一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法

专利名称：一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法
技术领域：
本发明涉及变性蛋白质(包涵体)的重折叠复性，具体地说是一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法。
背景技术：
20世纪的最后一年，人类基因组计划的完成，生命科学的工业化以迅猛的速度跨越式地进入了一个崭新的时代，即后基因组时代；基因组工程的各种新兴学科，交叉学科应运而生，生物技术的发展犹如长江之水，一日千里，正在形成一个宏观的称之为“生命科学工业”，而不仅仅局限于生物技术或生物工程技术领域了；然而，生命的本质在于蛋白质，在了解到人类只有不到40,000个基因的同时，许多科学家正在为探索这一本质做出不懈的努力和创造。尽管，全球已有近4000种重组蛋白质已经被制备，但是能用于直接表达和制备的蛋白质不到25％，大部分基因工程菌(大肠杆菌或真菌)表达的重组蛋白质是作为变性的包涵体(Inclusion Body)形式分泌出细胞，以不溶解的凝聚物存在。这就使获得大量重组人体功能蛋白质成为生命科学工业发展的瓶颈。因此，开发毫克级乃至克级的高通量蛋白质分离纯化技术成为当前生命科学工业界的一大热点。
大肠杆菌原核表达系统已成为生物实验室或生物技术公司日常的工作，其原因是大肠杆菌便宜易得，蛋白质合成高效，工艺成本比脯乳动物、昆虫和真菌系统相对便宜而高效；对一些有细胞毒的蛋白质，可以通过该系统快速得到大量重组蛋白质，过量表达对于大肠杆菌并不造成伤害；重组后不溶蛋白质稳定，易于保存；可以避免其他系统所表达的重组蛋白质的降解，不稳定等问题。利用经典的细胞破壁(溶菌酶或机械法，lysozymeor French Press)、离心(10,000xg低速离心)，再经冻融和用不同的缓冲洗液洗涤法可高效地得到变性的包涵体(Krueger，J.K.等Biopharm，1989，340-45)。这样可以较容易地获得高于90％纯度的不溶蛋白质包涵体；由于众多的基因分子文库已经商业化，这样可以用这一常规法快速建立重组人体蛋白质包涵体分子文库备用。其关键是变性蛋白质(包涵体)的重折叠复性技术，尤其是做到高通量的重折叠是工业界急需解决的难题之一。
蛋白质折叠是个复杂的过程，体内维持蛋白质的三维结构与细胞的内环境有很大关系，可以是分子伴侣、或其他辅助物质的调节；然而，体外重折叠方法，除了使用常规热力学调节机制之外(如控制浓度、压力，pH值等)，常见的重折叠复性方法包括稀释法和渗透法。但是，在许多情况下，由于折叠复性的中间产物较易形成凝聚体(Aggregates)，常常很难拿到活性蛋白质；新近通过转向于体内蛋白质折叠的模拟，产生了一些新的方法，例如使用分子伴侣蛋白质GroEL在体内具有结合蛋白质的作用，相当于变性蛋白质的亲和配基；固定化GroEL柱(固定床)相当于变性蛋白质的亲和吸附层析柱，从而可提高样品的处理量，并使蛋白质在复性的同时得到浓缩和纯化，其特点在于1)不仅可以解决分子伴侣的重复利用问题，而且由于固定床的利用(近于平推流)，可提高分子伴侣的利用效率；2)由于采用连续操作，原料处理量大，产品可以得到浓缩、纯化；3)易于建立相关的模型，对于放大生产具有重要的指导作用；Teshima等利用固定化分子伴侣，在体外辅助了淀粉酶、碳酸酐酶、DNA酶的折叠复性(Teshima T等.Appl Microbiol Biotech，1997，4841-46)，其他备受关注的适用于蛋白质重折叠的分子伴侣还包括蛋白质二硫健异构酶(多肽脯氨酸顺式-反式异构酶，Peptidyl Proly Cis-Trans Isomerase，简称PPI)，GroEL，GroES，DnaJ，DnaK；还有报道利用“小分子伴侣”对目标蛋白质进行复性(Zahn R等.Proc Nail Acad Sci USA，1996，9315024-15029)，“小分子伴侣”是指GroEL的一个片段，而这个片段并不是GroEL的水解产物，而是由基因重组后包括GroEL191-345氨基酸残基片段(16.7kD)或191-376氨基酸残基片段(21kD)密码的基因片段在大肠杆菌中的表达产物，它们能有效地促进亲环蛋白A、硫氰酸酶以及芽孢杆菌RNA酶的复性；由于“小分子伴侣”分子较小，更适合于固定化，且不需另加复性辅助因子(如GroES和ATP等)，因此具有很大的应用前景；但是，由于这些分子伴侣均需特别制备技术，对于大规模多种蛋白质制备，仍属昂贵试剂。

