专利名称：苦荞种子内肌醇衍生物转化为其单体的方法及其提取物产品的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域。具体涉及一种苦荞麦种子内肌醇D-CHIRO-INOSITO与MYO-INOSITOL衍生物用生物工程方法转化为其单体的方法及得到的苦荞麦提取物产品。
背景技术：
胰岛素是由胰岛器官产生的激素，进入血液循环后作用于人体重要器官和周边组织调控糖、脂及其它代谢过程。胰岛素结合于人体细胞表面受体蛋白，激活一系列信号传递途径，导致细胞表面渠道打开，将血中葡萄糖引入细胞内从而达到降糖作用。这个信号传递途径中的任何步骤受阻或效率降低均会导致胰岛素失去作用，称为胰岛素抵抗性。为补偿胰岛素作用效率降低，人体产生更多的胰岛素，称为高胰岛素血症。血中持续高胰岛素浓度造成代谢紊乱、血糖升高、血甘油三脂水平升高、高密度脂蛋白胆固醇降低、血浆纤维蛋白原升高及高尿酸血症等。由胰岛素抵抗性导致的疾病统称为X综合症，包括糖尿病、高血压、高血脂、肥胖症、冠心病、多囊性卵巢综合症等。
美国科学家近20年的研究证明，肌醇(INOSITOL)类分子(以D-手性-肌醇(D-Chiro-Inositol)及肌-肌醇(Myo-Inositol)为代表)在胰岛素作用的信号传递过程中起了重要角色。研究发现正常人血中及尿液中含有一定浓度的D-Chiro-Inositol，而在II类糖尿病人中则几乎检测不到。因此，提示这些病人可能无法产生足够量的D-Chiro-Inositol，造成胰岛素作用的信号传递受阻。多个实验室的结果均确认，通过给试验动物补偿D-Chiro-Inositol或Myo-Inositol能有效地促进胰岛素功能，降低血糖、血中胰岛素、血甘油三脂水平等。正在进行的人体临床检验亦表明，纯化的D-Chiro-Inositol对II类糖尿病、多囊性卵巢综合症有显著疗效。
人类长期以来将荞麦种子制成各种食品，并有报道这种食品对糖尿病有益。但长期一来，对其中的功效分子一直不甚了解。荞麦属蓼科麦属一年生植物，栽培的荞麦有两种类型一种是普通荞麦，又称为甜荞(Fagopyrumesculentum)，子粒呈三棱形；二是鞑靼荞麦(Fagopyrum taricum)，俗称苦荞，比普通荞麦粒小，棱角钝、粒色灰暗、无光泽、料面粗糙、皮层不易脱落。《本草纲目》记载苦荞麦性味苦、平、寒、有益气力，续精神，利耳目，有降气宽肠健胃的作用。现代临床医学观察表明，荞麦具有降血糖、降血脂，增强人体免疫力的作用，对糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、中风等病人都有辅助治疗作用。
本发明人在研究普通荞麦(Fagopyrum esculentum)(又称甜荞)的过程中发现甜荞中含有丰富的D-Chiro-Inositol衍生物Myo-Inositol衍生物，但是由于人的胃肠内没有alpha-半乳糖苷酶的存在(Gitzelmann&Auricchio，1965)，使得荞麦种子中天然存在的D-Chiro-Inositol衍生物及Myo-Inositol衍生物在人体内无法分解为有效成分(亦即单独存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol分子)，亦无法充分吸收，无法完全发挥其功效。我们的研究发明了一种将荞麦种子内天然存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物转化为有效单体分子的方法，并可直接应用于开发生产治疗2型糖尿病、多囊性卵巢综合症、高血压、肥胖症及其它心血管疾病的药品和相关的保健食品(参见专利申请号01110472.4)。我们在随后的研究中又发现，在苦荞(Fagopyrum tataricum)中同样含有大量的D--Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物，且用我们专利01110472.4所述方法的进一步改进，也能将苦荞种子内天然存在的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物转化为有效的单体分子。并发现使苦荞种子中的D--Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物转化为有效单体分子后的苦荞提取物具有显著的降糖、降脂功效，比同等量的纯化的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol以及普通荞麦提取物具有更好的功效。
