b、重组人干扰素α2a、重组集成干扰素为抗原，分别与不同稀释度单克隆抗体37℃作用1小时中和，采用WISH-VSV系统，按微量细胞病毒抑制法进行测定。
结果4G10单克隆抗体可中和重组人干扰素α1b、重组人干扰素α2b、重组人干扰素α2a、重组集成干扰素4种抗原。
3.2 West blot试验将重组人干扰素α1b、重组人干扰素α2b、重组人干扰素α2a、重组集成干扰素样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将蛋白从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维滤膜上，第一抗体为单抗腹水，第二抗体为辣根过氧化酶标记兔抗鼠IgG，底物为二氨基联苯胺显色。
结果4G10分别识别4种重组人干扰素α抗原。
4免疫球蛋白类和亚类的鉴定 采用琼脂双扩散法，将1％的琼脂糖制板(1克琼脂糖溶于0.06M巴比受纳-盐酸-3％聚乙二醇6000，PH7.2)，中央孔分别加10微升抗BALB/C小鼠IgG类或亚类标准血清，周围孔每孔滴加10微升待测样品和标准抗体，37℃湿盒过夜，次日观察结果。以出现明显沉淀线为阳性。
结果用双向琼脂扩散试验证明4G10单抗属IgG1。
5杂交瘤细胞染色体核型分析 生长中的杂交瘤细胞换液24～36小时后，加入终浓度为每毫升含2微克的秋水仙素培养2～4小时，1000转/分钟离心10分钟，用0.75M KCl室温低渗处理30-60分钟，离心弃上清，加10倍量以上甲醇-冰醋酸(3∶1)固定液固定15分钟，同上离心后，加适量固定液，取细胞悬液从高处滴片，迅速吹散细胞，火焰固定1分钟，用蒸馏水将1％Gimsa液稀释10倍后染色，20-30分钟后，洗净、干燥后镜检，染色体计数，照相。
结果每个SP2/0瘤细胞平均有72条染色体，小鼠脾细胞有42条染色体。融合后杂交瘤细胞的染色体大于72或为二者之和，6单克隆抗体纯化采用辛酸——硫酸铵分步沉淀方法提纯，100毫升腹水加3.3毫升的辛酸，边滴加边搅拌，10000转/分钟，4℃，离心30分钟；取其上清液。用10mmol/LpH7.4的PBS 4℃透析过夜。每100毫升加30克硫酸铵，边加边搅拌，10000转/分钟、4℃、离心20分钟；弃上清，将沉淀用生理盐水溶解，10mmol/LpH7.4的PBS，4℃透析24小时，除菌过滤，以备偶联用。
7纯化后单克隆抗体检测7.1单克隆抗体蛋白测定采用Lorrwy法。
单克隆抗体纯化后蛋白含量每毫升4G10腹水含有6.25mgIgG7.2单抗纯度检测 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。
单克隆抗体纯化后纯度鉴定结果采用辛酸—硫酸铵分步沉淀的方法提纯，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，在分子量20.1kd-30kd，43kd-67kd处出现二条蛋白带(重链、轻链)；电泳扫描重链和轻链纯度大于95％。
7.3细菌内毒素，细菌、真菌检查，支原体检查按照《中国生物制品规程》检测。
纯化后的单抗细菌内毒素、细菌、真菌检查，支原体检查结果为阴性。
8抗重组人干扰素α型亲和层析柱的制备以10毫升1mmol/L HCl加入1克CNBr-Act-Sepharose 4B的比例浸泡凝胶，抽洗。用偶联缓冲液(0.1mol/L pH8.3NaHCO3/0.5mol/L NaCl)洗涤凝胶；加入单克隆抗体(浓度24mg/ml)进行偶联，单克隆抗体与凝胶的体积比为2∶1，室温、4小时内不停地摇动；用5个体积的偶联液漂洗，除去剩余的配体；加入0.1mol/L pH8.0甘氨酸封闭活性基团，静止2小时；用含0.5mol/L NaC/l 0.1mol/L pH8.3 NaHCO3洗柱，再用0.1mol/LpH4.0醋酸盐，0.5mol/L NaCl洗柱。此步之前的流出液均收集测抗体蛋白量。用含万分之二NaN3/0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl/0.5mol/L NaCl洗柱，放4℃备用。1毫升CNBr-Act-Sepharose 4B凝胶可结合40mg 4G10单抗，结合率96％以上。