发明内容
本发明的目的在于提供一种成本低、可调控的适于规模化应用的变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为以价廉的人工分子伴侣体系“三合一”法、以不溶性变性蛋白质(包涵体)(或商业用酶)为原料，采用人工分子伴侣-去污剂-阻凝剂三联复性系统分离提纯重组蛋白质，具体操作过程如下1)在4～36℃温度下，将多次洗涤纯化后包涵体(纯度＞90％)(较好的方法参见Babbit，P.C.等Biotechnology 1990，8945-949；Wong，H.H.等Bioseparation 1996，6185-192)用6-8M尿素或3-7M胍缓冲液使包涵体变成一级结构的伸展态，其中含有蛋白质重量0.1～0.5％(w/v)去污剂和0.4～0.6M阻凝剂，0.5～5小时后，形成伸展态蛋白质-去污剂复合物在变性蛋白质溶液中加入去污剂和阻凝剂，通过与蛋白质形成复合体，抑制肽链间的相互聚集；加入去污剂(紫外分析检测A280)至无游离伸展态蛋白质；2)加入1～2M尿素或胍缓冲液稀释10～50倍，使蛋白质浓度为0.1～10毫克/毫升，时间0.5～2小时(用复性液稀释至理想复性浓度)；根据具体蛋白质而定，80％的包涵体为还原态，对于已知含有非还原态巯基的包涵体，可加入过量的谷胱甘肽在缓冲溶液中作为弱还原剂，以维持所有去折叠的包涵体处于还原肽；除在纯化包涵体时，充分除去膜蛋白和细胞壁一样重要，维持还原态是获得高产率的复性重组蛋白质的关键；3)加入含有浓度为20～100mM(毫摩尔浓度)分子伴侣和氧化还原系统的1～2M尿素或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构，时间3～5小时内复性，个别需～1周；脉冲法控制(可于90～120分钟内间歇式或梯度式)加入含有分子伴侣的缓冲液速度，逐步释放出伸展态的蛋白质一级结构，保持同时抑制错误折叠和包涵体再生，使游离出的蛋白质伸展态浓度达到理想的，利于分子内反应的浓度；控制一级结构蛋白质从去污剂-复合物上剥离下来的速度，变为部分折叠即不含去污剂分子的非活性状态PFP，进一步完成正确折叠蛋白质的复性，从而折叠为天然活性蛋白质NP。
4)使用各种平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥(以蛋白质溶液或固体方式，分别在4℃，-20℃，或-80℃储存)；所述分子伴侣为α-环糊精、β-环糊精或甲基-β-环糊精。
包涵体去折叠脲缓冲液组成为6-8M脲、1-5mM EDTA(乙二氨四乙酸二钠)、0.1M 2-Me、20mM NaOAc；胍缓冲液组成为3-7M胍、150mM的磷酸钠、25mM DTT(二硫苏糖醇)、10mM MgCl2和10mM KCl、pH5-7.6。缓冲液中可同时加入0.1-0.5％的去污剂和阻凝剂0.4-0.6M精氨酸，0.05％聚乙二醇(3550-5000分子量)所述去污剂为十二烷基磺酸钠，十六烷基三甲氨溴化氢季氨盐(CTAB)，甜菜碱或直链环糊精；所述阻凝剂为L-精氨酸、聚乙二醇(3500～6000)、甘油、葡萄糖、甘氨酸、乳酸钙、氯化锌、脯氨酸或硫代甜菜碱(NDSBs)；所述氧化还原系统是指脲缓冲液中含有10～100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)、还原剂缩硫乙二醇、巯基乙醇、1～30mM半胱氨酸、1～30mM谷光甘肽或二硫苏糖醇、10∶1～1∶1谷胱甘肽/半谷胱甘肽、10∶1～1∶1胱氨/半光氨或10∶1～1∶1胱氨酸/半胱氨酸；(具体条件根据各个蛋白质性质折叠/凝聚比而定)其用量为蛋白质当量浓度的5～100倍过量；所述平行分离纯化柱为固定相为Saphodex 30到Sophadex 300凝胶过滤柱或反相层析柱；流速＝5～8.4毫升/小时；所述平行分离纯化柱所得产物可以通过快速蛋白质液相层析方法进一步纯化；所述在加完分子伴侣后，采用在4℃恒温复性法或采用跳跃式升温法以提高重折叠复性收率，即先在4℃复性至最大活性，然后升温至20～36度，可缩短复性时间数倍，降低长期复性过程中蛋白质活性失去或凝聚付产物的形成，提高复性蛋白质的纯度；所得提纯液可以再次使用超滤浓缩到相应浓度，或加入稳定剂制成浓缩液在-20℃储存(活性可保持数月)，或冷冻干燥成含有低于1～2％水份的干粉，在-80℃长期保存(一年以上)。