本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，进一步研究开发苦荞种子，寻找具有显著降糖、降脂功效的提取物及制备方法。
本发明提供了一种使苦荞成熟种子内D-CHIRO-INOSITO衍生物及MYO-INOSITOL衍生物转化为D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的方法，该方法是苦荞成熟种子在22℃至30℃，0至30mM NaCl盐浓度条件下萌发18至48小时，或更好地在22℃至25℃，10至20mM NaCl盐浓度条件下萌发24至40小时，或最好地在25℃，20mM NaCl盐浓度条件下萌发36小时，种子中的D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物大幅度减少，D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL单体大幅度增加。Alpha-半乳糖苷酶活性在萌发过程中快速、急剧增加，提示D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物是通过水解而产生D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL单体。
本发明提供了上述方法的生产工艺，该工艺方法包括种子萌发、匀浆、搅拌、加热、离心过滤、纯化、浓缩、喷雾干燥、灌装成胶囊或者片剂等步骤。该方法包括的具体步骤为(1).将苦荞麦成熟种子在22℃～30℃，0～30mM NaCl盐浓度条件下萌发12～48小时；
(2).收集处理后的萌发的苦荞麦种子，按种子湿重量加入10～20倍体积(1g湿种子10～20ml酒精或者甲醇)的30～70％酒精或者甲醇，碾磨成匀浆，过滤；(3).收集滤液，冷冻干燥，获得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL单体的以可溶性碳水化合物为主的提取物。
按照此工艺，成熟的苦荞种子在25℃、20mM NaCl盐浓度条件下萌发36小时的种子中获得了高达135ug/粒种子的D-CHIRO-INOSITOL及43ug/粒种子的MYO-INOSITOL。
本发明的另一目的是提供了一种采用上述方法从苦荞种子内肌醇衍生物转化得到的苦荞提取物产品，该产品可用于制备抗糖尿病、降血脂药物。
本发明人对上述苦荞种子产品进行了动物实验，实验结果表明对糖尿病大鼠具有明显的降糖效应，对高血脂鹌鹑有明显的降血脂效应，并且该降糖、降脂效应与提取物中D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL单体含量成正比。另外，动物实验结果显示经本发明方法提取的苦荞麦种子的提取物比同等量的纯化的D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL单体具有更好的降糖、降脂功能，提示该提取物可能含有其它有效降糖、降脂的物质与D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL协同作用。黄酮类化合物是其中可能的活性物质。实验表明本发明的提取物对糖尿病大鼠、高血脂鹌鹑的降糖、降脂效应优于甜荞抽提物，这也表明苦荞麦种子抽提物中黄酮类化合物在降糖、降脂上的可能的协同作用。见下列实验(1)提取物的降糖功效实验1.鼠化学诱导糖尿病实验模型选取平均重量为250-280克的雄性Sprague-Dawley鼠，按45mg/kg的剂量IP注射STZ(Streptozocin，SigmaChemicals Co.，溶于柠檬酸缓冲液中)溶液。24小时后从鼠尾静脉抽血，用葡萄糖氧化法(Beckman葡萄糖分析仪，Fullerton，CA)测定其中的血糖含量。选取血糖在350至400mg/dl的大鼠作为糖尿病试验动物(正常大鼠的血糖水平为116mg/dl)。
2.上述选取的经化学诱导的糖尿病大鼠随机分组，每组以一定剂量的经过本发明实施所得提取物，按下表3中的剂量给予糖尿病大鼠，其结果为表3 抽提物在STZ诱导的糖尿病大鼠中的降糖效应
* P＜0.05**P＜0.01说明提取物为从25℃、20mM NaCl条件下萌发36个小时的种子中制备。上述数值均为10只实验鼠的平均值，0天时间血糖含量设为100，并将其它时间点数据作相应调整。上述四组处理的0天时间血糖浓度分别为0mg/kg(对照)，382.3+/-15.1mg/dl；25mg/kg，376.4+/-18.7mg/dl；50mg/kg，377.9+/-20.2mg/dl；100mg/kg，372.+/-16.3mg/dl。