9用单抗亲和层析柱纯化重组人干扰素α9.1大肠杆菌表达的重组人干扰素α1b、α2b、α2a和重组集成干扰素，用盐酸胍裂解、复性，经DEAE离子交换初步纯化后，再用Sepharose-4B偶联的单克隆抗体亲和层析柱纯化。
9.2pH7.0 PBS缓冲液平衡亲和层析柱，将干扰素粗制品用pH7.0 PBS缓冲液稀释成浓度为每毫升1毫克，再上样；上样完成后，用pH7.0 PBS-T20缓冲液冲洗柱子，再用pH7.0 PBS缓冲液洗脱柱子至基线；用pH2.5甘氨酸/盐酸缓冲液洗脱，收集干扰素洗脱峰，再用氢氧化钠调pH值至7.0。纯化后的重组人干扰素α进行纯度、蛋白含量、生物活性和鼠IgG含量检测，内毒素含量检测。
结果纯化重组人干扰素α1b，每毫升亲和层析介质可洗脱3.3mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，比活为2.2×107IU/mg，干扰素活性回收率100％。纯化重组人干扰素α2b，每毫升亲和层析介质可洗脱2.9mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，比活为2.5×108IU/mg，干扰素活性回收率100％。纯化重组人干扰素α2a，每毫升亲和层析介质可洗脱2.7mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，比活为2.8×108IU/mg，干扰素活性回收率100％。纯化重组集成干扰素，每毫升亲和层析介质可洗脱3.0mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，比活为5.9×108IU/mg，干扰素活性回收率100％。
检测残余鼠IgG含量均小于100ng/剂量(最大剂量540微克)符合中国药典标准。
鲎试剂检测内毒素含量90微克/每支/1毫升、270微克/每支/1毫升、540微克/每支/1毫升三个规格成品内毒素含量均小于10EU，家兔热原质试验检测合格，符合中国药典标准。
4G10单克隆抗体亲和层析柱，用于提纯重组人干扰素α，连续使用200次，纯化效果无明显下降。
权利要求
1.一种高效用于纯化重组人干扰素-α单克隆抗体亲和层析柱，
2.如权利要求1所述的单克隆抗体制备中，所用免疫抗原为纯化重组人干扰素α1b亚型，
3.如权利要求1所述的亲和层系柱，可用于多种α亚型干扰素的纯化，
4.如权利要求3所述的α亚型干扰素包括干扰素α1b、干扰素α2b、干扰素α2a和集成干扰素，
5.如权利要求3所述的干扰素纯化，每毫升亲和层系介质可洗脱3毫克干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，回收率100％。
全文摘要
本发明利用重组人干扰素α1b为免疫抗原，制备单克隆抗体4G10细胞株，用辛酸——硫酸铵方法纯化单抗，再与CNBr－Act－Sepharose 4B偶联制备亲和层析柱，纯化重组人干扰素α，每毫升亲和层析介质可洗脱3毫克干扰素，获得的干扰素纯度95％以上，回收率100％，连续使用200次以上，纯化效果无明显下降。为大规模生产重组人干扰素α，特别是生产大剂量规格干扰素提供了有力的工具。
文档编号C07K1/16GK1515589SQ03100059
公开日2004年7月28日 申请日期2003年1月8日 优先权日2003年1月8日
发明者吴美英, 艾艳萍, 任韧, 孙俭波, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司, 北京毕艾欧科技发展有限责任公司, 吴美英