所述包涵体原料可通过下述方法取得1)在大肠杆菌中引入人体外源基因表达/合成重组蛋白质的包涵体，快速分别沉淀出对应基因的包涵体，建立相应的颗粒包涵体粗品文库(方法Krueger，J.K.等.Biopharm 1989，340-45)；2)提纯包涵体到较高的纯度(Marston，F.A.O等Methods of Enzymology，1990，182，264-276)，然后，使用6～8M尿素缓冲液使包涵体变成一级结构的伸展态。
其中“三合一”法或称“鸡尾酒”法(去污剂+环糊精+阻凝剂或促折叠剂)为主要模型，(以前报道的“二合一”方法参见辅助碳酸酐酶和鸡蛋白溶菌酶复性，Rozema D et al.Biochemistry，1996，3515760-15771)，以及我们早期发表的“温度跳跃技术”(4℃然后30-36℃，Xie，Y.等，D.B.Protein Science 1996，5(3)517-523)。
本发明具有如下优点1.本发明运用组合学原理进行蛋白质平行复性，复性蛋白质浓度高，所用反应容器体积小，对于各种表达系统所形成的包涵体进行平行重折叠复性均有效；通过调节人工分子伴侣环糊精、去污剂、和阻凝剂的比例、加料方式(顺序)、和加料速度，达到热动力学协同调控的平行蛋白质纯化的技术，可快速获得多种重组蛋白质；比快速稀释法和透析法效率提高数十倍。以廉价的α或甲基-β-环糊精为模型分子伴侣，建立一个可适于高效蛋白质复性的“鸡尾酒”法可调控的重折叠平台技术(CART)；是对蛋白质组学研究中所需功能蛋白质提供大量制备的工业化平台方法。
2.本发明通过以大肠杆菌表达系统作为模型，建立一通用的其他任何表达系统的高通量变性蛋白质(包涵体)重折叠复性的技术。与GroE等蛋白质分子伴侣相比，去污剂-环糊精-阻凝剂的联合使用，即所谓“鸡尾酒法”协同调节重折叠技术(CART)具有明显的优点(1)人工分子伴侣不属于蛋白质，不易受环境影响而失活，操作条件较为温和；(2)去污剂和环糊精均可直接购买，省去大分子分子伴侣分离纯化的步骤；(3)去污剂与环糊精的分子量较小，容易与蛋白质分离，有利于提高工业化生产效率，重折叠和超滤浓缩可以“一锅煮”；可使分离提纯包涵体效率提高数倍乃至数十倍；该方法对蛋白酶(Protease)、基质金属蛋白酶(MatrixMetalloprotease)、和激酶(Kinase)等制备均有较好的效果，方法简便，适用于蛋白质组工程研究。
3.本发明重折叠反应可在同个反应器中进行，避免了中间物料转移的麻烦，同时蛋白质的重折叠过程的优化可通过如下步骤判断而不要测定活性1)过程没有大量的沉淀形成；2)蛋白质可以通过蛋白质复性装置中分子量截留膜，超滤浓缩到20～70毫克/毫升(A280纳米分光光度法测定)，小分子化合物和复性剂可通过此法除去；3)柱层析产生一个折叠单峰；4)非还原性SDS-凝胶电泳判断正确的分子量；
5)蛋白质可以通过结晶或使用蛋白质库中蛋白质图谱比较确定。
高通量制备毫克级以上的有活性重组蛋白质，方法简便，条件优化容易，产业化前景好；具体优化条件取决于1)复性系统的方法脉冲加液或多步法；一步加液或梯度加液法，稳态加液法，和跳跃升温法；2)所纯化的蛋白质的内在理化性质；3)重折叠复性的缓冲液中的组份搭配和进一步凝胶柱分离纯化，重折叠后的蛋白质通过凝胶过滤柱层析法或高效液相法提纯。


图1为本发明所述变性蛋白质“鸡尾酒”调控重折叠复性技术(CocktailAligned Refolding Technology-CART)的原理图。其中非折叠蛋白质UP(Unfolded Protein)；中间过渡态UP-D(Unfolded Protein-DetergentComplex)；部分折叠物PFP(Partial Folded Protein)；凝聚物Ag(Aggregates)天然蛋白质NP(Native Protein)。
图2为本发明的操作流程图。
具体实施例方式