从上表可以看出，当种子提取物使用剂量为50mg/kg时，在4天后实验鼠血糖含量比对照下降了40％。而在25mg/kg剂量下，4天内与对照没有明显区别，8天后才初见效果。当使用剂量进一步增加至100mg/kg时，1天后血糖含量比对照下降了30％，4天后下降达44％。且比单效的肌醇和黄酮类化合物用药更具有疗效。说明提取物中肌醇和黄酮类化合物具有协同作用，也可能在提取物中尚存在其它的功效成分。此外，苦荞提取物比同剂量的甜荞提取物降糖功效好。
实施例七、本发明提取物的鹌鹑降脂实验1.制造模型与分组实验动物鹌鹑为同窝孵出，体重在100g左右。10只动物喂普通饲料，其余喂高脂饲料，饲料均按25g/只，分早晚两次给予，自由饮水。喂养20天后，取普通饲料和高脂饲料喂养动物，分别检测血脂以确定高血脂模型的形成。将模型动物分六组1.苦荞提取物1组(25mg/kg)2.苦荞提取物2组(50mg/kg)3.苦荞提取物3组(100mg/kg)4.肌醇组(15mg/kg)5.黄酮组(15mg/kg)6.甜荞提取物组(50mg/kg)7.空白模型组正常动物，不给药，喂普通饲料。给药2周。
2.指标及测定使用酶法试剂盒检测指标①总胆固醇(TC)；②甘油三脂(TG)；③低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)；④高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)；⑤HDL-C/LDL-C。
3.统计方法t-检验按照上述方法，用不同剂量的本发明提取物对高血脂模型动物鹌鹑进行药效实验的研究，结果如下
表4 本发明提取物的降脂效应 *P＜0.05(与模型组比较)**P＜0.01(与模型组比较)从表2中可以看出，当使用25mg/kg苦荞提取物时，在2周后实验鹌鹑的胆固醇(CHO)含量、甘油三酯(TG)含量、低密度脂蛋白(LDL)含量分别比模型组下降了10％、2％和12％；当使用50mg/kg苦荞提取物时，上述含量则分别下降了19％、13％和26％；当使用100mg/kg苦荞提取物时，上述含量则分别下降了26％、23％和3l％；当使用15mg/kg黄酮时，上述含量分别下降了21％、7％和24％，而当使用15mg/kg肌醇时，上述含量分别下降了9％、6％和18％。
由此可见，本发明的提取物表现为1.从苦荞中分离、提取、纯化所得到的提取物具有显著的降低血液中的胆固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白含量的作用。
2.苦荞提取物的降血脂效应优于肌醇和黄酮类化合物，说明降血脂效应与其中所含的肌醇类分子和黄酮类分子的含量成正比，这二类分子具有明显的协同作用，也可能存在另外的功效成分。
已有许多报道黄酮类化合物具有有益的生理效应和病理作用，越来越引起人们的重视。现普遍认为黄酮类化合物具有改善微循环、降糖降脂、维持血管正常渗透压、防止血管脆化等功效。我们在本发明的提取物中也测定到较高的总黄酮类含量，并表明了其在降糖降脂上的可能作用。
表五 苦荞种子提取物中各类功效分子的含量
本发明的产品可与各种药学可接受的载体混合制成片剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、口服液等药物组合物，一般成人用量为600-6000mg提取物/每天。并且本发明的产品还可以直接加入食品中制备预防和治疗糖尿病的保健食品，一般加入的量以成人每天摄取300-3000mg本发明提取物为适宜的剂量范围。
实施例一一种将苦荞成熟种子内D-CHIRO-INOSITOL衍生物及MYO-INOSITOL衍生物显著转化为D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的生物学方法植物种子在萌发过程中激发一系列的生理生化反应，以提供种子萌发、生长所需的各种营养物质和能量。我们的研究发现，苦荞种子在萌发过程中会激活alpha-半乳糖苷酶的表达。因此，一种激活半乳糖苷酶表达的生物学方法或者化学方法处理，将能有效地转化D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL的半乳糖苷键衍生物，释放出游离的D-CHIRO-INOSITOL和MYO-INOSITOL分子。
在本项研究中，我们发现苦荞种子在适当的温度、盐浓度和萌发时间下，激活alpha-半乳糖苷酶基因高效表达，从而显著地将D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物转化为D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL分子。