实施例1HIV-1蛋白酶D30W的重折叠复性即HIV-胰蛋白酶包涵体(50毫克，美国BiotaiX，Inc.)溶解到8M脲中(100mM Tris，pH3.5)，然后脲的浓度稀释到2M(pH3.5，1mM DTT和3％的PEG，0.2％ C-12 SDS，0.5M精氨酸盐酸盐)，蛋白质最终浓度为0.5毫克/毫升，搅拌1小时，然后加入α-环糊精缓冲液(Aldrich，6当量，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG)，搅拌5小时，在自行设计的分子浓缩器中超滤(分子量截留超滤膜＝10,000)。浓缩到5毫升后，调节PH至4.4(加入大约0.5毫升含有1M氯化钠的100mM的醋酸钠缓冲液)；20分钟后，蛋白质溶液在室温下离心20分钟(10,000g)，剔除少量不溶物，上清液(PH3.5，4小时)经凝胶柱层析后，再经自制的生物反应器再次浓缩，得相应蛋白质溶液(收率35％)，纯度＞90％(SDS-PAGE和HPLC分析)，在4℃储存待用。
为获得最大效果和复性收率，可利用自制的平行反应器(国家专利申请号03210921.0)。
实施例2HIV-1蛋白酶V82N重折叠复性即HIV-蛋白酶(50毫克，美国BiotaiX.)溶到8M脲中，然后脲的浓度稀释到2M(pH3.5，1mM DTT和3％的聚乙二醇)，蛋白质最终浓度0.5毫克/毫升，搅拌1小时，加入去污剂和阻凝剂缓冲液(0.2％SDS，0.5M精氨酸盐酸盐，100mM醋酸钠，pH4.5，1mM DTT和1％的PEG)，搅拌1小时，然后加入α-环糊精(Aldrich，5当量，1-2mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，搅拌5小时，吸出反应液，离心20分钟(10,000g)，上清液(约100毫升)在自行设计的分子浓缩器中超滤(分子量截留超滤膜＝10,000)浓缩到5毫升后，调节PH至4.4(加入大约0.5毫升含有1M氯化钠的100mM的醋酸钠缓冲液)；20分钟后，蛋白质溶液在室温下再次离心20分钟(10,000g)，剔除少量不溶物，上清液经凝胶柱层析，再次在自制的分子浓缩器中浓缩，得相应蛋白质溶液，浓缩后测定约含38毫克活性蛋白质(纯度＞90％)，在4℃储存待用。
实施例3HIV-1变异蛋白质D30F的制备(包涵体的制备方法Ido，E.等J.Biol.Chem.1991，266，24359-24366.)溶到8M脲中(100mM醋酸钠，PH4.5)，搅拌2小时，然后用2M脲缓冲液(PH3.5，1mM DTT和3％的PEG，0.2％SDS，0.5M精氨酸盐酸盐)，稀释到最终蛋白质浓度0.5毫克/毫升，搅拌1小时，其后加入α-环糊精缓冲液(Aldrich，5当量，含有1-2mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG))搅拌5小时，吸出反应液，离心20分钟(10,000g)，上清液中加入400毫升10mM的醋酸钠和1mM DDT，PH5.0，时间维持5小时。在10,000g离心，除去不溶物质。该胰蛋白质溶液用分子量截留膜浓缩到5毫升。蛋白质的浓缩液在A280纳米(E0.1％＝1.0)测定浓度。使用阿普强制药公司的HIV-1抑制剂滴定测定所的蛋白质活性超过90％。
实施例4重组Caditropsinogen的包涵体复性Caditropsinogen包涵体根据已知方法(Lin，X.等.J.Biol.Chem.1992，267，17257-17263)制备。50毫克包涵体溶于2毫升含有8M脲缓冲液(50mM Tris，1mM 0.8和1mM EDTA，100mM 2-Me，pH8.0，5.7mM CATB，0.5M精氨酸)，搅拌30分钟，离心(175,000Xg)30分钟，除去不溶物，然后用去污剂缓冲液(含有最终浓度2M脲)稀释到蛋白质浓度1.0mg/ml，搅拌1小时，向最终溶液中加入甲基-β-环糊精缓冲液(含有6当量的甲基-β-环糊精，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM Tris-HCl)，脉冲法间歇式三次加料(约1小时)，然后在4℃搅拌48小时，用10,000Da分子量截留膜，超滤浓缩至10毫升，离心(175,000xg)15分钟除去少量不容物，上清液用Sephacryl S-300柱层析(3×90cm柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0的缓冲液平衡并洗脱，流速25毫升/小时)，活性部分用FPLC(阴离子交换柱momoQ，用pH为7.0的20mM Tris-HCl缓冲液平衡)，再用0～1MNaCl线性梯度洗脱，活性组份溶液经脱盐后，冷冻干燥得7.5克蛋白质，15％的收率，SDS-PAGE分析，显示单峰。纯度大于90％。