·萌发时间，盐浓度及萌发温度对苦荞种子中alpha-半乳糖苷酶活性的影响为了确定不同萌发温度、不同盐浓度、不同萌发时间对苦荞种子中alpha-半乳糖苷酶活性的影响，我们进行了多因子交叉实验。将成熟的苦荞种子在清水中浸泡数分钟，置于用不同浓度NaCl溶液(0mM，10mM，20mM，30mM)浸湿的4-5层吸水纸上，置于盘内，放置在不同温度下(22℃，25℃，30℃)萌发。分别在萌发0小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时后检测alpha-半乳糖苷酶活性。25℃结果示于表1所示。表1.25℃下萌发时间及盐浓度对苦荞种子中alpha--半乳糖苷酶活性的影响
单位每毫克提取物中所含alpha-半乳糖苷酶单位数(以每分钟水解1umol pnp-alpha-galactoside所需的酶量为1单位)从表1中可以看出，萌发开始后种子内alpha-半乳糖苷酶的活性急剧增加，在30到36小时内达到高峰。低浓度的NaCl加速alpha--半乳糖苷酶的激活并增大峰值。20mM NaCl条件下萌发36小时测得的酶相对活性最高，是处理前的40倍。·萌发温度、盐浓度、萌发时间对苦荞种子中INOSITOL衍生物转化为单体分子的影响上述多因子交叉实验下D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物及单体的含量示于下表。表2 25℃下萌发时间及盐浓度对苦荞种子中D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL衍生物及单体含量的影单位ug/粒种子
从表2的结果中可以得出几个结论1)伴随着萌发过程中D-chiro-inositol及myo-inositol衍生物的减少，D-chiro-inositol及myo-inositol单体含量增加，并在30至40个小时达到峰值。
2)萌发温度上升加速D-chiro-inositol及myo-inositol衍生物的消失及单体的积累。但我们发现超过25℃时单体含量反而减少。单体含量可由多重因素影响，包括衍生物降解、单体被利用于它种生物合成途径、单体被降解、单体新合成等。
3)低浓度NaCl大大增加D-chiro-inositol及myo-inositol单体含量，且这种效应不是通过影响衍生物降解而实现。NaCl可能通过减少单体的利用或降解或者增加单体的合成而达到单体含量大大增加的效果。
4)单体累积的最佳条件为25℃，20mM NaCl，萌发36个小时，每粒种子中含135ug D-Chiro-Inositol及43ug Myo-Inositol。实施例二、alpha-半乳糖苷酶活性的测定收集苦荞麦种子或萌发种子，在含有40m NaCl，3mMDTT的30mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中碾磨，13200g离心5分钟。在上清液中加入硫酸铵至60％饱和度，过夜，18000g离心15分钟。沉淀溶于0.01M磷酸钠缓冲液(pH7.0)，透析，18000g再离心15分钟以去除不溶物。上样于DEAE-Sephadex A-50柱(预先用0.01M pH7.0磷酸钠缓冲液饱和)，分别用0.01M磷酸钠缓冲液，0.05M缓冲液，0.1M缓冲液洗脱。alpha-半乳糖苷主要存在于0.05M磷酸钠洗脱液内。粗酶溶液再在0.05M醋酸钠溶液中透析(pH4.0)，用CM-SephadexC-50柱(预先用0.05M醋酸钠pH4.0饱和)进一步纯化，分别用0.05M醋酸钠缓冲液(pH4.0)和线性梯度NaCl溶液洗脱，收集富含alpha-半乳糖苷酶的部分。最后用Sephadex G-100柱进一步纯化，并浓缩，得到纯化的alpha-半乳糖苷酶。在10％SDS-聚丙稀酰胺胶上电泳检查其纯度，其分子量在45-47KD之间。
酶活性的测定采用下述方法以p-Nitrophenyl(PNP)alpha-galactoside(Sigma Chemical Co.)为底物，反应液中含有0.05M磷酸钠(pH6.0)0.2mM PNP-galactoside和酶，反应体积为0.1ml。37℃保温12小时后，反应用0.7ml0.2M硼酸钠(sodiumborate)(pH9.8)终止。在400nm下测定p-nitrophenol的分解量。酶活性单位为在上述条件下每分钟水解1umol底物所需的酶量。实施例三.