实施例5
重组胃蛋白酶原(Pepsinogen)的重折叠复性纯化的包涵体颗粒(制备方法参见Lin，X.等J.Biol Chem 1989，4482-4489)(50毫克)经离心(16,000xg，30min)溶于6M脲中(含有100mM 2-巯基乙醇，体积60毫升)，4℃搅拌6小时。残留不溶物质经离心(286,000xg，2小时)除去，用脲缓冲液稀释到200毫升(100mM Tris-HCl，0.3％硫代甜菜碱(NSBAs)，2mM EDTA，0.4M精氨酸盐酸盐，5mM GSH，0.5mM GSSG，0.1mM PMSF，pH8.0)，搅拌2小时，加入α-环糊精(100mMα-CD，6当量，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM Tris，pH8.0)搅拌5小时，本溶液经分子量截留膜30,000超滤浓缩到10毫升，离心(286,000xg)1小时，上清液用Sephacryl S-300凝胶柱层析，3×90-cm柱用20mM Tris-HCl，pH7.5，流速30/小时。如果使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)纯化(Pharmacia)阴离子交换MonoQ HR 5/5柱。缓冲液是20mMTris-HCl，pH8.0溶液梯度0-1M NaCl。30分钟，1毫升/分钟。脱盐后、干燥、得相应复性蛋白质(15mg，复性收率30％，纯度＞95％)。
实施例6重组蛋白质链激酶(StreptoKinase，SK)的纯化和表达，该重组蛋白质从pET11基因载体在大肠杆菌菌落中BL21(DE3)表达(方法参见Studier，F.W.等Methods Enzymol.1990，185，60-89.)。SK(SK残基1-147)。所表达的包涵体经提纯后，按实例1所述条件重折叠。50毫克包涵体，复性后，进一步在Sephacryl S-300柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)上纯化，洗脱缓冲液为20mM Hepes和0.4M脲，pH7.5，其后经阴离子交换树脂柱(20mM Hepes和0.4M脲，pH7.5，0～0.1M NaCl为洗脱剂。收率15％，纯度＞90％。
实施例7重组人体神经营养素-3(Human Neurotrophin-3，NT-3)的复性。重组人体神经营养素-3按报道方表达(Suenaga，M.等Biotechnology Appl.Biochem1998，28，119-124)，10克冷冻细胞(湿基)分散在40毫升缓冲液中(10mMEDTA，pH7.0)超声细胞破壁，悬浮离心(17,000g)一小时，上清液弃去，包涵体颗粒重新分散在上述缓冲液中，离心。重复改过程两次，确保除去所有细胞垃圾，和膜蛋白酶。然后包涵体颗粒用30毫升4M脲缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0，5mM DTT)均浆，并再次离心(17,000g)60分钟。最终纯化的包涵体颗粒在8M脲缓冲液(60毫升，pH3.0，20mM柠檬酸钠，0.1％SDS)中去折叠后，搅拌2小时，加入复性液稀释10倍(三次脉冲加料，50mM β-环糊精，0.1M磷酸钠，0.2精氨酸，1.0mM GSH和0.2mMGSSG，pH8.5)，在4℃搅拌一周后，采用跳跃快速升温至12-20度法，搅拌3小时，活性达到最大(＞90％，原法需一个月)，复性液浓缩到10毫升，用SP-Sepharose(Pharmacia Biotech，Sweden，10×150cm，含有0.1％CHAPS，pH6.0的0.1M磷酸钠缓冲液，使柱平衡)柱层析，洗脱液为含有0.4M NaCl的(pH6.0)的同样缓冲液，所得流份经RP/HPLC(ODS-120T，TosohCorporation，Japan)柱，用含有0.1％的TFA的20-36％乙腈洗脱，所得流份经冷冻干燥得10毫克NT-3。纯度＞95％。
实施例8碳酸酐酶II(碳酸酐酶CAB II，Sigma，Inc.，20毫克)溶于5毫升6M盐算胍缓冲液(含50mM Tris，1mM DTT，pH8.5)，4℃用2M脲缓冲液(pH7.5，1mM DTT和1％的PEG，1.1mM CTAB，0.5M精氨酸盐酸盐，1.43mMEDTA，5.7mM CTAB，5.7mM GSH，0.57mM GSSG，pH7.5，50mM Tris)稀释10倍，搅拌2小时，然后加入甲基-β-环糊精(6当量甲基-β-CD，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，50mMTris，两次间歇式加入)，搅拌3小时，超滤浓缩(分子量截留膜20K Da)，光散射法检测，复性收率97％，比我们前期使用盐酸胍缓冲液重复性方法收率稳定(Xie，Y.等.Protein Science 1996，5(3)517-523)。
实施例9截断的基质金属蛋白酶催化部位(protMMP3，多肽1-255，MW＝28,779)的制备根据已知方法表达脱辅基MMP3包涵体(Marcy，A.I.等Biochemistry 1991，30，6476-6483.)，50毫克protMMP3包涵体溶于8M脲中(50mM HEPES，0.1M NaCl)，搅拌1小时，用2M脲缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl，10mM CaCl2，0.2 SDS，0.5M精氨酸，30mM EDTA，4mM 1，10-邻二氮杂菲)稀释到0.4毫克/毫升蛋白质浓度，加入等体积的50mM HEPES，pH7.5，and 0.1M NaCl.)，在4℃搅拌1小时，加入甲基-β-环糊精(5当量，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽GSSG，50mM HEPES，pH7.5，分三批加入)，用缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl，2mM 1，10-邻二氮杂菲，and 3mM EDTA)稀释5倍后搅拌过夜，然后超滤，用缓冲液(5毫升，50mM HEPES，pH7.5，0.1M NaCl)稀释后吸出离心(12,000g)，取出上清液，弃去不溶物，冷冻干燥的10毫克去辅基截断基质金属蛋白酶催化部位(10毫克)。所得酶无活性，加入锌离子后活性恢复。该法可避免自身蛋白水解现象(相关活性分析与Wetmore，D.R.Biochemistry 1996，35，6549-6558等所用方法同)。
实施例10重组精氨酸激酶的纯化方法精氨酸激酶(AK)包涵体根据标准方法获得(Strong & Ellington，Comp Biochem Physiol 1996，113B，809-816)，大肠杆菌细胞经溶菌酶破壁，冻融后，在Beckman JA12离心机上(10,000g)离心，包涵体用80mL缓冲液IV(50mM Tris pH8.0；2％曲顿X-100(TritonX-100)；10mM EDTA；1M脲)洗涤以除去脂质体，核酸，和其他一些污染的蛋白质。同法、洗涤三次后离心AK分散到缓冲液(50毫升，10mM Tris·HClpH8.0；1mM EDTA；1mM DTT；10mM NaCl，and 0.02％w/v NaN3)，室温下，在8M脲中变性去折叠1小时，然后离心(8,000xg)1小时BeckmanJA20离心机，通过0.22μm膜过滤，再经凝胶柱层析(2.5×120厘米Sephacryl S-300柱)，洗脱液6M脲(50毫升，10mM Tris·HCl pH8.0；1mMEDTA；1mM DTT；10mM NaCl，and 0.02％w/v NaN3)，超滤浓缩后，取相当于50毫克AK包涵体浓缩液，用变性液8M脲(50mM Tris·HCl，10mMEDTA，2mM DTT)稀释到0.5毫克/毫升，4℃条件下，经蠕动泵缓慢加入2M脲复性液(100毫升，含50mM Tris·HCl，pH8.0；1mM EDTA，100mM2-巯基乙醇，0.1％SDS，0.5M精氨酸盐酸盐，1mM DTT和1％的PEG)中，搅拌2小时形成AK-去污剂复合物，然后加入α-环糊精(1～2mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1-0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，50mM Tris-HCl，pH8.0，三次间歇式加入6当量，3当量/次)脱除去污剂，搅拌复性5小时，离心20分钟(10,000g)，经阴离子交换柱层析(2.5×120cm Sephacryl S-100柱，自然装柱，UV检测，10 to 60mM KCl梯度洗脱(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT，and 0.02％NaN3)的纯化的产物，最后在分子浓缩器(10kDa)中真空超滤，浓缩到～1mL，既得纯化的精氨酸激酶(10毫克)。SDS-PAGE显示纯度＞90％。