一种同时提取苦荞种子中D-CHIRO-INOSITOL、MYO-INOSITOL和总黄酮的方法收集不同处理后的萌发的苦荞种子，按干燥种子重量加入10倍体积(1g干燥种子10ml)的50-60％酒精或者甲醇，碾磨成匀浆，在40-60℃保温下搅拌1-3个小时后，离心过滤，收集滤液，冷冻干燥，获得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL单体及其衍生物的以可溶性碳水化合物为主的抽提物。从未萌发的成熟荞麦种子制备的抽提物含约28％的D-Chiro-Inositol及Myo-Inositol衍生物和极少量(＜1％)的单体，而在25℃、20mM NaCl，、萌发36个小时的种子中制备的抽提物含约8％的D-Chiro-Inositol单体，3％Myo-Inositol单体，以及少量(＜3％)的衍生物和15％的总黄酮类化合物。经进一步纯化后，抽提物中D-Chiro-Inositol单体和Myo-Inositol单体的含量可高达43％和9％。实施例四.本实施例是肌醇分子的纯化及测定为了进一步纯化肌醇类分子，将实施例一所得到的抽提物按干重加入0.5倍体积(0.5ml/g)的75％丙腈(acetonitrile)，碾磨成匀浆。制备分离柱，该分离柱用具有3-氨醛(aminopropyl)键修饰的硅胶(9％)填充(AldrichChemical Company Inc.产品)，匀浆物在此柱上得到分离。用60-75％丙腈洗脱，0.4ml/Min。以5ml为单位收集不同组分洗脱液，其中的1ml蒸发干燥用于气相色谱分解。各组分在Hewlett-Packard 5890 Series II气相色谱仪上分析，分离柱为DB-1701(30-m length，0.25-mm i.d.，0.25um film thickness，J&w Scientific产品)。柱温为275℃和325℃。携带气(Carrier gas)是氦气(1.0ml/min)，split 1∶100；检测气是氢气(30ml/min)、空气(300ml/min)和氮气(30ml/min)。肌醇类分子含量是根据标准曲线，并与标样的保留时间和峰面积对比而计算的。肌醇、D-手性-肌醇及其它衍生物的标准均购自Sigma公司。实施例五、本实施例是总黄酮含量的测定精确称取样品3g，100ml 80％乙醇回流提取二次，每次一小时，合并滤液，浓缩至粘稠状，精密加入25ml甲醇后，用蒸馏水定容至250ml容量瓶中；取出5ml至50ml容量瓶中，按顺序分别在容量瓶中加入5％NaNO2和10％Al(NO3)3各2ml，摇匀，放置6分钟后，加入4％NaOH 20ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀放置5分钟，以0ml作空白，在510nm处测定。所用标样购自SIGMA公司，仪器为紫外可见分光光度计。
权利要求
1.一种使苦荞麦种子内肌醇D-CHIRO-INOSITO与MYO-INOSITOL衍生物转化为其单体的方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1).将苦荞麦成熟种子在22℃～30℃，0～30mM NaCl盐浓度条件下萌发12～48小时；(2).收集处理后的萌发的苦荞麦种子，按种子湿重量加入10～20倍体积的30～70％酒精或甲醇，碾磨成匀浆，过滤；(3).收集滤液，冷冻干燥，获得含有D-CHIRO-INOSITOL及MYO-INOSITOL单体的以可溶性碳水化合物为主的提取物产品。
2.根据权利要求1所述的一种使苦荞麦种子内肌醇D-CHIRO-INOSITO与MYO-INOSITOL衍生物转化为其单体的方法，其特征在于其中所述萌发步骤中的选择条件较佳为22℃至25℃，10至20mM NaCl盐浓度条件下萌发24至40小时，或在25℃，20mMNaCl盐浓度条件下萌发36小时；在碾磨匀浆的步骤中种子与酒精或者甲醇的用量为1g湿种子10～20ml酒精或者甲醇。
3.一种如权利要求1所述的方法获得的苦荞麦提取物产品，其特征在于该提取物产品含有8％～43％D-CHIRO-INOSITOL及1％～9％MYO-INOSITOL单体。
4.一种通过如权利要求1所述的方法获得的苦荞麦提取物产品在制备防治糖尿病和高血脂药物或保健食品中的应用。
全文摘要
本发明涉及生物工程技术领域。本发明提供了一种使苦荞麦种子内肌醇衍生物D－CHIRO－INOSITO与MYO－INOSITOL通过生物工程方法转化为其单体的方法。用本发明方法得到的苦荞麦提取物产品具有显著的降糖降脂功能，可用于制备抗糖尿病、降血脂的药物或用于防治糖尿病、高血脂的保健食品。
文档编号C07D311/30GK1442399SQ0311628
公开日2003年9月17日 申请日期2003年4月10日 优先权日2003年4月10日
发明者夏涛, 王沁, 刘华奇 申请人:上海诺金科生物科技有限公司