实施例11牛胰RNase的复性牛胰RNase A为商业酶(Sigma)50毫克RNase在6M盐酸胍的缓冲液中(2毫升，0.1M Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，0.14DTT，0.4M精氨酸，0.2％CTAB)室温下搅拌18个小时去折叠失活(Lyles，M.M.等Biochemistry 1991，30，613-619)。该溶液通过Sephadex G-25短柱(用0.1M Tris-HCl，pH8.7，含有1M盐酸胍，和1mM EDTA，以除去DTT并降低盐酸胍的浓度至1M(蛋白浓度在278nm测定，失活系数为9300M-1。调节还原的酶，用1M盐酸胍(含有0.1M Tis-HCl，pH8.7，0.5M精氨酸，0.2％CTAB，1mM EDTA)调节变性酶浓度至1mg/mL，搅拌2小时。加入甲基-β-环糊精(6当量，1～2mM还原型谷胱甘肽GSH，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，0.1M Tris-HCl，三次脉冲式加入)，在30℃搅拌5小时(酶活性由如下方法测定cCMP溶于0.05mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)含有5mM EDTA，cCMP浓度(0.12毫克/毫升)。取cCMP溶液(2.4毫升)溶于复性的上清液(100μL)中，在30℃波长287纳米测试cCMP溶液的吸收，与100％RNase A活性比较)，复性收率＞90％。
实施例12人体淋巴趋药性细胞素(Human Lymphotactin，hltn)是趋药细胞素C类中唯一一组专属性吸引T-淋巴细胞和天然杀伤细胞蛋白质该蛋白质由93个残基组成，无2或4-位保留的半胱氨酸。hltn的包涵体可由已知方法制得(Kuloglu，E.S等Biochemistry 2001，40，12486-12496)，即1升发酵液所获得的细胞糊分散于50mMTris-HCl，pH8.0，50mM NaCl，50mM PMSF，2mMEDTA)，经过多次冻融后，加入CaCl2活化融合蛋白质中的Snase(Aldrich-Sigma)至最终浓度为10mM。搅拌20分钟，离心(20000xg)15分钟，剔除上清液，下层颗粒用50mL的破壁缓冲液(0.5％Triton-100)洗涤两次。离心后得相应包涵体，取50毫克溶于7M盐酸胍缓冲液(40mMTris-HCl，pH7.4，20mM EDTA，50mM DTT，0.2％CTAB，0.5M精氨酸)，室温搅拌3小时，离心(20000g)20分钟，上清液取出，用复性液1M盐酸胍(含100mM Tris-Ac，pH8.0，0.2％CTAB，0.5M精氨酸，25μM 2-MTT)稀释到0.5毫克/毫升，4℃搅拌3小时，加入α-环糊精(5当量，三次脉冲式加入，1～2mM还原型谷胱甘肽(GSH)，0.1～0.2mM氧化型的谷胱甘肽(GSSG)，100mM Tris-HCl，pH8.0)，搅拌16小时，然后超滤浓缩(3000Da分子量截留膜)到10毫升，然后用取离子水(50毫升)洗涤三次，然后浓缩到约1毫升，用分解融合蛋白质缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl，10mM CaCl2)稀释10倍(每毫升约含5毫克融和蛋白质)。该融合蛋白质溶液用Xa因子(2单位/10毫克融和蛋白质，Xa因子购自Promega)处理1～2天，该hltn产物，经反相HPLC(C18柱，Vydac，Hesperia，CA，USA)分离制得。冷冻干燥，得5毫克蛋白质，纯度大于95％(SDS-PAGE显示其分子量为10.3kDa，与报道的方法同)。
该方法不限于本专利所列的蛋白酶、基质金属蛋白酶和激酶，也不限于大肠杆菌工程菌。对其他表达系统所获得的包涵体同样适用。
权利要求
1.一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于以不溶性变性蛋白质的包涵体为原料，采用人工分子伴侣-去污剂-阻凝剂三联复性系统分离提纯重组蛋白质，具体操作过程如下1)在4～36℃温度下，将洗涤纯化的包涵体，使用6～8M尿素或3～7M胍缓冲液，使包涵体变成一级结构的伸展态，其中缓冲液含有0.1～0.5％的去污剂和0.4～0.6M阻凝剂，0.5～5小时后，形成伸展态蛋白质-去污剂复合物；2)加入1～2M尿素或胍缓冲液稀释10～50倍，使蛋白质浓度为0.1～10毫克/毫升，时间0.5～2小时；3)加入含有浓度为20～100mM人工分子伴侣4～6当量和氧化还原系统的1～2M脲或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构，时间为3小时～1周；所述分子伴侣为α-环糊精、β-环糊精或甲基-β-环糊精4)使用平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥；
2.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于包涵体去折叠缓冲液组成为6～8M脲中含1～5mM EDTA；pH4～8，0.1M 2-Me；3～7M盐酸胍中含150mM的磷酸钠，PH 7.6；25mM DTT，10mM MgCl2和10mM KCl。
3.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述去污剂为十二烷基磺酸钠、甜菜碱、聚乙醚或直链环糊精。
4.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述阻凝剂为L-精氨酸、聚乙二醇、甘油、葡萄糖、甘氨酸、乳酸钙、氯化锌、脯氨酸或硫代甜菜碱。
5.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述氧化还原系统是指脲缓冲液中含有10～100mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、还原剂缩硫乙二醇、巯基乙醇、1～30mM半胱氨酸、1～30mM谷光甘肽、二硫苏糖醇、10∶1～1∶1谷胱甘肽/半谷胱甘肽、10∶1～1∶1胱氨/半胱氨或10∶1～1∶1胱氨酸/半胱氨酸；其用量为蛋白质当量浓度的5～100倍过量。
6.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述平行分离纯化柱为固定相为Saphodex 30到Sophadex 300凝胶过滤柱或反相层析柱；流速＝5～8.4毫升/小时。
7.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述平行分离纯化柱所得产物可以采用快速蛋白质液相层析方法进一步纯化。
8.按照权利要求1所述变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法，其特征在于所述在加完分子伴侣后，采用在4℃复性恒温复性法或采用跳跃式升温法提高重折叠复性收率，既先在4℃复性至最大活性，然后升温至20～36度。
全文摘要
本发明涉及一种变性重组蛋白质高通量重折叠复性方法；以不溶性变性蛋白质的包涵体为原料，采用人工分子伴侣－去污剂－阻凝剂三联复性系统，过程如下将包涵体使用含去污剂和阻凝剂尿素或胍缓冲液使包涵体变成一级结构的伸展态，形成蛋白质－去污剂复合物；加入脲或胍缓冲液稀释10～50倍，再加入含分子伴侣和氧化还原系统的脲或胍缓冲液，逐步释放出伸展态的蛋白质结构；使用平行分离柱纯化重折叠复性的重组蛋白质，浓缩或冷冻干燥；本发明的优点是有待复性蛋白质浓度高，所用反应容器体积小，对于各种表达系统所形成的包涵体或变性蛋白质均有效，效率提高数倍乃至几十倍；方法简便，适用于蛋白质组工程研究，条件易优化，产业化前景好。
文档编号C07K1/00GK1521183SQ03110960
公开日2004年8月18日 申请日期2003年1月28日 优先权日2003年1月28日
发明者梅晓丹, 谢岩生, 郭晓迪, 刘进前, 张利平 申请人:大连百奥科技发展有限公司